מאמר שיטה

אופטימיזציה מהירה של מערכת השראת אור לשליטה בביטוי גנים של יונקים

DOI:

10.3791/68779

⸱

4 בנובמבר 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר שיטה לניסויים בתפוקה גבוהה באמצעות מערך LED מודפס בתלת מימד כדי לייעל את ביטוי הגנים המושרה באור בתאי HEK293T.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלי ביטוי גנים הניתנים להשראה יכולים לפתוח יישומים חדשים בבריאות האדם ובביוטכנולוגיה, אך האפשרויות הנוכחיות הן לרוב יקרות, קשות להיפוך ויש להן השפעות לא רצויות מחוץ למטרה. מערכות אופטוגנטיות משתמשות בחלבונים המגיבים לאור כדי לשלוט בפעילות הרגולטורים כך שהביטוי נשלט באמצעות "היפוך מתג". מחקר זה מייעל מערכת אפקטור CRISPR (2pLACE) פשוטה המופעלת באור, המספקת שליטה מתכווננת, הפיכה ומדויקת על ביטוי גנים ביונקים. ה-OptoPlate-96 מאפשר סינון בתפוקה גבוהה באמצעות זרימה ציטומטרית לניתוח תאים בודדים ואופטימיזציה מהירה של 2pLACE. מחקר זה מדגים כיצד להשתמש במערכת 2pLACE עם OptoPlate-96 בתאי HEK293T כדי לזהות את יחסי הרכיבים האופטימליים למקסום הטווח הדינמי ולמצוא את עקומת התגובה של עוצמת האור הכחול. ניתן לפתח תהליכי עבודה דומים עבור תאי יונקים אחרים ועבור מערכות אופטוגנטיות אחרות ואורכי גל של אור. התקדמות זו משפרת את הדיוק, המדרגיות ויכולת ההסתגלות של כלים אופטוגנטיים ליישומי ייצור ביולוגי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלים של ביולוגיה סינתטית כגון מערכות ביטוי גנים הניתנות להשראה סיפקו תרומות משמעותיות למחקר הביולוגי. יכולתם לווסת את ביטוי הגנים בצורה מתכווננת, הפיכה ומדויקת יכולה לשפר את השליטה בייצור החלבון 1,2,3,4,5,6, מורפולוגיה של התא 7,8,9,10,11,12, מסלולים מטבוליים 13,14,15,16,17,18, ויעדים אחרים לייצור ביולוגי ויישומים טיפוליים. למערכות כימיות הניתנות להשראה יכולות להיות השפעות שיוריותשל 19,20 או מחוץ למטרה. תוספים כימיים יכולים להיות גם יקרים מאוד וקשים להגדלה תעשייתית עקב תהליכי טיהור נוספים במורד הזרם 21,22,23. מערכות ביטוי גנים הניתנות להשראת אור יכולות להציע שיטה ניתנת להרחבה ומדויקת לשיטות ייצור ביולוגי 24,25,26,27.

מערכות ביטוי גנים רבות הניתנות להשראת אור פותחו ככלים שימושיים לביולוגיה סינתטית במגוון יישומים 28,29,30,31,32,33,34,35,36 ואורכי גל של כחול 35,37,38, אדום/אדום רחוק 12,39,40, או אור ירוק41. במקרה של ויסות גנים אופטוגנטיים מבוססי CRISPR, שינוי כמות ה-RNA המנחה הבודד (gRNAs) המועברים יכול להשפיע על ביטוי ה-mRNA של גנים אנדוגניים42, ויהיה צורך לבצע אופטימיזציה עבור קווי תאים שונים. ניתן להשתמש גם בחלבוני טרנסאקטיביות כגון VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p6544, או היתוך שלהם 47, מה שמגדיל את המודולריות של מערכות אופטוגנטיות. על מנת לחקור מסלולים ביולוגיים מורכבים ושזורים זה בזה 12,40,48,49,50,51,52,53, ניתן לבדוק שילובים שונים של רכיבים ידועים אלה. בנוסף, קווי תאים שונים יכולים להראות הבדלים באינדוקציה עם אותה מערכת52. רמות אינדוקציה שונות עלולות להוביל לביטוי גנים לא מספיק או לרגישות בבקרה המדויקת של ביטוי הגנים, מה שדורש בדיקות קפדניות כדי למצוא מערכת אופטוגנטית אופטימלית בקווי תאים חדשים או רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית. עם קצב הולך וגדל והישימות המתרחבת של ויסות גנים אופטוגנטיים, הכרחי לאפיין במהירות את המערכות השונות הללו.

השיטות הנוכחיות לאפיון כלים אופטוגנטיים משתמשות בביטוי יציב או חולף של גנים12,54. יצירת קווי תאים בעלי ביטוי יציב ואופטימיזציה של דינמיקת המערכת לביטוי מקסימלי יכולה להיות גוזלת זמן ולכן יקרה. ביטוי חולף מאפשר תובנות מהירות ובעלות ערך, במיוחד בעת בדיקת מערכות אופטוגנטיות מרובות רכיבים. כאן, השתמשנו במערכת אפקטור CRISPR-dCas9 (LACE)37 המופעלת באור כחול, המורכבת מקריפטוכרום 2 (CRY2) ומסוף N בסיסי (CIBN). הוא שימש לשליטה בביטוי גנים בתאי יונקים כגון HEK293T (תאי כליה עובריים אנושיים)37,38, CHO-DG44 (תאי שחלה של אוגר סיני)55 ו-C2C12 (תאי מיובלסט של עכבר)38. האופי המודולרי שלו אידיאלי לאפיון מהיר של ביצועי המערכת באמצעות ביטוי טרנזיינטי ושיטות תפוקה גבוהה. לדוגמה, מערכות מרובות רכיבים כמו LACE עשויות להזדקק לאופטימיזציה של יחסי מסה כדי לשפר את האינדוקציה, צעד שאינו משמש בדרך כלל באפיון מערכת אופטוגנטית.

פרוטוקול זה מפרט את האופטימיזציה והאפיון המהירים של שתי מערכות פלסמיד LACE (2pLACE)38. במערך זה, 2pLACE שולט בביטוי של מדווח פלואורסצנטי, eGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר), בתאי HEK293T. ההפעלה מתבצעת בלוחות זכוכית שחורים עם תחתית 96 בארות באמצעות OptoPlate-96, מערך LED מודפס בתלת מימד שתוכנן ונבנה על ידי לוקאס בוגאי ועמיתיו 56,57,58,59. פרוטוקול זה מייעל באופן ספציפי את הביטוי המקסימלי עם יחסי מסה שונים של מערכת שני הפלסמידים. הוא כולל גם קוד ידידותי למשתמש לשליטה בעוצמות אור שונות כדי לחקור את כוונון המערכת ואת הטווח הדינמי המלא שלה. ציטומטריית זרימה משמשת לאיסוף וניתוח נתונים. פרוטוקולים ליצירת מבני פלסמיד וחומרי הדפסת תלת מימד עבור מערך ה-LED ניתן למצוא בפרסומים קודמים54,56. שיטות אלו מדגישות צינור מהיר ובעל תפוקה גבוהה לאפיון מערכות ביטוי גנים הניתנות להשראת אור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ציפוי תאים HEK293T בפורמט של 96 בארות

  1. בארון בטיחות ביולוגית, אספו מיכל פסולת אקונומיקה, פיפטות סרולוגיות, עזר פיפטה, תמיסת מלח פוספט (DPBS) של Dulbecco, מדיום נשר שעבר שינוי של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), ובקבוק תרבית תאים T-75 עם תאי HEK293T מתלכדים. מחממים את המדיה ל-37 מעלות צלזיוס.
  2. בבקבוק T-75, בדוק שהמפגש הוא כ-80%-100% מתכנס באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
  3. בארון הבטיחות הביולוגית, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי לשאוב את המדיה המושקעת מבקבוק תרבית התא. הימנע מלגעת במשטח או בפלסטיק של הבקבוק. השלך את המדיה המושקעת והשואב למיכל הפסולת.
  4. שטפו בעדינות את התאים עם כ -10 מ"ל DPBS על ידי שאיפתו לפינת הבקבוק וסיבובו בעדינות סביב פני השטח. שאפו את ה-DPBS מהבקבוק והשליכו את הכביסה והשואב למיכל הפסולת.
  5. הוסף 1.5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA כדי לכסות את פני הבקבוק ולדגור בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. הקש בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים מהשטח.
  6. הוסף 8.5 מ"ל DMEM טרי לבקבוק. השעו וערבבו תאים עם פיפטה סרולוגית עד שכל האגרגטים התפרקו על ידי שאיפה למעלה ולמטה.
  7. אסוף 9 מ"ל של תרחיף תאים לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל.
    1. הוסף 9 מ"ל DMEM טרי לבקבוק והנח אותו בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2
  8. בעזרת המוציטומטר, מערבבים 10 מיקרוליטר של תאים תלויים עם 10 מיקרוליטר של צבע כחול טריפן ביחס של 1:1 כדי לחשב את ריכוז התאים. השתמש בערך זה כדי להכין מספיק תאים לזריעה על הצלחת.
  9. זרע ~ 35,000 תאים ב -100 מיקרוליטר לכל באר של צלחת תחתונה זכוכית שחורה #1.5 בעלת ביצועים גבוהים עם 96 בארות ומניח בחממה ב -37 מעלות צלזיוס ו -5% CO2 למשך 24 שעות.

2. אופטימיזציה של טרנספקציה 2pLACE

  1. עבור באר אחת ו-10% עודף, יש להוציא 11 מיקרוליטר של DMEM חם ללא סרום (SFM) לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  2. שימוש ב-CRY2-eGFP: יחסי מסת פלסמיד CIBN-gRNA שווים ל-1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7: 3, 8:2 ו-9:1, כ-110 ננוגרם עבור כל באר של סך ה-DNA ל-aliquots של SFM (טבלה 1).
  3. כבקרה חיובית, ציטט את אותה מסה של פלסמיד CMV-eGFP למחירי SFM שונים.
  4. עבור כל באר, יש להקצות 11 מיקרוליטר של SFM לדילול מגיב טרנספקציה.
  5. הכן את מגיב הטרנספקציה ביחס של 1:3 מסה (מיקרוגרם) לנפח (μL) של DNA ומגיב טרנספקציה.
  6. הוסף ריאגנט טרנספקציה מדולל ל-DNA המדולל ודגר במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את מתחמי הטרנספקציה.
  7. הוסף ~20 מיקרוליטר של קומפלקס הטרנספקציה לכל באר. ודא שהוא לא נוגע בקירות הבאר.
  8. עוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום ומניחים אותה בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות.

3. הפעלת 2pLACE

  1. שנה את קוד הקלט של המיקרו-בקר כדי להאיר את הבארות הרצויות באמצעות הגדרות אלה (קובץ קידוד משלים 1, שורות 147 - 158).
    1. עוצמת LED: 9.27 mW/cm2 (קובץ קידוד משלים 1, שורות 200 - 215).
    2. אורך דופק: 1 שניות (קובץ קידוד משלים 1, שורות 280 - 290).
    3. תדר דופק: 0.067 הרץ (כל 15 שניות) (קובץ קידוד משלים 1, שורות 264 - 278).
      הערה: הגדרות אורך הגל נקבעות לפי סוגי נוריות ה-LED המותקנות.
  2. רססו את המכסה המודפס בתלת מימד של ה-OptoPlate ב-70% אתנול ותנו לו להתייבש בארון בטיחות ביולוגית.
  3. הדליקו מנורת אור אדומה בחדר חושך והניחו את צלחת 96 הבארות בארון בטיחות ביולוגית, והחליפו את המכסה במכסה המודפס בתלת מימד מיובש.
    הערה: ניתן להציג את תאי CMV-eGFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה.
  4. קח את צלחת 96 הבארות והנח אותה על מערך ה-LED כדי לבנות את מנגנון מערך ה-LED. ודא שהצלחת נצמדת למקומה.
  5. חבר את יציאות המיקרו-בקר, ה-LED והמאוורר למקור מתח.
  6. מרססים בזהירות חוטים עם 70% אתנול ומנגבים יבשים.
  7. הנח את מנגנון מערך ה-LED בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות. ודא שהנוריות נדלקות כמתוכנן ושהחוטים אינם מתוחים כאשר החממה אטומה.

4. הכנת ציטומטריית זרימה

  1. בסביבה של אור אדום, הוצא את ה-OptoPlate והנח את הצלחת בארון בטיחות ביולוגית
    הערה: ניתן להציג את התאים באופן אופציונלי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר חזותית את השראת האור.
  2. שאפו בזהירות את כל המדיה מכל באר.
  3. נתק את התאים באמצעות 30 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין-EDTA ודגר למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
  4. מערבבים כל באר עם מאגר FACS קר של 100 מיקרוליטר (1% FBS ב-PBS) עד לקבלת תא יחיד.
  5. מעבירים כל דגימה לצלחת V-bottom של 96 בארות.
  6. צנטריפוגה את צלחת 96 בארות ה-V התחתונה ב-164 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. שאפו 80 מיקרוליטר של סופרנטנט מבלי להפריע לגלולה.
  8. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר FACS קר כדי להשעות מחדש את הגלולה.
  9. עטפו את צלחת 96 בארות ה-V התחתונה בנייר אלומיניום לבידוד קל.
  10. מניחים את הצלחת בקופסת קלקר עם קרח להובלה.

5. שער ציטומטריית זרימה ואיסוף נתונים

  1. הפעל את ציטומטר הזרימה באמצעות המתג מאחור, ופתח את תוכנת ציטומטריית הזרימה המתאימה במחשב.
  2. הפעל את תוכנית אתחול המערכת וטען 2 מ"ל של מים DI במעמיס הדגימה (איור משלים 1A).
  3. הפעל בקרת איכות (QC) באמצעות חרוזי ה-QC המסופקים (איור משלים 1B).
  4. ודא שציטומטר הזרימה נמצא במצב דגימת צלחת (איור משלים 1C).
  5. הגדר וציין בארות לדוגמה (איור משלים 1D).
  6. צור את עלילות הפיזור והטבלאות הבאות (איור משלים 2A).
    1. פיזור צדדי (SSC-A) לעומת פיזור קדימה (FSC-A).
    2. SSC-H לעומת SSC-A.
    3. SSC-A לעומת FITC-A.
    4. טבלת סטטיסטיקה של FITC-A (איור משלים 2B).
  7. הצמד את צלחת ה-V התחתונה לתוך טוען הצלחות של הציטומטר.
  8. בחר באר לא מועברת ולחץ על אתחול ולאחר מכן לחץ על הפעלה.ודא שקצב דגימת הנפח הוא 10 μL/min (איור משלים 2C).
  9. התאם את מתחי SSC ו-FITC כדי לרכז את אוכלוסיית העניין בתרשים SSC-A לעומת FSC-A (איור משלים 2C).
    1. צור מצולע כדי לשער את אוכלוסיית התאים הבריאה המעניינת (איור משלים 2D).
    2. צור מצולע לשער להבחנה כפולה בחלקת SSC-H לעומת SSC-A.
    3. כוונן את מתח ה-FITC כדי למקם תאים לא מועברים משמאל לתרשים SSC-A לעומת FITC-A (איור משלים 2D).
  10. חזור על הפעולה עבור הבארות הנותרות שלא עברו העברה ורשום נתוני FITC-A ממוצעים.
  11. בחר באר CMV-eGFP שעברה טרנספטציה ולחץ על הפעל.
  12. התאם את מתח ה-FITC כדי ללכוד הן תאי פלואורסצינג אוטומטי והן תאי פלואורסצציה בעלילת SSC-A לעומת FITC-A.
    1. צור מצולע כדי לשער את התאים הפלואורסצנטיים כנגד התאים שאינם פלואורסצנטיים תוך התייחסות לשער ההתחלתי בתאים לא מועברים (איור משלים 2E).
  13. תיעוד אוטומטי של דגימות ב-60 מיקרוליטר לדקה עד שהגיעו ל-200 שניות ו/או האירועים הגיעו ל-10,000 (איור משלים 2F).
  14. ייצא את Mean FITC כקובץ CSV ונתח את הנתונים.
  15. נקה את ציטומטר הזרימה באמצעות אפשרות הניקוי היומי (איור משלים 2G).

6. אופטימיזציה של עוצמת LED

  1. ערוך את סקריפט המיקרו-בקר כדי לבדוק את עוצמות ה-LED הרצויות (קידוד משלים file 1, שורות 200-215).
    הערה: עוצמות LED שוות ערך ביחס לערכים בסקריפט המיקרו-בקר מדווחות במקום אחר38. ייתכן שיהיה צורך בכיול עצמי בעת שימוש בנורות LED שונות.
  2. ודא שקובץ ה- Script מכיל את הערכים הבאים ב- (קובץ קידוד משלים 1, שורות 200-215) כפי שתוכנן בטבלה 2, והעלה את הקוד למיקרו-בקר.
  3. חזור על שלבים 1-5.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוך אימוץ אלמנטים של זרימת עבודה מהספרות הקודמת 37,38,55, הוספנו תאורה בו-זמנית בתפוקה גבוהה מה-OptoPlate-96 והדגמנו צינור לאופטימיזציה מהירה של מערכת ביטוי גנים הניתנת להשראת אור בתאי יונקים (איור 1).

עבור מערכות ביטוי גנים הניתנות להשראה, טווחים דינמיים גבוהים הם סמן ביצועים קריטי, בנוסף לביטוי מוחלט להפעלה וכיבוי (דולף). באמצעות דימות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים את הבקרה האופטוגנטית של ביטוי גנים חולף רב-רכיבי בתאי יונקים, ומאפשר לחוקרים אחרים לאפיין במהירות ובמקביל מערכות אופטוגנטיות מודולריות עם מדווח פלואורסצנטי.

במקרה זה, מערכת השראת אור דו-פלסמידית עברה אופטימיזציה לביטוי eGFP בתאי HEK293T. להעברה משותפת מוצלחת, חיוני לייעל את צפיפות הזריעה ויחסי המסה ליעילות הטרנספקציה הגבוהה ביותר. זה חיוני במיוחד כאשר מיישמים זאת בתרבית תאי גזע, שבה מפגש יכול לגרום להתמיינות 62,63,64 ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי המכון למחקר תרגומי באמצעות הסכם שיתוף פעולה של נאס"א NNX16AO69A ועל ידי מכון Good Foods. פרויקט זה נתמך על ידי מעבדת המשאבים המשותפים לציטומטריית זרימה באוניברסיטת קליפורניה בדייוויס בסיוע טכני של ברידג'ט מקלפלין, ג'ונתן ואן דייק ואשלי קראג'ה, במימון NCI P30 CA093373 (מרכז הסרטן המקיף) ו-S10OD018223 (ציטומטר "ציטופלקס" של בקמן קולטר).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לVWR10025-724
מאגרי ריאגנט של 10 מ"לVWR77395-252
פיפטות סרולוגיות 10 מ"לVWR75816-100
1000 & mu; קצות פילטר LVWR76322-154
15 מ"ל  צינורות צנטריפוגה בעלי ביצועים גבוהים, פקק שטוחVWR89039-664
מד הספק אופטי 1931-Cניופורט1931-C
פיפטות סרולוגיות של 2 מ"לVWR75816-104
20 & mu; קצות פילטר LVWR76322-134
200 & mu; קצות פילטר LVWR76322-150
צינורות צנטריפוגה בעלי ביצועים גבוהים בנפח 50 מ"ל, מכסה שטוחVWR89039-656
לוחות V-bottom עם 96 בארותלוחות מותג781661
A21, נורת LED אדומהנורות בלוקסלא זמיןמקור אור אדום
תוכנת Arduino IDEארדואינולא זמין
ארון בטיחות ביולוגית, מחלקה IINuAireלא זמין
המוציטומטר קווי בהירהאוסר סיינטיפיק3110
שקופיות ספירת תאיםBioRad1450016
לוח תרבית תאים 96-באר, לוח תחתית זכוכית #1.5HסלביסP96-1.5H-N
תוכנת CytExpertבקמן קולטרלא זמין
CytoFLEX מוכנים לשימוש יומיומי ב-QC פלואורוספירותבקמן קולטרC657194 & דרגה C
ציטומטר זרימה CytoFLEX-S (4 סגול, 2 כחול, 4 צהוב ירוק, 3 תעלות אדומות)בקמן קולטרC09766
אבקת מלח עם בופר פוספט של Dulbecco, ללא קליקום, ללא מגנזיוםפישר סיינטיפיק21600069טמפרטורת החדר
צנטריפוגה אפנדורף 5804אפנדורף  022622501שלב צנטריפוגה עם פלטת V תחתית
צנטריפוגה אפנדורף 5810Rאפנדורף22625501
Eppendorf Research פלוס, 8 ערוצים, נפח משתנה, 30 - 300 & mu; Lאפנדורף3125000052
Eppendorf Research פלוס, ערוץ יחיד, נפח משתנה, 100 - 1000 & mu; Lאפנדורף3123000063
Eppendorf Research פלוס, ערוץ יחיד, נפח משתנה, 2 - 20 & mu; Lאפנדורף3123000039
Eppendorf Research פלוס, ערוץ יחיד, נפח משתנה, 20 - 200 & mu; Lאפנדורף3123000055
סרט תיוג מעבדה כלליVWR89097-920
Gibco DMEM, אבקה, סוכר גבוהפישר סיינטיפיק121000614 & דרגה C
תמיסת Gibco Trypan Blue, 0.4%פישר סיינטיפיק15-250-061טמפרטורת החדר
FBS מושבתת Gibco Value Heatפישר סיינטיפיקA5256901-20 & דרגה C
Gibco, Trypsin-EDTA (0.05%), עם EDTA, Animal Origin, 1X, פנול אדום, 500 מ"לגיבקו25300062-20 & דרגה C
HEK293T תאיםATCCCRL-11268-80 ו-deg; C, חנקן נוזלי
סמני מעבדה, MicronovaVWR89205-944
מנורת שולחן מתכתיתעיצובים פשוטיםלא זמיןמנורה לאור אדום
OptoPlate-96LABmakerלא זמין
XP פיפט-איידדרומונד4-000-101
פלסמיד: CIBN-gRNAלא זמיןלא זמין-20 & דרגה C
פלסמיד: CMV-eGFPלא זמיןלא זמין-20 & דרגה C
פלסמיד: CRY2-eGFPלא זמיןלא זמין-20 & דרגה C
תגובת DNA פוליג'ט במבחנהפישר סיינטיפיקNC15361174 & דרגה C
בקבוק תרבית תאים T-75VWR10062-860
חממה CO2 עם מעטפת מיםVWR10810-884

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poulain, A., Perret, S., Malenfant, F., Mullick, A., Massie, B., Durocher, Y. Rapid protein production from stable CHO cell pools using plasmid vector and the cumate gene-switch. J Biotechnol. 255, 16-27 (2017).
  2. Li, Y., et al. A cross-species inducible system for enhanced protein expression and multiplexed metabolic pathway fine-tuning in bacteria. Nucleic Acids Res. 53 (2), gkae1315(2025).
  3. De Baets, J., De Paepe, B., De Mey, M. Delaying production with prokaryotic inducible expression systems. Microb Cell Fact. 23, 249(2024).
  4. Wang, J., et al. Design and characterization of allantoin-inducible expression systems in budding yeast. Biotechnol Biofuels Bioprod. 18 (1), 26(2025).
  5. De Carluccio, G., Fusco, V., di Bernardo, D. Engineering a synthetic gene circuit for high-performance inducible expression in mammalian systems. Nat Commun. 15 (1), 3311(2024).
  6. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  7. Bibek, G. C., Zhou, P., Naha, A., Gu, J., Wu, C. Development of a xylose-inducible promoter and riboswitch combination system for manipulating gene expression in Fusobacterium nucleatum. Appl Environ Microbiol. 89 (9), e00667-e00723 (2023).
  8. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  9. Villegas, L. D., et al. Generation of three isogenic gene-edited Huntington's disease human embryonic stem cell lines with DOX-inducible NGN2 expression cassette in the AAVS1 safe locus. Stem Cell Res. 77, 103408(2024).
  10. Lange, L., et al. Inducible forward programming of human pluripotent stem cells to hemato-endothelial progenitor cells with hematopoietic progenitor potential. Stem Cell Rep. 14 (1), 122-137 (2020).
  11. Gupta, S., Schoer, R. A., Egan, J. E., Hannon, G. J., Mittal, V. Inducible, reversible, and stable RNA interference in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (7), 1927-1932 (2004).
  12. Beyer, H. M., et al. Genetically-stable engineered optogenetic gene switches modulate spatial cell morphogenesis in two- and three-dimensional tissue cultures. Nat Commun. 15 (1), 10470(2024).
  13. Lee, S. H., Hu, Y., Chou, A., Chen, J., Gonzalez, R. Metabolic flux optimization of iterative pathways through orthogonal gene expression control: application to the β-oxidation reversal. Metab Eng. 82, 262-273 (2024).
  14. Lan, M. S., Wang, H. W., Chong, J., Breslin, M. B. Coupling of glucose response element from L-type pyruvate kinase and G6Pase promoter enhances glucose-responsive activity in hepatoma cells. Mol Cell Biochem. 300 (1), 191-196 (2007).
  15. Zhang, J., Liu, Y. J., Cui, G. Z., Cui, Q. A novel arabinose-inducible genetic operation system developed for Clostridium cellulolyticum. Biotechnol Biofuels. 8 (1), 36(2015).
  16. Mukherjee, P., Sivaprakasam, S. Engineering the D-lactic acid responsive promoter/repressor system as dynamic metabolic engineering tool in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus for controlled D-lactic acid biosynthesis. Enzyme Microb Technol. 185, 110606(2025).
  17. Sathesh-Prabu, C., Tiwari, R., Kim, D., Lee, S. K. Inducible and tunable gene expression systems for Pseudomonas putida KT2440. Sci Rep. 11 (1), 18079(2021).
  18. Banerjee, A., Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., Lovley, D. R. Lactose-inducible system for metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii. Appl Environ Microbiol. 80 (8), 2410-2416 (2014).
  19. Stout, A. J., et al. Engineered autocrine signaling eliminates muscle cell FGF2 requirements for cultured meat production. Cell Rep Sustain. 1 (1), 100009(2024).
  20. Shahini, A., et al. NANOG restores the impaired myogenic differentiation potential of skeletal myoblasts after multiple population doublings. Stem Cell Res. 26, 55-66 (2018).
  21. Torres, M., et al. Engineering mammalian cell growth dynamics for biomanufacturing. Metab Eng. 82, 89-99 (2024).
  22. Shupe, J., Zhang, A., Odenwelder, D. C., Dobrowsky, T. Gene therapy: Challenges in cell culture scale-up. Curr Opin Biotechnol. 75, 102721(2022).
  23. Siddiqui, M., Tous, C., Wong, W. W. Small molecule-inducible gene regulatory systems in mammalian cells: progress and design principles. Curr Opin Biotechnol. 78, 102823(2022).
  24. Minami, S. A., Garimella, S. S., Shah, P. S. Computational evaluation of light propagation in cylindrical bioreactors for optogenetic mammalian cell cultures. Biotechnol J. 19 (1), 2300071(2024).
  25. Das, M., Maiti, S. K. Employment of light-inducible promoter in genetically engineered cyanobacteria for photosynthetic isobutanol production with simulated diurnal sunlight and CO2. J Biotechnol. 393, 31-40 (2024).
  26. Borella, L., Sforza, E., Bertucco, A. An internally LED illuminated photobioreactor to increase energy conversion efficiency: design and operation. Energy Convers Manag. 270, 116224(2022).
  27. Choi, S. Y., et al. Scalable cultivation of engineered cyanobacteria for squalene production from industrial flue gas in a closed photobioreactor. J Agric Food Chem. 68 (37), 10050-10055 (2020).
  28. Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnol Bioeng. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  29. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  30. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  31. Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 41 (7), e77(2013).
  32. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  33. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  34. Müller, K., Naumann, S., Weber, W., Zurbriggen, M. D. Optogenetics for gene expression in mammalian cells. Biol Chem. 396 (2), 145-152 (2015).
  35. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  36. Qiao, L., et al. A sensitive red/far-red photoswitch for controllable gene therapy in mouse models of metabolic diseases. Nat Commun. 15, 10310(2024).
  37. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nat Chem Biol. 11 (3), 198-200 (2015).
  38. Garimella, S. S., et al. A simplified two-plasmid system for orthogonal control of mammalian gene expression using light-activated CRISPR effector. BMC Biotechnol. 25 (1), 58(2025).
  39. Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nat Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
  40. Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nat Chem Biol. 13 (6), 633-639 (2017).
  41. Chatelle, C., et al. A green-light-responsive system for the control of transgene expression in mammalian and plant cells. ACS Synth Biol. 7 (5), 1349-1358 (2018).
  42. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  43. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  44. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  45. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).
  46. Kaberniuk, A. A., Baloban, M., Monakhov, M. V., Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Single-component near-infrared optogenetic systems for gene transcription regulation. Nat Commun. 12 (1), 3859(2021).
  47. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  48. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  49. Tak, Y. E., et al. Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors. Nat Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).
  50. Varma, S., Gulati, K. A., Sriramakrishnan, J., Ganla, R. K., Raval, R. Environment signal dependent biocontainment systems for engineered organisms: Leveraging triggered responses and combinatorial systems. Synth Syst Biotechnol. 10 (2), 356-364 (2025).
  51. Chen, X., Li, T., Wang, X., Yang, Y. A light-switchable bidirectional expression module allowing simultaneous regulation of multiple genes. Biochem Biophys Res Commun. 465 (4), 769-776 (2015).
  52. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  53. Muench, P., et al. A modular toolbox for the optogenetic deactivation of transcription. Nucleic Acids Res. 53 (3), gkae1237(2025).
  54. Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells. J Vis Exp. (173), e62109(2021).
  55. Minami, S. A., Shah, P. S. Transient light-activated gene expression in Chinese hamster ovary cells. BMC Biotechnol. 21 (1), 13(2021).
  56. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  57. Chen, S. Y., et al. Optogenetic control reveals differential promoter interpretation of transcription factor nuclear translocation dynamics. Cell Syst. 11 (4), 336-353.e24 (2020).
  58. Meyer, K., Lammers, N. C., Bugaj, L. J., Garcia, H. G., Weiner, O. D. Optogenetic control of YAP reveals a dynamic communication code for stem cell fate and proliferation. Nat Commun. 14 (1), 6929(2023).
  59. Benman, W., et al. A temperature-inducible protein module for control of mammalian cell fate. Nat Methods. 22 (3), 539-549 (2025).
  60. Stadinski, B. D., Huseby, E. S. How to prevent yourself from seeing double. Cytometry A. 97 (11), 1102-1104 (2020).
  61. Merah-Mourah, F., Cohen, S. O., Haziot, A. A two-stage flow cytometry strategy to distinguish single cells from doublets in heterogeneous cell mixtures and improve cell cluster identification: Application to human monocyte subpopulations. Curr Protoc. 1 (8), e229(2021).
  62. Cheng, Y. S., et al. A protocol for culture and characterization of human induced pluripotent stem cells after induction. Curr Protoc. 3 (8), e866(2023).
  63. Wu, S. H., Liao, Y. T., Huang, C. H., Chen, Y. C., Chiang, E. R., Wang, J. P. Comparison of the confluence-initiated neurogenic differentiation tendency of adipose-derived and bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biomedicines. 9 (11), 1503(2021).
  64. Yang, B., Cao, L., Liu, B., McCaig, C. D., Pu, J. The transition from proliferation to differentiation in colorectal cancer is regulated by the calcium activated chloride channel A1. PLoS One. 8 (4), e60861(2013).
  65. Chua, K. H., et al. Effects of serum reduction and VEGF supplementation on angiogenic potential of human adipose stromal cells in vitro. Cell Prolif. 46 (3), 300-311 (2013).
  66. Messmer, T., et al. A serum-free media formulation for cultured meat production supports bovine satellite cell differentiation in the absence of serum starvation. Nat Food. 3 (1), 74-85 (2022).
  67. Li, V. C., Kirschner, M. W. Molecular ties between the cell cycle and differentiation in embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (26), 9503-9508 (2014).
  68. Binder, B. Y. K., Sagun, J. E., Leach, J. K. Reduced serum and hypoxic culture conditions enhance the osteogenic potential of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 11 (3), 387-393 (2015).
  69. Vincent, R. K., Odorico, J. S. Reduced serum concentration is permissive for increased in vitro endocrine differentiation from murine embryonic stem cells. Differentiation. 78 (1), 24-34 (2009).
  70. An-adirekkun, J., et al. A yeast optogenetic toolkit (yOTK) for gene expression control in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Bioeng. 117 (3), 886-893 (2020).
  71. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  72. Hashemi, A., et al. Optimization of transfection methods for Huh-7 and Vero cells: a comparative study. Cytol Genet. 46 (6), 347-353 (2012).
  73. Nihongaki, Y., Kawano, F., Nakajima, T., Sato, M. Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing. Nat Biotechnol. 33 (7), 755-760 (2015).
  74. Jayaraman, P., Devarajan, K., Chua, T. K., Zhang, H., Gunawan, E., Poh, C. L. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6994-7005 (2016).
  75. Nicoletti, I., Migliorati, G., Pagliacci, M. C., Grignani, F., Riccardi, C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods. 139 (2), 271-279 (1991).
  76. Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nat Protoc. 1 (3), 1458-1461 (2006).
  77. Choi, S., et al. Protective effect of melatonin against blue light-induced cell damage via the TRPV1-YAP pathway in cultured human epidermal keratinocytes. Biofactors. 51 (2), e70015(2025).
  78. Alghamdi, R. A., Exposito-Rodriguez, M., Mullineaux, P. M., Brooke, G. N., Laissue, P. P. Assessing phototoxicity in a mammalian cell line: How low levels of blue light affect motility in PC3 cells. Front Cell Dev Biol. 9, 738786(2021).
  79. Yokoi, Y., et al. Potential consequences of phototoxicity on cell function during live imaging of intestinal organoids. PLoS One. 19 (11), e0313213(2024).
  80. Flores-Ibarra, A., et al. Light-oxygen-voltage (LOV)-sensing domains: activation mechanism and optogenetic stimulation. J Mol Biol. 436 (5), 168356(2024).
  81. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  82. Lan, T. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends Genet. 38 (12), 1253-1270 (2022).
  83. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPRthroughputHEK293T

מאמרים קשורים