הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חידוד של OnePot PURE וייצור ריבוזום גולמי לסינתזה של חלבון ללא תאים הניתנת לשחזור

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68826

⸱

22 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול מעודכן לייצור מערכת OnePot 'סינתזת חלבון באמצעות אלמנטים רקומביננטיים' (PURE) וריבוזומים גולמיים לסינתזת חלבון נטול תאים, תוך התמקדות בשליטה על צמיחת התאים כדי למזער שינויים בין אצווה לאצווה.

תקציר

ההתקדמות האחרונה אפשרה לייצר את מערכת סינתזת החלבון באמצעות אלמנטים רקומביננטיים (PURE) ללא תאים במעבדות בודדות באופן כלכלי ועם נטל עבודה מופחת. עם זאת, הכנת 36 רכיבי החלבון והריבוזום, המרכיבים את PURE, היא עדיין משימה מורכבת, עם הרבה מקום לשונות וטעויות. אנו מציגים נוהל מפורט ומעודכן לייצור PURE המבוסס על פרוטוקול OnePot שפורסם לאחרונה, הכולל ויסות של מספר שלבים מרכזיים, בפרט, חיסון תרביות באמצעות מלאי גליצרול מנורמל בצפיפות אופטית (OD), ניטור קפדני של צמיחת התאים ובקרה על ריכוזי הגליצרול הסופיים. באמצעות גישה זו, אנו מדווחים על תכשירים הניתנים לשחזור של PURE ממספר שכפולים ביולוגיים ומשתמשים. פרוטוקול זה משמש כנקודת התייחסות ונקודת התחלה למעבדות אחרות לייצר ולפתור בעיות במערכות PURE משלהן, ובכך להגביר את הדמוקרטיזציה של היישומים הרבים ש-PURE מאפשרת, כגון בנייה מלמטה למעלה של מערכות ביומולקולריות ופיתוח תאים סינתטיים.

מבוא

סינתזת חלבון נטול תאים (CFPS) הבשילה כטכנולוגיה ליישומים מגוונים, כולל ייצור ביולוגי, חישה ביולוגית ואבחון, אב טיפוס של חלקים ומסלולים גנטיים ומטבוליים, הנדסת חלבונים מהירה וחינוך 1,2. מערכות CFPS המשתמשות ברכיבים מטוהרים, שפותחו במקור כמערכת 'סינתזת חלבון באמצעות אלמנטים רקומביננטיים' (PURE)3, מציעות מספר יתרונות על פני החלופות מבוססות הליזאט שלהן. למערכות PURE יש הרכב מוגדר, המורכב מ-36 גורמי חלבון, ריבוזום E. coli 70S, ותערובת מוגדרת של סובסטרטים כימיים הכוללים נוקלאוזידים טריפוספטים (NTPs), חומצות אמינו ו-tRNAs, הניתנים להתאמה כרצונם ליישום הנדרש. לפיכך הם מתאימים מאוד למחקרים כגון שילוב חומצות אמינו לא קנוניות, מודלים מכניסטיים ובנייה מלמטה למעלה של מערכות ביומולקולריות ותאים סינתטיים1. בעוד ש-PURE זמין מספקים מסחריים, עלותו (0.34-1.63 דולר לתגובה של 1 מיקרוליטר) אוסרת על ניסויים בקנה מידה גדול; והאסטרטגיה האלטרנטיבית של ייצור PURE בתוך הבית נפגעה עד כה על ידי פרוטוקולים עתירי עבודה הכוללים טיהור מקביל של 36 חלבונים וריבוזומים4, אשר מאתגרים לביצוע בצורה חזקה וניתנת לשחזור, במיוחד עבור משתמשים חסרי ניסיון.

ההתפתחויות האחרונות סייעו לייצור ביתי של PURE. לדוגמה, וואנג ועמיתיו הנדסו זנים של E. coli כך שיכללו תגי הקסה-היסטידין משולבים גנומית במכונות התרגום, מה שמקל על טיהור חד-שלבי5. גנים המקודדים את כל חלבוני ה-PURE הורכבו למספר קטן של פלסמידים, ששימשו באופן דומה להפחתת עבודת הטיהור6. Villareal ואחרים הנדסו קונסורציום אלגנטי של זני PURE, המאזנים את הביטוי על מנת לייצר חלבונים ביחס הנכון, ובמקביל מאפשרים טיהור חד-שלבי7.

מערכת OnePot PURE החדשנית שפותחה על ידי Lavickova et al. טומנת בחובה הבטחה גדולה לנוחות השימוש 8,9. במערכת זו, זני ה-PURE המקוריים עוברים תרבית משותפת ומטוהרים באמצעות שלב כרומטוגרפיה יחיד. למרות שלא ניתן להגדיר במדויק את הרכב מערכת ה-PURE המתקבלת, המחברים הראו כי קבוצות מרובות של המערכת ניתנות לשחזור במידה רבה, וניתן להשיג רמה גסה של שליטה על ידי שינוי נפח החיסון של כל זן. הפשרה של בקרת הרכב מדויקת עבור קלות הייצור היא כזו שתהיה מקובלת על משתמשים רבים, בהתחשב בכך שתפוקת סינתזת החלבון הכוללת ממערכת OnePot דומה לזו המתקבלת מסחרית. עם זאת, בעוד שקיימים פרוטוקולים מפורטים עבור מערכת OnePot, זה היה מאתגר לשחזר לחלוטין את התוצאות של Lavickova et al. במעבדות אחרות. לדוגמה, נצפו חוסר יציבות וקטור ביטוי, זנים הגדלים לאט ופרוטאוליזה10.

בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול OnePot PURE מפורט ומעודן, השולט בצמיחת התאים באמצעות מלאי גליצרול סטנדרטי והתאמות מדיה, נותן הנחיות לניטור צמיחה וקציר OD, ומנרמל את כמות הגליצרול בטיהור הסופי. שנית, אנו מציגים הליך טיהור ריבוזום גולמי אופטימלי באמצעות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית בלבד, המאזן את הפשרה בין פעילות הריבוזום, לבין העלות והמורכבות של שיטות מתוחכמות יותר.

למרות שזה מציג שלבים נוספים לפרוטוקול OnePot, הם מאפשרים למשתמש הזדמנות מוגברת לפתור את ההליך בצורה יסודית יותר במידת הצורך, כמו גם לשנות אותו לצרכיו. אנו מדגימים את יכולת השחזור של התהליך על ידי הצגת שכפולים ביולוגיים מרובים שבוצעו על ידי מספר משתמשים באותה מעבדה. אנו מוצאים כי שליטה הן על רכיבי ה-PURE והן על הכנת הריבוזום חיונית להבטחת ביצועי CFPS גבוהים של המערכת.

הכנת ה-PURE והריבוזום נמשכת כל אחד 4 או 5 ימים, בהתאמה, ויכולה להתבצע ברצף על ידי משתמש אחד או במקביל על ידי שני משתמשים. תכשיר ה-PURE כולל 4x500 מ"ל של תרבית נוזלית, כל אחד מניב ~2 גרם של כדור תא ו~1 מ"ל של חלבוני PURE בריכוז של ~15 מ"ג/מ"ל. תכשיר הריבוזום כולל 4 × 500 מ"ל = 2 ליטר של תרבית נוזלית, מה שמוביל לסך של ~3 גרם של כדור תא ומניב ~1 מ"ל של ריבוזומים גולמיים בריכוז של ~17 מיקרומטר. הפרוטוקול הנוכחי מייצר מערכות PURE עם תפוקות סינתזה של עד ~100 מיקרוגרם/מ"ל GFP או ~130 מיקרוגרם/מ"ל של mCherry במשך שעתיים של תגובת אצווה11, מה שמשווה לטובה ל-OnePot המקורי כמו גם למערכות מסחריות (~140-160 מיקרוגרם/מ"ל)8,12. לפיכך, זוהי נקודת התחלה מתאימה לאופטימיזציה נוספת באמצעות תוסף או אפנון של רכיבים רגישים כגון מלחים, חומרי צפיפות וגורמי חלבון בודדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול מחולק לשלושה חלקים. למען התמציתיות והבהירות, אנו מדגישים את השינויים החשובים הספציפיים לעבודה זו, ולכן מוזכרים פרטים זהים לאלה הקיימים בפרסומים אחרים.

עבודה מקדימה צריכה להתבצע רק פעם אחת. ארבעת הסעיפים כוללים הכנת מלאי גליצרול וצלחות התחלה לחלבוני PURE וכן אימות ומדידה של זמני הביטוי של הזנים. השימוש בצלחות התחלה מסיר את השונות הקשורה לחיסון ישיר ממלאי גליצרול מגורד. חיוני לוודא שעבודה זו נעשית ביסודיות לפני שתמשיך לשלב הייצור. בשל המספר הגדול של מלאי הגליצרול השונים המעורבים בהכנת PURE, חיוני לוודא את שלמות הפלסמיד והביטוי של כל זן לפני שמנסים לייצר את המערכת.

סכימה של זרימת העבודה ניתנת באיור 1, ולוח זמנים מומלץ בטבלה 1. החומרים הנדרשים, והשלבים שבהם נעשה בהם שימוש, ניתנים בטבלת החומרים, ומתאר המאגרים והמדיה הנדרשים בכל שלב מסוכם באיור משלים S1.

1. עבודה מקדימה

  1. יצירת מלאי גליצרול
    הערה: כל הפלסמידים זמינים מ-Addgene.
    1. לייצר 25% משקל/נפח מלאי גליצרול מכל הזנים המפורטים בטבלה 2, בהתאם לנהלים סטנדרטיים9, ולאחסן בקריוביאלים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת צלחות התחלה של PURE (לילה)
    1. הכן 20 מ"ל של מדיית LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין (LB+AMP).
    2. סמן 36x צינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מ"ל מ #1-#36.
    3. הוסף 500 מיקרוליטר של LB+AMP לכל צינור. יש לחסן כל שפופרת בזן המתאים באמצעות קצה פיפטה כדי לגרד כמות קטנה ממאגר הגליצרול המקורי. ודא שמלאי הגליצרול לא יפשיר. מערבולת לערבב היטב.
    4. Aliquot 300 μL מכל צינור מחוסן לבאר המתאימה של צלחת באר עמוקה סטרילית של 1 מ"ל 96 בהתאם לפריסה המוצגת באיור 2.
      הערה: בכל השלבים הבאים הכוללים צלחות, שמור על אותה פריסת צלחת לאורך כל הדרך.
    5. דגרו את הצלחת למשך הלילה בשייקר צלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 1,000 סל"ד למשך 15 שעות.
    6. למחרת, הכינו 25 מ"ל של מדיה LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין (LB+AMP) ו-15 מ"ל של 50% (v/v) גליצרול.
    7. העבירו 30 מיקרוליטר מכל תרבית מלוח הבאר העמוק לתחתית צלחת אופטית של 96 בארות, באמצעות פיפטה רב-ערוצית. הוסף 270 מיקרוליטר של מדיית LB+AMP לכל תרבית המכילה באר, כדי להשיג דילול פי 10 של כל תרבית.
    8. מדוד את ה-OD600 של כל תרבית באמצעות קורא צלחות. חשב את הנפח של כל תרבית הדרושה לחיסון 650 מיקרוליטר של LB+AMP טרי ל-OD600 התחלתי של 0.2. גיליון אלקטרוני המסייע בחישובים מסופק כטבלה משלימה S1.
    9. הכן שלוש צלחות באר עמוקות סטריליות חדשות של 1 מ"ל 96. בצלחת אחת, הוסף 650 מיקרוליטר של LB+AMP ל-36 בארות, וחסן כל באר בנפח המחושב של תרבית לילה כדי לקבל OD600 = 0.2.
    10. העבירו 300 מיקרוליטר של תרבית מחוסנת לכל אחת משתי הצלחות האחרות. צלחת אחת תהיה התרבות, והשנייה תשמש לניטור OD. דגרו את שתי הלוחות בשייקר צלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 1000 סל"ד, עד שהתרביות מגיעות ל-OD600 ~ 1 (~1.5-2 שעות). עקוב אחר ה-OD בשעה אחת, ולאחר מכן שוב לפי הצורך, על ידי הסרת דגימות של 30 מיקרוליטר מהלוח השני והוספה ל-270 מיקרוליטר של LB+AMP לדילול פי 10.
    11. כאשר בארות בודדות מגיעות ל-OD600 ~ 1, הסר אותן מהשייקר. הוסף נפח שווה של 50% (v/v) גליצרול סטרילי לכל תרבית כדי להשיג ריכוז סופי של OD600 = 0.5 ב-25% גליצרול. מערבבים היטב ומאחסנים את הצינורות הללו על קרח. אלה הם מלאי העבודה הראשי.
    12. יש להקצות מקסימום 40 מיקרוליטר מכל מלאי מאסטר ללוחות PCR של 96 בארות, תוך שמירה על תבנית הבאר המקורית. מחלקים לכמה שיותר צלחות על סמך קיבולת האחסון. אטום עם אטמי צלחת נייר כסף ואחסן את לוחות ההתחלה של PURE בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: יש להפשיר את לוחות המתנע הללו לכל היותר פי 3. יש להחליף בצלחות חדשות אם חורגים ממגבלה זו כדי לשמור על שלמות המתח ויכולת השחזור.
  3. קביעת זמני גידול של תרבית סטרטר (לילה)
    1. להפשיר צלחת התחלה טהורה על קרח.
    2. הוסף 50 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל אמפיצילין ל-50 מ"ל של מדיה סטרילית LB בצינור חרוטי סטרילי (LB+AMP).
    3. סמן צינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים בגודל 36 x 1.5 מ"ל מ-#1-#36, והוסף 1 מ"ל של LB+AMP לכל צינור.
    4. הוסף 10 מיקרוליטר מכל אחד ממלאי הגליצרול לצינור המסומן המתאים וערבב היטב על ידי מערבולת.
    5. הוסף 300 מיקרוליטר מהתרבית המחוסנת מכל צינור לבאר המתאימה של צלחת באר סטרילית של 1 מ"ל 96. אוטמים את הצלחות עם אטם צלחת נושם ודוגרים את צלחת התרבות בשייקר צלחות ב-1000 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס. קבע ורשום את הזמן שלוקח לתרביות להגיע ל-OD600 ~ 2-3 מבלי לחרוג מ-OD600 = 3. קבע פרמטר זה לפני שתמשיך.
      הערה: במעבדה שלנו, זה לוקח 15 שעות.
  4. ניסוי ביטוי של זני PURE
    1. הכן 38 מ"ל של מדיית LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין (LB+AMP), מלאי IPTG של 10 מ"מ ומגיב מיצוי חלבון 1x.
    2. להפשיר צלחת התחלה טהורה על קרח.
    3. הוסף 1 מ"ל של LB+AMP לכל אחת מ-36 בארות של צלחת באר עמוקה סטרילית של 2 מ"ל 96. חסנו כל באר עם 20 מיקרוליטר מתרבית המתנע המתאימה. דגרו את הצלחת בשייקר צלחות ב-1000 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס, למשך כשעה, או עד שמגיעים ל-OD600 = 2.
    4. לגרום לביטוי חלבון על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של 10 מ"מ IPTG לכל באר, לריכוז IPTG סופי של 0.1 מ"מ. המשך הדגירה למשך 3 שעות ב-1000 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס.
    5. בתום תקופת הביטוי של 3 שעות, העבירו 700 מיקרוליטר מכל תרבית לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים בגודל 36 x 1.5 מ"ל. צנטריפוגה בטמפרטורה של 20,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
    6. השעו מחדש כל כדור ב-70 מיקרוליטר של מגיב מיצוי חלבון 1x. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה כדי לאפשר ליזה של תאים.
    7. צנטריפוגה ליזטית ב-20,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את החלק הבלתי מסיס.
    8. בצע טיהור His-tag בקנה מידה קטן של כל חלבון באמצעות חרוזים מגנטיים Ni-NTA בהתאם להוראות היצרן.
    9. נתח חלבונים מטוהרים באמצעות SDS-PAGE כדי לאשר ביטוי של כל חלבון ו/או זיהום צולב בין זנים9.
      הערה: זנים המבטאים חלבון יציגו רצועות נפרדות ב-SDS-PAGE המתאימות למשקל המולקולרי הצפוי של חלבון המטרה. אם לא מתגלות רצועות, ייתכן שהזן אינו מבטא את החלבון. במקרים כאלה, יש לבודד ולרצף את הפלסמיד כדי לאשר את זהות הרצף ושלמותו, ולהחליף את הפלסמיד במידת הצורך.

2. טיהור חלבון OnePot PURE (4 ימים)

הערה: הכנת מערכת PURE אחת דורשת עיבוד של 500 מ"ל של תרבית נוזלית. רצוי לייצר 4 x 500 מ"ל הכנות בו זמנית כדי לייצר ארבע קבוצות PURE עצמאיות בריצה אחת. לאחר מכן ניתן לכמת את הקבוצות הללו באופן עצמאי או לשלב במידת הצורך. ניתן לקצר את הפרוטוקול של 4 ימים ל-3 ימים על ידי ביצוע שלב הדגירה של השרף בן לילה, אך זה כרוך ביום שלישי ארוך. שתי האפשרויות מפורטות להלן.

  1. יום 1: הכנת חומרים וגידול תרביות התחלה
    1. הכן תמיסות מלאי ומאגרים לתכשיר PURE כמתואר בטבלה משלימה S2 ובאיור משלים S1.
      הערה: הכן את המדיה והמאגרים הרלוונטיים הנדרשים מיד לפני ביצוע כל חלק של הפרוטוקול ואחסן רק למספר הימים המרבי לפני השימוש כפי שצוין.
    2. להפשיר צלחת התחלה טהורה על קרח.
    3. הוסף 50 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל אמפיצילין ל-50 מ"ל של מדיה סטרילית LB בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל (LB+AMP).
    4. סמן צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים בגודל 36 x 1.5 מ"ל מ-#1-#36, והוסף 1 מ"ל LB+AMP לכל צינור.
    5. הוסף 10 מיקרוליטר מכל אחד ממלאי הגליצרול לצינור המסומן המתאים, וערבב היטב על ידי מערבולת.
      הערה: כדי לעקוב בקלות אחר החיסון של כל זן, לאחר הוספת הזן לכל צינור, הוצא את קצה הפיפטה לבאר המתאימה של לוחית המתנע PURE. חזור על תהליך זה עבור כל הזנים. לאחר השלמתו, הסר את קצות הפיפטה בזהירות מהצלחת לפני איטום מחדש עם נייר כסף וסרט חיטוי, ואחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    6. הוסף 300 מיקרוליטר של התרבית המחוסנת מכל צינור לבאר המתאימה של צלחת באר סטרילית של 1 מ"ל 96, למעט זן #25 (EF-Tu). אטום צלחות עם חותם צלחת נושם. דגרו את צלחת התרבות בשייקר צלחת בטמפרטורה של 1,000 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס, למשך 14 שעות.
    7. הוסף 1 מ"ל של תרבית מחוסנת מצינור #25 ל-10 מ"ל של LB בצינור חרוטי של 50 מ"ל כדי להכין את תרבית המתנע EF-Tu. דגרו את הצינור בחממה בטמפרטורה של 260 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות.
      הערה: זן #25, EF-Tu, נדרש בריכוז גבוה בהרבה משאר הרכיבים ולכן מעובד בנפרד, כמתואר בפרוטוקולהמקורי 8.
    8. יש להניח 2 ליטר של מדיה סטרילית 2x YTP בבקבוק זכוכית של 2 ליטר ולהניח באינקובטור סטטי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לחימום מראש למשך הלילה.
  2. יום 2: גדילה וכדורים
    1. הכן ריאגנטים נדרשים:
      1. 2 ליטר של מדיה סטרילית מחוממת מראש 2x YTP (מהיום הראשון)
      2. 2 מ"ל של 100 מ"ג/מ"ל אמפיצילין
      3. 100 מ"מ IPTG, סטרילי
      4. 100 מ"ל PBS, סטרילי, קר כקרח
      5. מדיה של 10 מ"ל LB
    2. העבירו 30 מיקרוליטר מכל תרבית מתנע מלוח הבאר העמוק המתנע, וצינור המתנע EF-Tu, לתחתית צלחת אופטית של 96 בארות, באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
    3. הוסף 270 מיקרוליטר של מדיה LB לכל תרבית המכילה באר, כדי להשיג דילול פי 10 של כל תרבית.
    4. מדוד את ה-OD600 של כל תרבית באמצעות קורא צלחות. כל הזנים צריכים להיות ב-OD600 = 2-3.
      הערה: אם תרבית גדלה מעל OD600 = 3, יש לדלל ל-OD600 = 3 באמצעות 2x YTP+AMP (טבלה משלימה S1). דילול של מנות ראשונות מגודלות יכול להיות גוזל זמן ונוטה לטעויות. ככזה, רצוי לקבוע את זמן הדגירה המדויק הנדרש כדי להגיע ל-OD600 2-3 כמתואר בעבודה מקדימה סעיף 1.3.
    5. העבירו 500 מ"ל של מדיה 2x YTP מחוממת מראש ו-500 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל אמפיצילין לבקבוק מבולבל סטרילי של 2.5 ליטר (2x YTP+AMP).
    6. לתוך צינור חרוטי סטרילי יחיד של 15 מ"ל, הוסף 55 מיקרוליטר מכל תרבית מצלחת תרבית המתנע ו-1675 מיקרוליטר מתרבית EF-Tu. מערבבים היטב על ידי מערבולת.
      הערה: זוהי תרבית OnePot המשלבת את כל הזנים הטהורים יחד. בשלב זה ניתן ליצור מערכות נוקאאוט (ΔPURE) על ידי השארת זנים מסוימים, או להוסיף רכיבים אחרים הדורשים טיהור משותף.
    7. הוסף את תכולת הצינור הזה לבקבוק המבולבל בנפח 2.5 ליטר המכיל 500 מ"ל של 2x YTP+AMP. חזור על שלבים 5-7 כדי לקבל תרביות עצמאיות פי 4.
    8. דגרו את הצלוחיות בטמפרטורה של 260 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס, למשך 1.5-2 שעות, עד OD600 = 0.2-0.3.
    9. לאחר שמגיעים ל-OD600 = 0.2-0.3, יש לחסן כל בקבוק ב-500 מיקרוליטר של 100 מ"מ IPTG, לריכוז אינדוקציה סופי של 0.1 מ"מ IPTG.
    10. דגרו על התרביות למשך 3 שעות נוספות בטמפרטורה של 260 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס.
    11. במהלך הדגירה יש לשקול ולסמן ארבעה צינורות חרוטיים סטריליים של 50 מ"ל.
    12. יש לקרר מראש צנטריפוגות ל-4 מעלות צלזיוס כנדרש, ולתייג ולקרר מראש ארבעה בקבוקי צנטריפוגות קופולימר מפוליפרופילן.
    13. הכניסו ארבעה בקבוקי זכוכית מסומנים בנפח 500 מ"ל לאמבט מי קרח.
    14. בתום הדגירה של 3 שעות, שפכו בזהירות כל תרבית לבקבוק זכוכית על קרח כדי להפסיק את הצמיחה.
      הערה: העברת תרביות לבקבוקים מקוררים חיונית לעצירת הצמיחה במהירות: הנחת צלוחיות חמות ישירות לאמבט מי הקרח לא תביא לסיום יעיל של הצמיחה. כל השלבים הבאים נעשים על קרח אלא אם צוין אחרת.
    15. הוסף 250 מ"ל מכל תרבית לבקבוקי הצנטריפוגה המתאימים, וצנטריפוגה ב-3,220 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות, תוך שמירה על 250 מ"ל הנותרים באמבט מי הקרח.
    16. יש לשפוך בזהירות את הסופרנטנט ולייבש על מגבות נייר.
    17. הוסף את 250 מ"ל הנותרים של כל תרבית לבקבוקי הצנטריפוגה המתאימים, וצנטריפוגה שוב ב -3,220 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות.
    18. יש לשפוך בזהירות את הסופרנטנט ולייבש על מגבות נייר.
    19. הוסף 20 מ"ל של PBS סטרילי קר כקרח לכל בקבוק צנטריפוגה והשהה מחדש את כדור התא ביסודיות.
    20. העבירו כל מתלה לצינורות החרוטיים המוכנים בנפח 50 מ"ל.
    21. צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורה של 2,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 8 דקות.
    22. הסר את הסופרנטנט על ידי סילוק בזהירות.
    23. צנטריפוגה את הצינורות שוב בטמפרטורה של 2,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 2 דקות.
    24. הסר שאריות סופרנטנט על ידי פיפטינג, ושמור את כדורי התא על קרח.
    25. כל צינור מכיל כעת את גלולת התא מתרבית בודדת של 500 מ"ל. שקלו כל צינור, חישבו את מסת כדור התא (בדרך כלל, ~2 גרם) על ידי הפחתת המשקל הריק של כל צינור, ורשמו.
    26. הצמד להקפיא כדורי תאים ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לליזה.
      הערה: לחלופין, ניתן להשלים את הפרוטוקול תוך 3 ימים, על ידי המשך ישירות לשלב הליזיס בשלב זה.
  3. יום 3: ליזה, טיהור ודיאליזה
    1. הכן ריאגנטים נדרשים:
      1. הכן 50 מ"ל של מאגר מתלה מחדש.
      2. הכן 0.5 מ' TCEP.
    2. להפשיר כדורי תאים על קרח.
    3. יש לצרף 50 מ"ל של מאגר השעיה לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל, ולהוסיף 100 מיקרוליטר של 0.5 מ' TCEP. מערבבים היטב על ידי מערבולת.
    4. השעו מחדש כדורי תאים במאגר השעיה + TCEP ביחס של 2 מ"ל לכל 1 גרם של כדורי תאים. מערבולת ביסודיות כדי להשהות.
    5. מחלקים את מתלה התאים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל כך שלכל צינור יש 5 מ"ל מתלה. סמן את הצינורות כנדרש כדי לעקוב אחר 4 התרביות העצמאיות. יש לאחסן על קרח.
    6. תאי ליז באמצעות סוניקציה במשרעת של 30%, 20 שניות דולקות, 20 שניות כבויות, למשך 10 מחזורים באמבט מי קרח באמצעות בדיקה סוניקציה מקוררת (איור 3A,B).
      הערה: יש להעביר כ-1000 J של אנרגיה לכל צינור במהלך סוניקציה. השתמש במעמד מאובטח כדי לשמור על הצינור במקומו במהלך סוניקציה כדי להבטיח עקביות של העברת אנרגיה.
    7. מחלקים את הליזט לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של 2 מ"ל, כך שכל צינור מכיל 1 מ"ל ליזאט. חזור על שלבים 2.3.6 ו- 2.3.7 כדי לבצע ליזה של כל ארבע התרבויות. השלבים הבאים מבוצעים עבור 4 ליזטים במקביל.
    8. צנטריפוגה בטמפרטורה של 15,923 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 20 דקות.
    9. במהלך הצנטריפוגה, שטפו ואזנו 5 מ"ל של שרף לטיהור חלבון (הכינו ארבעה עמודים לארבעת הליזטים):
      1. הוסף 2 מ"ל של שרף טיהור חלבון טרי לעמודת כרומטוגרפיה של זרימת הכבידה.
      2. שטפו את העמוד ב-30 מ"ל מים מזוקקים סטריליים פעמיים כדי להסיר אתנול אחסון.
      3. תוספת של 30 מ"ל של מאגר השעיה עם 60 מיקרוליטר של 0.5 M TCEP לריכוז סופי של 1 מ"מ.
      4. מכיוון שהעמודה בנפח של 30 מ"ל, שפכו חוצצים ישירות לתוך העמודה כדי למלא אותה. ודא שהשסתום סגור, אזן את העמודה על ידי הוספת 30 מ"ל של מאגר השעיה + TCEP.
      5. פתח את השסתום כדי לאפשר לזרום ~25 מ"ל של מאגר, לפני סגירת שסתום העמוד, והשאיר ~5 מ"ל של מאגר מעל מיטת השרף כדי למנוע ייבוש. העמודה מוכנה כעת לשימוש.
    10. לאחר הצנטריפוגה, שלב את כל הסופרנטנט המובהר ללא כדורים מכל תרבית ל-4 צינורות חרוטיים טריים של 50 מ"ל על קרח.
    11. השעו מחדש את השרף ב-5 מ"ל הנותרים של מאגר השעיה + TCEP בתוך כל עמודה, והוסיפו מאגר ושרף לכל אחד מהצינורות החרוטיים המכילים את הסופרנטנט הליזאט.
    12. סוגרים וסוגרים את המכסה עם Parafilm, ודוגרים בשייקר רוטיסרי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות.
      הערה: אם הליזיס בוצע מיד לאחר הצמיחה, ניתן לדגור ליזאט זה עם שרף למשך הלילה.
    13. הכן ריאגנטים נדרשים:
      1. הוסף TCEP בריכוז סופי של 1 מ"מ למאגרי שטיפה והסרת מים ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      2. שמור על 20% אתנול (v/v) מוכן.
    14. לאחר הדגירה, דופק לזמן קצר את הצינורות בצנטריפוגה כדי לאסוף את השרף לתחתית הצינור.
    15. השעו מחדש את השרף באמצעות פיפטה, והוסיפו את השרף בחזרה לעמוד טיהור החלבון.
    16. לאחר שהשרף התיישב במיטה בתחתית העמוד, תן למאגר לעבור דרכו.
      הערה: אופציונלי לאסוף זרימה ושטיפה במהלך טיהור החלבון לניתוח באמצעות SDS-PAGE כדי לפתור בעיות בהליך הטיהור
    17. עמוד כביסה עם נפח עמודה אחד של Wash Buffer + TCEP.
    18. הוסף 5 מ"ל Elution Buffer + TCEP לעמודה, השהה את השרף כמה פעמים בעזרת פיפטה ודגר למשך 10 דקות.
    19. לאחר הדגירה, יש לאסוף את הפליטה לתוך שפופרת ביז'ו בנפח 5 מ"ל ולאחסן על קרח.
    20. נקה ואחסן את שרף טיהור החלבון:
      1. לאחר השלמת הפליטה, שטפו את העמודה ב-30 מ"ל של מאגר אלוטיון כדי להסיר את כל החלבונים הקשורים שנותרו.
      2. שוטפים את השרף עם 30 מ"ל מים מזוקקים סטריליים, חוזרים על עצמם פי 3.
      3. העבירו 30 מ"ל של 20% אתנול (v/v) דרך העמודה פעם אחת.
      4. מלאו את העמוד באתנול 20% ואטמו במכסה או בפרפילם. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש הבא.
        הערה: נדרש ניקוי בלבד - אל תנסה להפשיט את הניקל מהשרף. שרף מנוקה מתאים לשימוש חוזר בתכשירי מערכת PURE סטנדרטיים; עם זאת, עבור גרסאות מערכת ΔPURE, השתמש תמיד בשרף טרי כדי למנוע זיהום צולב.
    21. השרו קלטת דיאליזה של 15 מ"ל 2 kDa ב-Buffer HT (ללא TCEP) למשך 10 דקות.
    22. הוסף 5 מ"ל של תמיסת חלבון מווסת לקלטת הדיאליזה.
    23. הסר כמה שיותר אוויר מהקסטה לפני שתחזיר את המכסה.
    24. יש לבצע דיאליזה של 5 מ"ל של חלבון מופשט כנגד 1 ליטר של Buffer HT (ללא TCEP) למשך שעתיים, ולאחר מכן ליטר אחד נוסף של Buffer HT טרי למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תוך ערבוב עדין.
      הערה: אם משלבים פליטות מטיהורים מרובים, ניתן לבצע דיאליזה של עד 10 מ"ל של פליטה כנגד 2 ליטר של Buffer HT למשך שעתיים, ולאחר מכן 2 ליטר נוספים של Buffer HT למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. אם דגירה של שרף בוצעה במהלך הלילה, ניתן לבצע דיאליזה במהלך היום באמצעות פרוטוקול של שעתיים ואחריו 4 שעות, ומיד לאחר מכן שלבי ריכוז החלבון למטה.
  4. יום 4: ריכוז ואחסון
    1. הכנת ריאגנטים נדרשים:
      1. הכן את Buffer HT Refresh + TCEP.
      2. הכן מלאי-60 + TCEP.
    2. לאחר סיום הדיאליזה, הסר 5 מ"ל מהדגימה שעברה דיאליזה מהקסטה וחלק 500 מיקרוליטר לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים בגודל 5 x 2 מ"ל.
    3. סובב כדי לגלול את כל החלבונים המשקעים ב-14,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות.
    4. שלבו מחדש את הסופרנטנט נטול הכדורים והוסיפו ליחידת מסנן צנטריפוגלי של 3 kDa MWCO, ומלאו את הנפח ב-10 מ"ל של Buffer HT Refresh + TCEP.
    5. צנטריפוגה בטמפרטורה של 3,220 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות או עד שנפח הדגימה יקטן ל-1.5 מ"ל.
      הערה: משקעי חלבון במהלך שלבי הריכוז יכולים להפחית משמעותית את ביצועי ה-CFPS הכוללים. לאחר כל מחזור צנטריפוגה של 30 דקות, השתמש בפיפטה של 1 מ"ל כדי להשעות מחדש את הדגימה בצינור המסנן הצנטריפוגלי כדי לעקור את כל החלבונים המשקעים מתחתית המסנן.
    6. הסר את הדגימה מהיחידה הצנטריפוגלית וחלק 500 מיקרוליטר לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים בגודל 3 x 2 מ"ל.
    7. סובב כדי לגלול את כל החלבונים המשקעים ב-14,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות.
    8. שלבו מחדש את הסופרנטנט נטול הכדורים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי טרי על קרח.
    9. קבע את ריכוז החלבונים בתמיסה באמצעות בדיקת ברדפורד, בהתאם להוראות היצרן.
    10. רכז את תמיסת החלבון על ידי הוספה למסנן MWCO טרי של 3 kDa, וצנטריפוגה ב-14,862 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 15 דקות או עד שמגיעים לנפח הדגימה לקבלת ריכוז סופי של 25-30 מ"ג/מ"ל.
    11. הסר את הדגימה מהיחידה הצנטריפוגלית וחלק 500 מיקרוליטר לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של 2 מ"ל.
    12. סובב כדי לגלול את כל החלבונים המשקעים בטמפרטורה של 14,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות.
    13. קבע את ריכוז החלבון באמצעות מבחן ברדפורד. המשך לשלב הבא רק אם הריכוז הוא בין 25 ל-30 מ"ג/מ"ל.
    14. שלבו מחדש את הסופרנטנט נטול הכדורים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה טרי על קרח.
    15. הוסף נפח שווה של Stock-60 + TCEP לתמיסת החלבון המרוכזת, וערבב על ידי פיפטינג עדין.
    16. קבע את ריכוז החלבון הסופי באמצעות מבחן ברדפורד.
      הערה: החלבון נמצא כעת ב-Buffer HT + 30% גליצרול, וכל דילול נוסף עם Stock-30 אינו משנה את ריכוז הגליצרול.
    17. במידת הצורך, יש לדלל את הדגימה עם Stock-30 + TCEP כדי להגיע לריכוז סופי של כ-12.5 מ"ג/מ"ל.
    18. Aliquot תמיסת חלבון PURE לתוך צינורות PCR ב-20 מיקרוליטר אליקוטים, מקפיאים בהצמדה בחנקן נוזלי ומאחסנים ב-80 מעלות צלזיוס.
      הערה: חיוני לקבוע את ריכוז החלבון במדויק לפני הוספת Stock-60, שכן ריכוז תמיסות חלבון המכילות גליצרול עלול לגרום לביצועי CFPS לא עקביים, עקב כמויות משתנות של גליצרול בתגובת ה-CFPS הסופית. לכן יש להוסיף את סטוק-60 רק לאחר אישור שריכוז החלבון נמצא בטווח האופטימלי של 25-30 מ"ג/מ"ל.

3. הכנת ריבוזום גולמי (5 ימים)

הערה: פרוטוקול טיהור הריבוזום עבר אופטימיזציה לעיבוד של 2 ליטר (צלוחיות 4 x 500 מ"ל) של תרבית נוזלית, מה שמוביל לסך של ~3 גרם של גלולת תאים ומניב ~1 מ"ל של ריבוזומים גולמיים בריכוז של 15-24 מיקרומטר.

  1. יום 1: הכנה וצמיחה של תרביות התחלה
    1. הכן תמיסות מלאי ומאגרים לתכשיר הריבוזום כמתואר בטבלה משלימה S2 ובאיור משלים S1.
      הערה: הכן את המדיה והמאגרים הרלוונטיים הנדרשים מיד לפני ביצוע כל חלק בפרוטוקול ואחסן רק למספר הימים המרבי לפני השימוש כפי שצוין.
    2. הכן שני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל: הוסף 10 מ"ל של מדיה LB לצינור אחד, ו-5 מ"ל של מדיה LB לשני.
    3. הסר את מלאי הגליצרול של BL21(DE3) מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס והניח על קרח, וודא שהשלבים הבאים הושלמו לפני שהמלאי מפשיר.
    4. חסנו את 10 מ"ל של מדיה LB עם גירוד התאים ממאגר הגליצרול, כדי ליצור 'מיני תרבית' LB. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד, יחד עם הצינור השני (הלא מחוסן) כדי לבדוק אם יש זיהום במדיה מכיוון שכל הגידולים נעשים ללא אנטיביוטיקה.
    5. החלף את מלאי הגליצרול במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
    6. מניחים 2.2 ליטר מרק סטרילי Terrific (TB) בבקבוקי זכוכית סטריליים, ומאחסנים באינקובטור סטטי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לחימום מוקדם למשך הלילה.
  2. יום 2: גדילה וכדורים
    1. הסר תרביות מהחממה, וודא שאין זיהום בצינור הלא מחוסן או בבקבוק המדיה שחומם מראש לפני שתמשיך.
    2. הכן דילול פי 10 על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תרבית המיני ל-900 מיקרוליטר LB בקובטה של 1 ס"מ, ומדוד את ה-OD600 באמצעות ספקטרופוטומטר (בדוק שהוא ~4-6).
    3. הוסף 200 מ"ל של השחפת המחוממת מראש לבקבוק חרוטי סטרילי של 500 מ"ל, וחסן בנפח מתאים של מיני תרבית כדי לקבל OD התחלתי600 = 0.05 (טבלה משלימה S1). זוהי 'תרבות הביניים'.
    4. דגרו את תרבית המידי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד עד OD600 = 1, מה שאמור לקחת כ-1.5-2 שעות.
    5. הוסף 500 מ"ל שחפת לכל אחת מ -4 צלוחיות מבולבלות סטריליות בנפח 2.5 ליטר. חסנו כל אחד בנפח מתאים של תרבית מידי כדי לקבל OD התחלתי600 = 0.05 (טבלה משלימה S1). אלו הן 4 'תרבויות המקסי'.
    6. דגרו על תרביות המקסי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד עד OD600 = 0.7-0.8, מה שאמור לקחת כ-1.5-2 שעות.
    7. בינתיים, סמנו והניחו ארבעה בקבוקי צנטריפוגות קופולימר פוליפרופילן נקיים, ו-4 בקבוקי זכוכית נקיים של 500 מ"ל, על קרח לקירור.
      הערה: מדוד את צפיפות התרבות המקסימלית כל 15 דקות לאחר שעה אחת של צמיחה כדי למנוע חריגה של OD600 = 0.7.
    8. לאחר שמגיעים ל-OD600 = 0.7, העבירו במהירות תרביות לבקבוקי זכוכית מקוררים והניחו באמבט מי קרח למשך 20 דקות כדי להפסיק את הצמיחה.
      הערה: העברת תרביות לבקבוקים מקוררים חיונית לעצירת צמיחה מהירה: הנחת צלוחיות ישירות לאמבט מי הקרח לא תביא לסיום יעיל של הצמיחה. כל השלבים הבאים נעשים על קרח אלא אם צוין אחרת.
    9. בזמן שתרביות מתקררות באמבט מי הקרח, יש לקרר מראש את הצנטריפוגה לכדורי תאים ולהניח 500 מ"ל של תמיסת PBS על קרח להתקררות.
    10. לאחר 20 דקות, העבירו 250 מ"ל מכל תרבית לבקבוק הצנטריפוגה המקורר מראש המתאים, וצנטריפוגה ב-3,220 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות, תוך שמירה על 250 מ"ל הנותרים על קרח.
    11. יש לשפוך בזהירות את הסופרנטנט ולייבש על מגבות נייר.
    12. הוסף את 250 מ"ל הנותרים של כל תרבית לבקבוק הצנטריפוגה המתאים, וצנטריפוגה שוב ב -3,220 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות.
    13. הסר את הסופרנטנט על ידי סילוק, וספוג את הבקבוקים יבשים על מגבות נייר לפני שמניחים את כדורי התא בחזרה על קרח.
    14. הוסף 30 מ"ל של PBS סטרילי קר כקרח לכל בקבוק צנטריפוגה והשהה מחדש את כדור התא ביסודיות.
    15. שקלו ותייגו 4x צינורות חרוטיים נקיים של 50 מ"ל.
    16. העבירו את מתלה התאים לצינורות החרוטיים בגודל 4X50 מ"ל.
    17. שוב צנטריפוגה ב-3,220 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות.
    18. הסר את הסופרנטנט על ידי סילוק, וספוג את הצינורות יבשים על מגבות נייר לפני הנחת כדורי התא בחזרה על קרח.
    19. הוסף 30 מ"ל של PBS סטרילי קר כקרח לכל צינור חרוטי והשהה מחדש את כדור התא ביסודיות על ידי מערבולת.
    20. שוב צנטריפוגה ב-3,220 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות.
    21. הסר את הסופרנטנט על ידי סילוק, וספוג את הצינורות יבשים על מגבות נייר לפני הנחת כדורי התא בחזרה על קרח.
    22. הוסף 30 מ"ל של PBS סטרילי קר כקרח לכל צינור חרוטי והשהה מחדש את כדור התא ביסודיות על ידי מערבולת.
    23. שוב צנטריפוגה ב-3,220 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות.
    24. הסר את הסופרנטנט על ידי סילוק, וספוג את הבקבוקים יבשים על מגבות נייר לפני שמניחים את כדורי התא בחזרה על קרח.
    25. צנטריפוגה בפעם האחרונה ב-3,220 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 2 דקות.
    26. הסר את כל עודפי ה-supernatant על ידי פיפטינג.
    27. שקלו ורשמו את המסה של כל צינור חרוטי. מסת כדור התא היא ההפרש בין ערכים אלה לבין המשקל הריק של הצינורות (צריך להיות ~1 גרם).
    28. הצמד כדורי תא הקפאה באמצעות חנקן נוזלי, ואחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  3. יום 3: ליזה, אולטרה-צנטריפוגה והשריית בופר B
    1. להפשיר כדורי תאים על קרח.
    2. הוסף 50 מ"ל של מאגר ריבוזום A לצינור חרוטי נקי.
    3. קח 100 מיקרוליטר של מאגר ריבוזום A מהצינור החרוטי והוסף לבקבוקון DTT ללא משקל. ממיסים לחלוטין את גלולת ה-DTT כדי לקבל מלאי DTT של 0.5 M.
      הערה: הכן את מלאי ה-DTT הבא של 0.5 מיליון כמתואר כאן אך באמצעות המאגר המתאים לכל שלב.
    4. הוסף 100 מיקרוליטר של 0.5 M DTT בחזרה לצינור החרוטי של 50 מ"ל כדי לקבל ריכוז סופי של 1 מ"מ DTT במאגר ריבוזום של 50 מ"ל A. שמור את התמיסה על קרח.
    5. השעו מחדש כל כדור תא במאגר ריבוזום A + DTT, ביחס של 2 מ"ל לכל 1 גרם של גלולת תאים, על ידי מערבולת יסודית. שלב את כל התאים המרחפים לצינור חרוטי אחד כדי לאמת את נפח התרחיץ המושעה הכולל, שאמור להיות 10 מ"ל מ-2 ליטר תרבית. במידת הצורך, טען את עוצמת הקול ל-10 מ"ל עם מאגר ריבוזום נוסף A + DTT.
    6. מחלקים את התרחיץ לדגימות של 2 x 5 מ"ל בצינורות חרוטיים נפרדים.
    7. לייז את התאים בכל צינור באמצעות סוניקציה במשרעת של 30%, 20 שניות מופעלות, 20 שניות כבוי למשך 10 מחזורים (אורך תוכנית כולל של 3 דקות ו-20 שניות), באמבט מי קרח, באמצעות בדיקה סוניקציה מקוררת (איור 3A, 3C).
      הערה: יש להעביר כ-1,000 J של אנרגיה לכל צינור במהלך סוניקציה. השתמש במעמד מאובטח כדי לשמור על הצינור במקומו במהלך סוניקציה כדי להבטיח עקביות של העברת אנרגיה.
    8. הגדל את הנפח של כל דגימה ליז ל-25 מ"ל עם מאגר ריבוזום A + DTT, ומערבולת קצרה לערבוב.
    9. העבירו את התכולה ל-2 צינורות צנטריפוגה S30 מקוררים.
    10. צנטריפוגה ב-30,000 × גרם למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס (איור 3E).
    11. שחזר מקסימום 75% מהסופרנטנט נטול הגלולות (כדי למנוע זיהום ממברנה מהגלולה) מכל צינור S30 לשני צינורות S30 נקיים ומקוררים מראש.
    12. צנטריפוגה בטמפרטורה של 30,000 × גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    13. שחזר מקסימום של 75% מהסופרנטנט נטול הכדורים לשני צינורות חרוטיים נקיים של 50 מ"ל, ומלא את הנפח של כל אחד מהם ל-25 מ"ל עם מאגר ריבוזום A + DTT.
    14. העבירו את הדגימה לשני צינורות S100 נקיים ומקוררים מראש.
      הערה: ודא שהצינורות מאוזנים במדויק (הפרש מקסימלי של 0.01 גרם בין צינורות מנוגדים) לפני אולטרה-צנטריפוגה וממולאים לנפח של 25 מ"ל (קיבולת מקסימלית של צינור S100).
    15. צנטריפוגה ב-100,000 × גרם למשך 4 שעות ב-4 מעלות צלזיוס (איור 3F).
    16. שלושים דקות לפני סיום ריצת S100, הכינו מלאי DTT של 0.5 M באמצעות מאגר ריבוזום קר כקרח B לפי ההוראות לעיל, וצרו פתרון סופי של 1 מ"מ DTT ב-50 מ"ל של מאגר ריבוזום B.
    17. הסר את הסופרנטנט מצינורות האולטרה-צנטריפוגה על ידי סילוק. הוסף 5 מ"ל של מאגר ריבוזום קר כקרח B + DTT לכל צינור S100 המכיל גלולה ריבוזומלית. אחסן את יתרת מאגר הריבוזום B + DTT בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש למחרת.
    18. דגרו צינורות על קרח בחדר קר כדי לאפשר לכדור הריבוזום להיספג במאגר הריבוזום B + DTT למשך הלילה.
      הערה: ודא שגלולת הריבוזום שקועה לחלוטין במאגר ריבוזום B + DTT. אפשר להשיג זאת על ידי הנחת צינורות בקרח בזווית (איור 3D).
  4. יום 4: אולטרה-צנטריפוגה והשריית Buffer C
    1. למחרת, הוסף עוד 5 מ"ל של מאגר ריבוזום קר כקרח B + DTT לכל צינור S100 המכיל את כדור הריבוזום שהושרה למשך הלילה.
    2. נסה בעדינות להשעות מחדש את הגלולה על ידי פיפטינג. השתמש בקצה הפיפטה כדי לגרד את הגלולה מקיר הצינור ולהשעות מחדש באופן זה. העבירו את התכולה לשני צינורות S30 נקיים ומקוררים מראש.
    3. הוסף עוד 10 מ"ל של מאגר ריבוזום קר כקרח B + DTT לכל צינור S100 המכיל את גלולת הריבוזום, וחזור על שלבי ההשעיה מחדש כאמור לעיל.
    4. אסוף את המתלה לאותו צינור S30 כמו קודם.
    5. צנטריפוגה ב-30,000 × גרם למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס (איור 3G).
    6. שחזר מקסימום של 75% מהסופרנטנט נטול הכדורים לשני צינורות חרוטיים נקיים של 50 מ"ל, ומלא את הנפח ל-25 מ"ל עם מאגר ריבוזום B + DTT.
    7. העבירו את הדגימה הזו לשני צינורות S100 נקיים ומקוררים מראש.
      הערה: ודא שהצינורות מאוזנים במדויק לפני אולטרה-צנטריפוגה וממולאים לנפח של 25 מ"ל (קיבולת מקסימלית של צינור S100).
    8. צנטריפוגה ב-100,000 × גרם למשך 4 שעות ב-4 מעלות צלזיוס (איור 3H).
    9. שלושים דקות לפני סיום ריצת S100, הכינו מלאי DTT של 0.5 M באמצעות מאגר ריבוזום קר כקרח C לפי ההוראות לעיל, וצרו פתרון סופי של 1 מ"מ DTT ב-5 מ"ל של מאגר ריבוזום C. שמרו את המאגר הזה על קרח.
    10. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והסירו את כל שאריות המאגר על ידי פיפטינג. עבדו במהירות כדי להימנע מהשארת הגלולה חשופה על ידי מאגר זמן רב מדי.
    11. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר ריבוזום קר כקרח C + DTT לכל צינור אולטרה-צנטריפוגה המכיל גלולה ריבוזומלית.
    12. דגרו צינורות על קרח בחדר קר כדי לאפשר לכדור הריבוזום להיספג במאגר ריבוזום C + DTT למשך הלילה.
      הערה: ודא שגלולת הריבוזום שקועה לחלוטין במאגר ריבוזום C + DTT. ניתן להשיג זאת על ידי הנחת צינורות בקרח בזווית.
  5. יום 5: איסוף
    1. למחרת השעו בעדינות את כדור הריבוזום באמצעות פיפטה של 1 מ"ל ועל ידי מערבולת עדינה כדי להמיס לחלוטין את כדור הריבוזום השקוף של ההילה הצלולה.
      הערה: כדור הריבוזום אמור להתמוסס לחלוטין במאגר בשלב זה: לא אמורה להיות גלולה בלתי מסיסה בשלב זה, אך אם נשאר כדור צהוב בלתי מסיס, אל תנסה להשעות אותו מחדש: רק השהה מחדש את כדור הריבוזום השקוף של ההילה
    2. העבירו את תמיסת הריבוזום לשני צינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של 2 מ"ל, וצנטריפוגה ב-20,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול כל חומר בלתי מסיס שנותר.
    3. אספו סופרנטנט נטול כדורים לתוך שפופרת נקייה ואחסנו על קרח (איור 3I).
    4. צור דילול פי 100 של תמיסת הריבוזום על ידי הוספת 2 μL ל-198 μL של מאגר ריבוזום C, בשלוש עותקים.
    5. למדוד את ריכוז ה-RNA ב-260 ננומטר; 10 יחידות ספיגה של הדגימה המדוללת שוות ערך ל-24 מיקרומטר של ריבוזומים13.
    6. תמיסות ריבוזום Aliquot (למשל, ב-50 μL aliquots, בהתאם לצרכי המשתמש), מקפיאות בהצמדה בחנקן נוזלי בריכוז מקסימלי של 24 מיקרומטר, ומאחסנות ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: הפרוטוקול אמור להוביל לכ-1 מ"ל של ריבוזומים בריכוז של 12-18 מיקרומטר. אם הריבוזומים מדוללים מדי, ניתן להשיג ריכוז באמצעות מסנן MWCO 3 kDa8.

4. הגדרת ניסויי CFPS

  1. עבודה מקדימה
    1. הכן את תבנית ה- DNA (ליניארית או פלסמיד) על פי פרוטוקולים שנקבעו9.
      הערה: במעבדה שלנו, אנו משתמשים בתבניות DNA המבוססות על מערכת הביטוי T7p14 המותאמת לביטוי ללא תאים14. מוצרי PCR מטוהרים יכולים לשמש כתבניות ליניאריות. חשוב לציין כי יש לנקות פלסמידים לאחר מיני-הכנה, וכי ערכות מסחריות שונות מניבות תוצאות משתנות15.
    2. הכן תמיסת אנרגיה פי 5 כמתואר בטבלה 3.
    3. הכן פתרון מטריצה 6x כמתואר בטבלה 4.
  2. הגדרה וניטור של תגובת PURE
    הערה: פרוטוקול זה מתאר את ההגדרה של מדידה משולשת באמצעות מיקס מאסטר. ניתן להגדיל או להקטין את מספר התגובות לפי הצורך, באמצעות הגיליון האלקטרוני המופיע בטבלה משלימה S3, אך אנו ממליצים על מינימום חזרות משולשות עבור תנאי ניסוי יחיד.
    1. ההפשרה דרשה כמויות של PURE, ריבוזומים, תמיסת אנרגיה ותמיסת מטריצה על קרח.
    2. הכן תערובת מאסטר לקבוצה אחת של תגובות משולשות בצינור PCR, בסך הכל 17 מיקרוליטר, כפי שמוצג בטבלה 5, על ידי הרכבת הרכיבים בסדר הבא: תמיסת אנרגיה, חלבונים טהורים, ריבוזומים, תמיסת מטריצה, מים נטולי נוקלאז עד 17 מיקרוליטר.
    3. הגדר את הפיפטה ל -5.1 מיקרוליטר ושאף בעדינות את התמיסה 5-6 פעמים לערבוב, מה שמבטיח הומוגניות.
    4. באמצעות אותה הגדרת פיפטה (5.1 מיקרוליטר), טען את תערובת המאסטר לשלוש בארות בודדות של צלחת אופטית של 384 בארות. הימנע מדחיפת הפיפטה מעבר לתחנה הראשונה כדי למנוע היווצרות בועות. השאירו רווח באר אחד בין כל שכפול כדי למזער את הקרינה הצולבת.
    5. אטום את הצלחת באמצעות אטם צלחת דבק.
    6. המשך במדידות דגירה במורד הזרם או קורא צלחות כנדרש.
      הערה: בעת שילוב רכיבים נוספים המכילים גליצרול (למשל, חלבונים משפרים), ודא שהנפח הסופי של רכיבים כאלה אינו עולה על 10% מנפח התגובה. לדוגמה, יש להגביל רכיב עם 30% גליצרול ל-1.7 מיקרוליטר לכל תערובת מאסטר של 17 מיקרוליטר.
      אין לצנטריפוגה את צלחת 384 הבארות לאחר הטעינה. צנטריפוגה עלולה לגרום להפרדה של רכיבים עשירים בגליצרול (למשל, מערכת PURE), וכתוצאה מכך לרמות ביטוי לא עקביות. עיצוב הצלחת תומך בתגובות נפח קטנות, ופיפטינג זהיר מבטיח שקיעה נאותה ללא צנטריפוגה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זרימת העבודה עבור תכשירי ה-PURE והריבוזום מוצגת באיור 1, ולוח זמנים מומלץ לעבודה מוצג בטבלה 1. בדרך כלל, תגובות מנוטרות באמצעות ייצור חלבונים פלואורסצנטיים כגון GFP או mCherry, וניתן להמיר קריאות RFU לריכוזים על ידי כיול11. עם זאת, תפוקות CFPS תלויות בחלבון הספציפי המיוצר, ולכן חשוב לייעל את המערכת כדי לייצר את החלבון הרצוי המעניין כפי שמתואר על ידי Thornton et al.16<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הצגנו נוהל מפורט שאפשר לנו להשיג מערכות PURE הניתנות לשחזור על פני מספר קבוצות ומשתמשים באותה מעבדה. ישנם מספר צעדים קריטיים הנדרשים כדי להשיג זאת.

הצעד החשוב הראשון הוא להבטיח את שלמותם של 36 זני PURE: בנוסף לריצוף כל הפלסמידים, חיוני לבצע ניסוי ביטוי כדי לוודא שכל הזנים מבטאים יתר על המידה כהלכה, שכן אובדן של זן בודד יכול לבטל את פעילות ה-CFPS. ראינו הן אובדן ביטוי עקב מוטציה, כמו גם זיהום כאשר מספר זנים קיימים במלאי אחד. חשוב לבטל את התרחיש השני אם רוצים מע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

SL הוא מייסד שותף ו-CTO של Biophoundry Inc., המפתחת טכנולוגיה נטולת תאים להנדסת פאג'ים.

תודות

NL, SL, AB ו-NZ נתמכים על ידי מלגת מנהיגי העתיד של NL (MR/V027107/1). SL נתמכת בנוסף על ידי Biophoundry Inc. SY נתמכת על ידי מלגת דוקטורט של Darwin Trust מאוניברסיטת אדינבורו. CW נתמך על ידי סטודנטים לדוקטורט של BBSRC Eastbio. המחברים מודים ל-A. Pompa על הסיוע בשימוש באולטרה-צנטריפוגה, שנתמך על ידי מימון מפלטפורמת המחקר Wellcome Discovery לביולוגיה נסתרת של התא [226791]. בנוסף, אנו מודים ל- B. Lavickova ו- S. J. Maerkl על הסיוע בהגדרת פרוטוקול OnePot המקורי. לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון Creative Commons Attribution (CC BY) על כל גרסת כתב יד מקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו. איור 1 נוצר בחלקו ב-BioRender. Laohakunakorn, N. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2x יוטיובסיגמאY2377-250G
חומצות אמינוסיגמאLAA21-1KT
אצטט אמוניום חופשי מ-RNAseתרמו-סיינטיפיקAM9070G
כלוריד אמוניוםסיגמא09718-1KG
אמפיציליןסיגמאA8351-5G
BL21(DE3) מיומן באי-קוליNEBC2527H
בקבוק, צנטריפוגה (Nalgene)תרמו-סיינטיפיק3120-9500בקבוק קו-פולימר פוליפרופילן
בקבוק, זכוכית (דוראן) 250 מ"ל, 500 מ"ל, 1 ליטר, 2 ליטרVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
בדיקת ברדפורד, Quick Start 1x ריאגנט צבעביו-ראד5000205
צנטריפוגהתרמו-סיינטיפיקהראוס מגאפוג' 16R
צנטריפוגה, מיקרואפנדורף5424R 
עמודת הכרומטוגרפיהביו-ראד7321010
קריאטין פוספטסיגמא27920
קובטים, חצי מיקרו 1.6 מ"לפישרברנדFB55147
די-נתרן מימן אורתופוספט דיהידרטפישר כימיקלS/4450/60
קלטת דיאליזה, Slide-A-Lyzer G3, 2 kDa MWCO, 15 מ"לתרמו-סיינטיפיקA52962
אורתופוספט די-אשלגן מימן אנהידרוספישר כימיקלP/5240/60
DTT ללא שקילהתרמו-סיינטיפיקA39255
יחידת סינון, צנטריפוגלי 3kDa MWCO Amicon Ultra 15EMD מיליפורUFC900324
בקבוק, 500 מ"לVWR214-1133
פלאסק, מבולבל 2.5 ליטר;טוניירSS-5013
חומצה פוליניתסיגמאF7878-100MG
גליצרולסיגמאG5516-1L
HClפישרברנדH/1200/PB17
בופר HEPES, תמיסת 1 M pH 7.3תרמו-סיינטיפיקBP299
אימידאזולסיגמאI2399-500G
חממהאפנדורףניו ברונסוויק אינובה ורג; 42
IPTGתרמו-סיינטיפיקR0392
כדורי KOHתרמו-סיינטיפיקP1767-500G
חומצה L-גלוטמית המימגנזיום מלח טטרהידרטסיגמא49605-250G
חומצה L-גלוטמית מונואשלגן מלח מונוהידרטסיגמא49601-500G
מגנזיום אצטט טטרהידרטסיגמאM5661-50G
כלוריד מגנזיוםפלוקה63020-1L
הגדרת ערבוב מגנטיסטיוארטUS152
ננודרופתרמו-סיינטיפיקננודרופ 2000
חרוזי מגני NEBExpress Ni-NTANEBS1423S
פאראפילםסיגמאP7543-1EA
פיפט, מחקר אפנדורף רב-ערוצי Plus 30-300 ומיקרו; Lאפנדורף3125000052
אטם דבק לפלטות לקורא לוחותאקסלסיינטיפיקSTR-SEAL-PLT (סטרילי)
חותם נושם בלוחסטארלאבE2796-3005
אטם נייר אלומיניוםאקסלסיינטיפיקFCS-25
קורא לוחותביו-טקסינרגיה H1
מנענע לוחותאלשנגMBI100-4A
צלחת, באר 384תרמו-סיינטיפיק242764
פלטה, באר בעומק 96 1 מ"לתרמו-סיינטיפיק736-0601
פלטה, באר 96 בעומק 2 מ"לסארסטדט82.1972.002
פלטה, 96 באר PCRסארסטדט721,978
פלטה, באר אופטית 96תרמו-סיינטיפיק10057581
כלוריד אשלגןסיגמאP5405-500G
אורתופוספט די-הידרוגן אשלגןפישר כימיקלP/4800/53
תגובת חילוץ חלבון (BugBuster)EMD מיליפור70584-3
שרף טיהור חלבונים (cOmplete)רוש5893682001
שייקר רוטיסריסטארלאבRM-Multi 1
כלוריד נתרןפישר כימיקלS/3105/70
גלאי סוניקציה, FisherBrand 15-50 מ"לתרמו-סיינטיפיק12931181
סוניקייטורפישר סיינטיפיקFB120
ספקטרופוטומטרג'נווייג'נובה פלוס
ספרמידיןסיגמאS2626-1G
TCEP 0.5 מטרסופלקו646547
Thermo Fisher NTP, טריס ממופרתרמו-סיינטיפיקR1481
tRNA מ-E. coli MRE600רוש10109541001
טריפטוןפורמדיוםTRP02
צינור, דרגת PCR של 0.2 מ"לסארסטדט72,737,002
שפופרת, ביז'ו סטרילין 7 מ"ל פוליסטירןתרמו-סיינטיפיק129A
צינור, קוני (Falcon) 15 מ"לסארסטדט62.554.502
צינור, קוני (Falcon) 50 מ"לסארסטדט62.547.254
צינור, מיקרוצנטריפוגה (אפנדורף) 1.5 מ"לסארסטדט72.690.001
צינור, מיקרוצנטריפוגה (אפנדורף) 2 מ"לסארסטדט72.695.700
שפופרת, צנטריפוגציה S100  בקמן-קולטר355619
צינור, S30 צנטריפוגה תרמו-סיינטיפיק3118-0050
אולטרה-צנטריפוגהבקמן-קולטראופטימה XPN-100
רוטור אולטרה-צנטריפוגהבקמן-קולטררוטור 70Ti בזווית קבועה
מים מזוקקים ללא DNase/RNase אולטרה-פיורתרמו-סיינטיפיק10977049
וורטקסרVWR444-2791
תמצית שמריםאוקסואידLP0021T

מקורות

  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Front Bioeng Biotechnol. 8 (213), 1-26 (2020).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2019).
  3. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  4. Shimizu, Y., Ueda, T. Pure technology. Methods Mol Biol. 607, 11-21 (2010).
  5. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synth Biol. 1 (2), 43-52 (2012).
  6. Shepherd, T. R., et al. De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Res. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  7. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nat Chem Biol. 14 (1), 29-35 (2018).
  8. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synth Biol. 8 (2), 455-462 (2019).
  9. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo, C. OnePot PURE cell-free system. J Vis Exp. (172), e62625(2021).
  10. Zhang, Y., et al. Optimizing protein expression in the One-Pot PURE system: insights into reaction composition and translation efficiency. ACS Synth Biol. 14 (5), 1496-1508 (2025).
  11. Yadav, S., Perkins, A. J. P., Liyanagedera, S. B. W., Bougas, A., Laohakunakorn, N. ATP regeneration from pyruvate in the PURE system. ACS Synth Biol. 14 (1), 247-256 (2025).
  12. Doerr, A., et al. Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys Biol. 16 (2), 025001(2019).
  13. Christodoulou, J., et al. Heteronuclear NMR investigations of dynamic regions of intact Escherichia coli ribosomes. PNAS. 101 (30), 10949-10954 (2004).
  14. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E coli TXTL toolbox 3.0: new capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synth Biol. 6 (1), 1-8 (2021).
  15. Romantseva, E., Alperovich, N., Ross, D., Lund, S. P., Strychalski, E. A. Effects of DNA template preparation on variability in cell-free protein production. Synth Biol. 7 (1), 1-17 (2022).
  16. Thornton, E. L., Boyle, J. T., Laohakunakorn, N., Regan, L. Cell-free protein synthesis as a method to rapidly screen machine learning-generated protease variants. ACS Synth Biol. 14 (5), 1710-1718 (2025).
  17. Laohakunakorn, N. Cell-free 3PGA energy solution. , Protocols.io. (2020).
  18. Kalpaxis, D. L., Theocharis, D. A., Coutsogeorgopoulos, C. Kinetic studies on ribosomal peptidyltransferase: the behaviour of the inhibitor blasticidin S. Eur J Biochem. 154 (2), 267-271 (1986).
  19. Blaha, G., et al. Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy. Methods Enzymol. 317, 292-309 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מערכת PUREהכנת ריבוזומיםביולוגיה סינתטיתיתאולטרה-צנטריפוגציהפלואורסצנציית GFPנורמליזציה של צפיפות אופטיתריכוז גליצרולביטוי חלבונים
חידוד של OnePot PURE וייצור ריבוזום גולמי לסינתזה של חלבון ללא תאים הניתנת לשחזור
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.