מאמר שיטה

תבניות מודפסות בתלת מימד מותאמות אישית להדמיית דג הזברה והתפתחות הלב

775 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68768

⸱

15 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mississippi

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים שיטה המשתמשת במדפסת תלת מימד סטריאוליטוגרפית זולה ליצירת תבניות כדי להקל על הרכבה ניתנת לשחזור של עוברי דג זברה למחקרי הדמיה. באמצעות שיטה זו, יצרנו תבניות להדמיית מורפוגנזה של הלב בעוברי דג הזברה.

תקציר

הרכבה של עוברים היא אחד האתגרים הטכניים בהם נתקלים חוקרים בעת ביצוע פרויקט הדמיה. העוברים צריכים להיות מכוונים בצורה הניתנת לשחזור כך שהרקמה המעניינת תהיה נגישה למיקרוסקופ במשך כל תקופת ההדמיה. כדי להתגבר על אתגר זה, חוקרים יכולים להטמיע עוברים במדיה צמיגה או ליצור כלים וגבס מיוחדים כדי להחזיק את העוברים בכיוון הרצוי במהלך ההדמיה. כאן, אנו מתארים שיטה לשימוש במדפסת תלת מימד סטריאוליטוגרפית (SLA) זולה לייצור תבניות רב פעמיות היוצרות בארות אגרוז בהן ניתן להרכיב עוברים להדמיה. בארות אגרוז אלה מספקות אמצעי אמין להכוונת עוברים מרובים להדמיה. שיטה זו כוללת מסגרת עיצוב הניתנת להתאמה אישית בקלות למגוון רקמות, אורגניזמים ואתגרי הדמיה. באמצעות שיטה זו, יצרנו תבניות להדמיית התפתחות הלב בדגי זברה עבור מיקרוסקופים זקופים והפוכים כאחד. על ידי שימוש בחומרים וציוד נגישים, שיטה זו מאפשרת לחוקרים ליצור בקלות תבניות ספציפיות לצרכי ההרכבה שלהם.

מבוא

הדמיית דינמיקה תאית בתוך בעל חיים שלם חיונית להבנת הפתולוגיות של מחלות מולדות והתהליכים הבסיסיים של התפתחות והומאוסטזיס. הדמיה זו כוללת הדמיה בקנה מידה מרחבי מרובה כדי לזהות דינמיקה פיזיולוגית על פני אורגניזם שלם כמו גם ברמת הרקמה, התא והתת-תאי. שיטות ההדמיה המשמשות להמחשת דינמיקה תאית נעות בין מחקרי אימונופלואורסצנציה של דגימות קבועות להדמיית זמן-lapse של דגימות חיות. שיטות הדמיה אלו דורשות החזקת דגימות שלמות בכיוונים ספציפיים, כך שאזור עניין נגיש למטרת המיקרוסקופ.

עוברי דג הזברה הם אורגניזם מודל אידיאלי למחקרי הדמיה בשל השקיפות האופטית שלהם, יכולת המשיכה הגנטית, ההפריה החיצונית ומוצא החולייתנים. עם זאת, הרכבת עוברי דג זברה באוריינטציה ספציפית באופן עקבי וניתן לשחזור ייצגה אתגר מתמשך. ההרכבה מאתגרת במיוחד להדמיה של התפתחות הלב בעוברי דג הזברה מכיוון שמורפוגנזה של הלב מתרחשת במישורים שונים1.

גישות מרובות פותחו כדי להתמודד עם האתגרים של הרכבת עוברים להדמיה. אחת השיטות הפשוטות ביותר כוללת הרכבת עוברי דג זברה בין שני כיסויים עם שכבות סרט בין הכיסויים כדי למנוע ריסוק. שיטה זו מאפשרת הדמיה במיקרוסקופים הפוכים וזקופים2. ניתן להרכיב עוברי דג זברה גם במדיה או ג'ל צמיג מאוד, כגון מתיל צלולוז או אגרוז בטמפרטורת נקודת התכה נמוכה של 0.1-0.8%, כדי להחזיק עוברים בכיוונים ספציפיים 2,3,4. גישות אלה בעלות תפוקה נמוכה עובדות היטב עבור פרויקטי הדמיה רבים; עם זאת, הבטחת שלמות העובר והשגת כיוונים ספציפיים באופן שחזורי יכולה להיות בעייתית. כדי להגדיל את תפוקת ההדמיה ולהקל על ההרכבה, ניתן ליצור בארות במרווחים קבועים מאגרוז מוצק בצלחת הדמיה 5,6,7,8. כדי להקל על יצירת בארות אגרוז אלה, נוצרו תבניות פלסטיק 9,10,11. בעוד שניתן ליישם תבניות אלו להדמיה לאורך הצירים הסטנדרטיים של גב-גחון-רוחב10,12, הן מיועדות לעתים קרובות לאתגרי הדמיה ספציפיים, כגון לשימוש בלוחות 96 בארות13 או לזיהוי פעימות הלב הראשונות14. במקרים מיוחדים, צלחות הדמיה שלמות נוצרו 5,15,16. לדוגמה, תא מיקרופלואידית (בשם ZEBRA) העשוי מ-PDMS מקל הן על הדמיה והן על חשיפה של עוברים לכימיקלים17. תבניות אלו עשויות לרוב מסיליקון או מיוצרות במכונה מלוציט 10,18,19. עם זאת, הופעתן של מדפסות תלת מימד (תלת מימד) זולות יחסית הפכה את היצירה של תבניות מותאמות אישית המשמשות ליצירת בארות הדמיה של אגרוז.

הדפסת תלת מימד, הנקראת גם ייצור תוסף או ייצור שכבתי, כוללת ייצור אובייקט תלת מימד מעיצוב דיגיטלי על ידי הוספה ומיזוג רציף של שכבות בודדות20,21. סטריאוליתוגרפיה (SLA) משתמשת באור אולטרה סגול (UV) כדי לרפא שרף נוזלי רגיש לאור בשכבות עוקבות22. מדפסות SLA הן חסכוניות, מהירות ומדויקות ביותר וניתן להשתמש בהן עם מגוון שרפים, כולל כאלה המספקים משטח חלק16. התהליך מתחיל בתוכנת עיצוב בעזרת מחשב (CAD), שבה ניתן לעצב מודלים דיגיטליים של האובייקט דה נובו או לשנות אותם מעיצובים קיימים. לאחר מכן המודל הדיגיטלי נחתך באופן וירטואלי לשכבות הניתנות להדפסה. באמצעות שכבות דיגיטליות אלה, מדפסת תלת מימד בונה את האובייקט, שכבה אחר שכבה. כאן, אנו מציגים שיטה ומסגרת לעיצוב ויצירה מותאמים אישית של תבניות הדמיה באמצעות מדפסת תלת מימד SLA בעלות נמוכה. בנוסף, אנו משתמשים במסגרת זו כדי ליצור תבניות להדמיית שלבים שונים של התפתחות הלב של דג הזברה במיקרוסקופים הפוכים או זקופים ולהדמיית עוברי דג הזברה לאורך ציר הרוחב, הגב או הגחון שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקולים, הניסויים והממצאים המתוארים כאן נערכו בהתאם לתקנות ולהנחיות לרווחת בעלי חיים, ולוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מיסיסיפי (פרוטוקול #24-008).

כדי ליצור בארות אגרוז בצורות שונות שבהן ניתן לכוון את העוברים להדמיה, פיתחנו עיצוב שמשתמש בבסיס שמחובר ליתדות (איור 1A). הצורה של היתדות האלה (ראו חץ שמצביע על יתדות בסגול באיור 1A) יכולה להיות מותאמת אישית כדי לכוון עוברים בשלבי התפתחות שונים ולהתמקד ברקמות שונות. להלן, אנו מתארים פרוטוקול להתאמה אישית של יתדות אלה ולשימוש במערכת זו ליצירת בארות אגרוז.

