מאמר שיטה

ייצור מיקרו-בועות יציבות בציפוי פוספוליפידים מונודיסטרי בטמפרטורת החדר באמצעות מכשיר מיקוד זרימה מיקרופלואידי

DOI:

10.3791/68796

⸱

10 באוקטובר 2025

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Department of Cardiology, Cardiovascular Institute, Erasmus MC, 2Molecular and Nanoscale Physics Group, School of Physics and Astronomy, University of Leeds

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר שיטה לייצור מיקרו-בועות מצופות פוספוליפידים מונו-דיספרסי באמצעות התקן מיקוד זרימה מיקרופלואידי בטמפרטורת החדר, כולל אופן הכנת נוסחת ציפוי הפוספוליפידים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו-בועות מונודיסטריות הוכיחו פוטנציאל משמעותי בשיפור היעילות של חומרי ניגוד אולטרסאונד הן להדמיה והן ליישומים טיפוליים. ניתן לייצר מיקרו-בועות אלו ישירות בשיטת מיקוד זרימה מיקרופלואידית, המאפשרת שליטה מדויקת על גודלן. עם זאת, מניעת התלכדות במהלך הייצור נותרה אתגר קריטי. בעוד שטמפרטורות ייצור גבוהות (למשל, 55 מעלות צלזיוס) יכולות לדכא התלכדות, תנאים כאלה מסבכים את תכנון המכשיר המיקרופלואידי ועשויים להיות לא תואמים לסוכני מטרה ומצומדים לתרופות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור מיקרו-בועות מצופות פוספוליפידים מונו-דיספרסי בטמפרטורת החדר, כאשר היציבות והפיזור החד-פעמי של המיקרו-בועות נשמרות למשך 7 ימים לפחות. הפרוטוקול מתאר גם ייצור של שבבים מיקרופלואידיים PDMS לשימוש חוזר והכנת פורמולציה של ציפוי פוספוליפידים המכיל את חומר פעילי השטח Pluronic F68. הממצאים שלנו מראים כי המיקרו-בועות המיוצרות בשיטה זו שומרות על גודלן ויציבותן במשך 7 ימים, ותומכות ביישומם העתידי במסגרות קליניות בהן חומרי ניגוד אולטרסאונד יציבים וניתנים לשליטה חיוניים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חומרי ניגוד אולטרסאונד (UCA) נמצאים בשימוש נרחב באכוגרפיה קלינית וביישומים טיפוליים 1,2,3. המיקרו-בועות הללו, הניתנות דרך הווריד, נשארות מוגבלות במערכת כלי הדם, ופועלות כסוכני מאגר דם 4,5. מעטפת מייצבת מצפה את המיקרו-בועות ומפחיתה את דיפוזיה הגז המונעת על ידי לחץ לפלס, ובכך מאריכה את תוחלת החיים של המיקרו-בועה 3,6. כאשר הם נחשפים לאולטרסאונד, מיקרו-בועות מתחילות להתנדנד ולייצר הדים חזקים עקב הדחיסות של ליבת הגז 7,8. התנודה בולטת ביותר בתדר התהודה של המיקרו-בועה, המושפע מגודל המיקרו-בועה ומתכונות המעטפת 9,10,11. UCA שאושר קלינית מורכב בדרך כלל ממיקרו-בועות פוליפיזר עם התפלגות בגודל רחב, בדרך כלל נע בין כ-0.5-10 מיקרומטר בקוטר 12,13,14. התפלגות הגודל הרחבה הזו מובילה למגוון רחב של תדרים שבהם המיקרו-בועות הללו מהדהדות . בהתחשב בכך שבדיקות אולטרסאונד קליניות פועלות בדרך כלל ברוחב פס תדרים צר, רק תת-קבוצה של אוכלוסיית UCA מהדהדת ביעילות15. מיקרו-בועות מונו-דיספרס, בעלות התפלגות גודל צרה (למשל, PDI 3~10%16,17), הוכחו כמגבירות את האבחון והטיפול בהשוואה למיקרו-בועות פולי-דיספרס. עבור הדמיית אולטרסאונד משופרת ניגודיות, העוצמה עלתה בשניים עד שלושה סדרי גודל18, בעוד שהרגישות לחישת לחץ לא פולשנית באמצעות אותות תת-הרמוניים כמעט הוכפלה ב-19,20,21, ויעילות מתן התרופות גדלה בכמעט סדר גודל אחד 22. כתוצאה מכך, ייצור מיקרו-בועות חד-דיספוזריות עם התפלגות גודל צרה ובכך תגובה אקוסטית היא המפתח למקסום הפוטנציאל שלהן להדמיית אולטרסאונד ויישומים טיפוליים, שבהם תנודות מיקרו-בועות מבוקרות הן קריטיות.

ניתן לייצר מיקרו-בועות מונו-דיספיזציה בשיטות שונות, כגון סינון23, סינון מכני24 וצנטריפוגה של חומר מיקרו-בועות פולידיספיזציה25. עם זאת, השגת בקרת גודל מדויקת וחד-פיזור גבוה נותרה מאתגרת עם טכניקות אלה26. גישה חלופית ומבוקרת יותר היא ייצור ישיר של מיקרו-בועות חד-דיספוזיות באמצעות מכשיר מיקוד זרימה מיקרופלואידי. בתהליך זה, חוט גז ממוקד בין שני זרמי ליפוזום מימיים על שבב מיקרופלואידי, מה שמוביל לצביטה ניתנת לשחזור של חוט הגז, מה שמאפשר ייצור מהיר של מיקרו-בועות מונודיסטריות בגודל הרצוי27. למרות שנעשה שימוש נרחב בשיטות מיקוד זרימה לייצור טיפות חד-פיזור28,29, היישום שלהן בייצור מיקרו-בועות חד-פיזור פחות נפוץ בשל הקושי למנוע התלכדות ולשמור כראוי על יציבות ארוכת טווח מבחינת גודל, חד-פיזור וריכוז30. התלכדות, שבה מיקרו-בועות מרובות מתמזגות לגדולות יותר, משפיעה על פיזור חד-פעמי. טמפרטורות ייצור גבוהות הוכחו כמפחיתות התלכדות31, אך הדבר מסבך את תכנון המערכת המיקרופלואידית וייתכן שלא יתאים לתכשירים הכוללים חומרים מכוונים או מצומדים לתרופות. לכן, ייצור מיקרו-בועות חד-פיזוריות בטמפרטורת החדר יהיה יתרון. חשובה לא פחות היא שיטת אחסון המיקרו-בועות החד-פיזוריות הללו, שכן מיקרו-בועות מצופות פוספוליפידים נוטות להתכווץ, לקרוס ולאבד את הפיזור החד-פעמי שלהן לאורך זמן32. הבטחת יציבות לטווח ארוך, לאורך מספר ימים, במהלך האחסון היא קריטית לתרגום טכנולוגיית מיקרו-בועות מונודיספרס ליישומים קליניים.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לייצור מיקרו-בועות מונודיסטריות מצופות פוספוליפידים באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית ממקדת זרימה בטמפרטורת החדר. שיטה זו תואמת לקצבי זרימת שומנים הנעים בין 13-42 מיקרוליטר לדקה ומיועדת לשימוש בטמפרטורת החדר, מה שהופך אותה למתאימה למעבדות חסרות בקרת טמפרטורה במערכת המיקרופלואידית שלהן. הפרוטוקול משתמש בפורמולציה של פוספוליפידים המורכבת מ-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[carbonyl-methoxypolyethylene glycol] (DPPE-PEG5000), ו-Pluronic F68, המבטיח יציבות ושחזור. הפרוטוקול מספק הוראות שלב אחר שלב לייצור שבבים מיקרופלואידיים PDMS לשימוש חוזר, הכנת תמיסות ציפוי הפוספוליפידים ושילוב חומר פעילי השטח Pluronic F68 למניעת התלכדות מיקרו-בועות במהלך הייצור בטמפרטורת החדר. הוא גם מפרט את הנהלים לניקוי המערכת המיקרופלואידית למניעת סתימת הזרבובית, התאמת לחץ הגז וקצב זרימת הנוזל כדי לשלוט בגודל המיקרו-בועות, ואיסוף ואחסון המיקרו-בועות המיוצרות ליציבות ארוכת טווח. שיטה זו מציעה גישה מעשית ליצירת מיקרו-בועות חד-דיספרסיות יציבות עם בקרת גודל מדויקת בטמפרטורת החדר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת סרטי ליפידים

הערה: תערובת השומנים לייצור מיקרו-בועות מונודיסטריות מנוסחת עם תערובת בינארית של DSPC ו-DPPE-PEG5000 ביחס מולארי של 90:10. DSPC נבחר כשומן העיקרי מכיוון שהוכח שהוא מספק יציבות מעולה כנגד פירוק גז הן בפולידיזר33,34 והן במיקרו-בועות מונו-דיספרסיות31. משערים כי יציבות משופרת זו נובעת מטמפרטורת מעבר הפאזה הגבישית הגבוהה יחסית של ג'ל לנוזל של 55 מעלות צלזיוס35, שהיא גבוהה מזו של ליפידים נפוצים אחרים כגון DPPC (~41 °C)35, ובכך מובילה למעטפת שומנים קשיחה ואטומה יותר בטמפרטורת החדר36. כאן מודגמת דוגמה להכנת תמיסת ציפוי פוספוליפידים של 3 מ"ל. כדי להשיג ריכוז פוספוליפיד סופי של 20 מ"ג/מ"ל, שהוא ריכוז אופייני לייצור מיקרו-בועות מונודיסטריות16,17, נדרש 60 מ"ג פוספוליפידים. הכמות הרצויה של כל רכיב פוספוליפיד מופיעה בטבלה 1.

  1. מוציאים את אבקת הפוספוליפידים מהמקפיא של -20 מעלות צלזיוס ומניחים להפשיר בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  2. שקלו את אבקת השומנים הדרושה בצלוחיות נפח נפרדות של 2 מ"ל.
  3. הכן 100 מ"ל של תערובת 90:10 v/v של כלורופורם: ממס מתנול במכסה אדים על ידי מדידת 90 מ"ל של כלורופורם באמצעות גליל מדידת זכוכית של 100 מ"ל ולאחר מכן העברתו לזכוכית 250 מ"ל Erlenmeyer. לאחר מכן מדוד 10 מ"ל מתנול באמצעות גליל מדידת הזכוכית של 100 מ"ל ושפך אותו לתוך זכוכית 250 מ"ל ארלנמאייר שכבר מכילה את הכלורופורם. סגור את הזכוכית ארלנמאייר עם פקק זכוכית וערבב את שני הממיסים על ידי סיבוב עדין של הארלנמאייר עד שהתמיסה תתבהר.
    זהירות: כלורופורם ומתנול הם כימיקלים רעילים. כלורופורם הוא חומר מסרטן פוטנציאלי ועלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה, בעור ובעיניים. מתנול הוא דליק מאוד, רעיל אם הוא נשאף, נבלע או נספג דרך העור, ועלול לגרום לעיוורון אם הוא נבלע. עבוד תמיד עם תערובות כלורופורם/מתנול במכסה אדים מאוורר היטב כדי למנוע שאיפת אדים. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, משקפי מגן וחלוק מעבדה. ודא שאין להבות פתוחות או מקורות הצתה בעת טיפול במתנול. השלך פסולת ממסים בהתאם לפרוטוקולי הפסולת המסוכנת של המוסד.
  4. כדי להמיס לחלוטין את אבקות השומנים שנשקלו בשלב 1.2, הוסף מ"ל מתערובת הכלורופורם/מתנול לכל בקבוק זכוכית נפחי של 2 מ"ל וסגור במהירות את מכסה הזכוכית כדי למנוע אידוי.
    הערה: ודא שאבקת השומנים מומסת במלואה. במידת הצורך, סובב בעדינות את הבקבוק כדי להקל על הפירוק.
  5. מערבבים את תמיסות השומנים המומסות לבקבוקון זכוכית של 30 מ"ל על ידי מזיגת כל תמיסה ברצף.
  6. לאדות את הממס תחת זרימה קבועה של גז ארגון, לסובב את הבקבוקון כדי להבטיח פיזור אחיד של סרט השומנים על משטח הזכוכית.
    הערה: העקבות הסופיים של הממס עשויים להיות קשים לאידוי באמצעות גז ארגון בלבד. השאירו את הבקבוקון במכסה האדים למשך שעתיים כדי לאפשר ייבוש נוסף. אם גז ארגון אינו זמין, ניתן להשתמש בגז חנקן37 או במאייד סיבובי ואקום המופעל ב-6 °C31,38 (כלומר, מעל טמפרטורת מעבר הפאזה של DSPC של 55 °C35) כדי לאדות את ממס הכלורופורם/מתנול.
  7. לאחר אידוי הממס, הכניסו את תערובת השומנים לוואקום כדי לחסל את שאריות הממס האורגני שנותרו. אטום את בקבוקון הזכוכית בשכבת פרפילם ונקב מספר חורים בעזרת מחט כדי לאפשר זרימת אוויר במהלך הוואקום.
    הערה: מטרת השימוש בפרפילם היא למנוע מהליפיד להתפזר מבקבוקון הזכוכית במהלך תהליך הייבוש בהקפאה.
  8. הנח את הבקבוקונים במייבש הקפאה תחת ואקום למשך הלילה כדי להסיר שאריות ממס אורגני.
  9. המשך לשלב הבא או אחסן את סרט השומנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד הצורך.
    הערה: לא נעשה שימוש בשלב צנטריפוגה בסעיף זה או במקומות אחרים בפרוטוקול.

2. ייצור שבבים מיקרופלואידיים ממוקדי זרימה

הערה: מיקרו-בועות חד-דיספרסיות מיוצרות באמצעות שבב מיקרופלואידי-נוזלי ממוקד זרימה, כפי שמוצג באיור 1A. סכימה של גיאומטריית התעלה המיקרופלואידית, כולל מידות הזרבובית והיציאה, מסופקת באיור משלים S1. פרוטוקול ייצור מפורט לפוטוליתוגרפיה מבוססת SU-8 המשמשת להכנת תבניות אלה תואר בעבר37 וניתן למצוא אותו כמידע משלים לפרוטוקול זה. תהליך הייצור של שבב ה-PDMS מתואר בשלבים הבאים.

  1. מערבבים את בסיס ה-PDMS (23. גרם) וחומר הריפוי (2.3 גרם) ביחס משקל של 10:1 כדי לקבל סך של 25.5 גרם PDMS.
  2. מניחים את תבנית המאסטר בצלחת פטרי ויוצקים עליה את תערובת ה-PDMS.
  3. הסר את התערובת בוואקום (2 ~ 7 mbar) למשך 40 דקות כדי להסיר את בועות האוויר הכלואות.
    הערה: עבור נפחים גדולים יותר, ייתכן שיידרש זמן הסרת גז ארוך יותר כדי להבטיח הסרת בועות מלאה.
  4. מניחים את התבנית על פלטה חמה של 75 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    הערה: עבור נפחים גדולים יותר, ייתכן שיידרש זמן ריפוי ארוך יותר.
  5. הניחו ל-PDMS להתקרר לטמפרטורת החדר. בעזרת אזמל, חותכים בזהירות סביב ה-PDMS הנרפא ומקלפים אותו כדי לשחרר את השבב.
  6. חותכים את שבב ה-PDMS לגודל הרצוי ומחוררים את חורי הכניסות/יציאות באמצעות אגרוף של 1 מ"מ.
  7. נקה את שבב ה-PDMS עם סרט דבק כדי להסיר חלקיקי אבק.
  8. נקה גם את שבב ה-PDMS וגם את שקופית הזכוכית עם איזופרופנול, ואחריו מים נטולי יונים.
  9. הצמד את ה-PDMS למגלשת הזכוכית על ידי טיפול בהם במנקה פלזמה אוויר למשך דקה אחת בהספק של 60% (60 וואט).
  10. הנח את השבב המודבק על פלטה חמה של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות כדי לשפר את ההדבקה.
  11. אפשר לשבב ה-PDMS להתקרר לטמפרטורת החדר. השבב המיוצר במלואו מוצג באיור 1C, ותמונת שדה בהיר מיקרוסקופית של הזרבובית מוצגת באיור 1D.
  12. הנח את השבב המלוכד במנקה הפלזמה למשך 5 דקות בהספק של 80% (80 וואט) כדי להחזיר את ההידרופיליות של פני השטח של התעלה המיקרופלואידית.
  13. מלאו מיד את השבב במי Milli-Q כדי לשמור על הידרופיליות.
  14. אחסן את הצ'יפס בטמפרטורת החדר במי Milli-Q עד לשימוש.

3. הכנת תמיסת ציפוי פוספוליפידים

  1. מוציאים את סרט השומנים המוכן מהמקפיא של -20 מעלות צלזיוס ומפשירים בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  2. הוסף 3 מ"ל של מי מלח מחוממים מראש (55 מעלות צלזיוס) עם חוצץ פוספט (PBS) לסרט השומנים (60 מ"ג) כדי להגיע לריכוז שומנים סופי של 20 מ"ג/מ"ל. מניחים את הבקבוקונים באמבט מים של 55 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות, מערבולת כל 15 דקות במהירות בינונית (רמה 3 מתוך 5 על מערבל המערבולת).
    הערה: שלב זה משמש להמסת מראש ופיזור אחיד של רכיבי השומנים ב-PBS לפני סוניקציה בשלב 3.5. טמפרטורה זו היא טמפרטורת מעבר הפאזה של DSPC39, המקדמת מסיסות חלקית ומפחיתה את צבירת השומנים. למרות שנדרשת סוניקציה בשלב 3.6 כדי להשיג בהירות אופטית מלאה, הדגירה התרמית המקדימה מאפשרת סוניקציה יעילה וניתנת לשחזור על ידי מזעור היווצרות אגרגטים ליפידים גדולים ושיפור ההומוגניות של הפיזור.
  3. הוסף 0.43 מ"ל של תמיסת פלורוניק F68 לתערובת השומנים כדי להגיע לריכוז מולארי של 10%, כלומר, DSPC: DPPE-PEG5000: פלורוניק F68 = 81: 9: 10 מול. לאחר מכן, הדגימה צריכה להידמות חזותית לאיור 2A, שהוא פתרון מעונן.
    הערה: פלורוניק F68 הוא חומר פעילי שטח המשמש למניעת התלכדות במהלך ייצור מיקרו-בועות חד-דיספרסיות16,40. בהיעדר פלורוניק F68, לא ניתן ליצור מיקרו-בועות מונודיסטריות באמצעות המכשיר המיקרופלואידי Horizon37וניסוח השומנים המתואר בפרוטוקולזה 16. לא נעשה שימוש בפרופילן גליקול בניסוח השומנים, מכיוון שדווח כי תרכובת זו פוגעת הן בפיזור החד-פעמי והן ביציבות של תרחיף המיקרו-בועות המונודיספיזציההמתקבל 38.
  4. להכנת מיקרו-בועות מונודיסטריות עם תווית פלואורסצנטית, שלבו בתערובת צבע שומנים, כגון צבע קרבוציאנין ליפופילי , בשלב זה.
  5. סוניקציה של תערובת השומנים באמבט מים בעוצמה של 100% למשך 20 דקות, תוך שמירה על טמפרטורת המים על 55 מעלות צלזיוס. תמיסת השומנים אמורה להידמות לאיור 2B לאחר 20 דקות, שהיא תמיסה פחות עכורה מאשר בשלב 3.4. המשך סוניקציה במרווחים של 10 דקות עד שהפתרון ברור, כפי שמוצג באיור 2C.
    הערה: עבור הפתרון באיור 2C, היה צורך ב-30 דקות של סוניקציה כדי להשיג פתרון ברור. ניתן לבצע אפיון של תמיסת השומנים על ידי מדידת גודל הליפוזום באמצעות, למשל, מפזר אור דינמי.
  6. הניחו לתמיסת השומנים להתקרר לטמפרטורת החדר לפני עיבוד נוסף.

4. הכנת בקבוקון איסוף מיקרו-בועות

הערה: כדי להבטיח אחסון לטווח ארוך של מיקרו-בועות חד-פיזור, יש צורך בבקבוקון רפואי אטום לגז כבקבוקון איסוף.

  1. אטמו בקבוקון רפואי מזכוכית בנפח 5 מ"ל עם פקק גומי ומלאו את הבקבוקון בגז C4F10 . לאחר מכן, לחץ מכסה אלומיניום סביב הבקבוקון כדי להבטיח את אטימות הגז. בקבוקון האיסוף מוכן כעת לשימוש.

5. הכנת הפלטפורמה המיקרופלואידית

הערה: כפי שמוצג באיור 3A, המערכת כוללת את פלטפורמת Horizon microfluidic37 (להלן 'פלטפורמה מיקרופלואידית'), מחשב עבור בקרה, מצלמה מהירה לניטור תהליך הייצור, מקור אור חיצוני של דיודה פולטת אור (LED) עבור תאורה במהלך הדמיה במהירות גבוהה, ומחולל צורות-גל פונקציות עבור הפעלת הדמיה במהירות גבוהה במרווחי זמן ספציפיים במהלך הייצור. לפני שמתחילים בייצור המיקרו-בועות, יש לנקות את המכשיר כדי להפחית את הסבירות לסתימת הזרבובית. הליך הניקוי כולל גם את הצינור וגם את השבב המיקרופלואידי.

  1. הליך ניקוי צינורות
    1. הפעילו את מתג ההפעלה של הפלטפורמה המיקרופלואידית, הממוקמת בצד ימין (איור 3A).
      הערה: "מתג ההפעלה" מתייחס ליחידת בקרת הכוח הראשית של פלטפורמת Horizon, המפעילה את המיקרו-בקר הפנימי, המשאבות והחיישנים של המערכת.
    2. הניחו בקבוקון זכוכית של 4 מ"ל מלא ב-70% אתנול בצד שמאל של תא משאבת ה-P של הפלטפורמה המיקרופלואידית (איור 3). התחל את זרימת הנוזל ב-100 מיקרוליטר לדקה כך שצינור כניסת הנוזל יישטף עם 70% אתנול מהבקבוקון. עצור את השטיפה על ידי עצירת זרימת הנוזל לאחר 5 דקות.
      הערה: משאבת P מתייחסת ליחידת אספקת הגז מבוקרת הלחץ המשולבת במערכת המיקרופלואידית. שלב זה נועד לנקות את הצינור בלבד; אין לחבר את הצינור לשבב המיקרופלואידי בשלב זה. תהליך זה מסיר אבק מסיס באתנול ומזהמים מהמערכת הנוזלית.
    3. החלף את הבקבוקון המלא באתנול בבקבוקון מלא במים של Milli-Q.
    4. שטפו את הצינור במי Milli-Q ב-100 מיקרוליטר לדקה למשך 5 דקות כדי להסיר שאריות אתנול מהמערכת.
  2. הליך ניקוי שבבים
    1. הפעל את מתג תאורת ה-LED הפנימי של הפלטפורמה המיקרו-נוזלית.
    2. הכנס את שבב ה-PDMS למחזיק.
    3. מקם את הסעפת מעל השבב ואבטח אותה באמצעות הגלגל המתכוונן.
    4. חבר את צינורות הגז, הנוזל והיציאה לשבב ה-PDMS באמצעות פינצטה. תצורת החיבור מוצגת באיור 3B. ודא שצינור היציאה מוביל לבקבוקון לאיסוף תמיסת הפסולת מתהליך הניקוי.
    5. כוונן את הפלטפורמה כדי למקם את זרבובית השבב בשדה הראייה של המטרה.
    6. נקו את השבב במי Milli-Q למשך 5 דקות באמצעות לחץ גז של 1000 מבר וקצב זרימת נוזל של 100 מיקרוליטר לדקה. תחילה התחל את זרימת הגז, ולאחר מכן עקוב אחר זרימת הנוזל.
      הערה: שלב זה הוא ניקוי השבב המיקרופלואידי במעלה הזרם של הזרבובית.
    7. עצור את זרימת הנוזל, ואחריה זרימת הגז.
    8. חבר מחדש את צינורות הגז והיציאה כפי שמוצג ב (איור 3C).
    9. חזור על הליך הכביסה עם מי Milli-Q למשך 5 דקות נוספות, תוך שימוש בלחץ גז של 1000 מבר וקצב זרימת נוזלים של 50 מיקרוליטר לדקה. תחילה התחל את זרימת הגז, ולאחר מכן עקוב אחר זרימת הנוזל.
      הערה: הגדרה זו מנקה את השבב המיקרופלואידי במורד הזרם של הזרבובית.
    10. עצור את זרימת הנוזל, ואחריה זרימת הגז. שבב ה-PDMS מוכן כעת לייצור מיקרו-בועות.

6. הגדרת הדמיה במהירות גבוהה

הערה: כדי לנטר ולשלוט בייצור של מיקרו-בועות מונו-פיזור, מומלץ לשלב מצלמה מהירה עם הפלטפורמה המיקרו-נוזלית, שכן המיקרו-בועה תיווצר בקצב ייצור גבוה מ-105 מיקרו-בועות לשנייה. המצלמה המהירה מאפשרת מדידה של גודל המיקרו-בועות על השבב וקצב הייצור, כמו גם ניטור התלכדות מיקרו-בועות על השבב.

  1. התקן מקור אור LED מעל פלטפורמת ההרכבה (איור 3A) כדי להאיר את השבב המיקרו-נוזלי במהלך הדמיה במהירות גבוהה.
  2. חבר את המצלמה המהירה ליציאת ההדמיה הצדדית של הפלטפורמה המיקרופלואידית.
  3. השתמש במחולל צורות גל של פונקציות חיצוניות כדי להפעיל הקלטות במהירות גבוהה במרווחים של 10 שניות למשך כל ייצור המיקרו-בועות. חבר את יציאת ההדק TTL של מחולל צורות הגל לכניסת ההדק החיצונית של המצלמה המהירה באמצעות כבל BNC סטנדרטי כדי להבטיח רכישה מסונכרנת. ניטור זה נחוץ כדי להעריך את צורת חוט הגז ואת יציבות הגודל של המיקרו-בועות במהלך הייצור.
    הערה: ניטור רציף חשוב, מכיוון שעלולה להתרחש סתימה במהלך הייצור. בנוסף, רצפי התמונות המהירים משמשים לחילוץ התפלגויות גודל מיקרו-בועות על השבב שנפתרו בזמן. ניתן לכוונן מרווח זה של 10 שניות בהתאם לדרישות המשתמש.

7. ייצור ואפיון של מיקרו-בועות מונו-דיספרסיות

  1. לפני תחילת הייצור, הגדר את בקבוקון האיסוף כפי שמוצג באיור 4A. חודרים מחט אחת דרך פקק הגומי כדי לשמש כמחט האיסוף, ומחט נוספת דרך הפקק כמחט אוורור, כאשר קצה המחט ממוקם ליד תחתית הבקבוקון. שמור את בקבוקון האיסוף הפוך באמצעות clamp במהלך הייצור.
    הערה: מחט האוורור מבטיחה לחץ קבוע בתוך הבקבוקון במהלך האיסוף. מכיוון ש-C4F10 כבד יותר מאוויר, הוא אינו יוצא מהבקבוקון באופן ספונטני.
  2. טען את תמיסת הפוספוליפידים המוכנה לתוך משאבת P של הפלטפורמה המיקרופלואידית.
  3. העבר את חלק הזרבובית של השבב לשדה הראייה של המטרה.
    הערה: הפלטפורמה המיקרופלואידית כוללת מודול אופטי פנימי עם זום ומיקוד מתכווננים, ומצמד חיצוני לתושבת F לחיבור מצלמה מהירה.
  4. כדי להתחיל בייצור מיקרו-בועות, הגדר את לחץ הגז ל-800 מבר ואת קצב זרימת הנוזל ל-40 מיקרוליטר לדקה.
    הערה: הפלטפורמה המיקרופלואידית משלבת שתי תעלות נוזל מבוקרות זרימה, 1-5 מיקרוליטר לדקה משמאל, ו-1-100 מיקרוליטר לדקה מימין, ותעלת גז אחת מבוקרת לחץ. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בתעלה הנוזלית של 1-100 מיקרוליטר לדקה ובתעלת גז מבוקרת לחץ.
  5. ברגע שהנוזל מגיע לזרבובית, חוט הגז צובט ומשחרר מיקרו-בועות חד-פיזוריות דרך היציאה (איור 4A).
  6. הגדר את ההקלטה המהירה לקצב פריימים של ≥-200,000 פריימים לשנייה והשתמש בהקלטות מהירות כדי למדוד את גודל המיקרו-בועות המיוצרות באמצעות פונקציית imfindcircles ב-MATLAB.
  7. התאם את לחץ הגז וקצב זרימת הנוזל כדי לשלוט בגודל המיקרו-בועה.
    הערה: לאחר התאמת קצב הזרימה ו/או לחץ הגז, השתמש בסקריפט MATLAB כדי לשרטט את התפלגות הגודל על השבב מההקלטה המהירה. התאמת התפלגות הגודל להתפלגות גאוסית, ניתן לגזור את σ μ וסטיית התקן הממוצעת. ה-μ מייצג את הגודל על השבב של המיקרו-בועות המונו-דיספרסיות המיוצרות. התלכדות מיקרו-בועות עלולה להתרחש בשלב הראשוני של הייצור עקב שאריות מים של Milli-Q בצינורות, המדללות את ריכוז השומנים. בעיה זו נפתרת בדרך כלל ברגע שתמיסת השומנים הלא מדוללת מגיעה לזרבובית. טבלה 2 מסכמת את קוטרי המיקרו-בועות המתקבלים עבור מספר קצבי זרימה מיושמים בלחץ גז קבוע של 800 mbar; שילובים שונים של לחץ גז וקצב זרימת נוזלים יכולים לייצר גדלי מיקרו-בועות דומים, אם כי שילובי פרמטרים שונים משפיעים גם על קצב הייצור. בקצב זרימת גז קבוע, ידוע כי קצב הייצור נמצא בקורלציה חיובית עם קצב זרימת הנוזל41. קצב ייצור המיקרו-בועות בפרוטוקול זה הוא בסדר גודל של ~105 מיקרו-בועות לשנייה, בהתבסס על ניתוח מסגרת אחר מסגרת של ההקלטות המהירות, העולה בקנה אחד עם ערכים שדווחו בעבר עבור גיאומטריות מיקוד זרימה דומות37.
  8. לאחר השגת גודל המיקרו-בועות הרצוי, אסוף את המיקרו-בועות המיוצרות על ידי חיבור צינור היציאה לבקבוקון האיסוף.
  9. במהלך האיסוף, הגדר את ההקלטה המהירה להפעלה כל 10 שניות כדי לפקח על תהליך הייצור.
    הערה: ניתן לכוונן את המרווח בין ההקלטות בהתאם לדרישות ספציפיות.
  10. לאחר איסוף תרחיף מיקרו-בועות מספיק, הסר גם את מחט האוורור וגם את מחט האיסוף מבקבוקון האיסוף.
  11. עצור את זרימת הנוזל, ואחריה זרימת הגז.
  12. אחסן את המיקרו-בועות שנאספו זקוף בטמפרטורת החדר, וודא שהבקבוקון מעורב מכנית מינימלית.
    הערה: לתמיסת המיקרו-בועות יהיו שלוש שכבות כפי שמוצג באיור 5A: שכבת קצף, שכבת מיקרו-בועות חד-פיזורית ותת-נטנט. עדיף להשאיר את שכבת הקצף בבקבוקון, שכן מחקרים קודמים דיווחו כי בועות הקשורות לקצף יכולות להתכווץ בהדרגה לגודל חד-דיספרסי16,38. המיקרו-בועות המיוצרות באמצעות פרוטוקול זה לא עברו הערכת בטיחות רגולטורית. עם זאת, השומנים המרכיבים (DSPC, DPPE-PEG5000) ופעילי שטח (Pluronic F68) נמצאים בשימוש נפוץ בתכשירים להזרקה שאושרו על ידי ה-FDA ונחשבים לתואמים ביולוגית42,43. נדרשת הערכה פרה-קלינית נוספת כדי לבסס בטיחות לשימוש רפואי.
  13. שעתיים לאחר הייצור (כלומר, שעתיים לאחר ייצור המיקרו-בועות המונודיסטריות), מאפיינים את הגודל והריכוז הסופיים של המיקרו-בועות באמצעות מכונת אפיון חלקיקים.
    הערה: מיקרו-בועות מונו-דיספרסיות המיוצרות בשיטת מיקוד הזרימה דורשות כ-90 דקות כדי להתייצב לגודלן הסופי44. לכן, מומלץ לאפשר לפחות שעתיים של ייצוב לפני השימוש במיקרו-בועות.
  14. חבר מחט 19 גרם למזרק מ"ל, המכונה להלן 'מזרק החילוץ'.
  15. הכנס מחט נפרדת של 19 גרם לבקבוקון המיקרו-בועה כמחט אוורור. ודא שקצה המחט נשאר ליד החלק העליון של הבקבוקון כדי לאפשר כניסת אוויר ולשמור על הלחץ הפנימי במהלך מיצוי המיקרו-בועות.
  16. סובב בעדינות את הבקבוקון כדי להומוגניזציה של המתלה. ההשעיה תיפרד לשלוש שכבות: שכבת קצף עליונה, שכבה אמצעית המכילה מיקרו-בועות חד-פיזוריות ושכבה מימית תחתונה.
  17. הכנס במהירות את מזרק החילוץ ומקם בזהירות את קצה המחט באמצע שכבת המיקרו-בועות המונודיסטרית, הימנע מהקצף ומשכבת המשנה המימית התחתונה. משוך את הנפח הרצוי של תרחיף המיקרו-בועות והסר את מזרק החילוץ מהבקבוקון. לאחר השלמת מיצוי המיקרו-בועות, הסר את מחט האוורור.

8. נוהל ניקוי וכיבוי

הערה: לאחר ייצור מיקרו-בועות, יש לנקות היטב את הפלטפורמה המיקרופלואידית והשבב כדי להבטיח תפקוד תקין ולאפשר שימוש חוזר בשבב. השלבים הבאים מתארים את תהליך הניקוי.

  1. עבור השבב, המשך באופן הבא:
    1. החלף את בקבוקון השומן בבקבוקון מים Milli-Q.
    2. שטוף את השבב המיקרופלואידי באמצעות לחץ גז של 800 mbar וקצב זרימת נוזל של 40 μL/min למשך 5 דקות.
    3. עצור תחילה את זרימת הנוזל, ולאחר מכן עצור את זרימת הגז.
    4. נתק רק את צינור כניסת הגז מהשבב המיקרופלואידי.
    5. מלאו את השבב המיקרופלואידי במי Milli-Q כדי לשמור על ההידרופיליות של המשטחים הפנימיים.
    6. עצור את זרימת הנוזל ונתק את כל הצינורות שנותרו מהשבב.
    7. אחסן את השבב במי Milli-Q עד שיידרש לשימוש עתידי.
  2. עבור המערכת המיקרופלואידית, המשך באופן הבא:
    1. החלף את בקבוקון המים Milli-Q בבקבוקון אתנול של 70% בפלטפורמה המיקרופלואידית.
    2. שטפו את צינורות כניסת הנוזל עם 70% אתנול בקצב זרימה של 100 מיקרוליטר לדקה למשך 5 דקות כדי להסיר שאריות שומנים.
    3. החלף את בקבוקון האתנול בבקבוקון מים Milli-Q ב-P-Pump1.
    4. שטפו את הצינור במי Milli-Q ב-100 מיקרוליטר לדקה למשך 5 דקות כדי להסיר שאריות אתנול מהמערכת. המערכת נקייה כעת.
    5. כבה את הפלטפורמה המיקרופלואידית ואת מערכת המצלמות המהירות.

9. שלבים לפתרון בעיות

  1. חסימת זרבובית
    הערה: בהתחשב בגודל הקטן של הזרבובית (5 מיקרומטר), עלולות להתרחש חסימות במהלך תהליך הייצור. כדי לנקות את הסתימה, בצע את השלבים הבאים.
    1. עצור מיד את זרימת הנוזל, ואחריה זרימת הגז.
    2. חבר מחדש את הצינור בהתאם להגדרה המוצגת באיור 3B.
    3. החלף את הבקבוקון המלא בפוספוליפידים בבקבוקון מלא במים Milli-Q ב-P-Pump1.
    4. הפעל לחץ גז של 1000 mbar והגדר את קצב זרימת הנוזל ל-100 μL/min למשך 5 דקות כדי לשטוף את הזרבובית.
      הערה: ברוב המקרים, חסימות מתנקות לאחר שטיפה של 5 דקות. עם זאת, אם החסימה נמשכת, ייתכן שיהיה צורך להחליף את שבב ה-PDMS בחדש.
    5. לאחר ניקוי הסתימה, חבר מחדש את הצינור כפי שמצוין באיור 3C.
    6. שטפו את השבב שוב במי Milli-Q למשך 5 דקות, תוך שימוש בלחץ גז של 1000 mbar וקצב זרימת נוזל של 50 μL/min כדי להבטיח מרווח מלא.
    7. החלף את הבקבוקון המלא במים Milli-Q בבקבוקון מלא פוספוליפידים ב-P-Pump1, והמשך את ייצור המיקרו-בועות.
      הערה: אם החסימות נמשכות במהלך הייצור, הדבר עשוי להצביע על ניקוי לא מספיק של הצינור או השבב המיקרופלואידי. במקרה זה, נתק את הצינור מהשבב ובצע את הליך הניקוי המתואר בשלב 5. אם חסימות ממשיכות להתרחש לאחר ניקוי יסודי של המערכת כולה, זה יכול להצביע על כשל במסנן הפנימי בפלטפורמה המיקרופלואידית. החלפת המסנן בחדש עשויה לפתור את הבעיה.
  2. השתמש שוב בשבב המיקרופלואידי אם תרצה.
    הערה: אם השבב אינו מאוחסן כראוי, הוא עלול לאבד הידרופיליות. אם זה קורה, הצביטה של חוט הגז עשויה להידמות לדפוס המוצג באיור 5E. במקרים כאלה, מומלץ לעבור לשבב חדש הידרופילי כדי להבטיח ייצור מיקרו-בועות עקבי ואמין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לייצור מיקרו-בועות חד-דיספיריות יציבות בטמפרטורת החדר באמצעות שבב מיקרופלואידי ממקד זרימה. שבב ה-PDMS מיוצר על ידי יציקה מתבנית מאסטר, כפי שמוצג באיור 1. כדי לחבר את שבב ה-PDMS למגלשת זכוכית, נעשה שימוש בטיפול בפלזמה. טיפול בפלזמה הוא חיוני מכיוון שהוא משנה את פני השטח של ה-PDMS מהידרופובי להידרופילי. הידרופיליות זו חיונית לשמירה על הצורה והמיקום של חוט הגז במהלך ייצור מיקרו-בועות, ומאפשרת יצירה יציבה לטווח ארוך (בסדר גודל של שעות) של מיקרו-בועות חד-פיזוריות בגו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לייצר ולאחסן מיקרו-בועות מונו-דיספרסיות יציבות בטמפרטורת החדר באמצעות שבב ממקד זרימה מיקרופלואידי. ניתן להשתמש במיקרו-בועה חד-דיסטרית להדמיית אולטרסאונד משופרת ניגודיות18, חישת לחץ לא פולשנית19 ואספקת תרופות בתיווך מיקרו-בועות22, הן במבחנה והן ב-vivo.

בעבר דווח כי ייצוב של מיקרו-בועות חד-פיזוריות לאחר הייצור דורש לפחות 90 דקות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק 805308) ובחלקה על ידי מדעים יישומיים והנדסיים TTW (VIDI-project 17543), חלק מ-NWO, שניהם הוענקו ל-K.K. הפלטפורמה המיקרופלואידית של Horizon פותחה במימון מענקי EPSRC (מענקים מס' EP/I000623 ו-EP/K023845). המחברים מודים לקונסורציום המיקרו-בועות (http://www.microbubbles.leeds.ac.uk/) באוניברסיטת לידס על דיונים מועילים, כמו גם לסטיוארט ווסטון ואנדרו פרייס על עזרתם בהמשגת המכשיר וייצור חלקים עבור פלטפורמת Horizon Microfluidic. תבנית המאסטר לייצור שבבי ה-PDMS סופקה באדיבות על ידי אוניברסיטת לידס. המחברים מודים לרוברט בורסקנס מהנדסה ביו-רפואית, המחלקה לקרדיולוגיה, ולחירט ספרינגלינג מהמחלקה למכשור רפואי ניסיוני, שניהם מ-Erasmus MC, הולנד, על הסיוע הטכני במהלך הניסויים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ניקוב ביופסיה 1 מ"מ קאי מדיקל143831
1,1'-דיוקטדציל-3,3,3',3'-טטרמתיל-אינדודיקרבוציאנין (DiD)תרמו פישר סיינטיקD307צבע קרבוציאנין ליפופילי
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[carbonyl-methoxypolyethylene glycol] (DPPE-PEG5000)ליפואידCAS-לא. 384835-61-4
1,2-דיסטארויל-SN-גליצרו-3-פוספוכולין (DSPC)ליפואידCAS-לא. 816-94-4
גליל מדידת זכוכית 100 מ"לבלאוברנד
צלוחיות זכוכית נפחיות 2 מ"לבלאוברנד
זכוכית 250 מ"ל Erlenmeyerבלאוברנד
בקבוקון זכוכית 30 מ"ל DWK מדעי החייםSCERC40752700D0C2
70% אתנול
75 מעלות; פלטה חמה C 
סרט דבק
כובע אלומיניום סיגמא-אולדריץ'27016
גז ארגון  לינדה גז בנלוקס
גז C4F10F2 כימיקלים
כלורופורםMerck KGaA67-66-3
זמין בקליניקה  חומר ניגוד אולטרסאונד (כלומר, מיקרו-בועה)Bracco,
Plan-LesOuates, שוויץ		סונווואיור 6A.
מחט איסוף ואוורור 19G100 סטריקני4657799
קולטר מונה מולטיסייזר 3בקמן קולטרמכונת אפיון חלקיקים
חומר ניגוד אולטרסאונד בהתאמה אישית (כלומר, מיקרו-בועה מונודיספרס)נהF1-10PFאיור 6A. הופק כמתואר על ידי: Wang, Y. et al. השפעת פלורוניק F68 על יציבות הגודל וההתנהגות האקוסטית של מיקרו-בועות מצופות פוספוליפידים מונודיסטריות המיוצרות בטמפרטורת החדר. ACS Appl. Mater. ממשקים 2025, 17, 8976−8986. (2025).
חומר ניגוד אולטרסאונד בהתאמה אישית (כלומר, מיקרו-בועה מונודיספרס)נהF2-10 PFאיור 6A. הופק כמתואר על ידי: Wang, Y. et al. השפעת פלורוניק F68 על יציבות הגודל וההתנהגות האקוסטית של מיקרו-בועות מצופות פוספוליפידים מונודיסטריות המיוצרות בטמפרטורת החדר. ACS Appl. Mater. ממשקים 2025, 17, 8976−8986. (2025).
דמי מים
נורת LED חיצוניתGSVITECGS02370
מייבש הקפאהמרטין קרייסט בע"מאלפא 1– 2 LD פלוס
מחולל צורות גל פונקציה זריזברקוד 33220א
בקבוקון זכוכית אטום לגזסיגמא-אולדריץ'Z113964-288EA
מגלשת זכוכיתVWR631-1552
מצלמה מהירהפוטרוןנובה S16
פלטפורמה מיקרופלואידית אופקאוניברסיטת לידס, אנגליההפלטפורמה זמינה מסחרית ומתוארת בפירוט ב: Abou-Saleh, R. H. et al. Horizon: פלטפורמה מיקרופלואידית לייצור מיקרו-בועות וננו-בועות טיפוליות. סקירת מכשירים מדעיים. 92 (7), 074105 (2021).
מטלבעבודות המתמטיקהR2023a
מתנולMerck KGaA67-56-1
מי Milli-Q
ג'ל PDMSסילגארדSYLGARD®   184
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS 1x) ג'יבקו10010023
מנקה פלזמההניקר סיינטיפיקHPT-100
פלורוניק F68תרמו פישר סיינטיפיק24040032
פקק גומיסיגמאZ166065-100EA
אבוביםמאסטרפלקסMFLX06407-41PTFE, מזהה 1/32 אינץ' x 1/16 אינץ' OD; 25 רגל
פינצטה
וורטקס סיגמא-אולדריץ'Z654779
סוניקטור אמבט מיםEMAGEMMI 30HC

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kooiman, K., et al. Ultrasound-responsive cavitation nuclei for therapy and drug delivery. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  2. Langeveld, S. A. G., Meijlink, B., Kooiman, K. Phospholipid-coated targeted microbubbles for ultrasound molecular imaging and therapy. Curr Opin Chem Biol. 63, 171-179 (2021).
  3. Frinking, P., et al. Three decades of ultrasound contrast agents: A review of the past, present and future improvements. Ultrasound Med Biol. 46 (4), 892-908 (2020).
  4. Greis, C. Ultrasound contrast agents as markers of vascularity and microcirculation. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (1-2), 1-9 (2009).
  5. Correas, J. M., et al. Ultrasound contrast agents. Examples of blood pool agents. Acta Radiol Suppl. 412, 101-112 (1997).
  6. Kooiman, K., et al. Acoustic behavior of microbubbles and implications for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 72C, 28-48 (2014).
  7. de Jong, N., et al. Ultrasonic characterization of ultrasound contrast agents. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 861-873 (2009).
  8. Cosgrove, D., Harvey, C. Clinical uses of microbubbles in diagnosis and treatment. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 813-826 (2009).
  9. Langeveld, S. A. G., et al. The impact of lipid handling and phase distribution on the acoustic behavior of microbubbles. Pharmaceutics. 13 (1), 119(2021).
  10. Dicker, S., et al. Influence of shell composition on the resonance frequency of microbubble contrast agents. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1292-1302 (2013).
  11. Doinikov, A. A., Haac, J. F., Dayton, P. A. Resonance frequencies of lipid-shelled microbubbles in the regime of nonlinear oscillations. Ultrasonics. 49 (2), 263-268 (2009).
  12. Sennoga, C. A., et al. Evaluation of methods for sizing and counting of ultrasound contrast agents. Ultrasound Med Biol. 38 (5), 834-845 (2012).
  13. Schneider, M., et al. Br1: A new ultrasonographic contrast agent based on sulfur hexafluoride-filled microbubbles. Invest Radiol. 30 (8), 451-457 (1995).
  14. Wang, S., et al. Microbubble type and distribution dependence of focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 40 (1), 130-137 (2014).
  15. Whittingham, T. A. Contrast-specific imaging techniques: Technical perspective. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2005).
  16. Wang, Y., et al. Influence of pluronic f68 on size stability and acoustic behavior of monodisperse phospholipid-coated microbubbles produced at room temperature. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2025).
  17. Segers, T., de Jong, N., Versluis, M. Uniform scattering and attenuation of acoustically sorted ultrasound contrast agents: Modeling and experiments. J Acoust Soc Am. 140 (4), 2506(2016).
  18. Segers, T., et al. Monodisperse versus polydisperse ultrasound contrast agents: Non-linear response, sensitivity, and deep tissue imaging potential. Ultrasound Med Biol. 44 (7), 1482-1492 (2018).
  19. van Hoeve, W., et al. Improved sensitivity of ultrasound-based subharmonic aided pressure estimation using monodisperse microbubbles. J Ultrasound Med. 41 (7), 1781-1789 (2022).
  20. Wang, P., et al. Sensitivity improvement of subharmonic-based pressure measurement using phospholipid-coated monodisperse microbubbles. Ultrason Sonochem. 104, 106830(2024).
  21. Spiekhout, S., et al. Ambient pressure sensitivity of subharmonic vibrating single microbubbles. Ultrasound Med Biol. 51 (6), 931-940 (2025).
  22. van Elburg, B., et al. Dependence of sonoporation efficiency on microbubble size: An in vitro monodisperse microbubble study. J Control Release. 363, 747-755 (2023).
  23. Goertz, D. E., et al. Attenuation and size distribution measurements of definity and manipulated definity populations. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1376-1388 (2007).
  24. Emmer, M., et al. Pressure-dependent attenuation and scattering of phospholipid-coated microbubbles at low acoustic pressures. Ultrasound Med Biol. 35 (1), 102-111 (2009).
  25. Feshitan, J. A., et al. Microbubble size isolation by differential centrifugation. J Colloid Interface Sci. 329 (2), 316-324 (2009).
  26. Pulsipher, K. W., et al. Engineering theranostic microbubbles using microfluidics for ultrasound imaging and therapy: A review. Ultrasound Med Biol. 44 (12), 2441-2460 (2018).
  27. Castro-Hernández, E., et al. Microbubble generation in a co-flow device operated in a new regime. Lab Chip. 11 (12), 2023(2011).
  28. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
  29. Xu, S., et al. Generation of monodisperse particles by using microfluidics: Control over size, shape, and composition. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (5), 724-728 (2005).
  30. Stride, E., et al. Microbubble agents: New directions. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1326-1343 (2020).
  31. Segers, T., et al. Improved coalescence stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at elevated temperatures. Lab Chip. 19 (1), 158-167 (2019).
  32. Dixon, A. J., et al. Enhanced intracellular delivery of a model drug using microbubbles produced by a microfluidic device. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1267-1276 (2013).
  33. Borden, M. A., Longo, M. L. Dissolution behavior of lipid monolayer-coated, air-filled microbubbles: Effect of lipid hydrophobic chain length. Langmuir. 18 (24), 9225-9233 (2002).
  34. Daeichin, V., et al. Microbubble composition and preparation for high-frequency contrast-enhanced ultrasound imaging: In vitro and in vivo evaluation. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 64 (3), 555-567 (2017).
  35. Chen, W., et al. Determination of the main phase transition temperature of phospholipids by nanoplasmonic sensing. Sci Rep. 8 (1), 14815(2018).
  36. Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Adv Colloid Interface Sci. 183-184, 82-99 (2012).
  37. Abou-Saleh, R. H., et al. Horizon: Microfluidic platform for the production of therapeutic microbubbles and nanobubbles. Rev Sci Instrum. 92 (7), 074105(2021).
  38. Segers, T., et al. Universal equations for the coalescence probability and long-term size stability of phospholipid-coated monodisperse microbubbles formed by flow focusing. Langmuir. 33 (39), 10329-10339 (2017).
  39. Kaneshina, S., et al. Barotropic phase transitions of dioleoylphosphatidylcholine and stearoyl-oleoylphosphatidylcholine bilayer membranes. Biochim Biophys Acta. 1374 (1-2), 1-8 (1998).
  40. Shih, R., et al. Flow-focusing regimes for accelerated production of monodisperse drug-loadable microbubbles toward clinical-scale applications. Lab Chip. 13 (24), 4816(2013).
  41. Cleve, S., et al. Microbubble formation by flow focusing: Role of gas and liquid properties, and channel geometry. J Fluid Mech. 972, A27(2023).
  42. Rodeheaver, G. T., et al. Pluronic f-68: A promising new skin wound cleanser. Ann Emerg Med. 9 (11), 572-576 (1980).
  43. Moloughney, G., Weisleder, J. Poloxamer 188 (p188) as a membrane resealing reagent in biomedical applications. Recent Pat Biotechnol. 6 (3), 200-211 (2012).
  44. Segers, T., et al. Stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at high production rates. Langmuir. 32 (16), 3937-3944 (2016).
  45. Izadiamoli, S., et al. A comprehensive experimental approach to understanding the effects of surface wettability on bubble formation at submerged orifices. Energy Equip Syst. 13 (2), 169-191 (2025).
  46. Dollet, B., et al. Role of the channel geometry on the bubble pinch-off in flow-focusing devices. Phys Rev Lett. 100 (3), 034504(2008).
  47. Shih, R., Lee, A. P. Post-formation shrinkage and stabilization of microfluidic bubbles in lipid solution. Langmuir. 32 (8), 1939-1946 (2016).
  48. Segers, T., et al. Foam-free monodisperse lipid-coated ultrasound contrast agent synthesis by flow-focusing through multi-gas-component microbubble stabilization. Appl Phys Lett. 116 (17), 173701(2020).
  49. Beekers, I., et al. Internalization of targeted microbubbles by endothelial cells and drug delivery by pores and tunnels. J Control Release. 347, 460-475 (2022).
  50. Beekers, I., et al. Opening of endothelial cell-cell contacts due to sonoporation. J Control Release. 322, 426-438 (2020).
  51. Zhang, W. Q., et al. Influence of molecular weight of polydimethylsiloxane precursors and crosslinking content on degree of ethanol swelling of crosslinked networks. React Funct Polym. 86, 264-268 (2015).
  52. Ren, K., et al. Materials for microfluidic chip fabrication. Acc Chem Res. 46 (11), 2396-2406 (2013).
  53. Segers, T., et al. High-precision acoustic measurements of the nonlinear dilatational elasticity of phospholipid coated monodisperse microbubbles. Soft Matter. 14 (47), 9550-9561 (2018).
  54. Jeong, H. H., et al. Liter-scale production of uniform gas bubbles via parallelization of flow-focusing generators. Lab Chip. 17 (15), 2667-2673 (2017).
  55. Jiang, C., et al. Microfluidic-assisted formation of multifunctional monodisperse microbubbles for diagnostics and therapeutics. Micro Nano Lett. 6 (6), 417(2011).
  56. Hashimoto, M., et al. Formation of bubbles and droplets in parallel, coupled flow-focusing geometries. Small. 4 (10), 1795-1805 (2008).
  57. Maskarinec, S. A., et al. Direct observation of poloxamer 188 insertion into lipid monolayers. Biophys J. 82 (3), 1453-1459 (2002).
  58. Frey, S. L., Lee, K. Y. C. Temperature dependence of poloxamer insertion into and squeeze-out from lipid monolayers. Langmuir. 23 (5), 2631-2637 (2007).
  59. Borden, M. A., et al. Lateral phase separation in lipid-coated microbubbles. Langmuir. 22 (9), 4291-4297 (2006).
  60. Borden, M. A., et al. Surface phase behavior and microstructure of lipid/peg-emulsifier monolayer-coated microbubbles. Colloids Surf B Biointerfaces. 35 (3-4), 209-223 (2004).
  61. van den Broek, M. R. P., et al. Functionalized monodisperse microbubble production: Microfluidic method for fast, controlled, and automated removal of excess coating material. Microsyst Nanoeng. 10 (1), 120(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDMSPluronic F68
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים