הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניקור ורידים בפנים לאיסוף דם עכברים

2.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68776

⸱

26 בספטמבר 2025

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, Dartmouth Geisel School of Medicine

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לטכניקת איסוף דם אופטימלית בנבדקים עכברים באמצעות ניקור ורידים בפנים באמצעות lancet. אנו משתמשים בטכניקה זו לצד הערכה ציטומטרית של זרימה ציטומטרית כדי לאפיין פנוטיפים תאיים של זנים טרנסגניים, קונגניים ומדווחים. הוא מתאים גם לניתוח ציטוקינים בסרום ולמחקרי סוכרת.

תקציר

מאמר זה מציג פרוטוקול אופטימלי לאיסוף דם מעכברים באמצעות ניקור ורידים בפנים באמצעות lancet, המציע אלטרנטיבה מהירה, זעיר פולשנית וחסכונית לטכניקות נפוצות אחרות כגון וריד זנב ודגימת רטרו-אורביטל. טכניקה זו מועילה במיוחד למחקרים הדורשים דגימה חוזרת, כגון פנוטיפ עכברים, ניתוח ציטוקינים בסרום וחקר סוכרת. הפרוטוקול יעיל, דורש ציוד מיוחד מינימלי, ומתאים היטב לניתוח תאים בתפוקה גבוהה בעכברים. היישום העיקרי שלנו הוא פנוטיפ של עכברים טרנסגניים, מולדים ומדווחים באמצעות ציטומטריית זרימה, המודגמת כאן עם צביעת נוגדנים ועכברים מדווחים tdTomette. המאמר מתאר את ההליך המלא, מהכנת בעלי חיים ועד לניתוח דגימות. השלבים העיקריים כוללים איסוף דם עם לנצט 3 מ"מ, ליזיס תאים, צביעה ופרופיל ציטומטרי זרימה. ניקור ורידים בפנים משפר את יעילות האיסוף תוך תמיכה בפרקטיקות מחקר אתיות. שיטה מעשית וניתנת להתאמה זו מתאימה למגוון רחב של פרוטוקולים ניסיוניים הכוללים דגימת דם של עכברים וניתוח תאי.

מבוא

איסוף דם יעיל, ניתן לשחזור וזעיר פולשני חיוני למחקרי עכברים רבים, במיוחד אלה הדורשים דגימה חוזרת. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה לאיסוף כמויות קטנות של דם באמצעות ניקור ורידים בפנים, ואחריו ליזה של כדוריות דם אדומות, צביעת נוגדנים וניתוח זרימה ציטומטרי. זרימת עבודה זו מתאימה היטב ליישומים בעלי תפוקה גבוהה תוך מזעור המורכבויות הטכניות.

שיטות רבות לאיסוף דם, כמו דימום רטרו-אורביטלי או חתך בווריד הזנב, יכולות לדרוש הליכים הכוללים חום,הרדמה 1 וזמני טיפול ממושכים, מה שעלול לגרום למצוקה משמעותית לבעל החיים2. לעומת זאת, ניקור ורידים בפנים עם lancet מציע אלטרנטיבה פשוטה ומהירה התומכת בתכנון ניסיוני אתי וניתן לשחזור. שיטה זו אומתה במחקרים קודמים כחלופה הומאנית לדגימת דם בנפח קטן בעכברים3.

אנו מדגימים שיטה זו על ידי פנוטיפ של תאים חיסוניים מעכברים טרנסגניים ומדווחים, כולל עכברים מדווחים TdTomato ועכברי MD4-IgHEL. האחרון דורש צביעה עם נוגדנים נגד CD19 ו-IgMa, אלוטיפ IgM.

בעוד שפרוטוקול זה פותח עבור פרופיל תאי דם, ניתן להתאים אותו בקלות לשימושים אחרים, כולל ניתוח ציטוקינים בסרום, זיהוי נוגדנים ספציפיים או מדידות גלוקוז, על ידי השמטת שלב הליזיס של תאי הדם האדומים. בסך הכל, טכניקה זו משפרת את איכות הנתונים ואת יעילות הניסוי תוך גרימת מצוקה מינימלית לבעלי חיים, מה שהופך אותה לשימושית באופן נרחב ביישומי מחקר מגוונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

העכברים שוכנו בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים במכללה הרפואית של דארטמות' היצ'קוק, מוסד מוסמך AAALAC, ונעשה בהם שימוש בהתאם לפרוטוקול מאושר תחת הוועדה המוסדית לטיפול וניצול בעלי חיים.

1. איסוף חומרים

  1. הכן צינורות תרבית של 5 מ"ל, כל אחד מהם מכיל 1.5 מ"ל של מאגר ליזה 1x תאי דם אדומים (RBC) (10X RBC Lysis מדולל במים סטריליים). השתמש בצינור אחד לכל עכבר.
  2. אסוף קופסה של 3 מ"מ (lancet אחד לכל עכבר).
  3. אוספים קופסת ספוגי גזה (ספוג גזה אחד לכל עכבר).
  4. אסוף צינורות העברה וצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 1x HBSS עם 0.5 מ"מ EDTA (מספיק לעד 20 עכברים).
    הערה: מאגר זה משמש לעצירת תגובת הליזיס. אם המאגר נחוץ רק לפנוטיפ ולא לניתוח נוסף במורד הזרם, ניתן להשתמש ברוב המאגרים הניטרליים עם pH 7.2-7.4 במקום HBSS.
  5. הביאו דלי קרח, מאגר ליזה נוסף של 1x RBC, צינורות נוספים של 5 מ"ל וצנרת העברה.

2. תיוג עכבר וצינור

  1. סמן כל כרטיס כלוב ועכבר עם מזהה פנוטיפ המתאים לתוויות על כל צינור כדי לסייע בהבחנה אילו תוצאות מתואמות לאיזה עכבר. מזהים נפוצים כוללים צבעי סמן קבועים שונים (למשל, אדום, כחול, ירוק, שחור) על זנבות העכברים, התואמים את הסימונים על הצינור.
    הערה: כלול תמיד עכבר בקרה לפנוטיפ. עבור עכברים מדווחים, ודא שיש לך בקרת מדווח שלילית. עבור עכברים טרנסגניים, כלול עכבר מסוג בר כבקרה.
  2. מסדרים את הצינורות המסומנים במתלה עם דלי קרח בקרבת מקום לאחסון צינורות מיד לאחר איסוף הדם.
  3. פתח את כל ה-lancets הדרושים להליך.
  4. פתח את כל ספוגי הגזה הדרושים להליך.

3. טיפול בעכבר ואיסוף דגימות

  1. השתמש ביד הדומיננטית כדי לתפוס את העכבר בזנב ולהניח אותו על מתלה הזנת חוט או כל משטח ישר.
  2. השתמש באצבע המורה ובאגודל הלא דומיננטיים כדי לקשקש את העכבר על ידי תמרון מהזנב לכיוון אזור צוואר הרחם.
  3. השתמש באצבעות הנותרות כדי לאבטח את הזנב, תוך מזעור תנועת העכבר.
  4. השתמש ביד הדומיננטית כדי לאחזר רומח פתוח בקוטר 3 מ"מ.
  5. אתר את הנקודה הקטנה חסרת השיער ממש מעבר לפה ועקב אחר קו ישר לכיוון האוזן. עצרו במקום שבו הקו מצטלב עם הפינה החיצונית של העין (איור 1).
  6. הכנס את ה-lancet בצומת זה כדי להבטיח אספקת דם בשפע.
  7. השתמש בקצה הצדדי השטוח של ה-lancet כדי לאסוף טיפת דם אחת.
  8. הפקידו את כל ה-lancet, עם דגימת הדם, לתוך הצינור המסומן המכיל מאגר ליזה RBC.
  9. ערבבו בעדינות את הצינור כדי להבטיח שכל הדגימה מעורבבת במאגר. ערבוב לא שלם עלול לגרום לקרישה ולאיכות נתונים ירודה.
  10. השתמש בספוג גזה כדי להפעיל לחץ עדין על מקום הניקוב למשך 5-10 שניות.
  11. החזר את העכבר לכלוב שלו.
  12. שמור על יחס חיץ דם לליזה גדול מ-1:10.
  13. חזור על השלבים בסעיף זה עבור כל עכבר נוסף.

4. ליזה, הכנה וניתוח של הדגימה

  1. המתן 7-10 דקות לאחר תחילת הליזה, הוסף כ-2 מ"ל של 1x HBSS עם 0.5 מ"מ EDTA (או מדיה אחרת).
  2. צינורות צנטריפוגה ב -400 גרם למשך 5 דקות. הכינו קוקטיילים של נוגדנים בתקופה זו.
  3. השליכו את הסופרנטנט.
  4. הסר את ה-lancets מהצינורות בעזרת מלקחיים.
  5. הוסף 30 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים שנועד לזהות את אוכלוסיות התאים הרצויות.
    הערה: לפנוטיפ MD4 IgHEL, הקוקטייל שלנו כלל 1 מ"ל של HBSS, 25 מיקרוליטר של IgMa PerCP cy-5.5 ו-25 מיקרוליטר של CD19 APC.
  6. השעיית תאים על ידי מערבולת למשך 2-3 שניות ודגירה למשך 25-30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  7. הפעל את ציטומטר הזרימה והגדר את עלילות הזרימה לצרכי הניסוי.
    הערה: אין צורך לסובב את התאים לאחר הצביעה אם המטרה היא פנוטיפ.
  8. הוסף 150-25 מיקרוליטר של HBSS או מדיה אחרת לכל דגימה באמצעות פיפטת העברה. במידת הצורך, ניתן להוסיף DAPI בריכוז סופי של 1. מיקרוגרם/מ"ל (השתמש ב-10 מיקרוליטר של מדיה המכילה DAPI).
  9. מערבולת כל דגימה למשך 2-3 שניות ממש לפני הרכישה.
  10. רכוש נתונים 8,000-10,000 אירועים לשנייה, במטרה להגיע ל-100,000 תאים אם הליזיס היה יעיל.
  11. נתח את הנתונים שנרכשו, המוצגים באיור 2 ובאיור 3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות ציטומטריית זרימה, איור 2 מציג דם ליזה מעכברים מדווחים מסוג בר (WT) ו-PF4-Cre TdTomato, שהוכנו באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל. הקבוצה הראשונה של תרשימי זרימה מציגה פיזור צד (SSC), המשקף את גרעיניות התא, לעומת פיזור קדימה (FSC), המציין את גודל התא. פסולת תאית וטסיות דם נצפים בסמוך למקור הצירים, בעוד שהלימפוציטים נראים קטנים יותר בהשוואה לנויטרופילים הגרגיריים יותר. הפרדה ברורה בין פסולת לתאים חיים מעידה על ליזה יעילה של ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול אופטימלי זה לאיסוף דם בוורידי הפנים מספק אלטרנטיבה יעילה ופשוטה לשיטות נפוצות אחרות, כגון וריד הזנב או דימום רטרו-אורביטלי. בעוד שהפרוטוקול פשוט וישיר, יש לעקוב בקפידה אחר כמה שלבים קריטיים. השלב החשוב ביותר לביצוע נכון הוא המיקום הנכון של אתר הניקוב4. התמקדות במיקום המתאים על הלחי מבטיחה זרימת דם מספקת עם מצוקה מינימלית לעכבר. הפקדה מיידית של דגימת הדם למאגר ליזה מקורר מראש היא גם חיונית, מכיוון שהדבר מונע קרישה ושומר על שלמות התא. צנטריפוגה של הדגימות ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות: R35 HL155458 (C.V.J.)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן CD19 נגד עכבר APCביולג'נד152410CD19 APC
צנטריפוגה 5810 R, ללא רוטור, 120 וולט, 50/60 הרץאפנדורף22625501צנטריפוגה
ספוגי גזה של דרמאסאה בגודל 8 שכבות 2" x 2"Covidien441211גואז-פונגס
פיפטות העברה חד-פעמיות מדורגותפישרברנד13-711-91 בבוקרפיפט העברה
פיפט ערוץ יחיד של ErgoOne (200 ומיקרו; L)USA Scientific7100-2200פיפטה
אתילנדיאמינטרטראאצטית (תמיסה של 0.5 M/pH 8.0)פישרברנדBP2482-100EDTA 5 M   
אנלייזר תאים FACSymphony A3BD ביוסיינסס660937ציטומטר זרימה
פישרברנד  מערבל מערבולת אנלוגיפישרברנד02-215-414מערבולת
Goldenrod Animal Lancet 3 מ"מ סטרייל 5 מגשים של 200גולדן רודGR 3 מ"מLancet 3 מ"מ
מלקחי גרפהכלי המדע המדויק11051-10מלקחיים
הנק' תמיסת מלח מאוזנת, 1X ללא סידן ומגנזיוםקורנינג21-021-CVRHBSS
PerCP/Cyanine5.5 אנטי-עכבר IgMa  נוגדןביולג'נד408612IgMa PerCP cy-5.5
RBC Lysis Buffer (10x)ביולג'נד420301RBC Lysis Buffer
מבחנות פוליסטירן עגולות ללא מכסהפישרברנדFB1496110צינורות תרבית
טושים קבועים של טוש, קצה אזמלטוש38254PPSharpies 
נבדק ל-USP מים סטריליים קורנינג25-055-CIמים בדרגת תרבית תאים
מילויים של TipOne Pipette Tip (200 ומיקרו; L Natural Beveled)USA Scientific1111-1730טיפים של פיפטה

מקורות

  1. Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Lab Anim. 52 (3), 253-264 (2018).
  2. Jo, E. J., Bae, E., Yoon, J. H., Kim, J. Y., Han, J. S. Comparison of murine retroorbital plexus and facial vein blood collection to mitigate animal ethics issues. Lab Anim Res. 37 (1), 12(2021).
  3. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  4. Francisco, C. C., Howarth, G. S., Whittaker, A. L. Effects on animal wellbeing and sample quality of 2 techniques for collecting blood from the facial vein of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (1), 76-80 (2015).
  5. Ng, M. S., Ng, A. S., Chan, J., Tung, J. P., Fraser, J. F. Effects of packed red blood cell storage duration on post-transfusion clinical outcomes: a meta-analysis and systematic review. Intensive Care Med. 41 (12), 2087-2097 (2015).
  6. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Exp Hematol. 44 (2), 132-137.e1 (2016).
  7. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  8. Ahrens Kress, A. P., Zhang, Y., Kaiser-Vry, A. R., Sauer, M. B. A comparison of blood collection techniques in mice and their effects on welfare. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (3), 287-295 (2022).
  9. Lavin, E. S., Feldman, E. R., Soprano, S. M., Moore, E. S. Venipuncture site influences blood-drop volume in C57BL/6 mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 63 (3), 325-332 (2024).
  10. Forbes, N., et al. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab Anim (NY). 39 (8), 236-240 (2010).
  11. Moore, E. S., et al. Comparing phlebotomy by tail tip amputation, facial vein puncture, and tail vein incision in C57BL/6 mice by using physiologic and behavioral metrics of pain and distress. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (3), 307-317 (2017).
  12. Gong, S., et al. Dynamics and correlation of serum cortisol and corticosterone under different physiological or stressful conditions in mice. PLoS One. 10 (2), e0117503(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

שיטת איסוף דםדגימה זעיר-פולשניתציטומטריית זרימהסמימה בנוגדניםליזיס של תאי דם אדומיםעכברים טרנסגנייםניתוח טסיות דםפנוטיפ Cellular
ניקור ורידים בפנים לאיסוף דם עכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.