Method Article

כימות תלת מימדי של ריר המעי באמצעות הדמיית רקמות שלמות

DOI:

10.3791/68789

⸱

September 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Microbe Interactions and Cell Dynamics, Department of Medical Biotechnology and Laboratory Science, College of Medicine, Chang Gung University, 2Institute of Microbiology and Immunology, National Yang Ming Chiao Tung University, 3Program in Molecular Medicine, National Yang Ming Chiao Tung University and Academia Sinica, 4Graduate Institute of Biomedical Sciences, College of Medicine, Chang Gung University, 5Center for Molecular and Clinical Immunology, Chang Gung University, 6Division of General Surgery, Department of Surgery, Chang Gung Memorial Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג שיטת הדמיה תלת מימדית המשתמשת ברקמות מעי שלמות ומיקרוסקופיה מרובת פוטונים כדי לכמת ריר מופרש, המאפשר ניתוח נפחי מדויק והדמיה של דינמיקת ריר בתגובה לגירויים כמו קרבמוילכולין כלוריד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליחה ממלאת תפקיד חיוני בשמירה על הומאוסטזיס במעי, בכך שהיא מקלה על העיכול, יוצרת מחסום מפני חיידקים ומווסתת את התגובות החיסוניות במעי. הפרשתו מווסתת על ידי גורמים פנימיים וחיצוניים שונים, כולל זיהומים מיקרוביאליים ודלקת. בעוד ששיטות מסורתיות לניתוח ריר מסתמכות על כימות יחסי, כגון מדידת עובי הריר בחתכים היסטולוגיים, גישות אלו מספקות תובנה מוגבלת לגבי הנפח בפועל וההתפלגות המרחבית של ריר מופרש בתוך לומן המעי. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה מפורטת לכימות מוחלט ותלת מימדי של ריר באמצעות רקמות מעיים שלמות ומיקרוסקופיה מרובת פוטונים. פרוטוקול זה כולל הכנת לולאות מעיים קשורות, טיפול בקרבמוילכולין כלוריד כגירוי להפעלת תאי גביע, קיבוע רקמות וצביעה להדמיה. באמצעות מיקרוסקופיה מרובת פוטונים, אנו רוכשים תמונות מוערמות Z של פני השטח הלומינליים. אלה מעובדים בתוכנת Imaris כדי לכמת את הנפח וההתפלגות המרחבית של ריר מופרש. אנו מדגימים כי קרבמוילכולין כלוריד גורם להפרשת ריר הן ברקמות האיליאליות והן ברקמות המעי הגס תוך 30 דקות. הריר המופרש מופיע באופן ספורדי ולא רציף לאורך הלומן, מה שמדגיש את החשיבות של ניתוח נפחי על פני גישות דו-ממדיות מסורתיות. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להשיג נתונים כמותיים מוחלטים ולדמיין את התפלגות הריר באתרו, ומציע כלי רב עוצמה לחקר דינמיקת ריר המעי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסביבה הרירית של מערכת העיכול של היונקים היא דינמית ביותר, ותומכת בקולוניזציה של קהילה מיקרוביאלית מגוונת. אפיתל המעי מורכב מתאים מיוחדים שונים המשתפים פעולה כדי לספוג חומרים מזינים, לשמור על שלמות המחסום ולתקשר עם מערכת החיסון1. בין אלה, תאי גביע מאחסנים גרגירי מוצין ומפרישים ריר ללומן בתנאים יציבים. ריר זה יוצר מחסום פיזי קריטי, המונע מגע מיקרוביאלי ישיר עם שכבת האפיתל, מווסת דלקת ברקמות ושומר על הומאוסטזיס במעי 2,3. חוסר ויסות של הפרשת ריר פוגע בתפקוד המחסום ונקשר לדלקת וגידול 4,5,6,7.

הפרשת ריר מעיים יכולה להיות מופעלת על ידי גורמים פנימיים, כגון המוליך העצבי אצטילכולין, ועל ידי רכיבים מיקרוביאליים מקומנסל 8,9. בהתחשב במורכבות של סביבת המעי, גורמים רבים המשפיעים על הפרשת ריר תאי גביע עדיין לא נחקרו. לכן, שיטה מדויקת לכימות ריר לומינלי חיונית לחקירת האופן שבו גירויים שונים משפיעים על דינמיקת ההפרשה. גישות מסורתיות מסתמכות בעיקר על כימות יחסי: לדוגמה, מדידת עובי הריר באמצעות חלקיקי פלואורסצנט או פחם במערכות ex vivo inplanting 10,11, או הערכת המרחק בין חיידקי לומינל לאפיתל בקטעי רקמה מוכתמים12,13. בעוד ששיטות אלו נוחות להשוואות יחסיות, ייתכן שהן לא לוכדות את ההתפלגות המלאה או את המבנה התלת מימדי של הריר המופרש, במיוחד מכיוון שהריר המופרש לא תמיד מכסה באופן אחיד את האפיתל.

במחקר זה, אנו מציגים שיטה להדמיה תלת מימדית וכימות מוחלט של ריר לומינלי באמצעות רקמות מעיים שלמות. גישה זו דורשת קיבוע רקמות טריות עם קיבוע מתאים לשמירה על שלמות מבנית ומורפולוגיה, ולאחר מכן צביעה פלואורסצנטית והדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או רב-פוטוני. על ידי מתן חומרי בדיקה ישירות ללולאות מעיים קשורות של עכברים מורדמים עמוק, ולאחר מכן קיבוע מיידי, השיטה משמרת את ארכיטקטורת הריר המקורית ומאפשרת ניתוח של קינטיקה של הפרשה. בהשוואה לרקמות חתוכות, שבהן עומק ההדמיה מוגבל בעיקר על ידי עובי הרקמה, עומק ההדמיה של רקמות שלמות (ללא דה-ליפידציה) מגיע לכ-200-300 מיקרומטר, מוגבל על ידי פיזור אור ואטימות רקמות. באמצעות טכניקה זו, אנו מראים כי קרבמוילכולין כלוריד (CCh), אנלוגי אצטילכולין שהקולטנים שלו באים לידי ביטוי בתאי גביע14, גורם בחוזקה להפרשת ריר מהירה. יש לציין כי הריר המופרש יוצר הן שכבה רציפה לאורך האפיתל והן מבנים לא רציפים בתוך הלומן, תכונות שקשה לזהות בקטעי רקמה קונבנציונליים. פרוטוקול זה מספק פלטפורמה חזקה לכימות ההתפלגות התלת מימדית של ריר המעי ולהשוואת פוטנציאל גרימת הריר של גירויים שונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת צ'אנג גונג. מתקן בעלי החיים של אוניברסיטת צ'אנג גונג מוסמך על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה (AAALAC). לא נצפו חששות לבריאות בעלי חיים במחקרים אלה.

1. הכנת בסיס קיבוע

  1. יש לערבב אבקת אגרוז עם ddH2O לריכוז של 4% (w/v) בבקבוק הניתן למיקרוגל. מיקרוגל 2-3 דקות עד שהוא מגיע לרתיחה ללא בועות קטנטנות.
    הערה: עוצמת הקול תלויה במספר הדגימות; כ -10 מ"ל לכלי 6 ס"מ.
  2. הניחו לתמיסת האגרוז להתקרר ל-~60 מעלות צלזיוס תוך ~3 דקות. יוצקים בזהירות את האגרוז לתבנית 6 ס"מ עד שגובה הנוזל מגיע למחצית המנה (כ -10 מ"ל לכלי 6 ס"מ).
  3. מניחים את המנה עם מכסה בשטח סגור למשך 20-30 דקות, עד שהאגרוז מתמצק לחלוטין.

2. הכנת חומר קיבוע

  1. הכן חוטי נחושת חדשים וחתוך אותם לאורכים של 5 מ"מ. כל פיסת רקמה דורשת 6-8 חתיכות חוט.

3. הכנת תמיסת CCh

  1. ממיסים CCh גבישי במאגר PBS סטרילי לריכוז סופי של 10 מיקרומטר (200 מיקרוליטר עבור לולאת מעי אחת).

4. הכנת חומרי הרדמה בהזרקה

  1. כדי להכין את תמיסת המלאי להרדמה, ממיסים 2,2,2-tribromoethanol ב-2-methyl-2-butanol.
  2. השתמש ב-PBS סטרילי כדי לדלל את תמיסת המלאי, כך שתמיסת העבודה הסופית תכיל 30 מ"ג/מ"ל 2,2,2-טריברומו-אתנול ו-3% (v/v) 2-מתיל-2-בוטנול.
  3. מערבולת ביסודיות למשך ~1 דקה עד שלא נשארת גלולה בתמיסה (קצב מקסימלי: 8).
  4. אחסן את תמיסת המלאי בחושך ב-4 מעלות צלזיוס כדי למנוע השפלה; השלך את המלאי חודש לאחר ההכנה.
  5. לפני ההרדמה, משוך את תמיסת המלאי לתוך PBS סטרילי ומערבב היטב כדי להבטיח פיזור אחיד, ולהשיג מינון סופי של 250 מ"ג/ק"ג לעכבר.
    זהירות: ל-2,2,2-טריברומו-אתנול יש רעילות עצבית, ו-2-מתיל-2-בוטנול נדיף ובעל ריח מגרה. יש להשתמש בציוד מגן מתאים. לסילוק יש לאסוף את הפסולת במיכל אטום ולעקוב אחר נהלי פינוי הפסולת הכימית המסוכנת של המוסד.

5. חיסון מעיים באמצעות הזרקת לולאה

  1. להרדים עכבר בן 6-8 שבועות עם הזרקה תוך-צפקית של 200 מיקרוליטר של 2,2,2-טריברומו-אתנול (250 מ"ג/ק"ג לעכבר), ולהניח את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת גופו.
  2. לאחר עיקור פני העור באלכוהול, בצע חתך בבטן התחתונה השמאלית של העכבר באמצעות מספריים לניתוח וחשוף את הצקום בהרדמה.
  3. זהה את האילאום או המעי הגס הפרוקסימלי, הנח את לולאת המעי על גזה סטרילית והשתמש במלחציים עורקיים כדי לאבטח את שני הקצוות, וליצור לולאה סגורה באורך 3 ס"מ.
  4. שוטפים את האיבר על הגזה בעזרת PBS סטרילי.
  5. להזריק מגיב PBS או CCh סטרילי בנפח של לא יותר מ-200 מיקרוליטר לתוך לולאת המעי הקשורה בהרדמה.

6. קציר רקמות, קיבוע וצביעה

  1. לאחר 30 דקות של טיפול, המתת חסד של העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם, וקצור את לולאת המעי.
  2. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את לולאת המעי ושטוף אותה בעדינות ב-PBS סטרילי.
  3. חותכים בעדינות את לולאת המעי לאורך ושוטפים את הרקמה ב-PBS סטרילי.
  4. משטחים את הרקמה ומשתמשים בקטעי חוטי נחושת כדי לעגן אותה על האגרוז בצלחת של 6 ס"מ.
  5. תקן את הרקמה עם 10 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 12-24 שעות בכלי.
  6. שטפו את הטישו עם PBS לפחות פי 3 כדי להסיר שאריות פרפורמלדהיד.
  7. טבלו את הרקמה ב-10 מ"ל של חיץ חוסם (PBS בתוספת 0.4% טריטון X-100 ו-3% אלבומין בסרום בקר [BSA]) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 12-24 שעות בצלחת.
  8. מכתים את הרקמה עם נבט חיטה אגלוטינין (WGA, 1:200) ופאלודין (1:500) במאגר חוסם, מנערים ב-120 סל"ד ב-4 מעלות צלזיוס למשך 12-24 שעות בצלחת.
    הערה: כדי למזער את צריכת הצבע, ניתן לעגן את הרקמה על אגרוז מוצק בצלחת של 3 ס"מ טבולה ב-2 מ"ל של מאגר צבע לצביעה.
    זהירות: פרפורמלדהיד מהווה סכנת שאיפה. יש להשתמש בציוד מגן מתאים במהלך הטיפול, כגון פעולה במכסה אדים. לסילוק יש לאסוף את הפסולת במיכל אטום ולעקוב אחר נהלי פינוי הפסולת הכימית המסוכנת של המוסד.

7. לכידת תמונה על ידי מיקרוסקופ מולטיפוטון

  1. שטפו את מאגר הצביעה שנותר לפחות פי 3 עם PBS.
  2. עוגן את הרקמה על אגרוז עם חוטי נחושת בצלחת של 6 ס"מ ב -10 מ"ל PBS.
  3. רכוש 100 חתכים אופטיים (המכסים 99 מיקרומטר בעומק) של רקמת המעי והריר המופרש הנלווה באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון המצויד בעדשת אובייקטיבית NA גבוהה להדמיית רקמות עמוקות. השתמש במקור עירור למיקרוסקופיה מרובת פוטונים המוגדרת לאורך גל של 750 ננומטר. אסוף אותות פליטה באמצעות מסנני מעביר פס BP500-550 ננומטר ו-BP565-610 ננומטר. הגדר את מהירות הסריקה ל-8.
    הערה: עבור מיקרוסקופיה מרובת פוטונים, מהירות הסריקה המרבית היא 9, כאשר ערכים גבוהים יותר מצביעים על רכישה מהירה יותר. הגדרת המהירות תלויה בקיבולת המיקרוסקופ. בעת שימוש בפלטפורמת ההדמיה המשמשת לרכישת ערימות תלת-ממדיות, אנו ממליצים על מהירות סריקה של 8 כדי לאזן את זמן הרכישה ואיכות התמונה.

8. ניתוח תמונה וכימות ריר (איור 1)

  1. כדי למדוד את הנפח של כל חלקיק ריר (בערוץ WGA), פתח את ערימת התמונות באימאריס על ידי גרירה ושחרור של הקובץ לדף הזירה. לחץ על סמל Surface כדי להתחיל בתהליך העבודה של יצירת המשטח. בצע את השלבים הסטנדרטיים כדי לפלח ולכמת נפחי חלקיקים בתוך מחסנית z. פרמטרים ספציפיים ושלבי עיבוד מפורטים באיור 1.
  2. אל תכלול חלקיקי ריר קטנים מ-1,000 מיקרומטרמעוקב, שהם בעיקר תאי גביע (איור 2A,B).
  3. סכם את נפח הריר המופרש עבור כל קבוצה.

9. ניתוח סטטיסטי

  1. נתח והשווה את הנפח הכולל עבור כל קבוצה. הזן את הערך של נפח הריר בעמודה ונתח באמצעות מבחן מאן-וויטני לא פרמטרי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשיטה זו, כימתנו את נפח ריר המעי מתמונות מוערמות של רקמות שלמות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופיה מולטיפוטון. רקמות המעיים נצבעו בפאלואידין פלואורסצנטי ואגלוטינין נבט חיטה (WGA) כדי לדמיין F-אקטין וריר תאי, בהתאמה15,16. הן ברקמות האיליאליות והן ברקמות המעי הגס שטופלו ב-PBS, ריר WGA+ זוהה בעיקר בתוך תאי גביע על פני האפיתל. לאחר מתן קרבמויל-כולין כלוריד (CCh) נצפתה כמות מוגברת של ליחה בלומן המעי של שתי הרקמות. יש לציין שהריר המופרש לא יצר שכבה רציפה מעל האפיתל,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תלת מימדי של ריר המעי באמצעות צביעת רקמות שלמות, מיקרוסקופיה מרובת פוטונים וניתוח עם תוכנת Imaris. הליך זה מאפשר תצפית על התפלגות לא רציפה של ריר בתוך לומן המעי ומספק מדידה מוחלטת של נפח הריר.

פיזור ריר לא רציף בעת גירוי נצפתה גם במערכות תרבית רקמות חיצוניות8. במחקרים קודמים שהשתמשו בתרביות ex vivo ex vivo, כימות הריר התבסס על מדידת המרחק בין חרוזים בתוספת לבין פני הרקמה10,11<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למעבדת הליבה של המיקרוסקופיה, בית החולים צ'אנג גונג ממוריאל, לינקו, על הסיוע הטכני. ברצוננו גם להודות לסיוע של מתקן ליבת ההדמיה של האוניברסיטה הלאומית יאנג מינג צ'יאו טונג עבור השירות של Zeiss LSM 7 MP Multi-Photon Microscope, במיוחד גב' פיי-ג'ון צ'ן ויונג-יו לו על תמיכתם הטכנית. המחברים מבקשים להודות לתמיכה מ-NSTC 110-2320-B-A49A-544-MY3 ו-113-2628-B-182-002-MY3 (ל-YHT).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-טריברומואתנולסיגמא-אלדריץ'T48402
2-מתיל-2-בוטנולסיגמא-אלדריץ'240486
צלחת 6 ס"מ;אלפא פלוס16021-1
Agarose היספנאגרA02599
BSABioShopALB001
קרבמומילכולין כלוריד > 98% (טיטרציה), גבישיסיגמאSI-C4382-1G
חוט נחושת (חדש)TOP TECH WIRE & תעשיית כבליםIW00125חוט נחושת ללא שכבת בידוד
מלקחייםשינטהST-M110
גזה, סטריליתGMTHמאי-40
GraphPad Prism 8 תוכנת GraphPad
כרית חימוםקונפורטSY-666
IMARIS 10.0.0אוקספורד אינסטרומנטס
פאראפורמלדהידביובובסBL0415-1000
PBSג'נסטארBL0180-1000
גשושי תיוג פאלואידיןInvitrogenA12379
מספרייםשינטה02-1250.18
טריטון X-100מרק1.08603.1000
קונגוגטים של אגלוטינין לנבט חיטה (WGA)ביוטיום29027
צייס 7MP עם מטרה לטבילה במים W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III (NA 1.0), לייזר Spectra-Physics Mai Tai HP ti ספיר פמטו-שניות (ללא מודול DeepSee) עם גלאי BP500 nm-550 ננומטר ו-BP565 nm-610 ננומטר, ואורך גל לייזר 750 ננומטרפלטפורמת הדמיה המשמשת לרכישת ערימות תלת-ממד עם עדשת אובייקטיב בעל NA גבוה להדמיית רקמות עמוקות; מקור עירור למיקרוסקופיה מרובת פוטונים שמוגדר לאורך גל של 750 ננומטר

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
  2. Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (6515), 467-472 (2020).
  3. Johansson, M. E., et al. The inner of the two muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (39), 15064-15069 (2008).
  4. Nyström, E. E., et al. An intercrypt subpopulation of goblet cells is essential for colonic mucus barrier function. Science. 372 (6539), eabb1590(2021).
  5. Van Der Post, S., et al. Structural weakening of the colonic mucus barrier is an early event in ulcerative colitis pathogenesis. Gut. 68 (12), 2142-2151 (2019).
  6. Van Der Sluis, M., et al. Muc2-deficient mice spontaneously develop colitis, indicating that muc2 is critical for colonic protection. Gastroenterology. 131 (1), 117-129 (2006).
  7. Velcich, A., et al. Colorectal cancer in mice genetically deficient in the mucin muc2. Science. 295 (5560), 1726-1729 (2002).
  8. Birchenough, G. M., Nyström, E. E., Johansson, M. E., Hansson, G. C. A sentinel goblet cell guards the colonic crypt by triggering NLRP6-dependent Muc2 secretion. Science. 352 (6293), 1535-1542 (2016).
  9. Dolan, B., Ermund, A., Martinez-Abad, B., Johansson, M. E., Hansson, G. C. Clearance of small intestinal crypts involves goblet cell mucus secretion by intracellular granule rupture and enterocyte ion transport. Sci Signal. 15 (752), eabl5848(2022).
  10. Gustafsson, J. K., et al. An ex vivo method for studying mucus formation, properties, and thickness in human colonic biopsies and mouse small and large intestinal explants. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (4), G430-G438 (2012).
  11. Sawaed, J., et al. Antibiotics damage the colonic mucus barrier in a microbiota-independent manner. Sci Adv. 10 (37), eadp4119(2024).
  12. Bergstrom, K., et al. Core 1-and 3-derived o-glycans collectively maintain the colonic mucus barrier and protect against spontaneous colitis in mice. Mucosal Immunol. 10 (1), 91-103 (2017).
  13. Cortez, V., et al. Astrovirus infects actively secreting goblet cells and alters the gut mucus barrier. Nat Commun. 11 (1), 2097(2020).
  14. Knoop, K. A., Mcdonald, K. G., Mccrate, S., Mcdole, J. R., Newberry, R. D. Microbial sensing by goblet cells controls immune surveillance of luminal antigens in the colon. Mucosal Immunol. 8 (1), 198-210 (2015).
  15. Nikitas, G., et al. Transcytosis of Listeria monocytogenes across the intestinal barrier upon specific targeting of goblet cell accessible E-cadherin. J Exp Med. 208 (11), 2263-2277 (2011).
  16. Tsai, Y. H., Disson, O., Bierne, H., Lecuit, M. Murinization of internalin extends its receptor repertoire, altering Listeria monocytogenes cell tropism and host responses. PLoS Pathog. 9 (5), e1003381(2013).
  17. Birchenough, G. M., Johansson, M. E., Gustafsson, J. K., Bergstrom, J. H., Hansson, G. C. New developments in goblet cell mucus secretion and function. Mucosal Immunol. 8 (4), 712-719 (2015).
  18. Maheras, K. J., Gow, A. Increased anesthesia time using 2,2,2-tribromoethanol-chloral hydrate with low impact on mouse psychoacoustics. J Neurosci Methods. 219 (1), 61-69 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intestinal MucusThree Dimensional QuantificationWhole Mount ImagingMulti Photon MicroscopyGoblet Cell SecretionMucus VolumeCarbamoylcholine ChlorideIntestinal Loop PreparationMucus DistributionTissue Staining

Related Articles