1. יצירת תבנית הדמיה בהתאמה אישית

  1. צור סקיצה ראשונית של הדגימה או העובר הממוקם בכיוון הרצוי. שקול את כיוון העובר הרצוי והאם המיקרוסקופ שבו יש להשתמש מכיל מטרות זקופות או הפוכות. קחו בחשבון גם את גודל המנה, את מספר העוברים שיש להרכיב ואת המרווח ביניהם.
  2. מדוד את מידות העובר (למשל, אורך, רוחב וגובה) באמצעות מיקרוסקופ בשילוב עם כלי תוכנה כגון FIJI23. השתמש במידות אלה כדי להבטיח שהעוברים יתאימו לבארות שנוצרו על ידי יתדות.
  3. זהה צורה התואמת את הגיאומטריה של העובר. שימוש במדידות משלב 1.2 בשילוב עם תוכנת עיצוב בעזרת מחשב (CAD) יוצרים יתד המתקרב לצורה ולגודל של הדגימה.
    הערה: ניתן ליצור צורה זו בתוכנת CAD בסיסית על-ידי שילוב וחפיפה של צורות שונות שתוכננו מראש, או ליצור את הצורה דה נובו באמצעות תוכנת CAD מתקדמת. בנוסף, ניתן לשנות את אחד מהיתדות המתוכננות מראש שלנו (ראה קובץ משלים 1). צמצום היתד, כמו באיור 1A, יכול לעזור לכוון את העוברים כדי להבטיח שהרקמה המעניינת היא הקרובה ביותר למטרה.
  4. שלבו עיצוב יתד עם עיצוב בסיס:
    1. בתוכנת CAD, הוסף יתד מעוצב בהתאמה אישית לאחד הבסיסים המתוכננים מראש (קובץ משלים 1). לאחר מכן, שכפל ומקם באופן שווה את היתדות לאורך הבסיס להדמיה בתפוקה גבוהה על ידי שימוש בכלים בתוכנת CAD מתקדמת. בדוק שוב כדי לוודא שכל היתדות מגיעות לאותו גובה הרחק מהבסיס.
  5. הכן את העיצוב להדפסת תלת מימד:
    1. העבירו את עיצוב התבנית המותאמת אישית או אחת מהתבניות המעוצבות מראש (קובץ משלים 2) לתוכנת פורס, הממירה את העיצוב לפקודות למדפסת התלת מימד.
    2. בתוך תוכנת הפריסה, הקפד לסובב את העיצוב כך שרכיבים קריטיים כגון יתדות ימוקמו הרחק משלב המדפסת. עבור מחזיק הכיסוי, המודפס במדפסת מידול תצהיר התמזגות (FDM), מקם את ההדפסה בצורה אופקית.
      הערה: סיבוב העיצוב ימנע עיוות, מה שעלול להתרחש כאשר חלקים עדינים ממוקמים קרוב לשלב ההדפסה.
    3. הוסף תומכים בתוך תוכנת הסלייסר כדי להבטיח שהיבטים עדינים של התבנית לא יישברו במהלך ההדפסה. תכונת מיקום התמיכה האוטומטית הבינונית בתוכנה יחד עם אוצרות ידנית מבטיחה פריסה טובה של תומכים ללא פערים גדולים. אסטרטגיית מילוי של 100% משמשת ליצירת תבנית מוצקה.
    4. הדפס מספר חלקים בו-זמנית על-ידי שימוש בקובץ STL יחיד המכיל את כל התבניות או סידור קבצי STL בודדים יחד באמצעות תוכנת הסלייסר.
  6. הדפסה
    הערה: מדפסות SLA הן סוג מדפסת התלת מימד המועדף עלינו עבור תבניות ההדמיה בשל היתכנותן, דיוקן ויצירת משטחים חלקים. מדפסת FDM משמשת לייצור מחזיק הכיסוי מכיוון שהיא יוצרת הדפסים קלים ונוקשים יותר ממדפסות SLA.
    1. התחל עם הגדרות ההדפסה הבאות ובצע אופטימיזציה משם: גובה שכבה של 0.05 מ"מ; 5 ספירת שכבות תחתונות; זמן חשיפה של 2.5 שניות; זמן חשיפה תחתון של 35 שניות; מרחק הרמה והרמה תחתון של 5 מ"מ; מהירות הרמה תחתונה של 60 מ"מ לדקה; מהירות הרמה של 80 מ"מ לדקה; ומהירות נסיגה של 210 מ"מ לדקה.
      הערה: סביר להניח שהמשתמש יצטרך לבצע אופטימיזציה של הגדרות ההדפסה מכיוון שהן תלויות בסוג השרף, בטמפרטורת החדר ובדגם המדפסת.
  7. לאחר ההדפסה, שטפו את התבניות במים, הסירו את התומכים והניחו את התבניות תחת אור UV במכסה מנוע לתרבית רקמות כדי להבטיח את התמצקות השרף.
    הערה: שטיפה וריפוי יסודי של התבניות חשובה למניעת התקלפות שרף ולמניעת עיוות התבנית.
    יש ללבוש כפפות ומעיל מעבדה בעת טיפול בשרף לא נרפא וניקוי התבניות, מכיוון ששרף לא נרפא יכול להיות מגרה בעור. מדפסות SLA משתמשות באור UV כדי לרפא את השרף, שעלול להזיק לעיניים ולעור. ודא שתא ההדפסה סגור היטב והימנע מלהסתכל ישירות על מקור האור UV.

