מאמר שיטה

חקירת המנגנון של אפנון LINC00511 בתיווך β-Elemene לדיכוי עמידות לציספלטין בסרטן ריאות

DOI:

10.3791/68825

⸱

19 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, 2Health Care Department, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Teaching Department, The Third Affiliated Clinical Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 4The Research Center of The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 5Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 6Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עמידות לציספלטין (DDP) מגבילה את יעילות הכימותרפיה בסרטן הריאות. מחקר זה נועד להבהיר כיצד β-Elemene (β-Ele) הופך את העמידות בתאי A549/DDP על ידי הורדת LINC00511. ניתוחי מבחנה ו-RNA-seq הראו כי ויסות זה מעכב גליקוליזה אירובית ואיתות Wnt/β-catenin, ומציע אסטרטגיה פוטנציאלית להתגבר על עמידות לכימותרפיה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עמידות לציספלטין מגבילה משמעותית את יעילות הכימותרפיה בסרטן ריאות של תאים לא קטנים, ומחייבת פיתוח אסטרטגיות חדשות להתגברות על מחסום זה. מחקר מבחנה זה נועד להבהיר את המנגנון שבאמצעותו β-Ele הופך את העמידות לציספלטין בתאי אדנוקרצינומה של הריאות באמצעות מסלולי גליקוליזה בתיווך LINC00511 ומסלולי איתות Wnt/β-catenin. קו תאי אדנוקרצינומה ריאתית אנושית עמיד לציספלטין (A549/DDP), עם ביטוי יתר LINC00511 או נוקדאון, הוקם באמצעות טרנספקציה של פלסמיד. יעילות הטרנספקציה הוערכה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז הפוכה כמותית (qRT-PCR) כדי לזהות רמות ביטוי LINC00511. הערכה באמצעות בדיקת 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) הצביעה על עיכוב משמעותי בתיווך β-Ele של התפשטות תאי A549/DDP. ניתוח RNA-seq נוסף גילה כי ההשפעה המעכבת של β-Elemene על עמידות לציספלטין הייתה קשורה קשר הדוק להפרעה של גליקוליזה תאית ודיכוי הפעלת מסלול האיתות Wnt/β-catenin. ניתוח כתמים מערביים של חלבוני מפתח, כולל טרנספורטר גלוקוז 1 (GLUT1), פירובט קינאז M2 (PKM2), לקטט דהידרוגנאז A (LDHA), β-קטנין וגליקוגן סינתאז קינאז 3β (GSK-3β), הראה כי β-Elemene הפך את העמידות לציספלטין על ידי עיכוב גליקוליזה אירובית וחסימת הפעלת מסלול האיתות Wnt/β-catenin באמצעות ויסות נמוך של LINC00511. באופן קולקטיבי, תוצאות אלה מדגימות כי β-Elemene מתגבר על עמידות לציספלטין בסרטן ריאות על ידי התמקדות ב-LINC00511 ובמסלול הגליקוליזה/Wnt/β-catenin האירובי הקשור אליו. זה יוצר מסגרת תיאורטית למחקרים פרה-קליניים וקליניים עתידיים תוך חשיפת יעדים טיפוליים פוטנציאליים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בקרב גידולים ממאירים ברחבי העולם, סרטן הריאה מציג שיעורי שכיחות ותמותה גבוהים במיוחד, המאופיינים בטרנספורמציה ממאירה וצמיחה פולשנית של תאי אפיתל הסימפונות 1,2. בהתבסס על מאפיינים היסטופתולוגיים, סרטן ריאות מסווג כקרצינומה של תאים לא קטנים (NSCLC) או קרצינומה של תאים קטנים (SCLC)3. ראוי להזכיר כי NSCLC מייצג כ-85% מכלל מקרי סרטן הריאות 4,5. כתקן כימותרפיה קו ראשון ל-NSCLC, ציספלטין (DDP) הוא הכרחי מבחינה קלינית6. עם זאת, תצפיות קליניות גילו שתאי גידול יכולים לפתח עמידות לתרופות באמצעות מנגנונים מרובים, הכוללים בעיקר הפעלת מסלולי בריחה חיסוניים, מוטציות בגני מטרה לתרופות וחוסר ויסות של מסלולי חילוף החומרים של תרופות 7,8,9.

RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNA) מייצג תעתיקים > 200 נוקלאוטידים (nt) חסרי יכולת קידוד חלבון10. עדויות מצטברות מצביעות על כך ש-lncRNA יכול להפוך את עמידות הציספלטין בתאי גידול באמצעות מנגנונים מרובים, כגון תפקוד כ-RNA אנדוגני מתחרה (ceRNAs) לספוג miRNAs ולשחרר את גני המטרה שלהם11, ויסות מסלולי איתות אפופטוזיס12, השתתפות בתיקון נזק ל-DNA13 וויסות אוטופגיה תאית14. יתר על כן, עם התקדמות המחקר על תכנות מחדש מטבולי של גידולים, צצו ראיות משמעותיות המראות כי lncRNA ממלא תפקיד רגולטורי קריטי בתהליך זה. אפקט ורבורג, המציין גליקוליזה אירובית, מהווה מאפיין מטבולי בסיסי של תאים ממאירים15. הוא לא רק מספק אנרגיה לשגשוג מהיר של תאים, אלא גם מייצר מטבוליטים ביניים המשמשים כקודמים לביוסינתזה, התומכים בסינתזת חלבון ושומנים כדי לעמוד בדרישות של צמיחת גידול ממאיר16. בסרטן ריאות, אושר כי lncRNA משפיע באופן משמעותי על התקדמות הגידול ועמידות לכימותרפיה על ידי ויסות מסלול הגליקוליזה האירובי17,18.

בין אלה, LINC00511, מולקולת lncRNA שנחקרה רבות בשנים האחרונות, דווח כקשורה קשר הדוק להתחלה והתפתחות של גידולים ממאירים שונים19. ממצאים אלה לא רק מבהירים את המנגנונים הספציפיים של מעורבות lncRNA בתכנות מחדש של חילוף החומרים של הגידול, אלא גם מספקים בסיס תיאורטי לאסטרטגיות טיפול בגידול ממוקד lncRNA, ופותחים אפיקים טיפוליים פוטנציאליים.

נגזר מקני השורש של Curcuma zedoaria, β-Ele הוא ססקיטרפנואיד ביו-אקטיבי עם יעילות אנטי-גידולית מוכחת. המחקרים הקודמים שלנו הוכיחו כי β-Ele משמש כמעכב סלקטיבי של מסלול האיתות PI3K/Akt/mTOR ומייצר אפקט סינרגטי עם ציספלטין על ידי התמקדות במטבוליזם של הגידול. זה דיכא משמעותית את צמיחת הגידול במודל xenograft של עכבר NSCLC20. מחקרים עוקבים מדגימים את יכולתו של β-Ele להחליש את הגליקוליזה האירובית בתאי NSCLC באמצעות אפנון של ציר האיתות miR-301a-3p/AMPKα, וכתוצאה מכך תוצאות אונקוסטטיות21. בהתבסס על הממצאים הקודמים שלנו, אישרנו כי LINC00511 מחליש עמידות לציספלטין בסרטן הריאות; עם זאת, מנגנון הפעולה המולקולרי המדויק עדיין צריך להיות ברור במלואו.

בהתחשב בתפקיד המרכזי של גליקוליזה אירובית בתכנות מחדש של חילוף החומרים של הגידול והתפקיד הקריטי של LINC00511 בהתפתחות הגידול והתקדמותו, מחקר זה נועד לחקור האם β-Ele יכול להפוך את עמידות הציספלטין בסרטן ריאות על ידי אפנון מסלול הגליקוליזה האירובי בתיווך LINC00511.

עדויות קודמות מצביעות על כך ש-β-Ele יכול להפוך את העמידות לציספלטין ולשפר את ההשפעות האנטי-גידוליות שלו על ידי הפעלת מסלולים אפופטוטיים22, ויסות הפרשת אקסוזום23 ועצירת מחזור התא24. עם זאת, מנגנונים ידועים אלה מציגים בדרך כלל השפעות רחבות וחסרים ויסות מדויק של מטרות מולקולריות ספציפיות, ובכך מגבילים את יכולת התרגום הקליני שלהם. לכן, יש צורך דחוף לחקור אסטרטגיות חדשות ממוקדות יותר, בעלות מנגנונים מוגדרים היטב ומדגימות פוטנציאל חזק לתרגום קליני להתגברות על עמידות לציספלטין. בניגוד למחקר קודם המדגיש את הפעולות הביולוגיות המיידיות של β-Ele, מחקר זה מאפיין את ההשפעה של β-Ele על חילוף החומרים של ורבורג ומסלול האיתות Wnt/β-catenin בתאי A549/DDP באמצעות ויסות מסלולים מולקולריים בתיווך lncRNA, במטרה להבהיר מנגנון חדש העומד בבסיס היפוך הרגישות הכימית בסרטן הריאות. מאמר זה לא רק חושף גישה חדשה עבור β-Ele להיפוך עמידות לכימותרפיה על ידי התמקדות ב-lncRNA, אלא גם מספק בסיס תיאורטי רענן ויעדי התערבות פוטנציאליים לניהול קליני של סרטן ריאות. ממצאים אלה, באמצעות הבהרה מפורטת של מטרה מולקולרית ספציפית (LINC00511) ומסלולי איתות מרכזיים (Warburg ו-Wnt/β-catenin), מדגימים פוטנציאל תרגומי קליני משופר משמעותית. הם צפויים לספק בסיס מדעי איתן לשיפור הרגישות לכימותרפיה בחולי סרטן ריאות ושיפור איכות חייהם, כמו גם לקדם פיתוח אסטרטגיות טיפול מדויקות לסרטן הריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ממס

  1. הכנת תמיסה בינונית לתאי A549/DDP: לטפח תאי A549/DDP במדיום השלם F-12K של האם (ראה טבלת חומרים לפרטים), בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS, ראה טבלת חומרים לפרטים), תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 1% (P/S, ראה טבלת חומרים לפרטים), ו-2 מיקרוגרם/מ"ל ציספלטין (DDP, ראה טבלת חומרים לפרטים).
    1. הכנת תמיסה בינונית מלאה: הכן תמיסה בינונית מלאה על ידי הוספת 50 מ"ל FBS ו-5 מ"ל P/S ל-500 מ"ל מדיום F-12K של Ham, ולאחר מכן ערבוב יסודי.
    2. הכנת תמיסה בינונית מלאה המכילה ציספלטין: שקלו 1 מ"ג אבקת ציספלטין (DDP, ראו טבלת חומרים לפרטים) והמיסו אותה ב-1 מ"ל מים מזוקקים כפולים (ddH2O) להכנת תמיסת הציר. מוסיפים 200 מיקרוליטר מתמיסת המלאי ל-100 מ"ל של מדיום שלם (מוכן לפי שלב 1.1.1) ומערבבים היטב להכנת תמיסת עבודה של מדיום שלם המכיל 2 מיקרוגרם/מ"ל ציספלטין.
      הערה: מכיוון שציספלטין הוא חומר ציטוטוקסי, בצע את כל ההליכים במכסה אדים או בארון בטיחות ביולוגית ולבש ציוד מגן כגון כפפות, מעילי מעבדה ומשקפי מגן.
  2. פתרון מתן β-Ele: ריכוז התרופה ששימש במחקר זה התבסס על תוצאות ניסויים קודמים שנערכו על ידי צוות המחקר שלנו20,21. ממיסים 1 מ"ג של β-Ele (ראה טבלת חומרים לפרטים) ב-20 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד (DMSO, ראה טבלת חומרים לפרטים) כדי להכין את תמיסת המלאי. לדלל את תמיסת המלאי ל-25 מ"ל באמצעות מדיום שלם כדי לקבל פתרון עבודה של 40 מיקרוגרם/מ"ל β-Ele.
    הערה: מכיוון ש-DMSO יכול לשפר את הספיגה של חומרים אחרים דרך העור, בצע את כל שלבי הפעולה במכסה אדים או בארון בטיחות ביולוגית וללבוש ציוד מגן כגון כפפות, בגדי מעבדה ומשקפי מגן.

2. תרבית תאים 

  1. השתמש בקו התאים העמיד לאדנוקרצינומה של ריאות אנושיות (A549/DDP, Procell, ראה טבלת חומרים לפרטים) במחקר זה. ודא שקו תאים זה זוהה על ידי ניתוח חזרה טנדם קצר (STR) והותאם בהצלחה לשושלות סטנדרטיות ב-ATCC ובמסדי נתונים אחרים.
    1. לשיטת ניתוח STR, אסוף כ-1 x 106 תאים, וחלץ DNA גנומי באמצעות ערכת מיצוי DNA מסחרית (ראה טבלת חומרים לפרטים).
    2. השתמש במערכת STR מולטיפלקס מאומתת המתאימה להקלדת DNA כדי להגביר 20 מיקומי STR יחד עם המיקום הקובע את המין. בצע PCR ampampבתנאי הרכיבה התרמית הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריה 29 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, חישול ב-59 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, עם שלב הארכה סופי ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. לנתח את תוצרי ה-PCR המתקבלים באמצעות אלקטרופורזה נימית באמצעות מנתח גנטי אוטומטי בהתאם להוראות היצרן. כאן, הקלדת האלל בוצעה באמצעות תוכנת ניתוח שברים (ראה טבלת חומרים לפרטים), עם סף זיהוי שיא שנקבע על 150 יחידות פלואורסצנטיות יחסית (RFU).
      הערה: פרופיל ה-STR של 20 לוקוס שנוצר הושווה מול פרופילי ייחוס של קווי תאים A549/DDP הזמינים במאגרי מידע ציבוריים. שיעור התאמה העולה על 80% נחשב כאינדיקציה להומולוגיה. היעדר פסגות אלל זרות אישר עוד יותר את היעדר זיהום צולב.
  2. מוציאים את התאים מחנקן נוזלי ומניחים אותם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס להפשרה מהירה עד שהנוזל נמס לחלוטין. העבירו את תרחיף התאים לצינור צנטריפוגה של 5 מ"ל, הוסיפו שני נפחים של תמיסה בינונית שלמה והשעו בעדינות את התערובת. לאחר צנטריפוגה (358 × גרם, 5 דקות, טמפרטורת החדר), יש להשליך את הסופרנטנט בזהירות.
    הערה: בעת שימוש בצינורות שימור הקפאה של תאים מחנקן נוזלי, יש ללבוש כפפות נגד הקפאה ומשקפי מגן או מסכת פנים, ואין לפנות לפה הצינור.
  3. השעו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום שלם עם פיפטינג עדין, ולאחר מכן דללו את המתלה ל-10 מ"ל על ידי הוספת 9 מ"ל של מדיום שלם. זרעו את התאים לתוך תבניות תרבית תאים של 100 מ"מ ותרבו אותם באינקובטור (ראו טבלת חומרים לפרטים) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. יחס מעבר התאים נשמר בין 1:2 ל-1:3.
    הערה: ציספלטין היא תרופה כימותרפית פלטינה עם ציטוטוקסיות. בשיטה זו, תאי A549/DDP מתורבתים עם מדיום המכיל ציספלטין. לכן, אספו את מדיום תרבית הפסולת המכיל ציספלטין לחבית נוזל פסולת מיוחדת ושלחו אותו באופן קבוע לחברה לטיפול בפסולת מסוכנת לסילוק מקצועי.

3. טרנספקציה של פלסמיד 

  1. השתמש במבנה פלסמיד לביטוי יתר של LINC00511 ו-siRNA ממוקד LINC00511 ספציפי לגן (מזהה גן: 400619; מזהה תעתיק: NR_033876.1) עבור טרנספקציה של תאים. רצפי ה-siRNA המנוצלים מסופקים בטבלה 1.
רצפי siRNA
שםחוש 5'-3'אנטיסנס 5'-3'
LINC00511-הומו-1625
CAGCUGUGAACUUCCUUATT
UAAAGGAAGUUCACAGCUGTT

טבלה 1: רשימת רצפי siRNA

  1. בחר באופן אקראי תאי A549/DDP שהועברו לדור השלישי לאחר החייאה, וחסן אותם באופן אחיד לצלחות של 6 בארות בצפיפות של 1 x 105 תאים לבאר. כל באר ממוספרת באופן אקראי, והבארות חולקו לקבוצות ניסוי על סמך המספרים האקראיים האלה.
  2. העבירו את התאים באמצעות מגיב טרנספקציה (ראו טבלת חומרים לפרטים) כאשר צפיפותם מגיעה לכ-70%.
    1. הכן את תמיסת הטרנספקציה של siRNA.
      1. מערבבים 250 מיקרוליטר של מדיום חיוני מינימלי אופטימלי (Opti-MEM, ראה טבלת חומרים לפרטים) עם 5 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה, מערבולת עדינה פי 3-5 כדי להבטיח הומוגניות, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      2. יש לדלל 5 מיקרוליטר של siRNA (50 ננומטר) ב-250 מיקרוליטר של Opti-MEM, מערבולת בעדינות פי 3-5 כדי לערבב היטב. שלב את מגיב הטרנספקציה המדולל עם תמיסת ה-siRNA ודגר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ליצירת קומפלקס הטרנספקציה של siRNA.
    2. הכן את תמיסת העברת הפלסמיד.
      1. מערבבים 250 מיקרוליטר של Opti-MEM עם 5 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה, מערבולת עדינה פי 3-5 כדי להבטיח הומוגניות, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      2. לדלל 2 מיקרוגרם פלסמיד ב-250 מיקרוליטר של Opti-MEM, מערבולת עדינה פי 3-5 כדי להבטיח ערבוב יסודי. שלב את מגיב הטרנספקציה המדולל עם תמיסת הפלסמיד ודגר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי להכין את תמיסת העברת הפלסמיד.
      3. הוסף את תמיסת טרנספקציה siRNA ואת תמיסת טרנספקציה פלסמיד ללוחות 6 הבארות, בהתאמה. הוסף 1,500 מיקרוליטר של מדיום שלם לכל באר. מערבבים בעדינות את לוחות התאים לפני ואחרי ההוספה כדי להבטיח פיזור אחיד. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 24 שעות לאחר הטרנספקציה לפני הניתוח.

4. זיהוי יעילות הטרנספקציה על ידי תגובת שרשרת פולימראז טרנסקריפטאז הפוכה כמותית (qRT-PCR)

הערה: קח את התאים לאחר טרנספקציה למשך 24 שעות בשלב 3.3 לזיהוי qRT-PCR לפי ההליך הבא. כל הניסויים בוצעו בשלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים (n = 3).

  1. מיצוי RNA
    1. השתמש בערכת מיצוי RNA טהורה במיוחד (ראה טבלת חומרים לפרטים). השליכו את המדיום בצלחת 6 הבארות לפי הוראות הערכה ושטפו את התאים עם PBS. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת ריאגנט ליזה מבוססת פנול-גואנידין לכל באר, פוצץ בעדינות את התאים עם קצה האקדח כדי להשעות אותם במלואם, ולהעביר את התערובת לצינור צנטריפוגה. השאירו אותו למשך 5 דקות כדי להבטיח ליזה מלאה של דגימת התא.
    2. מוסיפים 100 מיקרוליטר של מגיב ליזה פנול-גואנידין איזותיוציאנט, מנערים בחדות במשך 15 שניות ומשאירים למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שאפו בזהירות את השלב המימי העליון, העבירו אותו לעמוד הספיחה וצנטריפוגה ב-13,400 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. קושרים RNA לקרום הסיליקה ג'ל. שטפו אותו עם Buffer RW1 ו-Buffer RW2 כדי להסיר חלבונים. לאחר מכן, הוסף DNase I לעיכול שאריות DNA ובצע שטיפה משנית עם Buffer RW2 כדי להבטיח הסרה מלאה של זיהומים. לבסוף, אסוף דגימות RNA על ידי הוצאת RNA במים נטולי RNase וצנטריפוגה ב-13,400 x g למשך דקה אחת.
  2. מדוד את ריכוז ה- RNA.
    1. הנח כל 1.5 מיקרוליטר של תמיסת RNA לדוגמה בגלאי מיקרו חומצות גרעין (ראה טבלת חומרים לפרטים) וקרא את ערכי A260/A280.
      הערה: אם ערכי A260/A280 הנמדדים נמצאים בטווח של 1.8 עד 2.0 וריכוז ה-RNA הוא בין 20 ננוגרם/מיקרוליטר ל-200 ננוגרם/מיקרוליטר, הדבר מצביע על כך שאיכות ה-RNA מקובלת וניתן להשתמש בה לניסויים הבאים.
    2. בהתבסס על המדידות, יש לדלל את תמיסת ה-RNA במי דיאתיל פירוקרבונט (DEPC) כדי להבטיח ריכוזי RNA עקביים עבור כל הדגימות, תוך שימוש בריכוז ה-RNA המינימלי הנמדד כאמת מידה, ולאחר מכן ניסויי PCR.
  3. שעתוק הפוך של RNA
    1. השתמש ב-RNA הכולל שחולץ כתבנית וסינתז cDNA בהתאם להוראות ערכת השעתוק ההפוך (ראה טבלת חומרים לפרטים). הכן את מערכת התגובה בהתאם לדרישות הערכה.
    2. הוסף את תמיסת ה-RNA שחולצה ואת מערכת התגובה לצינור בן שמונה שורות, והגדר שתי בארות שכפול בכל קבוצה. התחל את התגובה בתנאים עוקבים: דגירה של 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, דנטורציה של חום של 5 שניות ב-85 מעלות צלזיוס, קירור של 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. תגובת PCR
    1. בצע הגברת PCR על מערכת PCR כמותית פלואורסצנטית בזמן אמת (ראה טבלת חומרים לפרטים) באמצעות תערובת האב PCR המעורבת מראש על בסיס SYBR Green (ראה טבלת חומרים לפרטים). השתמש ב-GADPH כגן הייחוס, עם רצפי פריימר המפורטים בטבלה 2, והכן את תערובת התגובה באופן הבא: הוסף ברצף 0.4 מיקרוליטר של הפריימר המתאים, 2 מיקרוליטר של תבנית cDNA, ואת תערובת התגובה לצינור רצועה של שמונה בארות כדי להשיג את נפח התגובה הסופי.
    2. הפעל הגברת PCR: 95 מעלות צלזיוס 30 שניות (מחזור אחד), 95 מעלות צלזיוס 5 שניות (40 מחזורים), 60 מעלות צלזיוס 20 שניות (40 מחזורים). חשב את רמות הביטוי היחסיות של גני יעד באמצעות שיטת 2 -ΔΔCt 25. חזור באופן עצמאי על כל הניסויים שלוש פעמים כדי להבטיח את אמינות הנתונים.
      הערה: פסולת כימית הנוצרת במהלך הליכי ניסוי חייבת להיאסף במיכלי פסולת מסוכנת ייעודיים ולהשליך אותה על ידי שירותי ניהול פסולת מסוכנת מוסמכים בהתאם למדיניות המוסדית.
רצפי פריימר
תחלרצף (5'-3')
אדם-LINC00511-FTTTCCCAGCACAGCTCAATC
אדם-LINC00511-RTCCCTTCCCTCTCGGTC
GAPDH-FAATCCCATCACCATCTTCCA
GAPDH-RAAATGAGCCCCCCCCTTCT

טבלה 2: רצפי פריימר לבדיקות PCR

5. זיהוי EdU

  1. הערך את ההשפעה של ביטוי LINC00511 משתנה על התפשטות תאי A549/DDP באמצעות ערכת בדיקת EdU (ראה טבלת חומרים לפרטים).
    1. בחר באופן אקראי תאי A549/DDP שהועברו לדור השלישי לאחר החייאה, וחסן אותם באופן אחיד לצלחות של 24 בארות בצפיפות של 2 x 104 תאים לבאר.
      הערה: כאן, כל הניסויים בוצעו בשלושה שכפולים ביולוגיים בלתי תלויים (n = 3).
    2. מספר באופן אקראי כל באר, והקצה את הבארות לאחת מארבע קבוצות ניסוי על סמך המספרים האקראיים הבאים: קבוצת ביקורת, קבוצת β-Ele, קבוצת ביטוי יתר β-Ele + LINC00511 (β-Ele + OV-LINC00511), וקבוצת β-Ele + LINC00511 נוקדאון (β-Ele + si-LINC00511).
  2. כאשר צפיפות התאים מגיעה לכ-70%, בצע טרנספקציה של פלסמיד וטיפול בהפרעות לפי שלב 3.3. לאחר 24 שעות של טרנספקציה, השליכו את המדיום המקורי והוסיפו 1 מ"ל של תמיסה בינונית המכילה β-Ele (40 מיקרוגרם/מ"ל) לכל באר בקבוצת הטיפול התרופתי.
  3. דגרו את התאים עם EdU לתיוג לאחר טיפול בהם ב-40 מיקרוגרם/מ"ל של β-Ele למשך 24 שעות. לאחר מכן תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות וחדור אותם עם 0.5% טריטון X-100.
  4. הוסף את תמיסת תגובת הלחיצה (שהוכנה על ידי המסת בקבוקון אחד של מגיב התוסף Click שסופק על ידי הערכה ב-1.3 מ"ל מים נטולי יונים עם ערבוב יסודי) בחושך ושמור על התגובה בחושך למשך 30 דקות. שטפו את התאים עם PBS לאחר השלמת התגובה, ואחריה מכתים את הוכסט למשך 5 דקות. לבסוף, צפו בתוצאות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1 ואיור 2).
    הערה: DMSO חדיר מאוד ונוזל דליק. בתכנית זו, פתרון הניהול של β-Ele מכיל DMSO. לכן, יש לאסוף את תמיסת הניהול של β-Ele לחבית נוזלית פסולת מיוחדת לאחר השימוש ולמסור אותה לחברה לטיפול בפסולת מסוכנת לסילוק מקצועי על בסיס קבוע.

6. זיהוי תוכן גלוקוז 

הערה: כל הניסויים בוצעו בשלושה שכפולים ביולוגיים בלתי תלויים (n = 3).

  1. בחר באופן אקראי תאי A549/DDP שהועברו לדור השלישי לאחר החייאה, וחסן אותם באופן אחיד לצלחות של 6 בארות בצפיפות של 1 x 105 תאים לבאר. מספר באופן אקראי כל באר, והקצה את הבארות לקבוצות ניסוי על סמך המספרים האקראיים הללו.
  2. כאשר צפיפות התא מגיעה לכ- 70%, המשך עם טרנספקציה והפרעות פלסמיד כמתואר בשלב 3.3. לאחר 24 שעות של טרנספקציה, טפל בתאים בקבוצות המטופלות ב-40 מיקרוגרם/מ"ל של β-Ele.
  3. לאחר 24 שעות של טיפול תרופתי, אוספים את מדיום התרבות העליון מהתאים ומצנטריפוגה אותו בטמפרטורה של 1000 × גרם למשך 5 דקות. אסוף את הסופרנטנט. על פי ההוראות בערכת בדיקת הגלוקוז (ראה טבלת חומרים לפרטים), הכינו את תמיסת התגובה וערבבו אותה היטב עם הסופרנטנט.
  4. הנח את הדגימות בצלחות של 96 בארות עם חמש בארות משוכפלות לכל קבוצה. מנערים בעדינות את הצלחות ומדגרים אותן בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מדוד את הספיגה של כל באר באמצעות קורא מיקרו-פלטות באורך גל של 505 ננומטר, וחשב את תכולת הגלוקוז באמצעות הנוסחה המסופקת בערכת הבדיקה:
    figure-protocol-1
    כאן,תקן C = 5.55 ממול/ליטר, N = גורם דילול.
    הערה: פסולת כימית הנוצרת במהלך הליכי ניסוי חייבת להיאסף במיכלי פסולת מסוכנת ייעודיים ולהשליך אותה על ידי שירותי ניהול פסולת מסוכנת מוסמכים בהתאם למדיניות המוסדית.

7. זיהוי תכולת חומצת חלב 

הערה: כל הניסויים בוצעו בשלושה שכפולים ביולוגיים בלתי תלויים (n = 3).

  1. בחר באופן אקראי תאי A549/DDP שהועברו לדור השלישי לאחר ההחייאה, וחסן אותם באופן אחיד לצלחות של 6 בארות (1 × 105 תאים/באר). מספר באופן אקראי כל באר, והקצה את הבארות לקבוצות ניסוי על סמך המספרים האקראיים הללו. כאשר צפיפות התא מגיעה לכ- 70%, המשך עם טרנספקציה והפרעות פלסמיד כמתואר בשלב 3.3. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, יש לטפל בתאים בקבוצות המטופלות ב-40 מיקרוגרם/מ"ל של β-Ele.
  2. לאחר 24 שעות של טיפול תרופתי, אספו את מדיום התרבות העליון מהתאים וצנטריפוגו אותו ב-1000 x גרם למשך 5 דקות. אסוף את הסופרנטנט. על פי ההוראות בערכת בדיקת חומצת החלב (ראה טבלת חומרים לפרטים), הכינו את תמיסת התגובה וערבבו אותה היטב עם הסופרנטנט.
  3. הוסף בסך הכל 250 מיקרוליטר של דגימה לכל באר של צלחת של 96 בארות, והגדר חמש בארות שכפול לכל קבוצה. מנערים בעדינות את הצלחת ומדגרים אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מדוד את הספיגה של כל באר באורך גל של 530 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות (ראה טבלת חומרים לפרטים), וחשב את תכולת הלקטט באמצעות הנוסחה המסופקת בערכת הבדיקה:
    figure-protocol-2
    כאן, תקן C = 3 ממול/ליטר, N = גורם דילול.
    הערה: פסולת כימית הנוצרת במהלך הליכי ניסוי חייבת להיאסף במיכלי פסולת מסוכנת ייעודיים ולהשליך אותה על ידי שירותי ניהול פסולת מסוכנת מוסמכים בהתאם למדיניות המוסדית.

8. RNA-seq בתפזורת

  1. הקמת מסד נתונים לדוגמה
    1. בחרו תאי A549/DDP לניסוי וחלקו אותם לקבוצות הבאות: קבוצת ביקורת, קבוצת DDP, קבוצת β-Ele (40 מיקרוגרם/מ"ל) + קבוצת DDP (48 מיקרומטר), קבוצת β-Ele+ DDP + OV-LINC00511 וקבוצת β-Ele + DDP +si-LINC00511. כלול 3 דוגמאות בכל קבוצה.
    2. חלץ RNA כולל מכל קבוצת תאים. השתמש בערכת בידוד mRNA מבוססת חרוזים מגנטיים (ראה טבלת חומרים לפרטים) כדי להעשיר mRNA אוקריוטי, שבו חרוזים מצופים Oligo(dT) נקשרים באופן סלקטיבי לזנבות הפולי (A) של mRNA באמצעות זיווג בסיס A-T. הוסף מאגר פיצול (1 μL/μg של RNA, ראה טבלת חומרים לפרטים) ודגר ב-94 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות כדי לפצל את ה-mRNA למקטעים קצרים.
    3. המשך בסינתזה של cDNA גדיל ראשון באמצעות פריימרים הקסמרים אקראיים לפי הוראות היצרן. לסינתזה של cDNA גדיל שני, הוסף כמויות מתאימות של מאגר תגובה, RNase H ו-DNA פולימראז I כדי להשלים את התהליך.
    4. בצע תיקון קצה וזנב A על cDNA דו-גדילי על ידי דגירה ב-25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (תיקון קצה), מיד לאחר מכן 72 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (זנב A). מתאמי רצף ליגייט לשברים שתוקנו בקצה.
    5. טהר ובחר גודל של מוצרים קשורים באמצעות חרוזי סיליקה מגנטיים שעברו שינוי בקרבוקסיל (ראה טבלת חומרים לפרטים). לבסוף, בנה את ספריית הרצף על ידי הגברת PCR.
    6. לאחר הכנת המדגם, נתח את ספריית הרצף בפלטפורמת DNBSEQ-T7 (ראה טבלת חומרים לפרטים). טען את הדגימה על שבב מיקרו-מערך דפוסי לצורך ריצוף.
      הערה: המכשיר אסף, קרא וזיהה אותות אופטיים באמצעות מערכת הדמיה ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע את פרטי הרצף של בסיסים בודדים. לאחר מכן, בצע מחזורי ריצוף נוספים כדי לקבל את רצף הבסיסים הבאים. לאחר מספר מחזורים, נתוני הריצוף הגולמיים נוצרו.
  2. ניתוח ביואינפורמטיקה
    1. רצף את הדגימות במכונה כדי להשיג את הנתונים הגולמיים, הידועים גם כנתונים מחוץ למכונה. יתר על כן, עבד את נתוני הרצף באמצעות fastp (v 0.21.0). הסר קריאות המכילות רצפי מתאם 3' והסר קריאות באיכות נמוכה עם ציון איכות ממוצע מתחת ל-Q20 כחלק מקריטריוני הסינון העיקריים. בצע את כל הניתוחים במורד הזרם על סמך הנתונים הנקיים והאיכותיים.
      הערה: בצע סינון ראשוני של נתוני רצף באמצעות fastp. עיין בתיעוד הרשמי עבור מערכי נתונים טרנסקריפטומיים (https://github.com/OpenGene/fastp#rna-seq-processing) עבור הפרמטרים הספציפיים של שורת הפקודה.
    2. השתמש ב- FastQC (גרסה 0.12.0) כדי להעריך את איכות נתוני הריצוף הנקיים. דרישות האיכות הן כדלקמן: לפחות 90% מהבסיסים חייבים להיות בעלי ציון איכות גבוה מ-Q20, ואחוז רצפי המתאמים הנותרים לא יעלה על 1%. נתונים העומדים בקריטריונים אלה נחשבים מוסמכים וניתן להשתמש בהם לניתוח במורד הזרם.
      הערה: הערך את איכות נתוני הריצוף הנקיים באמצעות FastQC, בהתאם להנחיות הרשמיות (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).
  3. ניתוח ביטוי גנים
    1. השתמש בתוכנת DESeq2 כדי לבצע ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בין שתי קבוצות ההשוואה.
      1. ראשית, הזן את הנתונים לתוכנה כדי לבנות מערך נתונים של DESeq. לאחר מכן, סנן גנים עם ספירה כוללת של פחות מ-10 בכל הדגימות.
      2. לבסוף, בצע את ניתוח הגנים הדיפרנציאלי וחלץ את התוצאות. התנאים לסינון גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי הם כדלקמן: שינוי הקפל בביטוי |log2FoldChange| > 1, והחשיבות padj ≤ 0.05.
        הערה: לשלבי הפעלה מפורטים של תוכנת DESeq2, עיין בשלבים המפורטים באתר הרשמי: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html.

9. זיהוי שינויים ברמת ביטוי החלבון על ידי כתם מערבי (WB) 

הערה: כל הניסויים בוצעו בשלושה שכפולים ביולוגיים בלתי תלויים (n = 3).

  1. בצע Western Blotting כדי לכמת את רמות ביטוי החלבון התאי.
    1. בחר באופן אקראי תאי A549/DDP שהועברו לדור השלישי לאחר החייאה, וחסן אותם באופן אחיד לצלחות של 6 בארות בצפיפות של 1 x 105 תאים לבאר.
    2. מספר באופן אקראי כל באר, והקצה את הבארות לאחת משש קבוצות הניסוי על סמך המספרים האקראיים הבאים: Control, β-Ele, OV-LINC00511, si-LINC00511, β-Ele + OV-LINC00511 ו-β-Ele + si-LINC00511.
    3. כאשר צפיפות התא מגיעה לכ- 70%, בצע טרנספקציה והפרעות פלסמיד כמתואר בשלב 3.3. לאחר 24 שעות של טרנספקציה, חשוף את קבוצת הטיפול ל-β-Ele (40 מיקרוגרם/מ"ל), תוך מתן מדיום טרי לקבוצת הביקורת. תרבו את שתי הקבוצות למשך 24 שעות נוספות.
    4. לאחר מכן, אספו כדורי תאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 1675 × גרם למשך 5 דקות. ליז כל קבוצת תאים עם 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה RIPA המכיל 1 מ"מ PMSF על קרח למשך 30 דקות (ראה טבלת חומרים לפרטים).
  2. צנטריפוגה התא ליזאט ב-13,400 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ולאסוף את הסופרנטנט. מדוד את ריכוזי החלבון באמצעות ערכת בדיקת ריכוז חלבון BCA (ראה טבלת חומרים לפרטים). הפרד כמויות שוות של דגימות חלבון ב-10% SDS-PAGE והעבר אותן לממברנות פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) באמצעות אלקטרופורזה.
  3. טבלו ממברנות בתמיסת חסימה (5% חלב דל שומן/תמיסת מלח Tris-buffered עם 0.1% Tween-20 (TBST)) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר ודגרו אותן למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד GLUT1, PKM2, LDHA, β-catenin, GSK-3β (1:1000) ו-β-Actin (1:2000, ראה טבלת חומרים לפרטים).
    1. למחרת יש לשטוף את הממברנות שלוש פעמים עם TBST, 5 דקות כל אחת, בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.
  4. למחרת, דגרו על הממברנות עם תמיסות נוגדנים משניות (IgG נגד ארנב עזים עם תווית HRP, 1:2000) ונערו בעדינות בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  5. לבסוף, הוסף 0.1 מ"ל/ס"מ2 של תמיסה כרומוגנית ECL זמינה מסחרית כדי לכסות באופן מלא את ממברנות ה-PVDF. יש לדגור למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לפני החשיפה. דמיין ונתח את הרצועות באמצעות מערכת כימילומינסנציה משופרת (ראה טבלת חומרים לפרטים). אנא עיין באיור 4C ובאיור 5B.
    הערה: פסולת כימית הנוצרת במהלך הליכי ניסוי חייבת להיאסף במיכלי פסולת מסוכנת ייעודיים ולהשליך אותה על ידי שירותי ניהול פסולת מסוכנת מוסמכים בהתאם למדיניות המוסדית.

10. אנליזה סטטיסטית 

הערה: כל הניסויים בוצעו בשלושה שכפולים ביולוגיים בלתי תלויים (n = 3).

  1. ארגן את נתוני הניסוי לפי קבוצה והזין אותם לתוכנת GraphPad Prism (גרסה 8.0.2; ראה טבלת חומרים לפרטים). ביצוע ויזואליזציה של נתונים וניתוח מובהקות סטטיסטית בהתאם להנחיות התוכנה. נתוני המדידה באו לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן. ההבדלים הסטטיסטיים בין הקבוצות הוערכו באמצעות חישוב גודל אפקט חד-כיווני של ANOVA עם η² (eta-squared), ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של Tukey26. קחו בחשבון את **P < 0.01 כמובהקות סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-Ele מדכא באופן משמעותי את התפשטות תאי A549/DDP

בניסוי זה, ריכוזי המתן של β-Ele ו-DDP נקבעו על סמך תוצאות המחקרים הקודמים שלנו20,21. תאי A549/DDP טופלו ב-β-Ele, לבד או בשילוב עם DDP, כדי לנתח את השפעתו על עמידות לכימותרפיה של DDP. ניתוח EdU (איור 1) גילה כי DDP בריכוזים של 24 מיקרומטר ו-48 מיקרומטר עיכב באופן משמעותי את התפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה התמקד בנושא הקליני הקריטי של עמידות לציספלטין בסרטן הריאות. סרטן הריאות, האחראי למספר הגבוה ביותר של מקרי מוות מסרטן בעולם, ממשיך להיות בעל שיעור הישרדות של חמש שנים מתחת ל-20%29,30. ציספלטין, כאבן הפינה של תרופות כימותרפיות מבוססות פלטינום, הוא חומר אנטי-סרטני יעיל ורחב טווח המעכב את שכפול ה-DNA כדי להפעיל את השפעותיו האנטי-סרטניות31. עם זאת, נצפה כי כמחצית מהחולים מפתחים עמידות נרכשת לתרופות במהל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לכל המחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המימון למחקר זה ניתן על ידי קרן מדעי הטבע של מחוז ג'ילין תחת פרס מס. YDZJ202401058ZYTS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי A549/DDPפרוסלCL-0519כתובות אתרים:https://www.procell.com.cn/p/a549-ddp--cl-0519
שולחן עבודה נקי במיוחדסוג'ואו אנטאי איירטקSW-CJ-2FDכתובות URL:http://www.sz-antai.com
ערכת בדיקת ריכוז חלבון BCAסולארביוPC0020כתובות אתרים:https://www.solarbio.com
צנטריפוגה ספסלתרמופיקו17כתובות אתרים:https://www.thermofisher.com
תא תרבית תאיםתרמו3111כתובות אתרים:https://www.thermofisher.com
צלחת תרבית תאיםביופילTCD000100כתובות אתרים:http://www.biofil.com.cn
מנתח כימילומינסנציהצ'ינשיאנג אינסטרומנטס 4300כתובות אתרים:https://www.clinx.cn/about_us
ציספלטיןאלאדיןC295225-250 מ"גכתובות אתרים:https://www.aladdin-e.com/
מכשיר ריצוף גנים DNBSEQ-T7MGI טק ושות', בע"מT7כתובות אתרים:https://www.mgitech.cn/
איזי פיור  ערכת DNA מיקרו גנומיתטרנסג'ן ביוטקEE181-01כתובות אתרים:https://www.transgen.com/
תמיסה כרומוגנית ECLסולארביוPE0010כתובות אתרים:https://www.solarbio.com
ערכת גילוי EDUביוטייםC0071Sכתובות אתרים:https://www.beyotime.com
מכשיר עם תווית אנזיםציוד DetieHBS-1096Aכתובות אתרים:https://www.detiebio.cn/
סרום בקר עוברי FBS)קלארקFB15015כתובות אתרים:https://zn.clarkbio.com/
Frag/Prime Buffer יאסןברקוד 11277ESכתובות אתרים:https://www.yeasen.com/products/detail/2151
מפת גנים  תוכנה  6תרמוגרסה 6תוכנה לניתוח פרגמנטים. כתובות אתרים:https://www.thermofisher.cn/   
פלטפורמת GenReaderבייג'ינג Yuewei גן טכנולוגיה ושות', בע"מhttps://yyigou.com/product/detail/0000037250.htmlמנתח גנטי אוטומטי המשמש לאלקטרופורזה נימית
ערכת בדיקת גלוקוזביוגרפיה של ג'יאנצ'נגא154-1-1כתובות אתרים:http://www.njjcbio.com
נוגדן רב-שבטי GLUT1קבוצת פרוטאינטקברקוד 21829-1-APכתובות אתרים:https://www.ptglab.com
פריזמה של GraphPadתוכנת GraphPadגירסה 8.0.2כתובות אתרים:https://www.graphpad.com
GSK-3 ובטא; נוגדןזיקהAF5016כתובות אתרים:https://www.affbiotech.com
ה-F-12K של האםפרוסלPM150910כתובות אתרים:https://www.procell.com.cn/
חרוזי בחירת DNA של Hieff NGSיאסןברקוד 12601ESכתובות אתרים:https://www.yeasen.com/products/detail/939
ערכת מאסטר לבידוד mRNA של HieffNGSיאסןברקוד 12603ZHכתובות אתרים:https://www.yeasen.com/products/detail/1119
HRP עם תווית עז נגד ארנב IgGסרוויסביוGB23303כתובות אתרים:https://www.servicebio.cn
ערכת בדיקת לקטטביוגרפיה של ג'יאנצ'נגא019-2-1כתובות אתרים:http://www.njjcbio.com
נוגדן פוליקלונלי ספציפי ל-LDHAקבוצת פרוטאינטק19987-1-APכתובות אתרים:https://www.ptglab.com
מחזורי אור 96רושLC96כתובות אתרים:https://lifescience.roche.com
ליפופקטמין 2000Invitrogen11668-019כתובות אתרים:https://www.thermofisher.com/invitrogen
אופטי-MEMג'יבקו31985-070כתובות אתרים:https://www.thermofisher.com/gibco
פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)ביושארפBL505Aכתובות אתרים:https://www.biosharp.cn/
נוגדן פוליקלונלי ספציפי ל-PKM2קבוצת פרוטאינטק15822-1-APכתובות אתרים:https://www.ptglab.com
PMSF ביוטייםST506כתובות אתרים:https://www.beyotime.com
ערכת ריאגנט PrimeScript RT (מושלם בזמן אמת)טקארהRR037Aכתובות אתרים:https://www.takarabio.com
ריפה ליזאטביוטייםP0013Bכתובות אתרים:https://www.beyotime.com
פלטפורמת ריצוףבי.ג'י.אייDNBSEQ-T7כתובות אתרים:https://www.bgi.com/global
שחפת ירוק פרמיקס אקס טאקטקארהRR420Aכתובות אתרים:https://www.takarabio.com
בודק עקבות חומצות גרעיןמכשיר Aoshengננו-100כתובות URL:http://www.hzaosheng.com
טריזון פאיקנוואקס ביוטקCW0597Sכתובות אתרים:https://www.canvaxbiotech.com
טריפסיןביושארפBL501Aכתובות אתרים:https://www.biosharp.cn/
ערכת RNA אולטרה-טהורה (DNase I)קנוואקס ביוטקCW0597Sכתובות אתרים:https://www.canvaxbiotech.com
&בטא;-נוגדן אקטיןקבוצת פרוטאינטק60008-1-IGכתובות אתרים:https://www.ptglab.com
&בטא;-קטנין נוגדן זיקהDF6794כתובות אתרים:https://www.affbiotech.com
&בטא;-אלמןסיגמא63965-25 מ"גכתובות אתרים:https://www.sigmaaldrich.com

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thandra, K. C., Barsouk, A., Saginala, K., Aluru, J. S., Barsouk, A. Epidemiology of lung cancer. Contemp Oncol (Pozn). 25 (1), 45-52 (2021).
  2. Huang, J., et al. Distribution risk factors, and temporal trends for lung cancer incidence and mortality: A Global Analysis. Chest. 161 (4), 1101-1111 (2022).
  3. Wang, H., Hu, Y., Lu, H., Wu, Z., Zhang, Y. Association between SOX gene family expression, DNA methylation, and miRNA regulation in lung adenocarcinoma progression. Discov Oncol. 16 (1), 188(2025).
  4. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  5. Qin, Z., et al. Phase separation of EML4-ALK in firing downstream signaling and promoting lung tumorigenesis. Cell Discov. 7 (1), 33(2021).
  6. Wang, X., Wang, H., Jiang, H., Qiao, L., Guo, C. Circular RNAcirc_0076305 promotes cisplatin (DDP) resistance of non-small cell lung cancer cells by regulating ABCC1 through miR-186-5p. Cancer Biother Radiopharm. 38 (5), 293-304 (2023).
  7. La Montagna, M., Ginn, L., Garofalo, M. Mechanisms of drug resistance mediated by long non-coding RNAs in non-small-cell lung cancer. Cancer Gene Ther. 28 (3-4), 175-187 (2021).
  8. Wu, S. G., Shih, J. Y. Management of acquired resistance to EGFR TKI-targeted therapy in advanced non-small cell lung cancer. Mol Cancer. 17 (1), 38(2018).
  9. Altorki, N. K., et al. The lung microenvironment: an important regulator of tumour growth and metastasis. Nat Rev Cancer. 19 (1), 9-31 (2019).
  10. Zhang, H., Wang, Y., Liu, X., Li, Y. Progress of long noncoding RNAs in anti-tumor resistance. Pathol Res Pract. 216 (11), 153215(2020).
  11. Li, H. Q., Fu, X. B., Guo, H. Y., Sun, Y., Wang, D., Zhang, Z. Z. Sevoflurane reverses cisplatin resistance in neuroblastoma cells through the linc00473/miR-490-5p/AKT1 axis. Saudi Medical Journal. 43 (11), 1209-1216 (2022).
  12. Guo, F., Cao, Z., Guo, H., Li, S. The action mechanism of lncRNA-HOTAIR on the drug resistance of non-small cell lung cancer by regulating Wnt signaling pathway. Exp Ther Med. 15 (6), 4885-4889 (2018).
  13. Ren, L., et al. The DDUP protein encoded by the DNA damage-induced CTBP1-DT lncRNA confers cisplatin resistance in ovarian cancer. Cell Death Dis. 14 (8), 568(2023).
  14. Chen, L., et al. H19/miR-107/HMGB1 axis sensitizes laryngeal squamous cell carcinoma to cisplatin by suppressing autophagy in vitro and in vivo. Cell Biol Int. 45 (3), 674-685 (2021).
  15. Peng, X., Li, S., Zeng, A., Song, L. Regulatory function of glycolysis-related lncRNAs in tumor progression: Mechanism, facts, and perspectives. Biochem Pharmacol. 229, 116511(2024).
  16. Kryczka, J., Kryczka, J., Czarnecka-Chrebelska, K. H., Brzeziańska-Lasota, E. Molecular mechanisms of chemoresistance induced by cisplatin in NSCLC cancer therapy. Int J Mol Sci. 22 (16), 8885(2021).
  17. Liu, J., Zhu, Y., Wang, H., Han, C., Wang, Y., Tang, R. LINC00629, a HOXB4-downregulated long noncoding RNA, inhibits glycolysis and ovarian cancer progression by destabilizing c-Myc. Cancer Sci. 115 (3), 804-819 (2024).
  18. Liao, M., et al. Targeting the Warburg effect: A revisited perspective from molecular mechanisms to traditional and innovative therapeutic strategies in cancer. Acta Pharm Sin B. 14 (3), 953-1008 (2024).
  19. Song, Z., Luo, J., Wu, M., Zhang, Z. linc00511 knockdown inhibits lung cancer progression by regulating miR-16-5p/MMP11. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 33 (7), 17-30 (2023).
  20. Cheng, G., et al. β-elemene suppresses tumor metabolism and stem cell-like properties of non-small cell lung cancer cells by regulating PI3K/AKT/mTOR signaling. Am J Cancer Res. 12 (4), 1535-1555 (2022).
  21. Li, L., et al. β-elemene suppresses Warburg effect in NCI-H1650 non-small-cell lung cancer cells by regulating the miR-301a-3p/AMPKα axis. Biosci Rep. 40 (6), BSR20194389(2020).
  22. Yao, C., Jiang, J., Tu, Y., Ye, S., Du, H., Zhang, Y. β-elemene reverses the drug resistance of A549/DDP lung cancer cells by activating intracellular redox system, decreasing mitochondrial membrane potential and P-glycoprotein expression, and inducing apoptosis. Thorac Cancer. 5 (4), 304-312 (2014).
  23. Song, H., et al. β-elemene ameliorates cisplatin resistance of gastric cancer via regulating exosomal METTL3-m6A-ARF6 axis. Cell Biochem Biophys. 83 (2), 2047-2058 (2025).
  24. He, J., et al. β-Elemene promotes ferroptosis and reverses radioresistance in gastric cancer by inhibiting the OTUB1-GPX4 interaction. Front Pharmacol. 15, 1469180(2024).
  25. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  26. Yang, L., Tao, Y., Luo, L., Zhang, Y., Wang, X., Meng, X. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. J Ethnopharmacol. 288, 114988(2022).
  27. Zhang, Z., Zhang, Y., Qin, X., Wang, Y., Fu, J. FGF9 promotes cisplatin resistance in colorectal cancer via regulation of Wnt/β-catenin signaling pathway. Exp Ther Med. 19 (3), 1711-1718 (2020).
  28. He, J., et al. Sox2 inhibits Wnt-β-catenin signaling and metastatic potency of cisplatin-resistant lung adenocarcinoma cells. Mol Med Rep. 15 (4), 1693-1701 (2017).
  29. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  30. Im, J. Y., et al. CYB5R3 functions as a tumor suppressor by inducing ER stress-mediated apoptosis in lung cancer cells via the PERK-ATF4 and IRE1α-JNK pathways. Exp Mol Med. 56 (1), 235-249 (2024).
  31. Manguinhas, R., et al. Impact of the APE1 Redox Function Inhibitor E3330 in non-small cell lung cancer cells exposed to cisplatin: Increased cytotoxicity and impairment of cell migration and invasion. Antioxidants (Basel). 9 (6), 550(2020).
  32. Jiang, L., et al. HCP5 is a SMAD3-responsive long non-coding RNA that promotes lung adenocarcinoma metastasis via miR-203/SNAI axis. Theranostics. 9 (9), 2460-2474 (2019).
  33. Singh, D., Assaraf, Y. G., Gacche, R. N. Long non-coding RNA mediated drug resistance in breast cancer. Drug Resist Updat. 63, 100851(2022).
  34. Sun, W., Zu, Y., Fu, X., Deng, Y. Knockdown of lncRNA-XIST enhances the chemosensitivity of NSCLC cells via suppression of autophagy. Oncol Rep. 38 (6), 3347-3354 (2017).
  35. Lu, Y., Tian, M., Liu, J., Wang, K. LINC00511 facilitates Temozolomide resistance of glioblastoma cells via sponging miR-126-5p and activating Wnt/β-catenin signaling. J Biochem Mol Toxicol. 35 (9), e22848(2021).
  36. Kong, X. Z., et al. Regulation of aerobic glycolysis by long non-coding RNAs in cancer. Biochem Biophys Res Commun. 479 (1), 28-32 (2016).
  37. Mao, Y., Xia, Z., Xia, W., Jiang, P. Metabolic reprogramming, sensing, and cancer therapy. Cell Rep. 43 (12), 115064(2024).
  38. Vaupel, P., Schmidberger, H., Mayer, A. The Warburg effect: essential part of metabolic reprogramming and central contributor to cancer progression. Int J Radiat Biol. 95 (7), 912-919 (2019).
  39. Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic reprogramming: a cancer hallmark even warburg did not anticipate. Cancer Cell. 21 (3), 297-308 (2012).
  40. Nagao, A., Kobayashi, M., Koyasu, S., Chow, C. C. T., Harada, H. HIF-1-dependent reprogramming of glucose metabolic pathway of cancer cells and its therapeutic significance. Int J Mol Sci. 20 (2), 238(2019).
  41. Xie, Y., Wang, M., Xia, M., Guo, Y., Zu, X., Zhong, J. Ubiquitination regulation of aerobic glycolysis in cancer. Life Sci. 292, 120322(2022).
  42. Hua, G., Zeng, Z. L., Shi, Y. T., Chen, W., He, L. F., Zhao, G. F. LncRNA XIST contributes to cisplatin resistance of lung cancer cells by promoting cellular glycolysis through sponging miR-101-3p. Pharmacology. 106 (9-10), 498-508 (2021).
  43. Yin, D., Hua, L., Wang, J., Liu, Y., Li, X. Long Non-coding RNA DUXAP8 facilitates cell viability, migration, and glycolysis in non-small-cell lung cancer via regulating HK2 and LDHA by inhibition of miR-409-3p. Onco Targets Ther. 13, 7111-7123 (2020).
  44. Vallée, A. Aerobic glycolysis activation through canonical WNT/β-catenin pathway in ALS. Med Sci (Paris). 34 (4), 326-330 (2018).
  45. Rathee, M., et al. Canonical WNT/β-catenin signaling upregulates aerobic glycolysis in diverse cancer types. Mol Biol Rep. 51 (1), 788(2024).
  46. Li, R., Lv, M., Liu, J., Sun, Q. Tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 promotes aerobic glycolysis and cisplatin resistance by regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway in lung cancer. Histol Histopathol. , (2024).
  47. Zhao, Q., Chen, L., Zhang, X., Yang, H., Li, Y., Li, P. β-elemene promotes microglial M2-like polarization against ischemic stroke via AKT/mTOR signaling axis-mediated autophagy. Chin Med. 19 (1), 86(2024).
  48. Jiang, Z., Jacob, J. A., Loganathachetti, D. S., Nainangu, P., Chen, B. β-Elemene: mechanistic studies on cancer cell interaction and its chemosensitization effect. Front Pharmacol. 8, 105(2017).
  49. Li, J., Li, Y., Meng, F., Fu, L., Kong, C. Knockdown of long non-coding RNA linc00511 suppresses proliferation and promotes apoptosis of bladder cancer cells via suppressing Wnt/β-catenin signaling pathway. Biosci Rep. 38 (4), BSR20171701(2018).
  50. Tan, Z., et al. Small peptide LINC00511-133aa encoded by LINC00511 regulates breast cancer cell invasion and stemness through the Wnt/β-catenin pathway. Mol Cell Probes. 69, 101913(2023).
  51. Ghafouri-Fard, S., Safarzadeh, A., Hussen, B. M., Taheri, M., Ayatollahi, S. A. A review on the role of LINC00511 in cancer. Front Genet. 14, 1116445(2023).
  52. Liu, J., et al. Targeting Wnt-driven cancer through the inhibition of Porcupine by LGK974. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20224-20229 (2013).
  53. Wang, W. J., et al. Serum lncRNAs (CCAT2, LINC01133, LINC00511) with squamous cell carcinoma antigen panel as novel non-invasive biomarkers for detection of cervical squamous carcinoma. Cancer Manag Res. 12, 9495-9502 (2020).
  54. Fan, K., Liu, Z., Gao, M., Tu, K., Xu, Q., Zhang, Y. Targeting nutrient dependency in cancer treatment. Front Oncol. 12, 820173(2022).
  55. Liu, B., et al. Knockdown of LINC00511 decreased cisplatin resistance in non-small cell lung cancer by elevating miR-625 level to suppress the expression of leucine rich repeat containing eight volume-regulated anion channel subunit E. Hum Exp Toxicol. 41, 9603271221089000(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Beta ElemeneWnt Beta CateninA549 DDPWestern BlotqRT PCREdU
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים