שיטת הדמיה אופטית התואמת למיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת למיפוי מוח תאי מזוסקופי

Summary

הצגנו טכניקת הדמיה חדשנית בשם Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), המאפשרת הדמיה ללא הטיה של כל התאים בדגימות מוח בקנה מידה מדום וניתן לשלבה בצורה חלקה בזרימת הדמיה של מיקרוסקופ אלקטרונים סרטורי מבוסס סרט על אותה דגימה.

Abstract

הבנת הקשרים המבניים והפונקציונליים בתוך רשתות עצביות מורכבות במוח דורשת בניית אטלסים למוח המחזיקים הן בשדה ראייה רחב והן ברזולוציה תת-תאית. עם זאת, שיטות הדמיה אופטית ומיקרוסקופיות אלקטרוניות קיימות קיימות במגבלות שמקשה על הדמיית כל התאים בתוך דגימה אחת. פרוטוקול זה מציג טכניקת הדמיה הנקראת טומוגרפיית התאבכות אופטית רב-שכבתית (OMLIT), המאפשרת הדמיה אופטית בלתי מובחנת של כל התאים בדגימות מוח שנעשו לאחר הכנת דגימת מיקרוסקופ אלקטרוני, ובכך משחזרת אטלס מוחי שלם של כל תאי העצב. בנוסף, ניתן לשלב את הדמיית OMLIT בצורה חלקה עם תהליך הדמיה של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק אולטרהמיקרוטומי אוטומטי (ATUM-SEM). דבר זה מאפשר לחוקרים לקבל מידע מבני בקנה מידה בינוני של תאים לפני הדמיית מיקרוסקופ אלקטרוני, מה שמקל על בחירה מדויקת של אזורים מעניינים ומפחית משמעותית את שטח ונפח הנתונים הנדרשים להדמיית מיקרוסקופ אלקטרוני ברזולוציה גבוהה (EM). אישרנו את הדיוק וההתאמה של שיטה זו בדגימות אמיתיות מקורטקס המוח של העכבר הבוגר, והדגמנו את אפשרויות היישום הרחבות שלה בבניית אטלס מוחי רב-קנה מידה.

Introduction

מיפוי מקיף של מעגלים עצביים ברזולוציה תאית ותת-תאית הוא חיוני לחשיפת המבנה והתפקוד של המוח. שיטות הדמיה אופטית מסורתיות, כגון מיקרוסקופיה דו-פוטונית¹, טומוגרפיה מיקרו-אופטית פלואורסצנטית (fMOST)^2,3,4, ומערכת VISoR⁵, אפשרו דימות נוירוני בקנה מידה מזוסקלי ודימות פונקציונלי ב-vivo. עם זאת, בשל הסתמכותם על סימון דליל, הם אינם מצליחים ללכוד את כל אוכלוסיית התאים. מצד שני, טכניקות דימות אופטי ללא תווית, כגון מיקרוסקופיה פוטואקוסטית פונקציונלית (fPAM)^6,7, טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT)⁸, ומיקרוסקופיית פאזה^{כמותית 9}, מחזיקות בפוטנציאל להמחיש את כל הנוירונים בשדה הראייה בו-זמנית. עם זאת, שיטות אלו מוגבלות בדרך כלל ברזולוציה צירית נמוכה ועומק דימות רדוד, ומורכבות החומרה שלהן פוגעת ביישום נרחב בבניית אטלס מוח. לעומת זאת, טכניקות מיקרוסקופיה אלקטרונית בחתך סידורי (ssEM), כולל SEM SEM-SEM (SBF-SEM^)10,11, SEM קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM)12,13,14, ואיסוף אוטומטי של מיקרוטומיה אולטרה-מיקרוטומית SEM (ATUM-SEM)15,16,17 , יכול לחשוף רשתות קישוריות סינפטיות צפופות ברזולוציה של ננומטר, ומספק כלים חיוניים לחיבור ברזולוציה גבוהה. עם זאת, טכניקות אלו סובלות מתפוקה נמוכה, זמני רכישה ארוכים, שדה ראייה מוגבל, ועלויות עיבוד וחומרה גבוהות¹⁸.

כדי להתגבר על המגבלות הנ"ל, פיתחנו שיטת הדמיה בשם Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), המציעה פתרון בעלות נמוכה ובעל תפוקה גבוהה להדמיה בלתי מובחנת, בעלת ניגודיות גבוהה ורחבת שדה של כל התאים בחתכים דקים במיוחד, תוך השגת רזולוציית תת-מיקרון באזורים גדולים של רקמה. במקביל, OMLIT תואם באופן מהותי לתהליכי SEM בחתכים סיריאליים: לפני מיקרוסקופיית אלקטרונים ברזולוציה גבוהה, OMLIT מספק מידע מבני על אותם מקטעים, מה שמאפשר ניווט מדויק בתשואה על השקעה ומפחית משמעותית את השטח ונפח הנתונים הנדרשים להדמיית EM מאוחרת. OMLIT מציע יתרונות ייחודיים ברמת ההדמיה המזוסקלית ומשמש כגשר קריטי המחבר בין מפות מבניות עצביות בקני מידה מרחביים שונים. אופיו הלא-הרסני שומר על הפוטנציאל לשילוב עתידי עם אסטרטגיות תיוג ספציפיות, כגון שימוש בחלבוני פלואורסצנטיים עמידים לאוסמיום¹⁹ להכנת דגימה והדמיה. שיטה זו מאפשרת הדמיה בקנה מידה בינוני של אזורים נבחרים במוח, ומאפשרת רכישה מהירה של מורפולוגיה, כמות, התפלגות וצפיפות נוירונים באזורים השונים. הוא גם מסייע באפיון כמותי של הקרנות אקסונליות ופיזור דנדריטים בין נוירונים באזורים שונים במוח. לאזורים ספציפיים המעניינים בתוצאות ההדמיה, ניתן להמשיך לחקור פרטים אולטרה-סטרוקטוריאליים במקום באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני.

עקרון ההדמיה של OMLIT תואר בעבודתו של האו פאן²⁰. בקצרה, במהלך ההדמיה, החתך הדק במיוחד, השכבה המצופפת, סרט האיסוף, הסרט המוליך והווייפר יוצרים מבנה סרט דק רב-שכבתי. כאשר גל מישור מתקשר עם מבנה זה, גלים מוחזרים נוצרים בממשקים שונים וחופפים במרחב הגילוי, מה שמוביל להפרעות אופטיות עקב הבדלים בהשתקפות, מקדם השבירה והספיגה בין החומרים. תוכנית סימולציה מבוססת MATLAB שפותחה על בסיס עיקרון זה הראתה הסכמה סבירה עם תוצאות הניסוי.

ניתן לסווג את שיטת ההדמיה OMLIT לשני סוגים בהתבסס על אסטרטגיית עיבוד הסרט. הראשונה היא אסטרטגיית ההחזרות הגבוהה, שבה מתכות כמו Cr, Cu, Al או Ag משמשות לציפוי פני הסרט, מה שמוביל לעוצמות אופטיות גבוהות יותר באזורים ציטופלזמיים ולומנים וסקולריים מלאי שרף בהשוואה לאזורים הסובבים. השנייה היא אסטרטגיית ההחזרה הנמוכה, המשתמשת בסרט קפטון לא מצופה, סרט D-50 או סרט PET מצופה CNT. במקרה זה, תוצאת ההדמיה האופטית היא הפוכה מהראשונה: אזורים עשירים בשרף ללא ממברנה (למשל, ציטופלזמה ולומנים וסקולריים) מופיעים בעוצמה נמוכה יותר.

אנו מסכמים ומקימים באופן שיטתי פרוטוקולים סטנדרטיים המותאמים לשתי אסטרטגיות דימות מובחנות. הפרוטוקולים המוצגים כאן מציעים נהלים ניסיוניים מקיפים ומפורטים. בנוסף, מסוכמים בעיות נפוצות שנתקלו במהלך הניסויים יחד עם פתרונות מוצעים. אנו מתמקדים בהצגת מערך נתונים של קליפת עכבר שנאספה באמצעות אסטרטגיית ההחזרה הנמוכה (805 × 857.5 × 11.66 מיקרון מעוקב), הממחיש את המאפיינים והיתרונות הייחודיים של גישת ההדמיה OMLIT.

Protocol

כל הליכי בעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות של אוניברסיטת המדע והטכנולוגיה של סין ולתקנות הלאומיות הרלוונטיות. הכנת הדגימה להדמיית OMLIT פועלת לפי אותו פרוטוקול כמו ב-EM קונבנציונלי, וההליך הספציפי שבו השתמשנו תואר במקום אחר²¹. בקיצור, לאחר ההרדמה, העכברים עברו פיוז טרנסקרדיאלי ברצף עם בופר קקודילט נתרן (קקודילאט), נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (ACSF), ולבסוף קיבע המכיל גלוטראלדהיד ופראפורמלדהיד. המוח הוסר בזהירות, וכ-1 × 1 × 1 מ"ק של רקמת מוח נחתכו. הדגימות קיבעו כימית, עברו כתמי מתכת כבדים סדרתיים, יובשו והוטמעו בשרף. תהליך העבודה הכללי של הפרוטוקול מוצג באיור 1.

איור 1: סקירה של תהליך העבודה. (א) קלטות איסוף שהוזכרו בפרוטוקול (משמאל לימין: פוליאמיד, D-50, ו-PET מצופה CNT). (ב) חיתוך סדרתי ואיסוף של הדגימות החתוכות. (ג) התקנת סרטים המכילים חתכים שנאספו על וייפר סיליקון עגול. (D) הדמיית מיקרוסקופיה אור, מוט קנה מידה 100 מיקרון. (E) ציפוי פחמן. (F) הדמיית מיקרוסקופ אלקטרוני תואמת את האזור המתואר באיור 1D, פס סולם: 10 מיקרון. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הכנת סרט

הערה: יש לבצע את ההליכים הבאים בחדר נקי כדי למנוע זיהום דבק מאבק.

1. אסטרטגיית רפלקטיביות גבוהה
   1. בחר סרט קפטון (להלן נקרא סרט פוליאמיד, בעובי 50 מיקרון) או סרט פנלייט (להלן נקרא D-50, בעובי 50 מיקרון) והתקן אותו על מערכת הסליל הממונעת. כאן משתמשים בסרט פוליאמיד כדוגמה.
      הערה: במחקר זה נעשה שימוש במכשיר סליל ממונע, שתוכנן להיות מונע על ידי מנוע צעד הנשלט דרך לוח ארדואינו, כדי להעביר את הסרט מסליל אחד לשני דרך חרוט הפלזמה הספטר. כדי לפצות על העלייה במהירות הקו של תרגום הסרט הנגרמת מהצטברות הסרט על גלגל ההנהגה, מה שמגדיל את קוטר גלגל הקליטה, נכתבה תוכנה לכוון סדרתי את מהירות הזווית של גלגל האיסוף לאחר כל סיבוב של 360°.
   2. מניחים שכבה דקה אחידה של Cr (או מתכות אחרות כמו אלומיניום, אגקלורד או Cu) על פני השטח של הסרט באמצעות מערכת התזות מגנטרון (ספטרינג כפול). מקם את הסרט במרחק של 80 מ"מ מהמטרה המתפצלת להצבה מיטבית. יש לבצע את התהליך בהספק ישר ובלחץ של 1.0 פסקל, המווסת על ידי גז ארגון של 99.99%.
   3. כוון את מהירות הסליף ל-0.6 מ"מ לשנייה כדי להגיע לעובי ציפוי מתכת של 50 ננומטר. לאחר ההפקדה, קרר את התא לאט לטמפרטורת החדר (RT) תחת ואקום גבוה כדי למזער את הלחץ על הציפוי.
      הערה: עובי הציפוי האופטימלי לאותו סרט יכול להשתנות בהתאם לסוג המתכת שבה משתמשים. כוונן את מהירות התרגום של הסרט כדי להשיג מגוון עובי ציפויים, כגון 50, 70, 100, 150 ו-200 ננומטר.
   4. הערך את עובי ואחידות הציפוי באמצעות פרופיילר סטיילוס, מיקרוסקופ כוח אטומי או מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
   5. נקה והפך את הסרט להידרופילי באמצעות מנקה פלזמה בהספק של 80 וואט, עם מהירות תנועה של 7 מ"מ/שנייה. לאחר הטיפול, טיפות המים המונחות על פני הסרט אמורות להתפשט במהירות לשכבה דקה (איור 2A).
2. אסטרטגיית השתקפות נמוכה
   הערה: פרוטוקול זה מאפשר שימוש בסרט D-50 או בסרט PET מצופה צינור פחמן מסחרי מצופה צינור פחמן (CNT). מכיוון שהאחרון עשוי להכניס רעש רקע במהלך הדמיית מיקרוסקופ אלקטרוני - אם כי לא חזק - הוא עשוי להשפיע על סגמנטציה של תמונות אלקטרומגנטיות. לכן, התיאור הבא עדיין ישתמש בסרט D-50 כדוגמה.
   1. הכינו את סרטי D-50 וחתכו את הגיליון המלא לסרטים ברוחב של כ-7 מ"מ. השתמש בצד אחד חשוף של הסרט לאיסוף מקטעים, תוך הגנה על הצד השני בשכבת סרט מט כדי למנוע שריטות וזיהום. הסר את סרט המט במהלך שלב ההרכבה הבא של וופר סיליקון.
   2. למספר גדול יותר של מקטעים, יש לחבר חלקים שונים של סרט D-50 יחד. אבטח את החיבורים בין מקטעי הסרט באמצעות סרט דבק דו-צדדי.
      הערה: בעת הדבקת מקטעי הסרט, ודאו שהסרט הקדמי חופף את הסרט האחורי מלמעלה למטה דרך הסרט הדו-צדדי. המזער את שטח ההדבקה והשאר שוליים לאורך קצוות הסרט כדי למנוע סחיטת דבק החוצה במהלך סיבוב הסרט, מה שעלול לזהם את הסרט (איור 2B).
   3. נקה והפך את הסרט להידרופילי באמצעות מנקה פלזמה, תוך ביצוע אותו תהליך וקבלת אותו אפקט שתואר קודם.
      הערה: למעט שלבי ציפוי המתכת וההתזת הפחמן, שאר השלבים בשתי האסטרטגיות זהים.

2. חתך סדרתי אולטרה-דק ואיסוף מבוסס סרט

1. באמצעות מטחנה קטנה או כלי חיתוך דומה, חתוך את השרף בצד עם הדגימה, מסיר את השרף הריק שמסביב כדי לחשוף את אזור הדגימה.
2. הנח את הבלוק המוטמע בשרף במחזיק הדגימה, והדק את הידית כדי לקבע את הבלוק היטב.
3. התקן את מחזיק הדגימות על הזרוע הניידת של המיקרוטום. התקן סכין זכוכית או סכין חיתוך יהלום (בזווית של 45°) על מחזיק הסכין. מתחת למיקרוסקופ, גזמו את פני הדגימה לצורת פירמידה והחליקו את המשטח.
   הערה: הקצוות הקדמיים והאחוריים של בלוק הדגימה החתוך צריכים להיות מקבילים ככל האפשר (ראו איור 2C).
4. חתוך והחליק את ארבעת הצדדים של בלוק הדגימה כדי להסיר שרף עודף סביב הקצוות, ולמנוע התנגשות אפשרית עם סכין היהלום. סובב את הידית כדי לוודא שהקצוות הקדמיים והאחוריים של הבלוק החתוך מיושרים במצב אופקי.
5. הסר את סכין החיתוך והחלף אותו בסכין יהלום בזווית של 45°. הגדר את זווית ההטיה של בסיס המיקרוטום ל-6°. הזז לאט את מחזיק הסכין באמצעות הכפתור עד שהקצה הקדמי של סכין היהלום נמצא במרחק של 1-2 מ"מ משטח הדגימה.
6. התבונן ברצועה הבהירה בין משטח הדגימה לקצה הסכין, וכוון את זווית ההטיה כך שהרצועה תהיה אחידה מלמעלה למטה ומצד לצד. זה עוזר להבטיח שהחלק הראשון יכלול את כל משטח הדגימה, ולא רק פינה.
7. הזרקו מים מזוקקים לחריץ סכין היהלום, מאפשרים לרמת הנוזל לעלות ולהבטיח שהלהב רטוב. לאחר מכן, השתמש במזרק כדי להסיר חלק מהמים עד שרמת הנוזל יורדת, וההשתקפות נראית כסופה.
8. הגדר את עובי החתך (הזנה), מהירות החיתוך וחלון החיתוך ביחידת הבקרה. כוון את מהירות החתך ל-0.6 מ"מ/ש והגדר את עובי החתך ל-60 ננומטר (המהירות והעובי הספציפיים תלויים באיכות הדגימה).
9. תתחילו בחתכים. לאחר שהמיקרוטום פועל יציב ונוצרים חתכים אחידים, עצרו את תהליך החיתוך. השתמש במברשת דקה כדי להסיר את החלקים החתוכים וכל הלכלוך שנשאר.
10. התקן גם את גלגל הסרט המצופה וגם גלגל איסוף ריק על מערכת איסוף החלקים האולטרה-דקים האוטומטית. אבטח את מנגנון הנעילה ובצע ניסוי כדי לוודא שהסרט זז בצורה חלקה במהירות קבועה ונאסף כראוי על הגלגל הריק.
11. טבלו את ראש האיסוף של מכשיר איסוף הסרט באמבט המים של סכין היהלום. כוונן את מיקום ראש האיסוף כך שיהיה מקביל לקצה הסכין, במרחק של פי 1.5 מאורך פרוסת הדגימה, כדי להבטיח שהחלקים החתוכים נאספים בצורה חלקה על הסרט. אבטח את מכשיר האיסוף והמשך בחתכים תוך כדי הפעלת מכשיר איסוף הסרט בו-זמנית.
12. לאחר איסוף מספיק של חתכים רציפים, עצרו את תהליך החיתוך. חתוך את הסרט באזור החתך שבו לא נאספו מקטעים, והמשך להפעיל את מכשיר איסוף הסרט עד שכל הסרט הנותר נאסף על הסליל.
13. הסר את הסליל המכיל את החלקים שנאספו והכניס אותו לתנור ייבוש אלקטרוני. נקה את מכשיר איסוף הסרט ואת המיקרוטום, והחזר את כל האביזרים למקומותיהם הנכונים.

איור 2: הכנות לפני החיתוך. (א) טיפות מים על פני השטח של סרט D-50 לפני (למעלה) ואחרי (למטה) טיפול הידרופילי. (B) תצוגות סכמטיות למעלה ולצד של אזור הצומת של סרט D-50. כחול: סרט D-50; כתום: דבק דו-צדדי; חץ ירוק: כיוון תנועת סרט. (ג) מבט חזיתי של הדגימה לאחר החיתוך, המציג את הקצוות העליונים והתחתונים המקבילים. (ד) מכשיר איסוף קלטות אוטומטי. א: סליל סרט להזנת סרט D-50; ב: סליל סרט לשליפת סרט; חץ אדום: כיוון תנועת הסרט. (ה) מיקום ראש האיסוף על מכשיר איסוף הסרט האוטומטי. הקופסה הצהובה בפינה הימנית התחתונה מצביעה על קטע חדש שעומד להיאסף על ידי המכשיר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. התקנה על וופר סיליקון

הערה: ודאו שמקום העבודה נקי כדי למנוע זיהום הדבק באבק במהלך השלבים הבאים.

1. השתמש בווייפר סיליקון עגול בקוטר 4 אינץ', מנוקה מראש ומותאם במערכת טיפול בפלזמה (בהספק של 80 וואט, 3 דקות).
2. לבשו כפפות נקיות, הניחו את הוופר הסיליקון על משטח ישר, וחתכו חתיכת סרט פחמן מוליך דו-צדדי לאורך מתאים (עם בליטה של 2-3 ס"מ משני הקצוות). הסר את שכבת ההגנה הלבנה מצד אחד של הסרט המוליך הדו-צדדי, ומרח אותה מלמעלה למטה על הוופר הסיליקון.
   הערה: שני צידי הסרט המוליך צריכים להיות במרחק של כ-2 מ"מ זה מזה, וקצוות הסרט צריכים להיות גלויים על הווייפר הסיליקון. עבור סרט מוליך דו-צדדי ברוחב 25 מ"מ, ניתן להחיל שלושה קטעי סרט על וופרת סיליקון אחת בקוטר 4 אינץ'.
3. צייר קווי מתאר של וופר הסיליקון בקוטר 4 אינץ' על שולחן העבודה וסמן את האורך המשוער של כל קטע סרט שיוחל על הוופר. חתוך את הסרט שאסף את החלקים לפי האורכים שסומנו קודם.
   הערה: הסרט החיתוך לא צריך לעלות על קצה וייפר הסיליקון, ואינו לחתוך את החלקים.
4. להסיר את סרט ההגנה השקוף מהסרט המוליך הדו-צדדי, ולסרט D-50, הסר את סרט ההגנה מאחורי הסרט בנקודה זו. מרח את הסרט במקביל לסרט המוליך הדו-צדדי. יש להניח עד שלושה קטעי סרט על כל חתיכת סרט מוליך דו-צדדי.
   הערה: כדי להפחית את הסיכון שסרט ה-D-50 לא ייישר או יזהם על ידי אבק, כיסו חלק מהסרט המוליך בשכבה השקופה שנשלפה קודם לכן, והשאירו רק חלק קטן מהסרט המוליך חשוף לחיבור קצה הסרט D-50. זה מאפשר התאמה קלה יותר של כיוון הסרט. לאחר מכן, יש לקלף בהדרגה את הסרט השקוף שנותר, לאפשר לשאר סרט D-50 ליפול בעדינות ולהיצמד לסרט המוליך.
5. לאחר התקנת הסרט, עלולות להיווצר בועות אוויר בין הסרט לסרט המוליך, מה שעלול להפריע לתהליך ההדמיה הבא. הניחו את וופר הסיליקון בתא ואקום (או בציוד ואקום אחר) ומרחו ואקום. לאחר סיום תהליך הוואקום, ודא שבועות האוויר נעלמו.

4. צביעה לאחר

1. הכינו 4% אורניל אצטט ו-3% עופרת ציטרט, וחממו אותם מראש ל-50°C בעזרת סיר מים.
   אזהרה: אצטט אורניל הוא רדיואקטיבי ויש לו רעילות משמעותית לכבד ולכליות. ציטראט עופרת עלול לגרום להרעלת עופרת, המשפיעה על מערכת העצבים, הכליות ומערכת ההמטופואיטית. העבודה עם חומרים אלו צריכה להתבצע באמצעות מכסה אדים, ויש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל מעיל מעבדה, כפפות ניטריל, מסכה ומשקפי מגן. במקרה של מגע עור או עין, יש לשטוף מיד כמויות גדולות של מים, לדווח לצוות הבטיחות במעבדה, ולפנות לטיפול רפואי.
2. הניחו את הוופר הסיליקון, שעבר שאקום וללא בועות, במערכת הידרופיליזציה פלזמטית לצורך הידרופיליזציה וניקוי.
3. באמצעות מזרק של 10 מ"ל עם המחט מוסרת, חבר מסנן מזרק של 0.22 מיקרון וסינן את אצטט האורניל של 4%. הניחו את התמיסה על החלק עד שכל פני השטח של החלק על וייפר הסיליקון מכוסים, ואז חכו 3 דקות.
4. שטפו במים מזוקקים במשך 3 דקות, חזרו על הפעולה 3 פעמים, ואז ייבשו את משטח הדגימה בחנקן.
5. באמצעות מזרק של 10 מ"ל עם המחט מוסרת, חבר מסנן מזרק של 0.22 מיקרון וסינן את ציטראט העופרת 3%. הורד את התמיסה על החלק עד שכל פני השטח של החלק על הווייפר הסיליקון מכוסה, ואז חכה 5 דקות.
6. שטפו במים מזוקקים במשך 3 דקות, חזרו על הפעולה 3 פעמים, ואז ייבשו את משטח הדגימה בחנקן.

5. רכישת נתונים

1. מיקרוסקופיה אופטית
   הערה: בסעיף זה משמש סורק שקופיות מחקר (VS200, אולימפוס) כדוגמה למיקרוסקופיה אופטית. מיקרוסקופים נוספים, כמו Axio Imager.A2 Vario (צייס, גרמניה), מתאימים גם הם להדמיה האופטית המתוארת כאן. השלבים במיקרוסקופים אופטיים אחרים בדרך כלל זהים.
   1. הניחו את הווייפר הסיליקוני על הבמה של המיקרוסקופ האופטי ואבטחו אותו עם סרט דבק שאינו שאריות.
   2. השתמש בעדשת אובייקטיב 5x כדי לקבל תמונת סקירה של וופרת הסיליקון, הסרט והדגימה.
   3. על תמונת הסקירה, סומן כל חלק ומיין אותם, ואז הוסף נקודות פוקוס ונקודות חשיפה כדי לבצע הדמיה אוטומטית בהגדלה של פי 20 או 50 על פני כל וייפר הסיליקון עם כל החלקים.
   4. לאחר סיום ההדמיה, שמור את התמונות, ואז בדוק את איכות התמונה. אם יש תמונות לא פוקוס או באיכות ירודה, יש למקד מחדש ולצלם מחדש.
2. מיקרוסקופיה אלקטרונית
   הערה: סוגים שונים של מיקרוסקופים אלקטרוניים יכולים לבצע הדמיה רציפה של חתכים דקים במיוחד המונחים על וופרים מסיליקון. כאן משתמשים ב-Multibeam 505 (Zeiss) כדוגמה.
   1. בצע ציפוי פחמן על פני הדגימה באמצעות ציפוי ספטר בוואקום גבוה, בעובי פחמן של 5.7 ננומטר.
      הערה: ניתן לדלג על שלב זה עבור סרטים שצופו במתכת באסטרטגיית רפלקטיביות גבוהה או מצופים בננו-צינורות פחמן (CNT) באסטרטגיה בעלת החזרות נמוכה.
   2. השתמשו במיקרוסקופ אופטי (Axio Imager.A2 Vario, Zeiss) כדי ללכוד את מפת הניווט האופטית של וייפר הסיליקון.
   3. הניחו את וייפר הסיליקון בתא הדגימה של ה-SEM. קישרו את מפת הניווט האופטי לתמונת מיקרוסקופ האלקטרונים על ידי זיהוי רציף של שני הסמנים המקוננים בצורת L בשלב הדגימה.
   4. השתמש במודול ה-SAT בתוכנת המיקרוסקופיה (v3.2, 64 ביט) כדי לזהות באופן חצי-אוטומטי את מיקומי החתכים ואזורי ההדמיה ממפת הניווט האופטית.
   5. הגדר את גודל הפיקסל של התמונה ל-4 ננומטר, זמן השהייה ל-0.8 מיקרושניות, נקודות מיקוד ומיקומים, ומיקומי אחסון.
   6. התחל בהדמיה רציפה.

6. עיבוד נתונים

הערה: התפירה הדו-ממדית של תמונות OMLIT מתבצעת אוטומטית על ידי התוכנה. לרישום וחלוקה תלת-ממדיים רחבי היקף של תמונות OMLIT, זמינים אלגוריתמים AI חזקים יותר. כאן, לנוחות רוב המעבדות לאמת את התהליך, מוצגים תפירה, רישום וסגמנטציה באמצעות Fiji (v1.54p, 64 ביט) ו-VAST (v1.5.0, 64 ביט).

1. פתח את מאגר הנתונים של התמונות בפיג'י על ידי גרירת התיקייה המכילה את כל קבצי התמונה לממשק של פיג'י, ובחר ב-Virtual Stack כאשר מתבקשים.
2. השתמש בכלי המלבן כדי לבחור את אזור העניין (ROI), ואז חתוך את מערך הנתונים באמצעות Image > Crop.
3. יישר את ערימת התמונה באמצעות תוסף Register Virtual Stack Slices (תוספים > Registration > Register Virtual Stack Slices).
4. שמור את מערך הנתונים המיושר בפורמט TIFF (קובץ > Save As > Tiff).
5. ייבא את ערימת התמונות של TIFF ל-VAST²² באמצעות ייבוא > ייבוא נפח תמונה מתמונות ל-. קובץ VSV.
   הערה: למדריך מפורט יותר, אנא עיינו באתר: https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/
6. על ידי חיבור טאבלט חיצוני, השתמשו בכלי המברשת במצב Draw Segment Mode כדי להתחיל בסגמנטציה ידנית ומעקב (השתמשו בקיצורי דרך A ו-Z כדי לנווט במהירות בין פרוסות התמונה).
7. דמיין את המבנה המפוצל בתלת-ממד באמצעות Window > 3D Viewer > View > Update.
8. שמור את תוצאות הסגמנטציה דרך קובץ > שמור סגמנטציה.

Results

תהליך העבודה הכולל של הפרוטוקול (איור 1) מתחיל בהכנת קלטות איסוף שונות. איור 1 מציג את שלושת סוגי הסרטים המוזכרים בפרוטוקול (משמאל לימין: Kapton, D-50, ו-PET מצופה CNT), שמפגינים תכונות אופטיות מובחנות כאשר הם מונחים על אותו מצע רקע. לאחר הכנת הדגימה וגזירת בלוקים, יש לאסוף תחילה כמה מקטעים להדמיה במיקרוסקופ אלקטרוני כדי לוודא שההכנה עומדת בציפיות. באמצעות מערכת איסוף סרטים אוטומטית, ניתן לאסוף אלפי מקטעים ולהיצמדם לסרטים מצופים...

Discussion

כאן פיתחנו גישת דימות אופטי, הנקראת OMLIT, שמאפשרת הדמיה מזוסקופית ותואמת לתהליכי עבודה של מיקרוסקופיה אלקטרונית סרתית מבוססת סרט. באמצעות שיטת OMLIT, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה אופטית ללכידת תכונות מבניות מזוסקופיות מדגימות מוח, כולל כלי דם, גופי תאים, גרעינים, ענפים דנדריטיים עיקריים וכמה אקסונים מיאליניים גדולים. בנוסף, ניתן לשלב את OMLIT בצורה חלקה בצינור ה-SEM הסדרתי, המספק מידע מבני לפני הדמיית מיקרוסקופ אלקטרוני ומשמש כמדריך לזיהוי אזורים בעלי עניין לרכישת אלקטרומגנטים בהמשך. הדגמנו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
סרט דבק	3M	B5005094008	דבק דו-צדדי
מיקרוסקופ כוח אטומי	ברוקר	אייקון הממד
מערכת איסוף חתכים אולטרה-דקים אוטומטית	להואה	AutoCUTS II
סרט דבק מוליך	טד פלה	FP16084-8
Dektak Stylus Profilers	ברוקר	DektakXT
סכין יהלום לחתך	דיאטום	DUJ3530	סכין ג'מבו דיאטומית
סכין יהלום לחיתוך	דיאטום	DTB90	סכין זכוכית
מיקרוסקופ אלקטרונים	צייס	MultiSEM505	חלופה: GeminiSEM 300, Zeiss
פיג'י (v1.54p, 64 ביט)	קוד פתוח	https://fiji.sc
סכין גיטור זכוכית	סלפמייד
ציטראט עופרת	לייקה	T534/2
מיקרוסקופ אור	אולימפוס	VS200	חלופה: Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
מיקרוסקופ אור	צייס	Axio Imager.A2 Vario
מנקה פלזמה	יידון טכנולוגיות	הידרו-S4	חלופות: Ted Pella Pelco או חומר ניקוי פלזמה שולחני אחר
סרט פולימר	מלטון	קפטון	האתר של החברה כבר אינו נגיש. אנו ממליצים לחוקרים לנסות קלטות KAPTON זמינות מקומית.
סרט פולימר	טייג'ין	חיית מחמד	https://www.teijin.com/
סרט פולימר	טייג'ין	D-50	https://www.teijin.com/
וייפר סיליקון	סאיצ'י	912303	הווייפר מלוטש בצד אחד.
ספאטר קואטר	לייקה	ACE600	חלופה: דבל-הד ספאטר, יוג'יה
אולטרהמיקרוטום	לייקה	UC7	חלופה: RMC PT-PC
אורנילאצטט	EMS	22400
VAST (גרסה 1.5.0, 64-ביט)	מכון הווארד יוז לרפואה	https://software.dvid.io/vast/	VAST A1:D32Lite הוא כלי חינמי להערות ידניות ולחלוקה של מאגרי נתונים גדולים במיקרוסקופיה תלת-ממדית.
תוכנת ZEN (גרסה 3.2, 64 ביט)	צייס	https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html