הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עכברי של הישנות לוקמיה לכימותרפיה אינדוקציה ללוקמיה לימפובלסטית חריפה

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68797

⸱

17 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול נועד לתאר מודל עכברי ליצירת הישנות של לוקמיה לימפובלסטית חריפה, בהתבסס על הדינמיקה של התגובה לכימותרפיה אינדוקציה.

תקציר

לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) היא ניאופלזמה של תאי מבשר לימפואידים לא בשלים ואחת הממאירות הנפוצות ביותר בילדות. למרות ששיעורי הריפוי ב-ALL בילדים מתקרבים ל-90%, הישנות ועמידות לתרופות נותרו אתגרים. בהקשר זה, חקר ביולוגיה של סרטן in vivo הוא חיוני, ונעשה שימוש נרחב ב-xenografts שמקורם בחולה (PDX) באמצעות מודלים של עכברים למטרה זו. עם זאת, PDX מדגימות חוזרות - או בהשוואה לדגימות אבחנתיות - אינן מעריכות באופן מלא את המנגנונים מאחורי התחלה והתקדמות של הישנות. פרוטוקול זה מסתמך על יצירת הישנות B-ALL PDX בעכברים, המאפשר איסוף של תאים לוקמיים לאורך תהליך רכישת עמידות לתרופות. בעלי חיים שהושתלו בתאי B-ALL PDX מטופלים בשילוב של ארבע תרופות המשמשות בדרך כלל בטיפול ALL, המייצגות מנגנוני פעולה נפרדים: דקסמתזון, וינקריסטין, L-אספרגינאז ודאונורוביצין. לאחר שלב השראת הפוגה של 4 שבועות, בעלי חיים מנוטרים להישנות במהלך תקופת מנוחה. מחזור הטיפול וההישנות חוזר על עצמו עד שזמן ההישנות מתקצר, ומשמש כתחליף לעמידות מוגברת לתרופות in vivo. כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס הישנות ועמידות, תאים לוקמיים נאספים לפני ואחרי כל מחזור טיפול לניתוח פנוטיפי וגנטי. כדי לאמת את המודל, נבדקו דגימות שונות של ALL בילדים, כולל מגיבים טובים וגרועים, כפי שהוערך על ידי נוכחות בלסטים בדם היקפי לאחר 7 ימים של טיפול בקורטיקוסטרואידים ועל ידי מחלה שיורית מינימלית (MRD) בימים 15, 33 ו-78/96. התוצאות שנצפו בעכברים היו עקביות עם נתוני המטופלים, ואישרו את דיוק המודל בחיקוי התגובה הקלינית לכימותרפיה. גישה זו מאפשרת מחקר דינמי של הישנות ועמידות לתרופות ב-B-ALL, תומכת בחקירות מכניסטיות ובפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

מבוא

לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) היא הסרטן השכיח ביותר בקרב ילדים. למרות שיעורי הריפוי הגבוהים שהושגו בעשורים האחרונים עם הישרדות כוללת של 5 שנים שהגיעה ל-90% במדינות בעלות הכנסה גבוהה1 ומאמצים גדולים בחיפוש אחר אסטרטגיות טיפוליות חדשות, במדינות מפותחות, 15%-20% מהחולים חוזרים מהמחלה, למי שיעור ההישרדות נע בין 30%-60% תלוי אם ההישנות הראשונה מתרחשת מוקדם (מתחת ל-18 חודשים) או מאוחר יותר (36 חודשים) לאחר האבחון2, 3. לאור זאת, עקשן והישנות נותרו אתגרים שיש להתגבר עליהם. מבחינת האבחנה, ALL עקשן נבדל מהישנות על ידי רגישות לקויה לכימותרפיה, בעוד שהישנות ALL מאופיינת בהישנות המחלה לאחר תקופה של הפוגה. כמו בסוגי סרטן אחרים, ALL מאופיין בהפרעות גנטיות, כולל אנופלואידים, סידורים מחדש של כרומוזומים ומוטציות גנטיות שונות הקשורות לתגובות טיפוליות שונות ולסיכון להישנות4. מכיוון שכל ההישנות מתרחשות בתדירות גבוהה יותר בחולים בסיכון גבוה - שכבר קיבלו כימותרפיה בעצימות מקסימלית - סביר להניח שהתאמות נוספות למינונים או שילובים של תרופות לא יספיקו. במקום זאת, יש להפנות את המאמצים לזיהוי המנגנונים העומדים בבסיס עמידות והישנות לתרופות.

לאור זאת, חוקרים ניסו להבין כיצד לחץ הברירה המופעל על ידי כימותרפיה תורם להופעתם של תאים עמידים. רוב הספרות הקיימת מייחסת הישנות להתפשטות של תת-שבט ממאיר עמיד שכבר היה קיים בזמן האבחנה5. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה מצביע על קיומם של מנגנונים חלופיים, כגון שינויים אפיגנטיים המווסתים תוכניות שעתוק, שעשויים גם לתרום להישנות6.

מאמץ ניכר הוקדש ליצירת מודלים מדויקים in vivo לחקר כל ההישנות של כל ההישנות . עכברים חסרי חיסון שימשו בהצלחה להשתלת ALL, תוך שמירה על מאפייני המחלה המקוריים 7,8, מה שהוביל לפיתוח קסנוגרפטים שמקורם בחולה (PDX). מודל זה מאפשר השתלבות והתפשטות של תאי גידול/לוקמיה מקוריים במיקרו-סביבה תואמת. אחד היתרונות העיקריים שלו הוא היכולת להעריך את התגובה של תאי ALL מושתלים לכימותרפיה9.

מודלים של PDX שימשו גם כדי לחקות ולחקור את כל ההישנות של כל ההתקפים. לדוגמה, פרוטוקול שפותח על ידי סמואלס ואחרים.10 השתמש בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים / חסרי חיסון משולב חמור (NOD/SCID) שהושתלו בתאי לוקמיה של חולים כדי לחקור מנגנוני עמידות למשטר כימותרפיה דמוי אינדוקציה. המחברים תיארו את הטיפול בווינקריסטין, דקסמתזון, L-אספרגינאז ודאונורוביצין (VXLD) וסיפקו דוגמאות למספר מחזורי הטיפול ותזמון הישנות. עם זאת, המודל התמקד בניתוח תאים מיד לאחר הטיפול - אלה ששרדו את הטיפול הראשוני - ככל הנראה מייצגים מחלה שיורית מינימלית (MRD) ולא הישנות.

מחקר עדכני יותר העריך אם טיפול קצר טווח ב-NOD מושתל ALL. עכברים חסרי חיסון Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NOD scid gamma, או NSG) יכולים לחזות הישנות בחולים מקבילים11. דגימות ALL בסיכון בינוני - הן מחולים התקפיים והן מחולים שאינם התקפיים - הושתלו בעכברים וטופלו במשטר דמוי אינדוקציה המורכב מווינקריסטין, דקסמתזון ו-L-אספרגינאז (VXL). זמן ההשתלה וההישנות שלאחר הטיפול נמדדו והושוו. התוצאות הצביעו על כך שמודל PDX זה יכול לשמש ככלי פרוגנוסטי לחיזוי תוצאות המטופלים. ממצא זה תומך בתועלת של מודלים של עכברי PDX בחקר הביולוגיה של כל ההישנות של ALL. לדוגמה, ניתן היה לבחון תאים חוזרים בנקודות זמן שונות כדי לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס הישנות.

בכתב היד הזה, אנו מציגים שיפורים במודל עכברי PDX לחקר הישנות B-ALL. אנו שואפים לחקור את הישנות המחלה ואת המאפיינים של תאים חוזרים לאחר עיצובם על ידי כימותרפיה אינדוקציה. משטר דמוי אינדוקציה של ארבע תרופות - וינקריסטין, דקסמתזון, L-אספרגינאז ודאונורוביצין - תוקנן, תוך שימוש בזן עכברי NSG. ידוע כי לזן זה יש מגבלות בעמידה במחזורי כימותרפיה חוזרים ונשנים עקב מוטציית Prkdcscid ורגישות מוגברת ללחץ גנוטוקסי12. לכן, משקל גוף בעלי החיים נוטר כסמן לרעילות הטיפול. ניתן לחלק את מודל ההישנות של B-ALL לשלושה שלבים עיקריים: (1) השתלת תאי ALL בעכברים, במטרה להגיע לסף השתלה של 0.2-1% תאי CD45⁺ אנושיים בדם היקפי; (2) 4 שבועות של טיפול כימותרפי, ולאחר מכן תקופת מנוחה עד להישנות הראשונה (R1); ו-(3) עם גילוי R1, חזרו על מחזורי טיפול מסוג אינדוקציה של שבוע אחד. הישנות עוקבות (R2, R3... RN) עלולה להתרחש, והמרווח בין הטיפול להישנות (Δt) נרשם. קיצור מתקדם של Δt מתפרש כאינדיקציה לעמידות נרכשת לתרופות. כחלק מחקירות מעמיקות יותר של מנגנוני הישנות, ניתן לאסוף תאי B-ALL לפני ואחרי שלבים שונים של הפרוטוקול. חשוב להדגיש כי בהתאם לזמן שבין התרחשות ההישנות להתאוששות התאים, ייתכן שהמנגנונים האינהרנטיים של תופעה זו לא יישמרו. לאור זאת, חשוב ביותר שתאי הישנות ייאספו במהירות לאחר אישור הישנות. התאים שנאספו יכולים לשמש לניתוחים פנוטיפיים וגנטיים עתידיים, כולל הערכות של דינמיקת מחזור התא, נדידת תאים, תדירות תאים יוזמי לוקמיה, שינויים כרומוזומליים ושינויים אפיגנטיים, בין היתר.

למטרות מאמר זה, נתמקד בתיאור מודל העכבר החוזר. מידע מפורט יינתן עבור שלושת שלבי הניסוי - השתלה, טיפול עד להישנות ראשונה (R1), וטיפול מחזורי עד להישנות מרובות (R2, R3...). אנו מקווים שמודל זה יאפשר לחוקרים לייצר תאי B-ALL עמידים לכימותרפיה מתת-סוגים מגוונים, מה שיאפשר חקירה מעמיקה יותר של השינויים התאיים והמולקולריים הקשורים להישנות. בסופו של דבר, זה עשוי לתרום להבנה טובה יותר של מנגנוני ההתנגדות ולהקל על פיתוח טיפולים יעילים ומותאמים אישית יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי התקנות וההנחיות האתיות של Comissão de Ética no Uso de Animais מ-Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0047-2024). דגימות הלוקמיה ששימשו במחקר זה התקבלו מבקבוקונים ביולוגיים של חולים שטופלו בסנטרו אינפנטיל בולדריני, שאפשרו את השימוש בתאים שלהם באמצעות טופס הסכמה מדעת. הפרויקט אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית (CAAE 34601120.7.0000.5376).

1. השתלת תאי לוקמיה וניטור חריטה

  1. הכנת דגימות לוקמיה להשתלת עכבר
    1. הפשירו בעבר דגימות בהקפאה של כל התאים שנלקחו משאיבת מח העצם של המטופל. יש להשתמש באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הפשירו את הדגימות על ידי הזזת צינור הקירור בתנועה מעגלית.
    2. העבירו את הדגימה המופשרת לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. הוסף לדגימה 14 מ"ל של PBS סטרילי 1x כדי לשטוף את התאים ולהסיר את תמיסת השימור בהקפאה. צנטריפוגה את הצינור ב -300 x גרם למשך 5 דקות. הסר את ה-supernatant.
  2. הכנת תמיסת השתלה
    1. השעו מחדש את התאים המופשרים ב-PBS סטרילי 1x. השתמש ב-5-10 x 106 תאים ברי קיימא בנפח של 100 מיקרוליטר PBS עבור כל בעל חיים להשתלה. שמור את תמיסת ההשתלה על קרח עד ההשתלה.
      הערה: תאים נספרו לפי השיטה החצי אוטומטית13.
  3. השתלת עכברים
    1. בחר NOD זכר או נקבה בן חודשיים. עכברי Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) להשתלת לוקמיה.
      הערה: כדי לשמור על תכנון ניסוי הומוגני ללא התערבות מינית של בעלי חיים, דגימות ה-ALL הושתלו בשני מיני העכברים, מה שמבטיח שכל הלוקמיות המגיבות הטובות והגרועות מיוצגות באופן שווה בשני המינים. כתוצאה מכך, מצאנו שעכברים נקבות משתלטים מוקדם יותר מעכברים זכרים. בהתחשב בכך, כדי למנוע התערבות אפשרית של מין עכבר בניתוחים עתידיים (כגון קינטיקה של השתלה), אנו מציעים להשתמש רק במין עכבר אחד בעת עבודה עם אותה דגימת לוקמיה. לא נעשה שימוש בפרמטרים אחרים כדי להעדיף מין אחד על פני השני.
    2. הנח עכבר אחד בכל פעם במלכודת עכברים מאובטחת ומאושרת כדי להבטיח הכלה נכונה של החיה. ודא שזנב החיה נמצא מחוץ למלכודת ונגיש בקלות להשתלה.
      הערה: תאי לוקמיה מושתלים בעכברים על ידי הזרקה תוך ורידית (i.v). פרוטוקולים מבוססים משתמשים בוורידים הצדדיים של הזנב למטרה זו11.
    3. השתמש באור אינפרא אדום כדי להבטיח הרחבה נכונה של הווריד. הזרקת 100 מיקרוליטר של תמיסת ההשתלה באמצעות מחט הזרקה סטרילית, חדה וחד פעמית. שמור את העכברים המושתלים במתקן ספציפי נטול פתוגנים. הניחו להם לנוח במשך 15 יום.
      1. כדי להשתמש באור האינפרא אדום, שמור את החיה המרוסנת כבר מחוץ לכלוב ובמרחק של 30 ס"מ מהאור. בהתאם לעוצמת האור הפוטנציאלית, התאם את זמן החשיפה. בעת שימוש באור בעוצמה בינונית, מספיקה תקופה של 5 דקות בכדי להבטיח הרחבת ורידים. השארת הזנב חשוף לתקופה ארוכה יותר עלולה לגרום לכוויות ולחץ לבעל החיים.
      2. לצורך ההזרקה השתמש במזרק אינסולין עם מחט מחוברת, בנפח 1 מ"ל וגודל מחט של 12.7 מ"מ על 0.33 מ"מ. את המפרט של המחט המשמשת ניתן למצוא בטבלת החומרים. שמרו על עכברים במשטר מחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות. בנוסף, יש לשכן את בעלי החיים ששימשו במחקר זה בכלוב פוליקרבונט ענבר שקוף הניתן לחיטוי עם העשרה סביבתית ליצירת קנים.
  4. איסוף דם היקפי
    1. אסוף דגימת דם היקפית של 50 מיקרוליטר מכל עכבר שבועיים לאחר החיסון וכל שבוע לאחר מכן.
    2. רסנו ידנית את החיה ביד שמאל, וודאו שראשו מוחזק היטב. ביד ימין, השתמש ברומח סטרילי, חד וחד פעמי כדי לנקב את וריד הפנים של מקלעת התת-לסת של החיה.
      הערה: זהו הליך שעלול להזיק לעכברים ויש לעשות זאת בזהירות.
      1. ודא שהחיה יכולה לנשום בקלות במהלך האיפוק. שימו לב לשינויים בקצב הנשימה (קוצר נשימה) ושינויים בצבע הפה (הוא לא אמור להפוך לסגול או כחול כהה). אם מקלעת הלסת התחתונה אינה מנוקבת כהלכה, עלול להתרחש דימום באוזן עקב ניקוב תעלת האוזן. כדי להנחות נסיינים עתידיים, איור משלים 1 זמין כדי להבטיח את המיקום הנכון של המקלעת.
        הערה: כחלופה, ניתן להשתמש בדימומים מוורידי הזנב גם לאיסוף דגימות דם.
    3. לאחר האיסוף, אל תשאיר את החיה ללא השגחה. זה חייב להיות פעיל ולא נפגע. אם העכבר מראה סימני נפילה (ראש או גוף) וחוסר פעילות, יש להמית אותו. אין לחרוג מנפח 50 מיקרוליטר, מכיוון שכמויות דם גדולות יותר עלולות לגרום למוות של בעל החיים.
    4. שמור את דגימת הדם שנאספה בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 8 מיקרוליטר של 50 מ"מ EDTA כדי למנוע קרישת דגימה.
      הערה: כאן, השתמשנו בתמיסת EDTA שהוכנה בעבר כנוגד קרישה. אם מעדיפים, ניתן להשתמש גם בצינורות EDTA בנפח נמוך הזמינים מסחרית לאיסוף דם בשלב זה. יש לעבד את דגימות הדם באותו היום.
  5. הכנת דגימות דם היקפיות לעיבוד
    1. הומוגניזציה של הדם עם EDTA. מעבירים 50 מיקרוליטר מהתערובת לצינור ציטומטריית זרימה.
    2. הכן תערובת נוגדנים שתתווסף לכל דגימה המורכבת מנוגדנים CD45 נגד עכבר (mCD45), נוגדן CD45 אנטי אנושי (hCD45), נוגדן CD19 אנטי אנושי (hCD19) וסטרילי 1x PBS כמדלל.
  6. עיבוד דגימות דם
    1. הוסף 10 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים לכל דגימת דם. הפוך להומוגניזציה על ידי הקשה עדינה עם האצבע המורה. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנת מפני אור.
      הערה: בחר את הנוגדנים המתאימים שתוארו לעיל, בהתחשב בערוצים הזמינים של הציטומטר. כדי לקבוע את כמות הנוגדנים המשמשת לכל דגימה, שקול לבצע עקומת טיטרציה עבור כל נוגדן. הנוגדנים ששימשו במחקר שלנו, הפלואורוכרומים והנפח שנבחר לדגימות מפורטים בטבלה משלימה 1. תיאור מלא של המספרים הקטלוגיים של הנוגדנים ושמות השיבוטים מופיע בטבלת החומרים.
    2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת ליזה מסחרית של תאי דם אדומים (RBC) לכל דגימה. הומוגניזציה נמרצת עם האצבע המורה. דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנת מפני אור.
      הערה: תמיסת הליזה המשמשת בשלב זה היא תמיסת ליזה 10x RBC זמינה מסחרית. אם נעשה שימוש במגיב אחר, יש להתאים את נפח העבודה פי 1 לליזה.
    3. הוסף 2 מ"ל של PBS סטרילי 1x לכל דגימה לשלב הכביסה הראשון. דגימות צנטריפוגה ב-200 x גרם (ברוטור נדנדה) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו בעדינות את הנוזל על ידי היפוך וייבשו את כל הנוזל שנותר בחלק העליון של השפופרת על ידי ספיגה עדינה במגבות נייר.
      הערה: בשלבי הכביסה, תאי הלוקמיה יושלכו בתחתית צינור הציטומטר, והנוזל הנותר יושלך. חובה לנקוט משנה זהירות בעת הטיפול בדגימות, שכן במקרים מסוימים, ייתכן שלא ניתן יהיה להבחין בכדור. כדי להבטיח את שלמות הגלולה, הימנע מטלטול הדגימה, מכיוון שהדבר עלול לגרום לאובדן שלה.
    4. חזור על שלב 1.6.3. השעו מחדש את תאי הלוקמיה עם 200 מיקרוליטר של PBS סטרילי 1x על ידי הקשה עדינה על צינור הציטומטריה באצבע המורה. הדגימות מוכנות לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. יש לבצע ניטור השתלה באותו יום עם איסוף הדם.
  7. ניטור חריטה על ידי זרימה ציטומטרית
    1. השתמש במתודולוגיות ציטומטריית זרימה סטנדרטיות 9,14 כדי לקבוע את אחוז תאי CD45+ אנושיים בדם ההיקפי ביחס לתאי CD45+ של עכברים (% hCD45+).
    2. אסוף נתונים שנוצרו על ידי ציטומטריית זרימה לניתוח עוקב של אחוז hCD45+ על סך תאי CD45 (hCD45+ פלוס mCD45+) באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה.
      הערה: כדי להבטיח ניטור נכון של החריטה, יש לבצע את שלבי הניתוח הבאים באותו היום. רצף יומי זה חשוב במיוחד כאשר בוחנים את תחילת לוח הזמנים העתידי של הטיפול, אותו אנו מציעים להתחיל ביום שני. בחוסר האפשרות להתחיל ביום שני, הטיפול יכול להתחיל בכל יום בשבוע, תלוי בהשגת hCD45+% (0.2%-1%) בדם היקפי.
  8. הכנת הסביבה לניתוח נתוני זרימה ציטומטרית
    1. הפעל תוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה. ייבא את הנתונים שנאספו והמתן לזיהויים על-ידי הכלי.
    2. פתח את הנתונים מהדגימה הראשונית כדי ליצור את השער שכותרתו לימפוציטים. אמת את הגדרות הציר: בחר FSC-A עבור ציר ה-X ו-SSC-A עבור ציר ה-Y. בלוח יצירת השער העליון, בחר את כלי הפולי-ליינר ותאר את אוכלוסיית התאים הראשית.
      הערה: לימפוציטים מופיעים בדרך כלל בין 50,000-100,000 על ציר ה-X ו-0-50,000 על ציר ה-Y. הערכים עשויים להשתנות בהתאם למאפיינים של כל לוקמיה.
    3. לחץ פעמיים על האוכלוסייה המגודרת כדי ליצור שער חדש. כדי לא לכלול כפולות תאים, הגדר את FSC-A על ציר ה- X ואת FSC-H על ציר ה- Y. השתמש בכלי הפולי-ליינר כדי לבודד את אוכלוסיית התאים הראשונית. צייר את השער קרוב סביב האוכלוסייה, לא כולל אירועים מרוחקים לאורך ציר ה-X.
      הערה: שלב זה מבחין בין אירועי תאים בודדים.
  9. יצירת פאנל הציטומטריה להבחנה בין אוכלוסיות תאים
    1. לחץ פעמיים על האוכלוסייה שנבחרה כדי להבדיל בין תאי CD45 אנושיים לתאי CD45 של עכבר. הגדר את ציר ה-X לפלואורופור mCD45 ואת ציר ה-Y ל-SSC-A. בעזרת כלי הצורה, ציירו ריבוע סביב האוכלוסייה השלילית mCD45.
    2. לחץ פעמיים על האוכלוסייה המתקבלת כדי להבחין בין תאים hCD19+ ו/או hCD45+. הגדר את ציר ה-X לפלואורופור hCD19 ואת ציר ה-Y ל-hCD45. בחלונית יצירת השער, בחר קווים מאונכים כדי להפריד בין האוכלוסיות הנפרדות.
      הערה: כחלופה, החוקר יכול להשתמש בשער או באפשרות להבחנה בין תאי hCD45 ו-mCD45. אפשרות זו מתייחסת לסכום האירועים כ-100%, ויוצרת אסטרטגיה מדויקת יותר לזיהוי אוכלוסיות.
  10. החלת סטטיסטיקה על החלונית שנוצרה
    1. חשב את האחוז של כל אוכלוסיית תאים מבודדת ביחס לכל האירועים הנרכשים. בחלון התוכנה הראשי, לחץ לחיצה ימנית על סמל תת-גרף הנגזר מהגרף הראשי של כל דגימה ובחר צור סטטיסטיקה. בחלון שנפתח, לחץ על תדירות של ובחר תאים בודדים. בצע שלב זה בנפרד עבור כל תת-גרף.
    2. בחר את כל השינויים שבוצעו כדי להחיל את אסטרטגיית השער והנתונים הסטטיסטיים המשויכים על כל הדגימות. לאחר מכן, באמצעות לחצן העכבר השמאלי, גרור את השינויים שנבחרו לאפשרות כל הדוגמאות בחלון התוכנה הראשי.
    3. לחץ על עורך הטבלאות בחלון הראשי כדי ליצור טבלה עם כל התדירות המחושבת. בחלון המוקפץ, בחר בתבנית קובץ .xls, הקצה את תיקיית היעד ולחץ על Create Table.
      הערה: ניתן לדמיין את כל השלבים שבוצעו באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה באיור משלים 2. הטבלה הסופית שנוצרה על ידי שלב זה מכילה את אחוז ה-hCD45+ הדרוש ליצירת גרפים לניתוח התקדמות החריטה לאורך זמן.
  11. שרטוט התקדמות החריטה
    1. הפעל תוכנת שרטוט וניתוח גרפים. בחר את תבנית טבלת XY. בחלון הראשי, בחר הזן או ייבא נתונים לטבלה חדשה, הגדר את X למספרים ואת Y להזנת ערכים משוכפלים בעמודות משנה זו לצד זו.
    2. בטבלה שנפתחה, ארגן את כותרות העמודות: הזן ימי חריטה עבור העמודה X ו-% hCD45+ ב-PB עבור הקבוצה הראשונה של עמודות משנה Y. השלם את עמודת ה-X עם הימים שלאחר ההזרקה המתאימים לימי איסוף הדם לניטור החריטה. הזן ידנית את האחוז השבועי שנאסף של נתוני hCD45+ עבור כל עכבר בעמודות המשנה Y.
    3. בתפריט התוכנה, תחת קבוצת המשנה משפחה, בחר נתונים 1. בחלון המוקפץ, בחר באפשרות הגרף השנייה בשם Points & Connecting Line with Error Lines, ואפשר התוויה של קווי ממוצע ושגיאה.
    4. התאם את צירי הגרף לטווחים הרצויים. לחץ על יצא בפינה השמאלית העליונה של התפריט כדי להוריד את הגרף הסופי.
      הערה: כל הנתונים שנאספו במהלך הניסויים עם כל ALL יחיד חייבים להיות משורטטים על אותו גרף כדי להקל על ניתוחים לאורך זמן מאז תחילת הניסוי. דוגמה תיאורית להתוויית גרפים ניתן למצוא באיור משלים 3.

2. טיפול בעכברים

  1. הכנת פתרונות עבודה לתרופות
    1. הכן תמיסת עבודה וינקריסטין בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. הכן תמיסת עבודה של דקסמתזון במינון של 4 מ"ג/מ"ל. הכן תמיסת עבודה L-אספרגינאז ב-2,000 IU/mL. הכן את תמיסת העבודה daunorubicin ב -2 מ"ג/מ"ל.
      הערה: התרופות המשמשות בפרוטוקול זה שוות ערך לאלו המשמשות בטיפול הקליני בחולים15. רכב תמיסת עבודה של דקסמתזון מורכב מקריאטינין, נתרן ציטראט דיהידרט, נתרן הידרוקסיד, נתרן ביסולפיט, מתילפרבן, פרופילפרבן ומים להזרקה. רכב תמיסת העבודה של Vincristine מורכב ממניטול, חומצה גופרתית, נתרן הידרוקסיד ומים להזרקה. L-אספרגינאז ודאונורוביצין זמינים לעתים קרובות בצורה ליופילית. במקרים כאלה, הכלי המומלץ להרכבה מחדש הוא מים סטריליים להזרקות, בהם יש להשתמש כדי להשיג את הריכוז הנכון. כדי למנוע אובדן פעילות תרופתית עקב מחזורי הפשרה חוזרים ונשנים, יש לחלק את התרופות לאליקוטים עובדים המשמשים לא יותר מפי 3.
  2. בעלי חיים שוקלים כאשר מתגלה לוקמיה
    1. התחל את הטיפול בנקודה שבה אחוז תאי hCD45+ בדם ההיקפי של עכברים מגיע לטווח חציוני בין 0.2% ל-1%. עם ההגעה אליו, חלקו את העכברים המושתלים לשתי קבוצות נפרדות: אחת לקבלת טיפול ואחת לשמש כביקורת.
    2. עם השגת הסף שנקבע, התמיד במעקב השבועי אחר התקדמות הלוקמיה. איסוף רציף של נתוני hCD45% כדי לנטר את ההיענות לטיפול, התרחשות של הישנות וזיהוי עמידות לתרופות.
    3. שקלו את בעלי החיים שיש לטפל בהם. השתמש בממוצע האריתמטי של המשקולות כדי לברר את המינון של כל תרופה שתינתן לקבוצה. שקלו את בעלי החיים בקבוצת הביקורת כדי להשוות עלייה/ירידה במשקל בין הקבוצות.
      1. השתמש במינוני התרופות הבאים: וינקריסטין, 0.15 מ"ג/ק"ג; דקסמתזון, 5 מ"ג/ק"ג; L-אספרגינאז, 1,000 יחב"ל/ק"ג; ודאונורוביצין, 1.2 מ"ג/ק"ג. שקלו את כל בעלי החיים לפחות 3 פעמים בשבוע: בימים שני, רביעי ושישי. השתמש במשקולות כדי להתאים את מינוני הטיפול של התרופות וכדי לעקוב אחר רמת הרעילות של הטיפול.
  3. הכנת פתרונות מתן התרופות מפתרון העבודה
    הערה: פתרונות מתן תרופות מורכבים מ-PBS סטרילי 1x כמדלל והנפח הנכון (בהתאם למשקל החיה) של תמיסות תרופות עובדות (מים סטריליים משמשים אך ורק להרכבה מחדש ולא להזרקה) הניתנים בכל יום בשבוע. תרופות הניתנות תוך צפקיות יכולות להיות מאוחדות באותו תמיסה; עם זאת, אם תרופה כלשהי ניתנת דרך הווריד, יש להניח אותה בתמיסה אינדיבידואלית. נפח תמיסת מתן התרופות שיינתן לכל בעל חיים הוא 100 מיקרוליטר.
    הערה: מזרק אינסולין סטרילי עם מחט מחוברת (1 מ"ל, עם מידות מחט 12.7 מ"מ X 0.33 מ"מ) שימש בשלב שתואר לעיל. תיאור מלא של המזרק ניתן למצוא בטבלת החומרים.
    1. ביום שני, הכינו תמיסה למתן תרופות המורכבת מדקסמתזון, וינקריסטין ו-PBS. נהל את התרופות תוך צפקית.
    2. בימים שלישי וחמישי, הכינו תמיסה למתן תרופות המורכבת מדקסמתזון, L-אספרגינאז ו-PBS. נהל את התרופות תוך צפקית.
    3. ביום רביעי, הכינו תמיסה למתן תרופות המורכבת מדקסמתזון ו-PBS ותנו אותה תוך צפקית. הכן תמיסת מתן תרופות שנייה המורכבת מדאונורוביצין ו- PBS. יש לתת אותו דרך הווריד.
    4. ביום שישי, הכינו תמיסה למתן תרופות המורכבת מדקסמתזון ו-PBS. יש לתת את התרופה תוך צפקית.
    5. אפשר לבעלי החיים לנוח בימי סוף השבוע. חזור על מחזור הטיפול למשך 4 שבועות.
      הערה: ניתן למצוא לוח זמנים מקיף לטיפול בטבלה משלימה 2. חשוב להבהיר כי נבדקו פרוטוקולים אחרים שכבר נקבעו לטיפול בעכברים, אך הביאו לרמות גבוהות של רעילות לזן NSG. לכן, לוח הזמנים של הטיפול המוצע הוגש תחילה לתהליך סטנדרטיזציה להפחתת הרעילות, שהביא למינונים ולתדירות המתן המוצגים בפרוטוקול זה. צפוי שאחוז hCD45+ בקבוצה המטופלת יקטן בהשוואה לאחוז hCD45+ בקבוצת הביקורת עקב מתן הטיפול.
  4. מתן תרופות וניטור היענות ללוקמיה
    1. לרסן ידנית את החיה ביד שמאל כדי לתת תרופות תוך צפקית. שמור את החיה עם החלק הגחוני למעלה. בחלק הגחוני, אתר את הרביע הימני התחתון.
    2. ביד ימין, השתמש במחט הזרקה סטרילית, חדה וחד פעמית והזריק 100 מיקרוליטר מתמיסת מתן התרופה לרביע הימני התחתון של העכברים.
      הערה: היזהר בעת ריסון החיה; זה לא אמור להיות הליך מזיק לעכברים. כמו באיסוף דם, היו מודעים לכל סיבוכים נשימתיים. במקרה של זריקות תוך-צפקיות, החזק תמיד את המחט בניצב על מנת למנוע קידוח איברים.
    3. עקוב אחר אותן הוראות המשמשות להשתלת תאי לוקמיה למתן תרופות תוך ורידי. אפשר לעכברים לנוח לאחר 4 שבועות של מתן טיפול עד להופעה חוזרת של כל התאים, כאן נקרא הישנות ראשונה (R1).
      הערה: למרות ההבדל במסלול המתן, ההזרקה התוך ורידית משתמשת באותו נפח כמו בהזרקה תוך צפקית.
  5. ניטור היענות ללוקמיה וזיהוי הישנות ראשונה (R1)
    1. אין להפסיק את ניטור הזרימה הציטומטרית השבועית של לוקמיה במהלך שלבי הטיפול או המנוחה.
      הערה: בהתחשב בטיפול של 5 ימים בשבוע, מומלץ מאוד לבצע מעקב בתחילת השבוע. במחקר שלנו, איסוף דם, עיבוד דגימות וניתוח בוצעו תמיד בימי שני.
    2. בצע איסוף דם וכל הליכים עוקבים הנדרשים לניטור לפי שלבים 1.4 - 1.11.
      הערה: לאחר תקופת המנוחה הנתונה, תאי R1 יתגלו על ידי העלייה הפתאומית באחוז hCD45+ בדם ההיקפי של עכברים. התקופה בין סיום הטיפול להופעת ההישנות משתנה ויכולה להיות מובחנת עבור כל לוקמיה שנבדקה. עם גילוי R1, יש לבצע את השלב השלישי והאחרון של מודל ההישנות המוצע של העכבר. כדי לשפר את ניתוחי הניטור והתגובה, אנו מציעים להשתמש במדדי תגובה אובייקטיביים כגון מחלה מתקדמת, מחלה יציבה, רמת היענות (חלקית, מלאה או נשמרת), הפוגה ועמידות, בהתאם להנחיות שתוארו על ידי Randall et al. (2024)16.

3. מחזורי טיפול חוזרים ונשנים עד להופעת תאים עמידים

  1. איתור הישנות ראשונה
    1. לתת שבוע שלם של טיפול מסוג אינדוקציה לכל עכבר שיש לו הישנות לוקמיה (נקרא R1), כלומר, כאשר מגיעים לסף של 0.2% hCD45+ בדם היקפי. במשך שבוע אחד, מיום שני עד שישי, עקוב אחר לוח הזמנים של מתן התרופות המשמש לטיפול מסוג אינדוקציה של 4 שבועות.
      הערה: מתן טיפול של שבוע אחד בלבד בשלב זה נועד לבדוק in vivo אם תאי הלוקמיה צברו עמידות לכימותרפיה תוך כדי הנעת התקדמות הלוקמיה להישנות עוקבות לאורך זמן, תחת לחץ כימותרפיה. בחרנו לא לנהל לוח זמנים שני של 4 שבועות כאמצעי למנוע רעילות מוגזמת ואובדן בעלי חיים.
    2. אפשר לעכברים לנוח בסוף השבוע המלא של מתן התרופה. המשך את הניטור השבועי של תגובת הלוקמיה על ידי זרימה ציטומטרית לפי שלבים 1.4 - 1.11.
      הערה: בשלב זה, תאי הלוקמיה צפויים להמשיך להגיב לטיפול. כתוצאה מכך, בעת ניטור הלוקמיה, אחוז ה-hCD45+ בעכברים אמור לרדת ולהישאר שלילי לתקופה מסוימת.
  2. ניטור מראה R2
    1. המתן להופעת R2 הישנות (תאי hCD45+ ≥ 0.2%). כאשר הוא מופיע, ספרו את הזמן שחלף בין סיום הטיפול להופעת R2. קרא לתקופה זו Δt1.
    2. המשך לשבוע שלם שני של מתן טיפול מסוג אינדוקציה. פעל בהתאם לאותן הנחיות כמו הניהול הראשון של לוח זמנים זה.
    3. אפשר לעכברים לנוח בסוף הטיפול. המשך ניטור לוקמיה.
  3. ניטור מראה R3
    1. המתן להופעת R3 הישנות. ספור את הזמן באותו אופן כמו בשלב 3.2.1. תקראו לזה Δt2.
    2. השווה בין Δt1 ל-Δt2. חזור על השלבים לעיל N פעמים כדי להשיג הישנות מרובות של לוקמיה (R1, R2... RN) אם תקופת Δt נשארת זהה. הפסק את מחזורי הטיפול ברגע שתקופת ה-Δt מתקצרת.
      הערה: ירידה ב-Δt להישנות היא אינדיקציה לעמידות לתרופות שנצברו על ידי תאי הלוקמיה. תוצאה זו מחזקת את היכולת של מודל ההישנות של העכברים לייצר תאי ALL עמידים לכימותרפיה.
    3. שחזר תאי לוקמיה כמתואר בשלב 4 להלן. אחסן אותם חיים על ידי שימור בהקפאה או על ידי כל חומר משמר התואם לניתוחים הבאים המיועדים.
      הערה: האירוע המומלץ להתאוששות תאי לוקמיה הוא עד 25% מ-hCD45+ בדם ההיקפי, כפי שמתואר בספרות עדכנית16.

4. התאוששות תאים לוקמיים באמצעות קצירת איברים

  1. המתת חסד של עכברים עם מנת יתר של חומרי הרדמה כימיים
    1. המתת חסד של עכברים על ידי מנת יתר של חומרי הרדמה כימיים, ולאחר מכן פריקת צוואר הרחם לאישור המתת חסד כמתואר להלן.
    2. הכינו תערובת המכילה שלושה חומרי הרדמה מדוללים ב-PBS סטרילי 1x להרדמה עמוקה. השתמש ב-150 מיקרוליטר של אצפרומזין מלאט מסחרי, 50 מיקרוליטר של קסילזין מסחרי, 80 מיקרוליטר של קטמין מסחרי ו-220 מיקרוליטר של PBS עבור כל בעל חיים להמתת חסד.
    3. יש לתת 500 מיקרוליטר מהתערובת המוכנה על ידי הזרקה תוך צפקית. עקוב אחר אותן הנחיות ריסון והזרקה כמתואר בשלב 2.4.
    4. בהשפעת מנת יתר של חומרי הרדמה כימיים, עכברים ישכבו על קרקעית הכלוב. לאחר מספר דקות, שימו לב אם העכברים סובלים מדום נשימה. אם כן, המתן עד שהמאמץ הנשימתי ייפסק. כדי לוודא שהליך המתת החסד היה יעיל, בדוק אם יש רפלקס לא רצוני על ידי הפעלת לחץ על אחת הרגליים האחוריות של החיה. כדי לאשר המתת חסד, המשך לפריקת צוואר הרחם.
  2. פריקת צוואר הרחם
    1. החזק את החיה עם החלק האחורי של הגוף כלפי מעלה כנגד סורג ההזנה של הכלוב. השתמש באצבעות המורה והאגודל של יד שמאל כדי ליצור צורה של פינצטה. הניחו את האצבעות בצורת פינצטה ישירות מתחת לראש החיה. לחץ בחוזקה על החלק הצווארי של עמוד השדרה.
    2. אחזו בזנב החיה ביד ימין. משוך אותו לאחור בתנועה יציבה ויציבה עד שראש החיה מופרד משאר גופו.
      הערה: פריקת צוואר הרחם היא אחת השיטות המקובלות לאישור המתת חסד 17,18,19. שיטות אחרות, כגון חשיפה מתמשכת ל-CO2 למשך 15 דקות לפחות לאחר דום נשימה, יכולות לשמש כחלופה.
  3. הכנת בעלי חיים לקצירת איברים
    1. חטאו את העכברים על ידי מריחת 70% אלכוהול על כל גופם. הנח את גופת החיה מעל משטח כירורגי למכרסמים כשהחלק הגחוני כלפי מעלה. לגלח את החלק הבטני של הגוף.
      הערה: תיאור מלא של פלטפורמת ההפעלה הכירורגית למכרסמים ניתן למצוא בטבלת החומרים.
  4. קציר טחול
    1. בצע חתך קטן בעזרת מספריים כירורגיים סטריליים ופינצטה על עור הבטן. הסר אותו מאזור הבטן וחשף את הצפק.
    2. בצע חתך קטן בצפק. חותכים אותו עד לקבלת גישה מלאה לאיברים הממוקמים בבטן.
    3. אתר את הטחול, ממש מתחת לבטן החיה. הסר את הטחול. הנח אותו בנמען המכיל PBS סטרילי 1x להמשך עיבוד.
  5. קציר עצם הירך
    1. המשך בפתיחת חלל הצפק כדי לקבל גישה לרגליים האחוריות של החיה.
    2. אתר את עצם הירך. הסר אותו על ידי חיתוך במפרקים המאחדים אותו עם עצם האגן ועם השוקה והפיבולה. בצע תהליך זה עבור שתי עצמות הירך.
    3. נקו את העצמות על ידי הסרת כל השרירים, העור או הרקמות שנותרו. הנח אותם בנמען המכיל PBS סטרילי 1x להמשך עיבוד. יש להשליך את פגר בעל החיים בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של בעלי חיים.
      הערה: בהתאם למטרות המחקר, ניתן לאסוף את כל התאים גם מהכבד, מערכת העצבים המרכזית, בלוטת התימוס, בלוטות הלימפה וכו'. בכתב היד הזה, כדוגמה, אנו מתארים את אוסף כל התאים מהטחול וממח העצם.
  6. הכנה לעיבוד איברים
    1. אסוף צינור צנטריפוגה סטרילי אחד של 50 מ"ל, שני מזרקים סטריליים של 1 מ"ל, מחט היפודרמית סטרילית אחת בגודל 25 מ"מ על 0.6 מ"מ ושתי מסננות תאים סטריליות של 70 מיקרומטר.
  7. עיבוד טחול
    1. הנח מסננת תא אחת על גבי צינור צנטריפוגה פתוח של 50 מ"ל. הניחו את הטחול על פני מסננת התאים. יש להשרות את האיבר עם החלק השטוח של בוכנת המזרק עד שלא נראים חלקים גדולים.
    2. הוסף PBS סטרילי 1x לטחול המרוטש. בצע תנועות מעגליות עם החלק השטוח של בוכנת המזרק כדי להבטיח סינון תאים.
      הערה: ניתן לבצע את יציקת ה-PBS בהדרגה; עם זאת, הנפח הסופי בשימוש אינו יכול לעלות על 6 מ"ל. עם השלמת עיבוד הטחול, מסננת התאים צריכה להיות שקופה ונטולת כל רקמה שיורית. במקרה של רוויה של מסננת תאים, ניתן להשתמש במסננת תאים חלופית. ניתן להעביר את תכולת המסננת הראשונית למסננת השנייה, ולאחר מכן ניתן להמשיך בעיבוד. כדי לגשת לעומס הגידול בתוך איבר זה, ניתן להפריד חלק מהטחול להערכה היסטופתולוגית.
  8. עיבוד מח עצם
    1. שלב מסננת תאים חדשה לעיבוד מח עצם בצינור הצנטריפוגה שכבר נמצא בשימוש. חותכים את שולי עצם הירך עד לגישה לפתחי מח העצם. הכנס את המחט ההיפודרמית למזרק חדש. הוסף 1 מ"ל של PBS סטרילי 1x למזרק.
      הערה: בהתאם למטרות המחקר, יש לאסוף בנפרד את כל התאים המתקבלים מהטחול וממח העצם. במקרה זה, יש להשתמש בצינור צנטריפוגה נפרד לכל רקמה. ניתן להפריד חלק מעצם הירך לצורך הערכה היסטופתולוגית כדי להעריך את עומס הגידול בתוך איבר זה.
    2. בצע שטיפת מח עצם מעל מסננת התאים. הכנס את קצה המחט לצד אחד של פתח מח העצם. דחוף את בוכנת המזרק בתנועה יציבה ומתמדת. חזור על ההליך עם עצם הירך השנייה.
    3. נתק את המחט. השתמש בחלק השטוח של המזרק כדי להשרות את מח העצם הסמוק. הוסף PBS סטרילי 1x למח העצם המושרה . בצע תנועות מעגליות עם החלק השטוח של בוכנת המזרק כדי להבטיח סינון תאים. עם השלמת הליך העיבוד, צינור הצנטריפוגה של 50 מ"ל יכיל נפח כולל של 10 מ"ל, המורכב מתערובת של תאי טחול ומח עצם שדוללו ב-PBS.
      הערה: ניתן לבצע את תהליך יציקת PBS בהדרגה; עם זאת, חובה לוודא שהנפח הסופי בשימוש לא יעלה על 2 מ"ל.

5. בידוד תאים לוקמיים על ידי צנטריפוגה שיפוע

  1. הכנה לבידוד תאים לוקמיים
    1. אסוף צינור צנטריפוגה אחד של 15 מ"ל, פיפטות פסטר חד פעמיות סטריליות, צינור הצנטריפוגה של 50 מ"ל המכיל את האיברים שעובדו, ומדיום שיפוע הצפיפות לבידוד לימפוציטים.
      הערה: המדיום מקל על בידוד תאים חד-גרעיניים על ידי יצירת שיפוע צפיפות באמצעות צנטריפוגה. תאים חד-גרעיניים (לימפוציטים, מונוציטים ותאי ALL) יוצרים שכבה בממשק בין המדיום לפלזמה.
  2. בידוד תאים לוקמיים
    1. הוסף 5 מ"ל של מדיום שיפוע הצפיפות לבידוד לימפוציטים לצינור הצנטריפוגה של 15 מ"ל באמצעות פיפטה חד פעמית של פסטר. מוסיפים בהדרגה את 10 מ"ל מתערובת תאי הטחול ומח העצם מעל השכבה הבינונית. החזק את הצינור בזווית רדודה, בסביבות 30 מעלות או פחות, והוסף לאט את תערובת התאים לאורך דופן הצינור כך שהשכבה הבינונית של הצפיפות לא תופרע.
      הערה: היזהר במהלך תהליך זה כדי להבטיח שהתאים לא יתערבבו עם מדיום הצפיפות. הפרעה בתהליך זה עלולה להוביל לכישלון היווצרות שיפוע צפיפות במהלך הצנטריפוגה.
    2. צנטריפוגה של צינור 15 מ"ל ב-420 x גרם על רוטור דלי נדנדה, למשך 30 דקות, ללא תאוצה וללא הפסקה, כדי למנוע הפרעה לשלבים שנוצרו.
      הערה: תאים לוקמיים הולכים ליצור שכבה בין מדיום הצפיפות לשלבים המימיים.
    3. הסר והשליך את השלב המימי העליון באמצעות פיפטה פסטר חד פעמית סטרילית. אוספים את שכבת התאים הלוקמיים שנוצרו עם פיפטה פסטר חד פעמית סטרילית. העבירו אותו לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל.
      הערה: אל תדאג אם חלק מהשכבה הבינונית בצפיפות נמוכה יותר מוזרם יחד עם תאי הלוקמיה.
  3. שטיפת תאים לוקמיים
    1. הוסף PBS סטרילי 1x לצינור המכיל את התאים שנאספו עד להגעה לגבול של 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה של התאים ב -300 x גרםלמשך 5 דקות. החזר תאוצה ובלימה מקסימלית. הסר והשליך את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים בקור סטרילי חדש 1x PBS.5.3.3.המשך לבדיקת כדאיות התאים והתאים. עקוב אחר הנחיות נוהל ספירת התאים הסטנדרטיות13. ניתן לצבוע את התאים השטופים בנוגדנים CD45 נגד עכבר (mCD45), נוגדן CD45 אנטי אנושי (hCD45) ונוגדנים CD19 אנטי אנושיים (hCD19), ולאחר מכן שלבי כביסה ואיסוף נתונים.
      הערה: במקרה של עיבוד תאי הטחול ותאי מח העצם בצינורות צנטריפוגות שונים, ניתן להשתמש בחלק מדגימות אלו כדי לגשת לעומס הגידול בתוך איברים אלה באמצעות ציטומטריית זרימה.
  4. שימור בהקפאה של תאים לוקמיים
    1. גלולה למטה את התאים על ידי צנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט. שמור את התאים על קרח.
    2. הכינו מדיום הקפאה המורכב מ-90% סרום בקר עוברי קר סטרילי (FBS) ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO). השתמש ב-1 מ"ל של תמיסה זו עבור כל בקבוקון שימור בהקפאה.
    3. על קרח, השעו מחדש תאים בתמיסה המוכנה בריכוז של 2 x 107 תאים/מ"ל. הכניסו את התאים לתוך צינורות השימור בהקפאה. שימור תאים בהקפאה בהתאם להנחיות הסטנדרטיות לשימור בהקפאה של תרבית תאים20.
      הערה: ניתן להשתמש בתאים אלה לניתוחים נוספים. במקום להקפיא תאים ברי קיימא, ניתן גם לצרף ולשמר תאים בחומרים משמרים שונים לניתוחי DNA, RNA, חלבון ומטבוליטים הבאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בהקשר של המחקרים שלנו, נבחרו דגימות ALL של תאי B קודמים משתי קבוצות חולים: אחת שהראתה תגובה חיובית, כפי שנקבעה על ידי היעדר תאים לוקמיים בדם היקפי ביום 8 והיעדר תאי לוקמיה שיוריים במח העצם בימים 15, 33 ו-78/96. הקבוצה השנייה נוצרה על ידי ALLs שהתאימו לתת-הקבוצות המולקולריות של הקודמות, שהתקבלו מחולים שהייתה להם תגובה קלינית גרועה כפי שהוערך על ידי מחלה שיורית מינימלית (MRD), כפי שמוצג בטבלה 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הבנת המנגנונים הביולוגיים העומדים בבסיס מחלות ניאופלסטיות חיונית לפיתוח טיפולים יעילים יותר ולשיפור תוצאות המטופלים. במצבים כמו לוקמיה לימפובלסטית חריפה בילדים, גישות חקירה אלו לא רק רלוונטיות להגדלת שיעורי הריפוי אלא גם בעלות ערך מיוחד עבור חולים בהם הטיפולים הסטנדרטיים הגיעו לגבולות האינטנסיביות והסבילות הטיפולית. במצב של הישנות ועמידות לטיפול, לא ניתן עוד לטפל באתגר רק על ידי התאמת משטרי כימותרפיה. במקום זאת, היא מחייבת חשיפת המנגנונים המולקולריים והתאיים של העמידות, שעשויים ליידע את ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

אנו מודים ל-Centro Infantil Boldrini ולכל המטופלים שתרמו את הדגימות שלהם למחקר. מנואלה מ. הוף קיבלה מלגה מטעם Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) מקרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP, 2024/ 03383-2). חוסה א. יונס קיבל מלגת פרודוקטיביות מהיועץ הלאומי לפיתוח טכנולוגי ומדעי (CNPq, 308399/2021-8). עבודה זו נתמכה על ידי מימון מחקר ממשרד הבריאות הברזילאי על ידי תוכנית PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 mL  מזרקBD #309628קצירת איברים
מים סטריליים של 10 מ"ל להזרקהHalex Istar Indú stria Farmaceutica LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/שיקום התרופות
תמיסת פירוק תאי דם אדומים 10Xביולג'נד#420302עיבוד דגימות דם בעכברים
מנתח תאים בעל 5 ערוציםBD ביוסיינסס658226R1ציטומטר זרימה 
מסננת תאים 70 uMפאלקום#352350קצירת איברים
Acepromazine maleate Inj Vetnil LTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1הרדמה בעכברים
APC אנטי-אנושי CD45 - עכבר איזוטיפ IgG1 - שיבוט HI30ביולג'נד#304037צביעת לימפוציטים
אספרגינאז 10000 Uאגינאז/מדאק#88660100טיפול בעכברים
Brilliant-Violet 605 נגד עכבר CD45 - עכבר איזוטיפ IgG2 - חיקוי 30-F11ביולג'נד#103139צביעת לימפוציטים
דאונורוביציןפארמרין#116880025טיפול בעכברים
דקסמתזוןAché#00000066טיפול בעכברים
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אלדריץ'#589569שימור קרא של לימפוציטים
מחט חד-פעמית - 0.60 x 25 מ"מ (23G x 1' ’)BD#300388קצירת איברים
לנסט חד-פעמי סטרילי  יאנצ'נג חוידה מכשירים רפואיים https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/איסוף דם עכברים
חומצה אתילנדיאמינטרטיסטיתטכנולוגיות חיים#15576-O28פתרון EDTA
סרום בקר עובריקולטילאב#F083שימור קרא של לימפוציטים
ניתוח תוכנה לציטומטריית זרימה - גרסה 10.10.0BD ביוסיינססhttps://www.flowjo.com/ניתוח ציטומטריית זרימה
ניתוח תוכנות גרף וגרפיה - גרסה 9.5.1דוטמטיקסhttps://www.graphpad.com/featuresשרטוט וניתוח גרפים
מזרק אינסולין עם מחט מחוברת 1 מ"ל FX 12.7 מ"מ X 0.33 מ"מדקארפאקe0342101השתלת עכברים ומתן תרופות
קטמין אינג'Sespo Indú stria e comé RCIO LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/הרדמה בעכברים
פלטפורמה ניתוחית רב-תכליתית למכרסמיםתאגיד קנט המדעיhttps://www.kentscientific.com/products/surgisuite/ניתוחי עכברים
PE אנטי-אנושי CD19 - עכבר איזוטיפ IgG1 - שיבוט HIB19ביולג'נד#302208צביעת לימפוציטים
כלוריד אשלגןסיגמא-אלדריץ'P3911-1KGפתרון PBS
פוספט אשלגן די-בסיסיסיגמא-אלדריץ'P0662-1KGפתרון PBS
תגובת בידוד לימפוציטיםציטיבה#17-1440-02, חבילה של 6 & 100  מ"לבידוד לימפוציטים מאיברים שנקטפו
כלוריד נתרןסיגמא-אלדריץ'S9888-1 ק"גפתרון PBS
נתרן פוספט דיביסיק  סיגמא-אלדריץ'S9763-1KGפתרון PBS
פינצטרים לניתוח אנטומי סטרילי - 12 ס"מ ABC 0170Lab Lí דר120פרוצדורות עכברים כירורגיים
מספריים סטריליים 12 ס"מ - ABC 0321Lab Lí דר136פרוצדורות עכברים כירורגיים
וינקריסטיןליבס#7896094208483טיפול בעכברים
זילזין אינג'Sespo Indú stria e comé RCIO LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/הרדמה בעכברים

מקורות

  1. Hunger, S. P., Mullighan, C. G. Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. N Engl J Med. 373 (16), 1541-1552 (2015).
  2. Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era. Front Pediatr. 10, 923419(2022).
  3. Bailey, L. C., Lange, B. J., Rheingold, S. R., Bunin, N. J. Bone-marrow relapse in paediatric acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 9 (9), 873-883 (2008).
  4. Inaba, H., Mullighan, C. G. Pediatric acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 105 (11), 2524-2539 (2020).
  5. Mullighan, C. G., et al. Genomic analysis of the clonal origins of relapsed acute lymphoblastic leukemia. Science. 322 (5906), 1377-1380 (2008).
  6. Turati, V. A., et al. Chemotherapy induces canalization of cell state in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Nat Cancer. 2 (8), 835-852 (2021).
  7. Uckun, F. M., et al. Prognostic significance of B-lineage leukemic cell growth in SCID mice: a Children's Cancer Group Study. Leuk Lymphoma. 30 (5-6), 503-514 (1998).
  8. Borgmann, A., et al. Childhood all blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  9. Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis andrelapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
  10. Samuels, A. L., et al. A pre-clinical model of resistance to induction therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Blood Cancer J. 4 (8), e232(2014).
  11. Alruwetei, A. M., et al. Examining treatment responses of diagnostic marrow in murine xenografts to predict relapse in children with acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 123 (5), 742-751 (2020).
  12. Wunderlich, M., et al. Improved chemotherapy modeling with RAG-based immune deficient mice. PLoS One. 14 (11), e0225532(2019).
  13. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  14. Liem, N. L., et al. Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia xenograft models for the preclinical evaluation of new therapies. Blood. 103 (10), 3905-3914 (2004).
  15. Treatment protocol for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia - AIEOP-BFM ALL 2017. , AIEOP-BFM Study Group. https://clinicaltrials.gov/study/NCT03643276#study-overview (2017).
  16. Randall, J., et al. In vivo activity of the second-generation proteasome inhibitor ixazomib against pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia xenografts. Exp Hematol. 132, 104176(2024).
  17. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  18. Guidelines to promote the wellbeing of animals used for scientific purpose. , National Health and Medical Research Council (NHMRC). https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/guidelines-promote-wellbeing-animals-used-scientific-purposes (2008).
  19. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  20. Ramos, T. V., Mathew, A. J., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Standardized cryopreservation of human primary cells. Curr Protoc Cell Biol. 64, A.3I.1-A.3I.8 (2014).
  21. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: Technologies and applications. Sig Transduct Target Ther. 8, 160(2023).
  22. Jin, J., Yoshimura, K., Sewastjanow-Silva, M., Song, S., Ajani, J. A. Challenges and prospects of patient-derived xenografts for cancer research. Cancers. 15 (17), 4352(2023).
  23. Duy, C., et al. Chemotherapy induces senescence-like resilient cells capable of initiating AML recurrence. Cancer Discov. 11 (6), 1542-1561 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Patient Derived Xenograft
מודל עכברי של הישנות לוקמיה לכימותרפיה אינדוקציה ללוקמיה לימפובלסטית חריפה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.