Method Article

כימות תלת מימדי של ריר המעי באמצעות הדמיית רקמות שלמות

DOI:

10.3791/68789

⸱

September 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Microbe Interactions and Cell Dynamics, Department of Medical Biotechnology and Laboratory Science, College of Medicine, Chang Gung University, 2Institute of Microbiology and Immunology, National Yang Ming Chiao Tung University, 3Program in Molecular Medicine, National Yang Ming Chiao Tung University and Academia Sinica, 4Graduate Institute of Biomedical Sciences, College of Medicine, Chang Gung University, 5Center for Molecular and Clinical Immunology, Chang Gung University, 6Division of General Surgery, Department of Surgery, Chang Gung Memorial Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג שיטת הדמיה תלת מימדית המשתמשת ברקמות מעי שלמות ומיקרוסקופיה מרובת פוטונים כדי לכמת ריר מופרש, המאפשר ניתוח נפחי מדויק והדמיה של דינמיקת ריר בתגובה לגירויים כמו קרבמוילכולין כלוריד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליחה ממלאת תפקיד חיוני בשמירה על הומאוסטזיס במעי, בכך שהיא מקלה על העיכול, יוצרת מחסום מפני חיידקים ומווסתת את התגובות החיסוניות במעי. הפרשתו מווסתת על ידי גורמים פנימיים וחיצוניים שונים, כולל זיהומים מיקרוביאליים ודלקת. בעוד ששיטות מסורתיות לניתוח ריר מסתמכות על כימות יחסי, כגון מדידת עובי הריר בחתכים היסטולוגיים, גישות אלו מספקות תובנה מוגבלת לגבי הנפח בפועל וההתפלגות המרחבית של ריר מופרש בתוך לומן המעי. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה מפורטת לכימות מוחלט ותלת מימדי של ריר באמצעות רקמות מעיים שלמות ומיקרוסקופיה מרובת פוטונים. פרוטוקול זה כולל הכנת לולאות מעיים קשורות, טיפול בקרבמוילכולין כלוריד כגירוי להפעלת תאי גביע, קיבוע רקמות וצביעה להדמיה. באמצעות מיקרוסקופיה מרובת פוטונים, אנו רוכשים תמונות מוערמות Z של פני השטח הלומינליים. אלה מעובדים בתוכנת Imaris כדי לכמת את הנפח וההתפלגות המרחבית של ריר מופרש. אנו מדגימים כי קרבמוילכולין כלוריד גורם להפרשת ריר הן ברקמות האיליאליות והן ברקמות המעי הגס תוך 30 דקות. הריר המופרש מופיע באופן ספורדי ולא רציף לאורך הלומן, מה שמדגיש את החשיבות של ניתוח נפחי על פני גישות דו-ממדיות מסורתיות. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להשיג נתונים כמותיים מוחלטים ולדמיין את התפלגות הריר באתרו, ומציע כלי רב עוצמה לחקר דינמיקת ריר המעי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסביבה הרירית של מערכת העיכול של היונקים היא דינמית ביותר, ותומכת בקולוניזציה של קהילה מיקרוביאלית מגוונת. אפיתל המעי מורכב מתאים מיוחדים שונים המשתפים פעולה כדי לספוג חומרים מזינים, לשמור על שלמות המחסום ולתקשר עם מערכת החיסון1. בין אלה, תאי גביע מאחסנים גרגירי מוצין ומפרישים ריר ללומן בתנאים יציבים. ריר זה יוצר מחסום פיזי קריטי, המונע מגע מיקרוביאלי ישיר עם שכבת האפיתל, מווסת דלקת ברקמות ושומר על הומאוסטזיס במעי 2,3. חוסר ויסות של הפרשת ריר פוגע בתפקוד המחסום ונקשר לדלקת וגידול 4,5,6,7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת צ'אנג גונג. מתקן בעלי החיים של אוניברסיטת צ'אנג גונג מוסמך על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה (AAALAC). לא נצפו חששות לבריאות בעלי חיים במחקרים אלה.

1. הכנת בסיס קיבוע

  1. יש לערבב אבקת אגרוז עם ddH2O לריכוז של 4% (w/v) בבקבוק הניתן למיקרוגל. מיקרוגל 2-3 דקות עד שהוא מגיע לרתיחה ללא בועות קטנטנות.
    הערה: עוצמת הקול תלויה במספר הדגימות; כ -10 מ"ל לכלי 6 ס"מ.
  2. הניחו לתמיסת האגרוז להתקרר ל-~60 מעלות צלזיוס תוך ~3 דקות. יוצקים בזהירות את האגרוז לתבנית 6....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשיטה זו, כימתנו את נפח ריר המעי מתמונות מוערמות של רקמות שלמות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופיה מולטיפוטון. רקמות המעיים נצבעו בפאלואידין פלואורסצנטי ואגלוטינין נבט חיטה (WGA) כדי לדמיין F-אקטין וריר תאי, בהתאמה15,16. הן ברקמות האיליאליות והן ברקמות המעי הגס שטופלו ב-PBS, ריר WGA+ זוהה בעיקר בתוך תאי גביע על פני האפיתל. לאחר מתן קרבמויל-כולין כלוריד (CCh) נצפתה כמות מוגברת של ליחה בלומן המעי של שתי הרקמות. יש לציין שהריר המופרש לא יצר שכבה רציפה מעל האפיתל,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תלת מימדי של ריר המעי באמצעות צביעת רקמות שלמות, מיקרוסקופיה מרובת פוטונים וניתוח עם תוכנת Imaris. הליך זה מאפשר תצפית על התפלגות לא רציפה של ריר בתוך לומן המעי ומספק מדידה מוחלטת של נפח הריר.

פיזור ריר לא רציף בעת גירוי נצפתה גם במערכות תרבית רקמות חיצוניות8. במחקרים קודמים שהשתמשו בתרביות ex vivo ex vivo, כימות הריר התבסס על מדידת המרחק בין חרוזים בתוספת לבין פני הרקמה10,11<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למעבדת הליבה של המיקרוסקופיה, בית החולים צ'אנג גונג ממוריאל, לינקו, על הסיוע הטכני. ברצוננו גם להודות לסיוע של מתקן ליבת ההדמיה של האוניברסיטה הלאומית יאנג מינג צ'יאו טונג עבור השירות של Zeiss LSM 7 MP Multi-Photon Microscope, במיוחד גב' פיי-ג'ון צ'ן ויונג-יו לו על תמיכתם הטכנית. המחברים מבקשים להודות לתמיכה מ-NSTC 110-2320-B-A49A-544-MY3 ו-113-2628-B-182-002-MY3 (ל-YHT).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-טריברומואתנולסיגמא-אלדריץ'T48402
2-מתיל-2-בוטנולסיגמא-אלדריץ'240486
צלחת 6 ס"מ;אלפא פלוס16021-1
Agarose היספנאגרA02599
BSABioShopALB001
קרבמומילכולין כלוריד > 98% (טיטרציה), גבישיסיגמאSI-C4382-1G
חוט נחושת (חדש)TOP TECH WIRE & תעשיית כבליםIW00125חוט נחושת ללא שכבת בידוד
מלקחייםשינטהST-M110
גזה, סטריליתGMTHמאי-40
GraphPad Prism 8 תוכנת GraphPad
כרית חימוםקונפורטSY-666
IMARIS 10.0.0אוקספורד אינסטרומנטס
פאראפורמלדהידביובובסBL0415-1000
PBSג'נסטארBL0180-1000
גשושי תיוג פאלואידיןInvitrogenA12379
מספרייםשינטה02-1250.18
טריטון X-100מרק1.08603.1000
קונגוגטים של אגלוטינין לנבט חיטה (WGA)ביוטיום29027
צייס 7MP עם מטרה לטבילה במים W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III (NA 1.0), לייזר Spectra-Physics Mai Tai HP ti ספיר פמטו-שניות (ללא מודול DeepSee) עם גלאי BP500 nm-550 ננומטר ו-BP565 nm-610 ננומטר, ואורך גל לייזר 750 ננומטרפלטפורמת הדמיה המשמשת לרכישת ערימות תלת-ממד עם עדשת אובייקטיב בעל NA גבוה להדמיית רקמות עמוקות; מקור עירור למיקרוסקופיה מרובת פוטונים שמוגדר לאורך גל של 750 ננומטר

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
  2. Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (651....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intestinal MucusThree Dimensional QuantificationWhole Mount ImagingMulti Photon MicroscopyGoblet Cell SecretionMucus VolumeCarbamoylcholine ChlorideIntestinal Loop PreparationMucus DistributionTissue Staining

Related Articles