אופטימיזציה מהירה של מערכת השראת אור לשליטה בביטוי גנים של יונקים

כלים של ביולוגיה סינתטית כגון מערכות ביטוי גנים הניתנות להשראה סיפקו תרומות משמעותיות למחקר הביולוגי. יכולתם לווסת את ביטוי הגנים בצורה מתכווננת, הפיכה ומדויקת יכולה לשפר את השליטה בייצור החלבון 1,2,3,4,5,6, מורפולוגיה של התא ^{7,8,9,10,11,12}, מסלולים מטבוליים 13,14,15^,16,17,18, ויעדים אחרים לייצור ביולוגי ויישומים טיפוליים. למערכות כימיות הניתנות להשראה יכולות להיות השפעות שיוריות^{של 19,20} או מחוץ למטרה. תוספים כימיים יכולים להיות גם יקרים מאוד וקשים להגדלה תעשייתית עקב תהליכי טיהור נוספים במורד הזרם 21,22,23. מערכות ביטוי גנים הניתנות להשראת אור יכולות להציע שיטה ניתנת להרחבה ומדויקת לשיטות ייצור ביולוגי 24,25,26,27.

מערכות ביטוי גנים רבות הניתנות להשראת אור פותחו ככלים שימושיים לביולוגיה סינתטית במגוון יישומים 28,29,30,31,32,33,34,35,36 ואורכי גל של כחול 35,37,38, אדום/אדום רחוק ^12,39,⁴⁰, או אור ירוק⁴¹. במקרה של ויסות גנים אופטוגנטיים מבוססי CRISPR, שינוי כמות ה-RNA המנחה הבודד (gRNAs) המועברים יכול להשפיע על ביטוי ה-mRNA של גנים אנדוגניים⁴², ויהיה צורך לבצע אופטימיזציה עבור קווי תאים שונים. ניתן להשתמש גם בחלבוני טרנסאקטיביות כגון VP64 37,42,43,44^, VP16 39,40,44,45,46, p65⁴⁴, או היתוך שלהם 47, מה שמגדיל את המודולריות של מערכות אופטוגנטיות. על מנת לחקור מסלולים ביולוגיים מורכבים ושזורים זה בזה 12,40,48,49,50,51,52,53, ניתן לבדוק שילובים שונים של רכיבים ידועים אלה. בנוסף, קווי תאים שונים יכולים להראות הבדלים באינדוקציה עם אותה מערכת⁵². רמות אינדוקציה שונות עלולות להוביל לביטוי גנים לא מספיק או לרגישות בבקרה המדויקת של ביטוי הגנים, מה שדורש בדיקות קפדניות כדי למצוא מערכת אופטוגנטית אופטימלית בקווי תאים חדשים או רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית. עם קצב הולך וגדל והישימות המתרחבת של ויסות גנים אופטוגנטיים, הכרחי לאפיין במהירות את המערכות השונות הללו.

השיטות הנוכחיות לאפיון כלים אופטוגנטיים משתמשות בביטוי יציב או חולף של גנים^12,54. יצירת קווי תאים בעלי ביטוי יציב ואופטימיזציה של דינמיקת המערכת לביטוי מקסימלי יכולה להיות גוזלת זמן ולכן יקרה. ביטוי חולף מאפשר תובנות מהירות ובעלות ערך, במיוחד בעת בדיקת מערכות אופטוגנטיות מרובות רכיבים. כאן, השתמשנו במערכת אפקטור CRISPR-dCas9 (LACE)³⁷ המופעלת באור כחול, המורכבת מקריפטוכרום 2 (CRY2) ומסוף N בסיסי (CIBN). הוא שימש לשליטה בביטוי גנים בתאי יונקים כגון HEK293T (תאי כליה עובריים אנושיים)^37,38, CHO-DG44 (תאי שחלה של אוגר סיני)⁵⁵ ו-C2C12 (תאי מיובלסט של עכבר)³⁸. האופי המודולרי שלו אידיאלי לאפיון מהיר של ביצועי המערכת באמצעות ביטוי טרנזיינטי ושיטות תפוקה גבוהה. לדוגמה, מערכות מרובות רכיבים כמו LACE עשויות להזדקק לאופטימיזציה של יחסי מסה כדי לשפר את האינדוקציה, צעד שאינו משמש בדרך כלל באפיון מערכת אופטוגנטית.

פרוטוקול זה מפרט את האופטימיזציה והאפיון המהירים של שתי מערכות פלסמיד LACE (2pLACE)³⁸. במערך זה, 2pLACE שולט בביטוי של מדווח פלואורסצנטי, eGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר), בתאי HEK293T. ההפעלה מתבצעת בלוחות זכוכית שחורים עם תחתית 96 בארות באמצעות OptoPlate-96, מערך LED מודפס בתלת מימד שתוכנן ונבנה על ידי לוקאס בוגאי ועמיתיו 56,57,58,59. פרוטוקול זה מייעל באופן ספציפי את הביטוי המקסימלי עם יחסי מסה שונים של מערכת שני הפלסמידים. הוא כולל גם קוד ידידותי למשתמש לשליטה בעוצמות אור שונות כדי לחקור את כוונון המערכת ואת הטווח הדינמי המלא שלה. ציטומטריית זרימה משמשת לאיסוף וניתוח נתונים. פרוטוקולים ליצירת מבני פלסמיד וחומרי הדפסת תלת מימד עבור מערך ה-LED ניתן למצוא בפרסומים קודמים^54,56. שיטות אלו מדגישות צינור מהיר ובעל תפוקה גבוהה לאפיון מערכות ביטוי גנים הניתנות להשראת אור.

1. ציפוי תאים HEK293T בפורמט של 96 בארות

1. בארון בטיחות ביולוגית, אספו מיכל פסולת אקונומיקה, פיפטות סרולוגיות, עזר פיפטה, תמיסת מלח פוספט (DPBS) של Dulbecco, מדיום נשר שעבר שינוי של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), ובקבוק תרבית תאים T-75 עם תאי HEK293T מתלכדים. מחממים את המדיה ל-37 מעלות צלזיוס.
2. בבקבוק T-75, בדוק שהמפגש הוא כ-80%-100% מתכנס באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
3. בארון הבטיחות הביולוגית, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי לשאוב את המדיה המושקעת מבקבוק תרבית התא. הימנע מלגעת במשטח או בפלסטיק של הבקבוק. השלך את המדיה המושקעת והשואב למיכל הפסולת.
4. שטפו בעדינות את התאים עם כ -10 מ"ל DPBS על ידי שאיפתו לפינת הבקבוק וסיבובו בעדינות סביב פני השטח. שאפו את ה-DPBS מהבקבוק והשליכו את הכביסה והשואב למיכל הפסולת.
5. הוסף 1.5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA כדי לכסות את פני הבקבוק ולדגור בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. הקש בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים מהשטח.
6. הוסף 8.5 מ"ל DMEM טרי לבקבוק. השעו וערבבו תאים עם פיפטה סרולוגית עד שכל האגרגטים התפרקו על ידי שאיפה למעלה ולמטה.
7. אסוף 9 מ"ל של תרחיף תאים לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל.
   1. הוסף 9 מ"ל DMEM טרי לבקבוק והנח אותו בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂
8. בעזרת המוציטומטר, מערבבים 10 מיקרוליטר של תאים תלויים עם 10 מיקרוליטר של צבע כחול טריפן ביחס של 1:1 כדי לחשב את ריכוז התאים. השתמש בערך זה כדי להכין מספיק תאים לזריעה על הצלחת.
9. זרע ~ 35,000 תאים ב -100 מיקרוליטר לכל באר של צלחת תחתונה זכוכית שחורה #1.5 בעלת ביצועים גבוהים עם 96 בארות ומניח בחממה ב -37 מעלות צלזיוס ו -5% CO₂ למשך 24 שעות.

2. אופטימיזציה של טרנספקציה 2pLACE

1. עבור באר אחת ו-10% עודף, יש להוציא 11 מיקרוליטר של DMEM חם ללא סרום (SFM) לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
2. שימוש ב-CRY2-eGFP: יחסי מסת פלסמיד CIBN-gRNA שווים ל-1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7: 3, 8:2 ו-9:1, כ-110 ננוגרם עבור כל באר של סך ה-DNA ל-aliquots של SFM (טבלה 1).
3. כבקרה חיובית, ציטט את אותה מסה של פלסמיד CMV-eGFP למחירי SFM שונים.
4. עבור כל באר, יש להקצות 11 מיקרוליטר של SFM לדילול מגיב טרנספקציה.
5. הכן את מגיב הטרנספקציה ביחס של 1:3 מסה (מיקרוגרם) לנפח (μL) של DNA ומגיב טרנספקציה.
6. הוסף ריאגנט טרנספקציה מדולל ל-DNA המדולל ודגר במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את מתחמי הטרנספקציה.
7. הוסף ~20 מיקרוליטר של קומפלקס הטרנספקציה לכל באר. ודא שהוא לא נוגע בקירות הבאר.
8. עוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום ומניחים אותה בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 24 שעות.

3. הפעלת 2pLACE

1. שנה את קוד הקלט של המיקרו-בקר כדי להאיר את הבארות הרצויות באמצעות הגדרות אלה (קובץ קידוד משלים 1, שורות 147 - 158).
   1. עוצמת LED: 9.27 mW/cm² (קובץ קידוד משלים 1, שורות 200 - 215).
   2. אורך דופק: 1 שניות (קובץ קידוד משלים 1, שורות 280 - 290).
   3. תדר דופק: 0.067 הרץ (כל 15 שניות) (קובץ קידוד משלים 1, שורות 264 - 278).
      הערה: הגדרות אורך הגל נקבעות לפי סוגי נוריות ה-LED המותקנות.
2. רססו את המכסה המודפס בתלת מימד של ה-OptoPlate ב-70% אתנול ותנו לו להתייבש בארון בטיחות ביולוגית.
3. הדליקו מנורת אור אדומה בחדר חושך והניחו את צלחת 96 הבארות בארון בטיחות ביולוגית, והחליפו את המכסה במכסה המודפס בתלת מימד מיובש.
   הערה: ניתן להציג את תאי CMV-eGFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה.
4. קח את צלחת 96 הבארות והנח אותה על מערך ה-LED כדי לבנות את מנגנון מערך ה-LED. ודא שהצלחת נצמדת למקומה.
5. חבר את יציאות המיקרו-בקר, ה-LED והמאוורר למקור מתח.
6. מרססים בזהירות חוטים עם 70% אתנול ומנגבים יבשים.
7. הנח את מנגנון מערך ה-LED בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 24 שעות. ודא שהנוריות נדלקות כמתוכנן ושהחוטים אינם מתוחים כאשר החממה אטומה.

4. הכנת ציטומטריית זרימה

1. בסביבה של אור אדום, הוצא את ה-OptoPlate והנח את הצלחת בארון בטיחות ביולוגית
   הערה: ניתן להציג את התאים באופן אופציונלי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר חזותית את השראת האור.
2. שאפו בזהירות את כל המדיה מכל באר.
3. נתק את התאים באמצעות 30 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין-EDTA ודגר למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
4. מערבבים כל באר עם מאגר FACS קר של 100 מיקרוליטר (1% FBS ב-PBS) עד לקבלת תא יחיד.
5. מעבירים כל דגימה לצלחת V-bottom של 96 בארות.
6. צנטריפוגה את צלחת 96 בארות ה-V התחתונה ב-164 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
7. שאפו 80 מיקרוליטר של סופרנטנט מבלי להפריע לגלולה.
8. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר FACS קר כדי להשעות מחדש את הגלולה.
9. עטפו את צלחת 96 בארות ה-V התחתונה בנייר אלומיניום לבידוד קל.
10. מניחים את הצלחת בקופסת קלקר עם קרח להובלה.

5. שער ציטומטריית זרימה ואיסוף נתונים

1. הפעל את ציטומטר הזרימה באמצעות המתג מאחור, ופתח את תוכנת ציטומטריית הזרימה המתאימה במחשב.
2. הפעל את תוכנית אתחול המערכת וטען 2 מ"ל של מים DI במעמיס הדגימה (איור משלים 1A).
3. הפעל בקרת איכות (QC) באמצעות חרוזי ה-QC המסופקים (איור משלים 1B).
4. ודא שציטומטר הזרימה נמצא במצב דגימת צלחת (איור משלים 1C).
5. הגדר וציין בארות לדוגמה (איור משלים 1D).
6. צור את עלילות הפיזור והטבלאות הבאות (איור משלים 2A).
   1. פיזור צדדי (SSC-A) לעומת פיזור קדימה (FSC-A).
   2. SSC-H לעומת SSC-A.
   3. SSC-A לעומת FITC-A.
   4. טבלת סטטיסטיקה של FITC-A (איור משלים 2B).
7. הצמד את צלחת ה-V התחתונה לתוך טוען הצלחות של הציטומטר.
8. בחר באר לא מועברת ולחץ על אתחול ולאחר מכן לחץ על הפעלה.ודא שקצב דגימת הנפח הוא 10 μL/min (איור משלים 2C).
9. התאם את מתחי SSC ו-FITC כדי לרכז את אוכלוסיית העניין בתרשים SSC-A לעומת FSC-A (איור משלים 2C).
   1. צור מצולע כדי לשער את אוכלוסיית התאים הבריאה המעניינת (איור משלים 2D).
   2. צור מצולע לשער להבחנה כפולה בחלקת SSC-H לעומת SSC-A.
   3. כוונן את מתח ה-FITC כדי למקם תאים לא מועברים משמאל לתרשים SSC-A לעומת FITC-A (איור משלים 2D).
10. חזור על הפעולה עבור הבארות הנותרות שלא עברו העברה ורשום נתוני FITC-A ממוצעים.
11. בחר באר CMV-eGFP שעברה טרנספטציה ולחץ על הפעל.
12. התאם את מתח ה-FITC כדי ללכוד הן תאי פלואורסצינג אוטומטי והן תאי פלואורסצציה בעלילת SSC-A לעומת FITC-A.
    1. צור מצולע כדי לשער את התאים הפלואורסצנטיים כנגד התאים שאינם פלואורסצנטיים תוך התייחסות לשער ההתחלתי בתאים לא מועברים (איור משלים 2E).
13. תיעוד אוטומטי של דגימות ב-60 מיקרוליטר לדקה עד שהגיעו ל-200 שניות ו/או האירועים הגיעו ל-10,000 (איור משלים 2F).
14. ייצא את Mean FITC כקובץ CSV ונתח את הנתונים.
15. נקה את ציטומטר הזרימה באמצעות אפשרות הניקוי היומי (איור משלים 2G).

6. אופטימיזציה של עוצמת LED

1. ערוך את סקריפט המיקרו-בקר כדי לבדוק את עוצמות ה-LED הרצויות (קידוד משלים file 1, שורות 200-215).
   הערה: עוצמות LED שוות ערך ביחס לערכים בסקריפט המיקרו-בקר מדווחות במקום אחר³⁸. ייתכן שיהיה צורך בכיול עצמי בעת שימוש בנורות LED שונות.
2. ודא שקובץ ה- Script מכיל את הערכים הבאים ב- (קובץ קידוד משלים 1, שורות 200-215) כפי שתוכנן בטבלה 2, והעלה את הקוד למיקרו-בקר.
3. חזור על שלבים 1-5.

תוך אימוץ אלמנטים של זרימת עבודה מהספרות הקודמת 37,38,55, הוספנו תאורה בו-זמנית בתפוקה גבוהה מה-OptoPlate-96 והדגמנו צינור לאופטימיזציה מהירה של מערכת ביטוי גנים הניתנת להשראת אור בתאי יונקים (איור 1).

עבור מערכות ביטוי גנים הניתנות להשראה, טווחים דינמיים גבוהים הם סמן ביצועים קריטי, בנוסף לביטוי מוחלט להפעלה וכיבוי (דולף). באמצעות דימות פלואורסצנטי של תאים שעברו טרנספטציה, ניתן לראות באופן איכותי את ההבדל בביטוי eGFP בין התאים המופעלים באור לבין התאים שנשמרו בחושך (איור 2). יחס של 1:9 מביא באופן ניכר לביטוי eGFP פחות מקסימלי בהשוואה ליחס של 5:5. כמו כן, ניתן לראות כי יש דליפה מוגברת ביחס של 5:5. הדמיה פלואורסצנטית של תאים שעברו טרנספטציה של eGFP (CMV-eGFP) ותאים לא טרנספקטיביים הם בקרות חיוביות ושליליות יקרות ערך להקשר של יעילות הטרנספקציה והביטוי המושרה והדולף של המערכת, בהתאמה. שימוש בהדמיה פלואורסצנטית מאפשר למשתמשים לראות ולאמת במהירות טרנספקציה מוצלחת והפעלה של ביטוי גנים באור כחול, ומספק מחסום רב ערך לפני זרימה ציטומטרית. לאחר מכן ניתן להשתמש בזרימה ציטומטרית כדי לכמת את עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) ואת הטווח הדינמי.

לאחר הפעלת התאים באור, הם מוכנים עם מאגר FACS ומנותחים באמצעות ציטומטריית זרימה. תאי HEK293T הם בערך 11-15 מיקרומטר, וכתוצאה מכך עלייה ב-FSC של 500 ועלייה ב-SSC של 125 (איור משלים 2C) כדי למרכז את אוכלוסיות התאים הבריאות. מתחים גבוהים יותר מביאים לניתוח של פסולת במקום אוכלוסיות תאים בריאות. הריצות שלנו כוללות באופן עקבי מעל ~60% מהאירועים בשער האוכלוסייה הראשון (P1) (איור 3A-D). ברגע שאוכלוסיות התאים הבריאות מהוות את רוב האירועים בתרשים SSC-A לעומת FSC-A, ניתן גם לבדוק את צפיפות האירועים כדי לזהות את רוב האוכלוסייה (איור משלים 3A). לאחר מכן, ניתן לבצע אפליה כפולה באמצעות תרשים SSC-H לעומת SSC-A, שהוא חיוני לתוצאות אמינות וניתנות לשחזור60,61. במערכת זו, מצאנו בדרך כלל שיותר מ-95% מהאירועים הסגורים ב-P1 הם סינגלים (איור 3A-D). בתרשים SSC-A לעומת FITC-A, תאים לא טרנספטקטיים יהיו בדרך כלל לכיוון שמאל של מרכז התרשים ויהיו מגודרים כך שאוכלוסייה תהיה <0.1% (איור 3A). לאחר מכן, תאים חיוביים ל-eGFP יאכלסו את השער שהיה ריק בדגימה הלא מועברת, וכתוצאה מכך מדידות ניתוח תאים בודדים של MFI (איור 3B). לאחר איסוף הבקרות השליליות והחיוביות לקביעת שערים ומתחים מתאימים, ניתן לנתח דגימות עם 2pLACE באמצעות אותם שערים כדי להוציא באופן אמין תאים אופלואורסצנטיים (איור 3C,D). כאן, אחוז האוכלוסייה עבור תאים חיוביים ל-eGFP היה ~99% עבור CMV-eGFP ו-~57% עבור תאים שעברו טרנספטציה של 2pLACE. ניתן להשתמש בשער סופי גם בערוץ PE-A כדי להבטיח שתאים פלואורסצנטיים מאוד נלכדים (איור משלים 3B).

יחס נוסף שנבחר לבדיקה היה 3:7. כשלב אימות, תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית צולמו לפני זרימה ציטומטרית ונצפו טרנספקציה מוצלחת לאינדוקציה של ביטוי eGFP עם 2pLACE, כצפוי פחות מ-CMV-eGFP (איור 4A). לאחר איסוף נתוני זרימה ציטומטרית של 2pLACE, ניתן להשוות ביטוי גנים המופעל על ידי אור כחול עם ביטוי גנים דולף (איור 4B). באמצעות ההגדרות המפורטות בשלב 3.1, הצלחנו לראות עלייה של פי ~3 בביטוי בעקבות הפעלת אור כחול, התואמת את אות הקרינה המוגבר שנראה באופן איכותי במיקרוסקופיה. נוסף על כך, ניתן לראות בעקיפין את יעילות הטרנספקציה על ידי מדידת אחוז האוכלוסייה החיובית ל-eGFP, או אחוז ההורים, ב~60% מהתאים הבודדים הבריאים (איור 4C).

מימוש פרוטוקול זה בשלמותו יכול לזהות יחסי מסה אופטימליים (איור 5A) ועוצמות אור (איור 5B) עבור תחום דינמי מקסימלי וביטוי מתכוונן. יחסי מסה נמוכים מ-6:4 הראו טווח דינמי גדול יותר (3.5-4.5), בעוד שיחסי מסה מעבר ל-6:4 הראו ירידה בטווח הדינמי עקב רקע מוגבר וירידה בביטוי eGFP מקסימלי. הן עבור ביטוי מקסימלי והן עבור טווח דינמי גבוה, עדיף יחס של 3:7. יחסים מתחת ל-3:7 הראו אינדוקציות קיפול דומות אך היו להם פחות ביטוי מקסימלי כללי. באמצעות ערכי עוצמת האור שכוילו בעבר38 (טבלה 2), ניתן לאפיין את רמת ביטוי הגנים ביחס לעוצמות אור שונות. עוצמות האור שלטו גם ברמות הביטוי של eGFP, כאשר MFI רווי ב-~3 mW/cm2. עוצמות אור מעבר לכך עשויות להיות בעלות ערכי MFI משתנים, ככל הנראה עקב הלבנת אור בדגימות מסוימות כפי שניתן לראות ב-~9 ו-11 mW/cm2.

איור 1: צנרת כללית של ניסויים בתפוקה גבוהה הבודקים מערכות אופטוגנטיות. התאים נזרעים לתוך צלחת שחורה של 96 בארות למשך 24 שעות. לאחר מכן, התאים עוברים טרנספטציה עם תקופת דגירה של 12 דקות של DNA ומגיב טרנספקציה. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, הצלחת מונחת על OptoPlate-96 להפעלת אור כחול. לאחר משך הזמן הרצוי של הפעלת האור הכחול, תאים מוכנים בסביבת אור אדום לזרימה ציטומטרית. נתוני זרימה ציטומטרית מיוצגים כגרפים של עוצמת הקרינה הממוצעת של תאים חיוביים ל-eGFP בחושך או מטופלים באור כחול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות מייצגות של 2pLACE במצב מופעל וכיבוי בתאי HEK293T. יחסי מסה שונים של CRY2-eGFP: CIBN-gRNA נבדקו לרמות ביטוי eGFP. התאים נחשפו לאור כחול (ON) או נשמרו בחושך (OFF) במשך 24 שעות. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תרשימי פיזור ציטומטריית זרימה מייצגת של תאים HEK293T לא-טרנספקטים (UT), CMV-eGFP ו-2pLACE. ציטומטריית זרימה בוצעה באמצעות פונקציית מעמיס הצלחות. (A) תאים HEK293T היו מגודרים על בסיס פיזור קדימה (FSC-A) ופיזור צדדי (SSC-A). ניתן לדמיין את ריכוז האירועים בחלקות SSC-A לעומת FSC-A באמצעות עלילת קווי מתאר (איור משלים 3A) כדי לסייע בשער אוכלוסיות בריאות. אפליה כפולה בוצעה בחלקת SSC-H לעומת SSC-A באמצעות שער ליניארי. התרשים הסופי מגודר תאים פלואורסצנטיים על ידי התייחסות לדגימה הלא מועברת. (B) התאים היו מגודרים כמו ב-(A), מה שמראה את האוכלוסייה הפלואורסצנטית ואת עוצמת הקרינה בטבלת הסטטיסטיקה (איור משלים 2B). (C,D) תאים שעברו טרנספטציה של 2pLACE היו מגודרים בנפרד דרך שער P3. אוכלוסיית המג'נטה מייצגת את כל התאים החיוביים ל-eGFP (איור משלים 3B). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניתוח איכותי וכמותי של ביטוי eGFP המושרה על ידי אור בתאי HEK293T. (A) תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים HEK293T שהועברו עם פלסמידים 2pLACE או CMV-eGFP. (B) כימות של עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) של eGFP בתאים שנשמרו בתנאי אור כחול או חושך. (C) אחוז התאים החיוביים ל-eGFP שנמדד באמצעות ניתוח שער זרימה ציטומטרית. שער הביא לכך ש-<0.1% מהתאים הלא מועברים נפלו בתוך הסף החיובי ל-eGFP. נתוני ציטומטריית זרימה מייצגים ערכים ממוצעים, ופסי שגיאה מצביעים על סטיות תקן מארבעה שכפולים טכניים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: זרימה ציטומטרית של יחסי מסה מייצגים של 2pLACE ועוצמות אור כחול. (A) יחסי מסה שונים של CRY2-eGFP: CIBN-gRNA הועברו לתאי HEK293T, שלאחר מכן נחשפו לאור כחול או נשמרו בחושך תוך שימוש באותן הגדרות שדווחו בשלב 3 של הפרוטוקול. כל תנאי הוא הממוצע של 3 שכפולים ביולוגיים. (B) מגמה מייצגת של ביטוי גנים כפונקציה של עוצמת האור הכחול. כל תנאי הוא הממוצע של 6 שכפולים טכניים. עוצמות הקרינה הממוצעות מכומתות באמצעות שער ציטומטר זרימה של תאים המבטאים eGFP. כל פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן. עבור יחסי פלסמיד, המובהקות הסטטיסטית של MFI חושבה באמצעות מבחן t חד כיווני המשווה את האור והחושך של יחס פלסמיד. עבור עוצמות אור, מובהקות סטטיסטית חושבה עם ANOVA חד-כיווני ומבחן T2 פוסט-הוק של Tamhane בהשוואה למצב החושך (OFF). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p <0.0001, *****p < 0.00001 ו-ns אינו מובהק. איור זה אומץ מ-Garimella et al.38. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: כמות הפלסמידים CRY2-eGFP ו-CIBN-gRNA לבאר באמצעות ריכוזים לדוגמה. כמויות הנפח הן לבאר וניתן לשנות אותן על סמך מספר הדגימות או השכפולים בניסוי. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: ערכים מומלצים לעוצמות אור כחול. הקוד נמצא בקובץ קידוד משלים 1 (שורות 215-228). ערכי עוצמה שווי ערך מחושבים באמצעות נתוני כיול שדווחו בעבר באמצעות מד כוח אופטי. לכל רמת אינטנסיביות יש 6 שכפולים טכניים. שורות G ו-H מיועדות ל-CMV-eGFP ולבארות בקרה לא מועברות. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

איור משלים 1: שלבים 5.1-5.5 של הפרוטוקול. (א) הפעלת תוכנית אתחול המערכת. (B) סטנדרטיזציה של בקרת איכות באמצעות חרוזי פלואורופור. (ג) מעבר מדגימת צינור למצב מעמיס צלחות. (ד) בחירת בארות לסימון כבארות לדוגמה; 35 בארות נבחרו לדוגמא זו. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

תרשים משלים 2: שלבים 5.6-5.14 של הפרוטוקול. (A) הגדרת עלילות פיזור אור: FSC-A לעומת SSC-A עבור שער אוכלוסיית תאים בריאה, SSC-A לעומת SSC-H עבור אפליה כפולה, ו-SSC-A לעומת FITC-A עבור שער תאים אוטו-פלואורסצנטיים וחיוביים ל-eGFP. (ב) הגדרת טבלת הסטטיסטיקה להשגת נתוני FITC-A למדידת עוצמת הקרינה הממוצעת. (ג) הדגשת כללי עצירה בכרטיסייה אירועים להצגה. ודא קצב זרימת דגימה איטי, הוצא וטען את הצלחת, אתחל את בדיקת ציטומטר הזרימה והתאם את מתחי הרכישה. (D) יצירת מצולעים כדי לשער כל אוכלוסייה כפי שמוצג. (ה) הוספת המספר המתאים של בארות. (ו) לחיצה על הקלטה אוטומטית לאחר השלמת ההגדרות והשערים. (ז) לחיצה על ניקוי יומי לאחר איסוף כל הדגימות וייצוא נתונים סטטיסטיים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 3: אימות של כל התאים בתוך השער שנלכד, המוצג על ידי אירועים ירוקים ב- P4 (מגנטה). (A) תרשים מתאר של האוכלוסייה הבריאה בתוך שער האוכלוסייה החיובית ל-eGFP (P3). התאים מרוכזים בעיקר באזורים האדומים, ופוחתים כלפי חוץ. (ב) SSC-A לעומת חלקת PE-A לשער P4, המספק בדיקה נוספת כדי להבטיח שכל אירועי ההפלרה נלקחים בחשבון בחלקת FITC-A. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 1: דוגמה לקוד Arduino המיישם את כל המאפיינים המתוארים בפרוטוקול לעיל. זה file מפעיל את כל מיקומי ה-LED באמצעות ערכי עוצמת ה-LED המומלצים בטבלה 2. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.