2. נוהל שימוש בתבניות מודפסות בתלת מימד ליצירת בארות אגרוז

  1. הכנת בארות אגרוז
    1. צור בארות אגרוז על ידי המסת 2% (גרם/מ"ל) אגרוז במדיה E3 (1.578 מ"מ NaCl, 0.169 מ"מ KCl, 0.249 מ"מ CaCl2*2H2O, 0.161 מ"מ MgSO4*7H2O). הניחו תבנית במרכז צלחת תחתונה עם כיסוי כשהחץ פונה כלפי מטה לכיוון הבאר (ראה איור 2A,B). פיפטה 750 מיקרוליטר של 2% אגרוז/E3 מותך לאורך מחצית מהיקף תבנית ההדמיה (ראה איור 2C).
      הערה: אגרוז מותך צריך להיות לא צמיג אך קריר מספיק כדי לפיפט מבלי ליצור בועות. אנו משתמשים בכלים בגודל 60 מ"מ עם תחתית כיסוי של 30 מ"מ, ואילו בתבניות המיועדות למיקרוסקופים זקופים ניתן להשתמש בכלי סטנדרטי בגודל 60 מ"מ. פרוטוקול שונה במקצת משמש לתבנית הסינון (ראה להלן).
    2. פיפטה עוד 750 מיקרוליטר של 2% אגרוז/E3 מותך לאורך החצי השני של היקף תבנית ההדמיה (ראה איור 2D).
    3. המתן 5-7 דקות עד שהאגרוז יתמצק, תוך התבוננות במעבר מנוזל שקוף לג'ל כחול אטום (ראה איור 2E).
    4. הוסף שכבה דקה של אגרוז מותך סביב היקף האגרוז המרכזי המוצק.
      הערה: למרות שאינו נדרש בהחלט, שלב זה עוזר לעגן את האגרוז המוצק לצלחת ולמנוע ניתוק הנגרמת על ידי מדיה.
    5. הנח את הטבעת החיצונית (איור משלים S1B) מעל מכלול תבנית האגרוז כשהחץ מכוון לכיוון האגרוז (ראה איור 2F).
    6. תוך כדי לחיצה עדינה על הטבעת החיצונית, משוך בזהירות ישר כלפי מעלה את התבנית הפנימית כדי לנתק אותה מהאגרוז (ראה איור 2G).
      הערה: כדי למנוע שבירה או נזק לבארות האגרוז, אל תלחץ כלפי מטה חזק מדי על הטבעת החיצונית ואל תסובב או תזיז את התבנית הפנימית בעת משיכה כלפי מעלה.
    7. הסר את הטבעת החיצונית, וחשוף את בארות האגרוז בצלחת התחתונה של הכיסוי (איור 2H).
    8. בדוק את בארות האגרוז תחת מיקרוסקופ כדי לאשר גודל וייצור נכונים.
      הערה: להדמיה במיקרוסקופ הפוך, לעתים קרובות יש להרים סרט דק של אגרוז מתחתית הבאר. ניתן לעשות זאת בעזרת מלקחיים.
  2. פרוטוקול שונה לשימוש בתבנית הסינון
    1. יוצקים 2% אגרוז/E3 מותך לתוך צלחת הפטרי עד שהיא מלאה בערך במחצית.
    2. החזיקו את התבנית כשהיתדות פונות כלפי מעלה ופיפטו מותך 2% אגרוז/E3 על היתדות, עד שהם מכוסים (~3 מ"ל).
      הערה: ודא שלא יוכנסו בועות על ידי שחרור רק 90% מהאגרוז המותך שנשאב לתוך הפיפט.
    3. בעזרת תנועת הטיה, הניחו קצה אחד ולאחר מכן את כל התבנית עם יתדות עם הפנים כלפי מטה לתוך צלחת הפטרי המכילה אגרוז מותך (איור משלים S2).
    4. הניחו לאגרוז להתמצק במשך 5-7 דקות.
    5. הסר בזהירות את התבנית באמצעות הידית כדי לחטט קצה אחד ולאחר מכן את הקצה השני.

3. הרכבת עוברים בבארות אגרוז עם ובלי אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה

  1. דה-כוריונאט והרדמה של עוברים בתמיסת טריקאין של 200 מיקרוגרם/מ"ל לפני ההרכבה.
    הערה: נדרשת תמיסת טריקאין של ~400 מיקרוגרם/מ"ל כדי לעצור את פעימות הלב.
    1. ללא שימוש באגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה: מלאו את צלחת ההדמיה ב-1x E3 וטריקאין (200 מיקרוגרם/מ"ל), הוסיפו עוברים מורדמים לכלי ההדמיה, השתמשו במלקחיים כדי למקם ולכוון עוברים בבארות האגרוז, ולאחר מכן הדמינו (ראו איור 2I, J).
      הערה: מכיוון שמלקחיים יכולים לפגוע בקלות בעובר, ניתן להשתמש בפוקר עוברי שבו חוט דיג בקוטר 0.41 מ"מ מוחדר לצינור נימי או קצה פיפטה ומאובטח עם דבק-עלבמקום 24.
    2. שימוש בטמפרטורת התכה נמוכה אגרוז:
      הערה: בעוד שהתבניות נועדו למקם עוברים בכיוונים ספציפיים, שימוש באגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה כדי להחזיק את העוברים במקומם יכול להבטיח שהעוברים לא ייסחפו במהלך ההדמיה או בזמן הובלת צלחת ההדמיה עם העוברים המותקנים למיקרוסקופ. השלבים שלהלן נגזרים מפרוטוקול6 הקודם שלנו.
      1. צור צינורות של אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה על ידי המסת אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה של 0.1-0.8% ב-5 מ"ל של מדיה E3 וחימום ל-65-70 מעלות צלזיוס באמבט מים. מדי פעם, הפוך את הצינור עד שהאגרוז בטמפרטורת ההיתוך הנמוכה נמס. הציגו את תמיסת האגרוז בטמפרטורת ההיתוך הנמוכה לתוך צינורות מיקרופוגה והניחו אותם על גוש חום המוגדר ל-42 מעלות צלזיוס. אפשר לתמיסה להתאזן ל-42 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות.
        הערה: בדרך כלל רצוי להשתמש בתמיסת אגרוז טרייה בטמפרטורת התכה נמוכה.
      2. בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית רחבה, העבירו עובר בודד לתוך צינור המכיל את תמיסת האגרוז בטמפרטורת ההיתוך הנמוכה. כדי להימנע מהוספת עודפי נוזלים לתמיסת האגרוז בטמפרטורת ההיתוך הנמוכה, העבירו רק את העובר והנוזל המקיפים אותו מיד. העבירו מיד את העובר, שנמצא כעת באגרוז נמס נמוך, לאחת מבארות האגרוז. החזר את תמיסת האגרוז בטמפרטורת ההיתוך הנמוכה לגוש החום לשימוש חוזר.
      3. בעזרת מלקחיים או פוקר עוברים (ראה שלב 3.1.1), מקם את העובר בבאר להדמיה.
      4. חזור על שלבים 3.1.2.2-3.1.2.3 עבור הבארות האחרות. אם הבארות הקודמות מתחילות להתייבש, השתמש בצינור p200 כדי להוסיף כמות קטנה של E3 (~50-100 מיקרוליטר) על גבי הבאר.
  2. לאחר שהעוברים הותקנו בכל הבארות והאגרוז בטמפרטורת ההיתוך הנמוכה התמצקה, בעזרת פיפט הוסיפו לאט לאט את תמיסת הטריקאין/E3 לצלחת ההדמיה.
  3. לאחר ההדמיה, הוציאו את העוברים בזהירות מהבארות באמצעות מלקחיים ואפשרו להם להתפתח עוד יותר כדי להבטיח שההדמיה לא גרמה לפגמים התפתחותיים.
    הערה: ניתן להסיר את בארות האגרוז מצלחת ההדמיה, אותה ניתן לשטוף ולעשות שימוש חוזר. שטיפה עם מנקה זכוכית זמין מסחרי ולאחר מכן מספר פעמים עם ddH2O עוזרת להסיר משקעי מלח על הכיסויים. למרות שלא חווינו רעילות עקב שאריות של מנקה זכוכית, מומלץ לחוקר לאשר תוצאות אלה באמצעות תנאי המעבדה שלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול הנ"ל שימש לתכנון תבניות להדמיית שלבים שונים של התפתחות הלב בדג הזברה, כולל איחוי לב, היווצרות צינור לב, לולאות לב והיווצרות תאים. מכיוון שהתפתחות הלב אינה מתרחשת לאורך הצירים האנטומיים העיקריים של העובר, צורת היתדות הותאמה לשלבי התפתחות שונים על מנת למקם את העוברים כראוי. לדוגמה, המיקום הפנימי הקדמי של לב דג הזברה 48 שעות לאחר ההפריה (hpf) ביחס לחלמון הכדורי דורש אוריינטציה משופעת של העובר אשר התאפשרה על ידי יצירת יתדות עם קצוות מחודדים בתבנית V2 (איור 1A,B). תוך ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לתכנון תבניות מודפסות בתלת מימד היוצרות בארות אגרוז שיכולות להקל על הרכבה של עוברים או רקמות למחקרי הדמיה. ניתן לייצר תבניות אלו להדמיה באמצעות מיקרוסקופים זקופים או הפוכים, ובארות האגרוז המיוצרות באמצעות תבניות מותאמות אישית אלה יכולות לשמש ליישומי הדמיה הנעים בין מחקרי אימונופלואורסצנציה של עוברים קבועים להדמיית זמן-lapse של עוברים חיים.

שיטה זו משתמשת בתשתית המכילה שני חלקים: תבנית בסיס פנימית בצורת בוכנה עם יתדות מחוברות וטבעת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

אנו רוצים להודות לחברים במעבדת בלומקץ, במיוחד לסמית'ה סינג ואליסון הולמס, כמו גם לליבת ההדמיה של GlyCORE (שנתמכת על ידי P20GM130460), למעבדת IDEA של אוניברסיטת מיסיסיפי, לד"ר ייווי האן ולמעבדת האן, ולחברים בקהילות מדעי הגליקולוגיה והביולוגיה ההתפתחותית של אוניברסיטת מיסיסיפי. עבודה זו נתמכת על ידי מימון מה-NIH (R15HD108782, P20GM130460).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדפסת תלת מימד SLAElegooMARS 2 PRO
Agarose Apex Bioresearch; ג'נסי סיינטיפיק 20-102QDניתן להחליף כל מותג
Autodesk Fusion 360Autodesk Inc.https://www.autodesk.com/products/fusion-360/ תוכנה לתכנון עזרי מחשב (CAD) - מתקדמת יותר
Axio-Zoom מיקרוסקופ זקוףZeissAxio Zoom.V16
ChituboxCBD-Techhttps://www.chitubox.com/תוכנת סלייסר
צלחת תחתונה Coverslip (צלחת 60 מ"מ עם באר תחתונה 30 מ"מ)CellvisD60-30-1.5N
F59 שרשרת כבדה מיוזין (כל האיזופורמים המהירים)DHSBF591:50 דילול
FDM חוטיםBambuPLA חוטים
מדפסת FDMBambuBambu X1 פחמן FDMזרבובית מכבש 0.4 מ"מ
מלקחייםפישר16-100-121מותגים אחרים עשויים להתאים
עז נגד עכבר Alexa 488ThermoFisher#A281751:300 דילול
ImarisAndor10.2תוכנה
מיקרוסקופ קונפוקלי הפוךLeicaLeica SP8 X
טמפרטורת התכה נמוכה אגרוזזהב ביוטכנולוגיהמספר קטלוג: A-204-25מותגים אחרים עשויים להתאים
משאבת פיפטהBel-ArtF37898
שרף למדפסת SLAElegooElegoo P05BB028פוטופולימר רחיץ במים שרף V2.0
Ricinus communis agglutinin (RCA-120)מעבדות וקטור#RLK-2200 (ערכת לקטין)דילול 1:300
טינקרקאדאוטודסק בע"מ https://www.tinkercad.com/תוכנה לתכנון עזרי מחשב (CAD) -
טריקאין בסיסי S ווסטרן כימיקלים בע"מ ANADA #200-226
אגלוטינין נבט חיטה (WGA)מעבדות וקטור#RLK-2200 (ערכת לקטין)דילול 1:300
פיפטת פסטור מזכוכית רחבת נשא  דוראן ויטון קימבל (DWK)63A53WT

מקורות

  1. Shrestha, R., Lieberth, J., Tillman, S., Natalizio, J., Bloomekatz, J. Using zebrafish to analyze the genetic and environmental etiologies of congenital heart defects. Adv Exp Med Biol. 1236, 189-223 (2020).
  2. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
  3. Upadhyay, S., et al. A layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos. J Vis Exp. (155), e60321(2020).
  4. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  5. Cooper, M. S., D'Amico, L. A., Henry, C. A. Confocal microscopic analysis of morphogenetic movements. Methods Cell Biol. 59, 179-204 (1999).
  6. McCann, T., Shrestha, R., Graham, A., Bloomekatz, J. Using live imaging to examine early cardiac development in zebrafish. Methods Mol Biol. 2438, 133-145 (2022).
  7. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
  8. Kleinhans, D. S., Lecaudey, V. Standardized mounting method of zebrafish embryos using a 3D-printed stamp for high-content, semi-automated confocal imaging. BMC Biotechnol. 19 (1), 68(2019).
  9. Alessandri, K., et al. All-in-one 3D printed microscopy chamber for multidimensional imaging, the universlide. Sci Rep. 7, 42378(2017).
  10. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. 546, 317-332 (2009).
  11. Wühr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W. III, Mitchison, T. J. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  12. Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2013).
  13. Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnol. 14, 36(2014).
  14. Jia, B. Z., Qi, Y., Wong-Campos, J. D., Megason, S. G., Cohen, A. E. A bioelectrical phase transition patterns the first vertebrate heartbeats. Nature. 622 (7981), 149-155 (2023).
  15. Ellett, F., Irimia, D. Microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae. J Vis Exp. 130, e56498(2017).
  16. Tan, S., Zhu, X., Zartman, J. J., Deng, Q. Low-cost polyethylene terephthalate lamination microfluidics designs for multiplexed zebrafish imaging. J Vis Exp. (211), e67313(2024).
  17. Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish entrapment by restriction array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
  18. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50 (5), 319-324 (2011).
  19. Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A four-well dish for high-resolution longitudinal imaging of the tail and posterior trunk of larval zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
  20. Bozkurt, Y., Karayel, E. 3D printing technology; methods, biomedical applications, future opportunities and trends. J Mater Res Technol. 14, 1430-1450 (2021).
  21. Murr, L. E. Frontiers of 3D printing/additive manufacturing: from human organs to aircraft fabrication. J Mater Sci Technol. 32 (10), 987-995 (2016).
  22. Gu, Z., Fu, J., Lin, H., He, Y. Development of 3D bioprinting: from printing methods to biomedical applications. Asian J Pharm Sci. 15 (5), 529-557 (2020).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development. J Vis Exp. (84), e50703(2014).
  25. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228 (1), 30-40 (2003).
  26. Bloomekatz, J., et al. Platelet-derived growth factor (PDGF) signaling directs cardiomyocyte movement toward the midline during heart tube assembly. eLife. 6, (2017).
  27. Cummings, R. D., et al. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. Ch 48, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 645-661 (2022).
  28. Gallagher, J. T., Morris, A., Dexter, T. M. Identification of two binding sites for wheat-germ agglutinin on polylactosamine-type oligosaccharides. Biochem J. 231 (1), 115-122 (1985).
  29. Yamamoto, K., Tsuji, T., Matsumoto, I., Osawa, T. Structural requirements for the binding of oligosaccharides and glycopeptides to immobilized wheat germ agglutinin. Biochemistry. 20 (20), 5894-5899 (1981).
  30. Wright, C. S., Jaeger, J. Crystallographic refinement and structure analysis of the complex of wheat germ agglutinin with a bivalent sialoglycopeptide from glycophorin A. J Mol Biol. 232 (2), 620-638 (1993).
  31. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  32. Isogai, S., Lawson, N. D., Torrealday, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. Angiogenic network formation in the developing vertebrate trunk. Development. 130 (21), 5281-5290 (2003).
  33. Illi, J., et al. Translating imaging into 3D printed cardiovascular phantoms: a systematic review of applications, technologies, and validation. JACC Basic Transl Sci. 7 (10), 1050-1062 (2022).
  34. George, E., Liacouras, P., Rybicki, F. J., Mitsouras, D. Measuring and establishing the accuracy and reproducibility of 3D printed medical models. Radiographics. 37 (5), 1424-1450 (2017).
  35. Elegoo Mars 2 Pro Mono LCD 3D Printer. , https://us.elegoo.com/products/elegoo-mars-2-pro-mono-lcd-3d-printer (2025).
  36. Shrestha, R., et al. The myocardium utilizes a platelet-derived growth factor receptor α (PDGFRα)-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling cascade to steer toward the midline during zebrafish heart tube formation. ELife. 12, e85930(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

agarose
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים