Method Article

זיהוי מבוסס גלאי פלואורסצנטי PCR של Aspergillus Spp., Cryptococcus neoformans ו-Pneumocystis jirovecii

DOI:

10.3791/68819

⸱

May 8th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול בדיקה קלינית המבוסס על שיטת גלאי פלואורסצנטי PCR לזיהוי בו-זמני של Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans ו-Pneumocystis jirovecii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר הליך סטנדרטי לזיהוי איכותני של Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans ו-Pneumocystis jirovecii בדגימות ליחה קליניות באמצעות ערכת זיהוי חומצות גרעין מבוססת גלאי פלואורסצנטי PCR. ההליך כולל איסוף דגימות קליני, טיפול מוקדם בנזילות אלקלית, חילוץ אוטומטי של חומצות גרעין וזיהוי PCR בזמן אמת במולטיפלקס. Aspergillus spp., C. neoformans ו-P. jirovecii מזוהים באמצעות גלאי פלואורסצנטיים ספציפיים למטרה (ערוצי FAM, VIC ו-CY5, בהתאמה), עם ערוץ בקרה פנימי (ROX) משולב לצורך הבטחת איכות. תוקף הבדיקה ופרשנות תוצאות המדגם מבוססים על ערכי סף מחזור מוגדרים (Ct). בקרה חיובית חייבת להציג עקומות הגברה בצורת S עם Ct ≤ 33.7 בכל הערוצים, בעוד שבקרה השלילית אין הגברה. בדגימות קליניות, ערך Ct ≤ 33.7 בערוץ FAM מצביע על חיוביות לסוגי Aspergillus , וערך Ct ≤ 36 בערוץ VIC או CY5 מצביע על חיוביות עבור C. neoformans או P. jirovecii, בהתאמה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהומים פטרייתיים פולשניים, כגון אלו הנגרמים על ידי אספרגילוס , Cryptococcus neoformans ו-Pneumocystis jirovecii, מהווים איום משמעותי על מטופלים עם מערכת חיסון מוחלשת, ומובילים לתחלואה ותמותה גבוהה. אבחון מדויק ובזמן הוא קריטי להתחלת טיפול אנטי-פטרייתי מתאים ולשיפור התוצאות הקליניות1. שיטות אבחון קונבנציונליות, כולל תרבית, מיקרוסקופיה וזיהוי אנטיגן, סובלות ממגבלות בולטות. התרבית גוזלת זמן ומציגה רגישות נמוכה, מיקרוסקופיה חסרה זיהוי ברמת מין ותלויה במפעיל, בעוד שבדיקות אנטיגן (למשל, גלקטומאנן, β-D-גלוקן) עשויות להראות תגובתיות צולבת וביצועים לא עקביים. אבחון מולקולרי, במיוחד PCR בזמן אמת, יכול לטפל בחלק מהפערים הללו על ידי הצעת זמני תגובה מהירים יותר ופוטנציאל לרגישות וספציפיות גבוהה. ההתקדמות ב-PCR מרובה מאפשרת גם זיהוי בו-זמני של מספר פתוגנים מדגימה אחת, ובכך משפרת את יעילות האבחון.

פרוטוקול זה מתאר בדיקת PCR מולטיפלקס פלואורסצנטית לזיהוי איכותני DNA של Aspergillus spp., C. neoformans ו-P. jirovecii בדגימות ליחה אנושית, על ידי מיקוד באזורים שמורים בגן 18S rRNA (Aspergillus spp.), גן ITS (C. neoformans) וגן mtLSU rRNA (P. jirovecii). מאפיינים מרכזיים של שיטה זו כוללים רגישות אנליטית מוגדרת: גבול הגילוי של אספרגילוס, C. neoformans ו-P. jirovecii הוא 1,500 עותקים למ"ל; ספציפיות פריימר/פרוב: פריימרים וגשושים ספציפיים למטרה ממזערים תגובתיות צולבת עם DNA אנושי או פלורה נפוצה אחרת; שליטה חזקה בזיהום: שילוב מערכות dUTP-UDG (אורציל-DNA גליקוזילאז) מונע ביעילות זיהום נמשך מאמפליקונים קודמים של PCR, תכונה קריטית לשמירה על אמינות הבדיקה במעבדה קלינית2; בקרה משולבת של תהליך: בקרה פנימית אנדוגנית המיועדת לגן RP (חלבון ריבוזומל) האנושי, המסומנת בפלואורופור ROX, מוגברת יחד כדי לנטר שלמות חילוץ חומצות גרעין ולזיהוי עיכוב פוטנציאלי ל-PCR, ובכך להפחית תוצאות שליליות שגויות3. גישה זו נתמכת על ידי הנחיות מבוססות לאבטחת איכות באבחון מולקולרי 4,5. הפרוטוקול מיושם בעיקר לדגימות נשימתיות (ליחה/BALF) מאוכלוסיות בסיכון גבוה, כגון מטופלי המטולוגיה-אונקולוגיה או מקבלי השתלות. נדונות גם מגבלות פוטנציאליות, כולל תוצאות חיוביות שגויות מזיהום סביבתי או ירידה ברגישות עקב דילול מופרז של דגימה, יחד עם אסטרטגיות הפחתה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בדגימות קליניות אושר על ידי ועדת האתיקה המתאימה (אישור מס': ZYS-GCP-2025006). כל המשתתפים נתנו הסכמה רחבה ומודעת לשימוש בנתונים ובדגימות שלהם במחקר. כל החומרים והחומרים המתכלים המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים ברשימתהחומרים (T able of Material).

1. איסוף דגימות

  1. אספו 3–5 מ"ל של ליחה או נוזל שטיפה ברונכואלואולרית במיכלים סטריליים והוגש לבדיקה במהירות.

2. הכנת תגובת

הערה: השלבים הללו בוצעו בחדר הכנת המגנים.

  1. הוציאו את ערכת הזיהוי מהמקפיא בטמפרטורה של מינוס 28°C והפשרו לחלוטין בטמפרטורת החדר (25–30 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות.
  2. חשב את מספר התגובות הכולל (N): N = מספר דגימות הבדיקה (n) + ביקורת חיובי/שלילית (2) + 1
  3. הכינו את תערובת התגובה בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי. לתגובה בודדת: 35 מיקרוליטר תערובת הגברה של חומצות גרעין + 5 מיקרוליטר תערובת פריימר-פרוב, מערבולת יסודית וצנטריפוגה קצרה.
  4. אליקווט 40 מיקרוליטר של תערובת התגובה לכל צינור PCR (בהתאם לפרוטוקול יצרן הערכה) ומועבר לחלון המעבר בחדר עיבוד הדגימות.

3. עיבוד דגימות

הערה: שלבים אלו בוצעו בחדר עיבוד הדגימות. סילוק פסולת: השליך את הסופרנטנט משלב 3.2.2 ופסולת נוזלית אחרת המכילה NaOH למיכל פסולת כימית ייעודי.

  1. נוזל
    1. הוסיפו נוזל ליחה/נוזל שטיפה ברונכואלוואולרי (BALF) לצינור עם מכסה בורג בנפח 50 מ"ל.
    2. הוסיפו 1–2 נפחים של תמיסת עיכול של 4% NaOH (ביחס לצמיגות הליחה).
      אזהרה: NaOH הוא קורוזיבי. הימנעו ממגע עם עור ועיניים.
    3. הדק את המכסה, מערבולת למשך דקה אחת, ודוגר בארון בטיחות ביולוגית בטמפרטורת החדר למשך 15–20 דקות.
  2. העשרה
    1. דגימות נוזליות בצנטריפוגה במהירות 3,000 סל"ד למשך 5 דקות.
    2. להשליך את הסופרנטנט באמצעות פיפטה, תוך שמירה על 1,000 מיקרו-ליטר של משקע.
    3. לסחרר את המשקעים היטב.
  3. ליסיס
    1. העבר 500 מיקרוליטר משקעים לצינור ליזיס. מערבולת ל-10 דקות וצנטריפוגה קצרה.
  4. חילוץ
    הערה: פינוי פסולת: לוחות חילוץ, קצוות וצינורות משומשים שפגעו בדגימות ביולוגיות חייבים להיות מושלכים למיכל פסולת ביולוגית מסוכנת מאושר.
    1. העבר את כל סופרנטנט הליזאט ו-100 מיקרוליטר של בקרות שליליות/חיוביות לעמודה 2 של לוח החילוץ.
    2. בצע חילוץ חומצות גרעין באמצעות מערכת אוטומטית לחילוץ חומצות גרעין עם התוכנית המיועדת6.
  5. טעינת דגימות
    1. העבר 10 מיקרוליטר של חומצה גרעין שהופקה (עמודה 6) ובקרות לצינורות PCR. צנטריפוגה קצרה והעברה לחלון המעבר של חדר ההגברה.

4. הגברה של חומצות גרעין

הערה: שלבים אלו בוצעו בחדר ההגברה.

  1. טעינו את צינורות ה-PCR למכשיר ההגברה הגרעינית האוטומטי ובחרו את תבנית ההגברה המתאימה.
  2. הקצאת ערוצי גילוי: Aspergillus spp.: ערוץ FAM; C. neoformans: ערוץ VIC; P. jirovecii: ערוץ CY5; בקרה פנימית: ערוץ ROX 7,8,9.
  3. קבע שמות לדוגמה והפעיל את התוכנית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עקומות הגברה מייצגות שהושגו באמצעות מבחן PCR של גלאי פלואורסצנטי במולטיפלקס מוצגות באיור 1 ובאיור 2. תקפות הבדיקה נקבעה על בסיס קריטריוני ביקורת מוגדרים מראש. בריצה תקפה, הבקרה החיובית יצרה עקומות הגברה אופייניות בצורת S בערוצי FAM, VIC, CY5 ו-ROX, עם ערכי סף מחזור (Ct) ≤ 33.7 בכל ערוצי הגילוי (איור 1A). הביקורת השלילית לא הראתה עקומות הגברה בצורת S באף ערוץ, וערכי Ct דווחו כ"לא מוגדרים" (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול ה-PCR בזמן אמת במולטיפלקס שנקבע במחקר זה מספק הליך סטנדרטי לגילוי בו-זמני ומהיר של שלושה פתוגנים פטרייתיים פולשניים מרכזיים (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans, ו-Pneumocystis jirovecii) בדגימות ליחה קליניות. שיטה זו מאפשרת זיהוי ישיר של DNA פתוגן מדגימות קליניות. בניגוד לשיטות אבחון מסורתיות כמו תרבית, מיקרוסקופיה או בדיקות אנטיגן סרולוגיות, שיטה מולקולרית זו אינה כפופה למגבלות הטבועות בטכניקות אלו, כולל זמן עיבוד ממושך הקשור לתרבית, הרגישות המשתנה ותלות המפעיל של מיקרוס...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות למחלקת המעבדה הקלינית בבית החולים העממי של מחוז שאנשווי בפושאן על מתן הציוד והתמיכה הטכנית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 & mu; קצה פיפט סטרילי מורחב עם קצה פילטר L (עם מדפים)ביוטכנולוגיה של שיאורויS20221126
1000 & mu; טיפים של פיפטה סטריליתחברת הכלים הרפואיים ג'יאנגסו שינקאנג בע"מ241101
200 & mu; קצה פיפט סטרילי עם פילטר מוארך Lביוטכנולוגיה של שיאורוי241001
צינורות ליסיסBeijing ZC ביו-סיינס & חברת טכנולוגיהF1040
ערכת זיהוי חומצות גרעין עבור Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans, ו-Pneumocystis jiroveciiBeijing ZC ביו-סיינס & חברת טכנולוגיה.CT8143-48T
תגובת חילוץ חומצות גרעיןBeijing ZC ביו-סיינס & חברת טכנולוגיהCN8053-B40T
בופר דילול דגימהBeijing ZC ביו-סיינס & חברת טכנולוגיהSP7065

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 11 (9), 1026-1030 (1993).
  3. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in PCR. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  4. Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), research0034.1-research0034.12 (2002).
  5. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  6. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  7. Loeffler, J., et al. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the LightCycler system. J Clin Microbiol. 38 (10), 3463-3466 (2000).
  8. Bovers, M., et al. Six monophyletic lineages identified within Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by multi-locus sequence typing. Fungal Genet Biol. 43 (5), 353-359 (2008).
  9. Wakefield, A. E., et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet. 336 (8726), 751-753 (1990).
  10. Schrader, C., et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  11. White, T. J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, J. J. , Academic Press. 315-322 (1990).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

Related Articles