מאמר מחקר

ביטוי, משמעות קלינית ותפקיד בהערכת יעילות אימונותרפיה של מולקולת הגירוי המשותף LLT1 בסרטן הקיבה

619 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68827

⸱

10 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3Jiangsu Institute of Clinical Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 4Jiangsu Key Laboratory of Clinical Immunology, Soochow University, 5Jiangsu Key Laboratory of Gastrointestinal Tumor Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

במאמר זה

סיכום

מחקר זה חוקר LLT1 כסמן ביולוגי אימונותרפיה מנבא בסרטן הקיבה באמצעות מולטי-אומיקס וניתוחים קליניים. המחקר מעריך את תפקידו של LLT1 בהתחמקות חיסונית ובאפנון מיקרו-סביבה של גידול כדי להקל על גישות אימונותרפיה מדויקות לתוצאות טיפול משופרות.

תקציר

LLT1 היא מולקולת מחסום חיסונית חדשה ומטרה טיפולית פוטנציאלית. אימונותרפיה שיפרה את התוצאות בסרטן קיבה מתקדם; עם זאת, חולים רבים אינם מגיבים או מפתחים עמידות, וחסרים סמנים ביולוגיים מנבאים. תפקידו של LLT1 בהתחמקות חיסונית מסרטן הקיבה והשפעתו על התגובה האימונותרפית נותרו לא ברורים. כדי להעריך זאת, ביטוי LLT1 נותח במערך הנתונים של אדנוקרצינומה בקיבה של אטלס גנום הסרטן (TCGA) באמצעות אלגוריתמים מרובים (TIMER, CIBERSORT ו-ESTIMATE) כדי לכמת חדירת תאי חיסון. ביטוי החלבון אומת על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) ב-268 דגימות אדנוקרצינומה בקיבה ועל ידי אימונופלואורסצנציה מולטיפלקס (MIF) ב-115 רקמות פוסט-אימונותרפיות. נתונים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים משולבים נותחו עבור קשרים עם תכונות מיקרו-סביבה של גידול ותוצאות אימונותרפיה קלינית. התוצאות הראו כי ביטוי גבוה של חלבון LLT1 היה קשור באופן משמעותי למאפייני גידול פחות מתקדמים (עומק פלישה נמוך יותר וגרורות קשריות; P < 0.05) והישרדות כללית ארוכה יותר (P = 0.012). רמות ה-mRNA והחלבון של LLT1 היו בקורלציה עם חדירה גדולה יותר של תאי CD8+ T ומקרופאגים M1 וביטוי מוגבר של PD-L1 במיקרו-סביבת הגידול. בקרב הקבוצה הראשונה של 198 חולים עם נתונים פרוגנוסטיים זמינים, חולים עם ביטוי LLT1 גבוה (n=117) הראו הישרדות כוללת ארוכה יותר באופן משמעותי בהשוואה לאלו עם ביטוי נמוך (n=81). בקבוצה השנייה של חולים שטופלו בשילוב אימונותרפיה וכימותרפיה, לגידולים עם ביטוי LLT1 גבוה (n=48) הייתה הישרדות ארוכה יותר ללא התקדמות (P = 0.014) מאשר לגידולים עם ביטוי LLT1 נמוך (n=67). עלייה משמעותית (P < 0.05) באוכלוסיות תאי חיסון PD-1+CD161+ נצפתה בחולים יעילים באימונותרפיה (n=62) בהשוואה לחולים עמידים לטיפול (n=53). באופן חד משמעי, ביטוי LLT1 הוא סמן ביולוגי מבטיח לפרוגנוזה חיובית בסרטן הקיבה. למיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון שהוכיח כי ביטוי LLT1 מנבא תגובה משופרת לכימותרפיה ואימונותרפיה משולבת בסרטן הקיבה, ותומך בפוטנציאל שלו בהנחיית אסטרטגיות אימונותרפיות.

מבוא

סרטן מערכת העיכול, במיוחד סרטן הקיבה (GC), מחזיק בתואר הצורה החמישית הנפוצה ביותר של סרטן בעולם והחמישית הקטלניתביותר. הסטטיסטיקה העולמית מגלה כי כמיליון מקרים חדשים מזוהים מדי שנה, כאשר מזרח אסיה נושאת בנתח לא פרופורציונלי של המחלה, מה שתורם ליותר ממחצית מההיארעות העולמית1. עבור אלה שאובחנו עם GC בשלב מוקדם, סיכויי ההישרדות חיוביים משמעותית, כאשר למעלה מ-90% משיגים שיעורי הישרדות של 5 שנים לאחר דיסקציה תת-רירית אנדוסקופית (ESD) או התערבות כירורגית רדיקלית2. עם זאת, הצגה עדינה של תסמינים ראשוניים מובילה לעתים קרובות לאבחנה של שלבמתקדם מקומי או גרורתי 3,4. התחזית עבור חולים בשלבים מתקדמים אלה היא עגומה, כאשר אלה שנותרו ללא טיפול חווים הישרדות כוללת חציונית (OS) של בקושי 6 חודשים. אפילו עם מתן משטרי כימותרפיה משולבים המבוססים על פלואורואורציל ופלטינום, ה-OS החציוני מתארך רק לשנה5 בקירוב.

לאחרונה חל שינוי משמעותי בטיפול בסרטן הקיבה בשלב מאוחר, הודות לתרופות החדשות הללו הנקראות מעכבי מחסום חיסוני. הם דומים לכדור קסם לתאים סרטניים שיש להם סמן מסוים, PD-L1, המופיע עליהם - לפחות ציון 1 בסולם הציון החיובי המשולב (CPS). טיפולים אלה יעילים מאוד גם לסרטן שכולם מעורבבים ב-DNA שלהם, מה שנקרא חוסר יציבות מיקרו-לוויין גבוה (MSI-H). גישה חדשה זו עושה את ההבדל במתן זמן רב יותר למטופלים 6,7. ניסויים קליניים מרכזיים מצביעים על כך שבתוך העוקבה החיובית ל-PD-L1, אנשים עם CPS של 10 ומעלה משיגים עלייה בולטת יותר בהישרדות לאחר טיפול בנוגדנים חד-שבטיים PD-1 8,9. עם זאת, האימונותרפיה הנוכחית עדיין מתמודדת עם אתגרים קליניים מרובים: שיעורי תגובה אובייקטיביים (ORR) בדרך כלל מתחת ל-20%, שיעורי עמידות משניים גבוהים עד 40%-60%, מערכות חיזוי סמנים ביולוגיים לא מושלמות (סמנים ביולוגיים קיימים יכולים לזהות רק 30%-40% מהמוטבים הפוטנציאליים), וקשיים בניהול תופעות לוואי הקשורות למערכת החיסון (irAEs)10,11,12,13,14. למרות שחסימה כפולה של מחסום חיסוני (למשל, עיכוב PD-1/CTLA-4 משולב) או משטרי כימותרפיה יכולים להגביר את שיעורי התגובה ל-40%-60%, כמחצית מהמטופלים עדיין לא מצליחים להשיג יתרונות קליניים מתמשכים15. לכן, הקמת מערכות סיווג מדויקות המבוססות על תכונות מולטי-אומיקס, גילוי סמנים ביולוגיים מנבאים חדשים וזיהוי נקודות ביקורת חיסוניות חדשות הפכו לכיווני מחקר קריטיים לשיפור התוצאות הקליניות של אימונותרפיה GC.

תעתיק דמוי לקטין 1 (LLT1) הוא חלבון הקשור ללקטין מסוג C, עם CD161, מרכיב במשפחת קולטני תאי ההרג הטבעי (NK), המשמש כשותף הקישור המזוהה שלו. הגן CLEC2D, האחראי על הסינתזה שלו, מוליד חמישה איזופורמים נפרדים באמצעות אירועי שחבור חלופיים העוקפים אקסונים מסוימים. גרסה 1, הידועה בשם LLT1, אומתה כגרסה היחידה הקיימת על קרום התא16,17. ביטוי LLT1 נצפה בעיקר בסוגי תאים חיסוניים שונים, כגון לימפוציטים מסוג B, תאי NK, תאים דנדריטיים (DCs), אוכלוסיות ספציפיות של תאי T (כולל תאי T מופעלים ומווסתים), מונוציטים ומקרופאגים, והוא נצפה גם בתאים ממאירים מסוימים ובמהלך אפיזודות דלקתיות18. ממצאים ראשוניים מצביעים על כך ש-LLT1 מווסת בתאי DC ו-B בעקבות גירוי קולטן דמוי טול (TLR). הוכח כי המעורבות של LLT1 עם CD161 מדכאת ציטוטוקסיות בתיווך תאי NK, מה שמרמז על מעורבותו בוויסות התגובה החיסונית18. בתאי B, ביטוי LLT1 מווסת על ידי זיהום ויראלי או גירוי דלקתי. כאשר מתפקדים כתאים מציגי אנטיגן (APCs), האינטראקציה LLT1-CD161 מפעילה השפעות אימונומודולטוריות כפולות על ידי דיכוי תפקוד תאי NK תוך גירוי משותף של התפשטות תאי T או ייצור IFN-γ19.

ידוע כי LLT1 קיים במגוון תאים סרטניים, כולל סרטן שד טריפל נגטיב, גליובלסטומה ולימפומה שאינה הודג'קין של תאי B. חלבון זה מתחבר לקולטן CD161 המצוי בתאי NK, וחוסם למעשה את יכולתם להשמיד תאים סרטניים, ובכך מסייע בהתחמקות מהתגובה החיסונית 20,21,22. תצפית בולטת בקרצינומה של תאי קשקש אורו-לוע שלילית ל-HPV היא הביטוי המשתנה של LLT1, אשר, על פי מחקרים אימונוהיסטוכימיים, מצביע על משמעות פרוגנוסטית חיובית כאשר הוא מתבטא מאוד במבנים לימפואידים שלישוניים (TLS), בעוד שנוכחותו על תאי גידול קשורה לתוצאה גרועה יותר23. יתר על כן, בהקשר של סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC), LLT1 אינו מתגלה בתאי הסרטן עצמם אלא נמצא בתוך המיקרו-סביבה של הגידול (TME), ורמת ביטוי ה-mRNA שלו קשורה לפרוגנוזה טובה יותר24.

כפי שהודגם על ידי Mathewson et al. במחקר גליומה, חסימת CD161 משפרת את ההרג בתיווך תאי T של תאי גליומה במבחנה ומשפרת את תפקודם האנטי-גידולי in vivo, תוך הדגשת הפוטנציאל הטיפולי של CD161 כמטרה למחסום חיסוני25. בהתחשב בכך ש-LLT1 הוא הליגנד הקנוני של CD16118, תפקידו כמטרה אימונותרפית מצדיק התייחסות רצינית. במקביל לאינטראקציה הקריטית בין PD-1 ו-PD-L1 באימונותרפיה, לחקירת הפונקציות הביולוגיות של LLT1 בסרטן הקיבה והמתאם שלו לתוצאות האימונותרפיה יש ערך קליני משמעותי.

מחקר זה מספק ניתוח מקיף של דפוסי ביטוי LLT1 במיקרו-סביבה של גידול סרטן הקיבה, תוך שילוב חקירות ברמת mRNA וחלבון. הוא מעריך באופן שיטתי את הפוטנציאל של LLT1 כסמן ביולוגי פרוגנוסטי בסרטן קיבה מתקדם ומעריך את הערך המנבא שלו ליעילות האימונותרפיה. תובנות אלו תורמות להבנה עמוקה יותר של פוטנציאל התרגום הקליני שלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחקר שכלל נבדקים אנושיים נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת סוצ'ו (אישור מס' 2019026). מועצת הביקורת האתית של בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת סוצ'ו אישרה או העניקה פטור לבדיקה אתית של שימוש בנתונים אלה. בנוסף, התקבלה הסכמה מדעת מכל המשתתפים.

ניתוח נתונים ביואינפורמטיים
לאחר בחינה יסודית של ניתוח ביטוי פאן-סרטני של מסדי הנתונים TCGA ו-Tumor IMmune Estimation Resource (TIMER), ההתנהגות של LLT1 נחקרה על פני סוגי סרטן שונים, עם דגש מיוחד על סרטן הקיבה. מסד הנתונים של TISIDB שימש לחקירת המתאם בין רמות ביטוי LLT1 ותת-סוגים מולקולריים שונים של סרטן הקיבה. המתאם בין המאפיינים הקליניים של המטופלים לביטוי LLT1 נותח עוד יותר עם נתוני TCGA באמצעות תכנות R. ניתוחי GO ו-KEGG שימשו כדי לחקור את התפקיד התפקודי של LLT1 בסרטן הקיבה. האלגוריתם ESTIMATE (אומדן של תאים סטרומליים וחיסוניים ברקמות גידול MAlignant באמצעות נתוני ביטוי) שימש בנוסף לכימות רמות חדירת תאי חיסון ותאי סטרומה ברקמות הגידול על פי דפוסי ביטוי LLT1. ניתוח נוסף באמצעות אלגוריתם CIBERSORT נערך כדי להעריך מתאמים בין רמות ביטוי LLT1 ודפוסי חדירה ספציפיים של תאים חיסוניים בתוך מיקרו-סביבת הגידול. ניתוח ביואינפורמטי מקיף בוצע באמצעות מערכי נתונים של TCGA ותכנות סטטיסטי R (v4.4.1) כדי לחקור מתאמים פוטנציאליים בין פרופילי ביטוי LLT1 וסמנים ביולוגיים של רגולציה חיסונית. לבסוף, נעשה שימוש במסד הנתונים של TCIA (The Cancer Immunome Atlas) כדי לחקור אם ביטוי LLT1 יכול לחזות תגובה לטיפול בחסימת מחסום חיסוני PD-1/PD-L1.

דגימות GAC ובניית מיקרו-מערך רקמות (TMA)
שתי קבוצות של נתוני מיקרו-מערך רקמות נוצרו כדלקמן:

הסט הראשון ניתח רטרוספקטיבית דגימות מ-268 חולים עם GAC שעברו ניתוח ב-2011. פתולוגים בחרו גושי פרפין, זיהו אזורי ליבת גידול ובנו אותם למיקרו-מערכי רקמות. לכל אתר דגימה בודד הוקצה מזהה ייחודי לניטור קפדני של פרמטרים קליניים קשורים כגון מין, גיל, מידות ניאופלזמה, מידת התמיינות ניאופלסטית, שלב התקדמות הסרטן, עומק פלישה, מעורבות לימפטית ונוכחות של התפשטות מרוחקת. משך ההישרדות הכוללת (OS) הוגדר כמרווח מתחילת הטיפול ועד להופעת התמותה או תאריך הסיום של דצמבר 2017. יש להדגיש כי נתוני מערכת הפעלה מקיפים היו זמינים רק עבור תת-קבוצה של 198 משתתפים.

הקבוצה השנייה כללה 115 חולים נאיביים עם GC מתקדם, שעברו כריתה כירורגית/אנדוסקופית בבית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת סוצ'ו בין השנים 2016 ל-2023. פתולוגים העריכו את גושי הפרפין ובנו מיקרו-מערכי רקמות עם מעקב צמוד אחר התקדמות המחלה. יש לציין כי כל הדגימות נאספו לפני כל טיפול טרום ניתוחי, והטיפול לאחר הניתוח כלל בעיקר נוגדנים חד-שבטיים PD-1 בשילוב עם כימותרפיה.

כל דגימות הכריתה הכירורגית נאספו מהאנטרום של הקיבה. כל הדגימות נקבעו בפורמלין ניטרלי משובץ והוטמעו בפרפין. בהתבסס על הערכת החתכים המוכתמים ב-H&E, שני פתולוגים בכירים זיהו באופן עצמאי את אזורי הרקמה המייצגים ביותר מהדגימות המשובצות בפרפין. המיקרו-מערכי הרקמות (TMA) נבנו באמצעות מערך רקמות אוטומטי, כאשר ליבות הרקמה ממוקמות במדויק בבלוקי ה-TMA על פי מודולים מוגדרים מראש. לבסוף, בלוקי ה-TMA שהושלמו נחתכו בעובי של 4 מיקרומטר על ידי היסטוטכנולוג מנוסה.

אימונוהיסטוכימיה (IHC) ואימונופלואורסצנציה מרובה (mIHC)
בדיקות אימונוהיסטוכימיות ואימונופלואורסצנטיות מרובות נערכו על מיקרו-מערך רקמות בנוי. צביעת IHC בוצעה בהתאם למתודולוגיה שנקבעה בעבר26. הסט הראשון של קטעי פרפין מיקרו-מערך הועבר על שקופיות זכוכית ונאפה ב-72 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר שהחלקים עברו דה-פרפין עם קסילן והתייבשו מחדש בדילול אתנול שהולך וגדל ברצף, פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית נחסמה על ידי מריחת תמיסת חסימת פרוקסידאז למשך 30 דקות. אחזור האנטיגן בוצע על ידי הרתחת השקופיות ב-110 מעלות צלזיוס בתמיסת אחזור אנטיגן ציטראט (pH 6.0) למשך 3 דקות. לאחר חסימה עם מאגר חוסם BSA של 5%, החלקים הודגרו עם עכבר חד שבטי CLEC2D אנטי אנושי, עכבר אנטי אנושי CD3 חד שבטי (מוכן לשימוש), עכבר אנטי אנושי CD4 חד שבטי (מוכן לשימוש), ארנב אנטי אנושי CD8 חד שבטי (מוכן לשימוש), עכבר אנטי אנושי CD11c חד שבטי (1:50) עכבר אנטי אנושי CD19 חד שבטי (מוכן לשימוש), עכבר אנטי אנושי CD31 חד שבטי (מוכן לשימוש), עכבר אנטי אנושי CD56 חד שבטי (מוכן לשימוש), עכבר אנטי אנושי CD68 חד שבטי (מוכן לשימוש), ארנב אנטי אנושי Foxp3 חד שבטי (1:50), עכבר אנטי אנושי IL-17 חד שבטי (1:50), עכבר אנטי אנושי IFN-γ חד שבטי (1:50), עכבר אנטי אנושי Ki67 חד שבטי (1:50), עכבר אנטי אנושי PD-L1 חד שבטי (מוכן לשימוש) ב-4 מעלות צלזיוס לילה27,28. לאחר מכן נשטפו השקופיות והודגרו בנוגדנים משניים המסומנים בחזרת פרוקסידאז (נגד עכבר וארנב) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הדגימות נשטפו, ומערכת הזיהוי EnVision שימשה לזיהוי חיסוני. מתחת למיקרוסקופ, כאשר מתחילים להופיע אזורים חומים על השבב, נדרשת התבוננות מדוקדקת. יש להפסיק את התגובה הכרומוגנית ברגע שהאזורים החומים כבר לא גדלים. השקופיות הוכתמו בהמטוקסילין של מאייר והורכבו בדבק ניטרלי. בביקורת השלילית, נעשה שימוש ב-IgG של עכבר או ארנב במקום הנוגדן הראשוני. הביקורת החיובית הייתה רקמת שקדים אנושית. הקבוצה השנייה של קטעי מיקרו-מערך משמשת לאימונוהיסטוכימיה מרובה (mIHC). תוך שימוש חוזר בתנאי אחזור וחסימת האנטיגן שהוזכרו לעיל, לוח הנוגדנים מותאם ספקטרלית כדלקמן: PD-L1 (480 ננומטר), CD161 (520 ננומטר), LLT1 (570 ננומטר), PD-1 (620 ננומטר), CD8 (690 ננומטר) ו-PAN-CK (780 ננומטר). הנוגדנים הראשוניים הודגרו באותם תנאים כמו בפרוטוקולהמקורי 29 (למעט PANCK ו-CD161, שהוצגו לאחרונה), בדילול המומלץ של 1:100, ואחריו צביעה פלואורסצנטית של הגברת אות טירמיד (TSA). לאחר כל סבב של צביעה פלואורסצנטית, מתבצעת הפשטת נוגדנים, ואחריה אחזור אנטיגן חוזר, חסימת פרוקסידאז אנדוגנית וחסימת מטרה לא ספציפית לפני הדגירה של הנוגדן הראשוני הבא. בעת ביצוע אימונוהיסטוכימיה מרובה, שלוש נקודות הן קריטיות: יש לבצע ניסויים מקדימים לכל צבע פלואורסצנטי, יש לשייך נוגדנים בעלי ביטוי חזק לאותות פלואורסצנטיים חלשים, בעוד שיש לשייך נוגדנים בעלי ביטוי חלש לאותות פלואורסצנטיים חזקים, ולאחר צביעת כל סמן פלואורסצנטי, יש לצפות בתוצאות הצביעה במיקרוסקופ בתנאים מוגני אור. לאחר הצביעה בצבע הפלואורסצנטיה-6, מוחל צביעה נגדית של DAPI על גרעיני תאי התווית, והשקופיות מותקנות. לבסוף, כל מערכי המיקרו של הרקמות נסרקו באמצעות סורק פתולוגיה דיגיטלי ונותחו באמצעות תוכנת ניתוח תמונות פתולוגיה דיגיטלית המופעלת על ידי בינה מלאכותית.

הערכת צביעת IHC/mIHC
תוצאות הצביעה פורשו על ידי שני פתולוגים מומחים בצורה כפולת סמיות. הם מדדו את עומק הצביעה באמצעות מטרה בעלת עוצמה גבוהה (הגדלה של פי 200) או הגדרה פלואורסצנטית תואמת (פי 200), והקצו ציונים הנעים בין 0 (ללא צביעה) ל-3 (צביעה אינטנסיבית). חלקי התאים החיוביים ל-LLT1 בדגימות קרצינומה של הקיבה חולקו לארבעה שכבות: 0 (<5%), 1 (5-25%), 2 (26-50%) ו-3 (>50%). ציון התגובתיות החיסונית (IRS) נגזר מהתוצר של עומק הצביעה ושיעור התאים החיוביים ל-LLT1. דגימות שקיבלו ציון אפס נחשבו שליליות, בעוד שציונים של 1-4 הצביעו על ביטוי חלש, 5-7 בינוני ו-8-9 ביטוי חזק; אותם קריטריונים יושמו כדי להעריך את הביטוי של סמנים אחרים כגון Ki67 ו-CD3. בהתבסס על מתודולוגיית ההערכה והקיבוץ, הדגימות סומנו כחזקות (IRS8-9), בינוניות (IRS5-7), חלשות (IRS1-4) או ללא ביטוי (IRS0). חולים עם הציונים הנמוכים ביותר (IRS≤4) הוקצו לקבוצת הביטוי הנמוך, ואלה עם ציונים גבוהים יותר (IRS≥5) הוקצו לקבוצת הביטוי הגבוה.

עם זאת, עבור סמן PD-L1, אומצה גישה שונה באמצעות ה-CPS. ציון זה נקבע על ידי היחס בין תאים חיוביים ל-PD-L1 (כולל תאי גידול, חיסון וסטרומה) למספר הכולל של תאי גידול ברי קיימא שהוגדל בפקטור של 100. אנשים עם CPS העולה על חמש הוצבו בקבוצת הביטוי הגבוה, ואילו אלה עם CPS של חמש ומטה קובצו בקבוצת הביטוי הנמוך.

קיבוץ תגובות אימונותרפיה
בהתאם לקריטריונים להערכת תגובה בגידולים מוצקים גרסה 1.1 (RECIST 1.1), הערכת נגעי המטרה בחולים מתחלקת לארבע קטגוריות נפרדות: (א) תגובה מלאה (CR): כל נגעי המטרה נעלמו לחלוטין, והציר הקצר של כל בלוטות הלימפה הפתולוגיות (הן מטרה והן לא מטרה) חייב להיות בגודל של פחות מ-10 מ"מ; (ב) תגובה חלקית (PR): הקוטר המצטבר של כל נגעי המטרה הניתנים למדידה הצטמצם ב-30% לפחות מהמדידות הבסיסיות; (ג) מחלה מתקדמת (PD): קטגוריה זו ישימה כאשר הקוטר המצטבר של נגעי המטרה גדל ב-20% לפחות בהשוואה לערך הקטן ביותר שתועד במהלך המחקר (תוך שימוש בקו הבסיס כהתייחסות אם הוא מייצג את הערך הקטן ביותר), כאשר העלייה המוחלטת היא לא פחות מ-5 מ"מ; בנוסף, הופעתם של נגעים חדשים מסווגת גם כמחלה מתקדמת (PD); (ד) מחלה יציבה (SD): הקוטר המצטבר של נגעי המטרה אינו משיג את קריטריוני ההפחתה ל-PR או את קריטריוני העלייה למחלת פרקינסון לאורך המחקר. יושמו שתי טכניקות ריבוד. השיטה הראשונה כללה הפרדה של חולים על סמך סטטוס התגובה שלהם, כאשר חולי פרקינסון (n=53) ו-SD (n=46) היוו את קבוצת הלא-מגיבים (n=99), בעוד שחולי PR (n=15) ו-CR (n=1) היוו את קבוצת המגיבים (n=16). הגישה השנייה כללה סיווג חולים לפי התקדמות המחלה, כאשר חולי CR, PR ו-SD סווגו כעוקבה היעילה לאימונותרפיה (n=62) וחולי פרקינסון כעוקבה לא יעילה של אימונותרפיה (n=53).

ניתוח סטטיסטי
הערכות אמפיריות בוצעו באמצעות פלטפורמת המחשוב R (גרסה 4.4.1) וחבילת התוכנה הסטטיסטית SPSS (גרסה 27.0). פערים בין קבוצות המחקר נחקרו על ידי יישום ניתוח טבלת המגירה של חי בריבוע. טכניקת המתאם הלא-פרמטרי של ספירמן שימשה כדי לחקור את החוזק והכיוון של הקשרים בין משתנים. שינויים בזמן ההישרדות נותחו באמצעות בניית אומדני קפלן-מאייר שהושלמו על ידי בדיקת דירוג לוג למשמעות. לאחר מכן, נעשה שימוש במודלים של רגרסיה פרופורציונלית של סיכונים של קוקס כדי לזהות גורמים שעשויים להשפיע על תוצאות ההישרדות של המטופלים. מובהקות סטטיסטית הוגדרה מראש כספי ערך p דו-צדדי של <0.05. כדי להבטיח את חוזק הממצאים, נערכו ניתוחי רגישות מקיפים כדי להעריך משתנים מבלבלים פוטנציאליים, עם מודלים מרובי משתנים שהותאמו בהתאם. יתר על כן, ניתנו פרשנויות מפורשות של יחסי סיכון כדי להקל על ההבנה הקלינית, תוך שימת דגש על ההשלכות המעשיות של גורמי סיכון שזוהו על הפרוגנוזה של המטופל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

קשר בין ביטוי mRNA CLEC2D לתת-סיווג סרטן קיבה/פרמטרים קליניים
בדיקת סרטן מקיפה ראשונית תוך שימוש במערך הנתונים של TCGA, שהוקלה על ידי מסד הנתונים TIMER, חשפה עלייה ניכרת ברמות התעתיק של CLEC2D על פני רקמות סרטניות שונות, כפי שמתואר באיור 1A. תצפית זו מרמזת על כך ש-CLEC2D עשוי לשמש כגורם אונקוגני כללי המעורב בפתוגנזה ובאבולוציה של סוגי סרטן שונים. השוואה קפדנית של רמות ה-mRNA של CLEC2D בין רקמות קיבה סר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המחקר שלנו הראה ביטוי גבוה יותר של CLEC2D mRNA ברקמות הגידול מאשר ברקמות רגילות. תוצאות אימונוהיסטוכימיות של סרטן הקיבה חשפו כי ביטוי גבוה של חלבון LLT1 ברקמות הגידול היה קשור לפרוגנוזה טובה יותר ונמצא בקורלציה חיובית עם חדירת תאים חיסוניים במיקרו-סביבת הגידול. ניתוח רקמות מחולי סרטן קיבה שקיבלו אימונותרפיה הצביע על כך שביטוי גבוה של LLT1 מנבא תגובה אימונותרפית טובה יותר. המחקר שלנו חקר את הביטוי והמשמעות הקלינית של LLT1 ברקמות סרטן הקיבה, וסיפק סמן הערכה חדש לאימונותרפיה קלינית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא דווח על ניגוד עניינים פוטנציאלי על ידי המחברים.

תודות

הכרת תודה מוענקת למסד הנתונים של TCGA על מתן תמיכה בנתונים. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 81974375) ומענקים של תוכנית פיתוח המדע והטכנולוגיה של סוג'ואו (SKY2022129). המחקר מקפיד על הנחיות ARRIVE.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5% חוצץ חוסם BSAבייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מ, סיןSW3015
אנטי-CD11c ZSGB-BIO, סין5D11
אנטי-CD161אבקאם, קיימברידג', בריטניהאילן אלכסנדר
אנטי-CD19   ZSGB-BIO, סיןEPl69
אנטי-CD3 ZSGB-BIO, סיןLNl0
אנטי-CD31ZSGB-BIO, סין  UMAB30
אנטי-CD4ZSGB-BIO, סיןUMAB64
אנטי-CD56 ZSGB-BIO, סיןUMAB83
אנטי-CD68 ZSGB-BIO, סיןKP1
אנטי-CD8ZSGB-BIO, סיןEP334
אנטי-CLEC2Dאבקאם, קיימברידג', בריטניהab197341
אנטי-Foxp3מו"פ D Systems, ארצות הברית1054ג
אנטי-IFN-&GAMMA;  סנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-74108
אנטי-IL-17מו"פ D Systems, ארצות הברית  MAB317 
אנטי-Ki67 ZSGB-BIO, סין8ח5
אנטי פאן ציטוקרטין אבקאם, קיימברידג', בריטניהאילן אלכסנדר
אנטי-PD-1אבקאם, קיימברידג', בריטניהab137132
אנטי-PD-L1DAKO,דנמרק22ג3
ציוד מערך רקמות אוטומטיEstigen OU, טרטו, אסטוניהביצ'ר ATA 27מכשיר זה משמש בעיקר לבניית מיקרו-מערכי רקמות.
פתרון אחזור אנטיגן ציטראטאלאדין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ , סיןC752119
ערכת כרומין DAB AiFang ביולוגית, סיןAFIHC004
סורק פתולוגיה דיגיטליNingbo Jiangfeng ביו-אינפורמציה טכנולוגיה ושות', בע"מ, סיןKF-FL-020מכשיר זה משמש בעיקר לסריקת אימונוהיסטוכימיה ושבבי אימונוהיסטוכימיה מרובים.
פריזמה GraphPad 10תוכנת GraphPad, ארה"בגרסה 10.0.3תוכנה זו מיועדת להתוויית עקומות קפלן-מאייר (עם ניתוח סטטיסטי של יומן), הדמיית נתונים מדעיים והכנת איורים.
PBSאלאדין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ , סיןP743267
תמיסת חסימת פרוקסידאזAiFang ביולוגית, סיןAFIHC012
פולימר-HRP מצומד עז נגד עכברים/ארנב נוגדן משניAiFang ביולוגית, סיןAFIHC001
ערכת צביעה אימונופלואורסצנטית מולטיפלקס של שבעה סמנים בשישה צבעיםAiFang ביולוגית, סיןAFIHC037ערכת ריאגנטים זו מיועדת לאימונוהיסטוכימיה מרובה (mIHC)
אס.פי.אס.אסIBM Corporation, ארה"בסטטיסטיקה של IBM SPSS 27התוכנה שימשה לניתוח סטטיסטי של הנתונים.
פרויקט Rצוות הליבה של Rגרסה 4.4.1כל חבילות R, הקוד הקשור והקבצים המקוריים הועלו למסד הנתונים הציבורי.
תוכנת VISIOPHARMVisiopharm,דנמרק2025.02.2.18022 x64תוכנה זו מיועדת בעיקר לניתוח כמותי של תמונות פתולוגיות.

מקורות

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  2. Suzuki, H., et al. Long-term survival after endoscopic resection for gastric cancer: Real-world evidence from a multicenter prospective cohort. Clin Gastroenterol Hepatol. 21 (2), 307-318.e2 (2023).
  3. Ma, S., et al. Clinical application and detection techniques of liquid biopsy in gastric cancer. Mol Cancer. 22 (1), 7(2023).
  4. Ugai, T., et al. Is early-onset cancer an emerging global epidemic? Current evidence and future implications. Nat Rev Clin Oncol. 19 (10), 656-673 (2022).
  5. Wagner, A. D., et al. Chemotherapy for advanced gastric cancer. Cochrane Database Syst Rev. 8 (8), Cd004064(2017).
  6. Chao, J., et al. Assessment of pembrolizumab therapy for the treatment of microsatellite instability-high gastric or gastroesophageal junction cancer among patients in the keynote-059, keynote-061, and keynote-062 clinical trials. JAMA Oncol. 7 (6), 895-902 (2021).
  7. Lee, K. W., et al. Association of tumor mutational burden with efficacy of pembrolizumab±chemotherapy as first-line therapy for gastric cancer in the phase III Keynote-062 study. Clin Cancer Res. 28 (16), 3489-3498 (2022).
  8. Wainberg, Z. A., et al. Efficacy of pembrolizumab monotherapy for advanced gastric/gastroesophageal junction cancer with programmed death ligand 1 combined positive score ≥10. Clin Cancer Res. 27 (7), 1923-1931 (2021).
  9. Zhao, J. J., et al. Low programmed death-ligand 1-expressing subgroup outcomes of first-line immune checkpoint inhibitors in gastric or esophageal adenocarcinoma. J Clin Oncol. 40 (4), 392-402 (2022).
  10. Zhu, Q., Zhang, R., Zhao, Z., Xie, T., Sui, X. Harnessing phytochemicals: Innovative strategies to enhance cancer immunotherapy. Drug Resist Updat. 79, 101206(2025).
  11. Khosravi, G. R., et al. Immunologic tumor microenvironment modulators for turning cold tumors hot. Cancer Commun (Lond). 44 (5), 521-553 (2024).
  12. Gibney, G. T., Weiner, L. M., Atkins, M. B. Predictive biomarkers for checkpoint inhibitor-based immunotherapy. Lancet Oncol. 17 (12), e542-e551 (2016).
  13. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  14. Naidoo, J., et al. Toxicities of the anti-PD-1 and anti-PD-L1 immune checkpoint antibodies. Ann Oncol. 27 (7), 1362(2016).
  15. Yang, M., Lin, W., Huang, J., Mannucci, A., Luo, H. Novel immunotherapeutic approaches in gastric cancer. Precis Clin Med. 7 (4), pbae020(2024).
  16. Germain, C., et al. Characterization of alternatively spliced transcript variants of clec2d gene. J Biol Chem. 285 (46), 36207-36215 (2010).
  17. Boles, K. S., Barten, R., Kumaresan, P. R., Trowsdale, J., Mathew, P. A. Cloning of a new lectin-like receptor expressed on human NK cells. Immunogenetics. 50 (1-2), 1-7 (1999).
  18. Rosen, D. B., et al. Cutting edge: Lectin-like transcript-1 is a ligand for the inhibitory human nkr-p1a receptor. J Immunol. 175 (12), 7796-7799 (2005).
  19. Germain, C., et al. Induction of lectin-like transcript 1 (llt1) protein cell surface expression by pathogens and interferon-γ contributes to modulate immune responses. J Biol Chem. 286 (44), 37964-37975 (2011).
  20. Marrufo, A. M., et al. Blocking llt1 (clec2d, ocil)-nkrp1a (cd161) interaction enhances natural killer cell-mediated lysis of triple-negative breast cancer cells. Am J Cancer Res. 8 (6), 1050-1063 (2018).
  21. Germain, C., et al. Lectin-like transcript 1 is a marker of germinal center-derived B-cell non-Hodgkin's lymphomas, dampening natural killer cell functions. Oncoimmunology. 4 (8), e1026503(2015).
  22. Roth, P., et al. Malignant glioma cells counteract antitumor immune responses through expression of lectin-like transcript-1. Cancer Res. 67 (8), 3540-3544 (2007).
  23. Sanchez-Canteli, M., et al. Lectin-like transcript 1 (llt1) checkpoint: A novel independent prognostic factor in hpv-negative oropharyngeal squamous cell carcinoma. Biomedicines. 8 (12), 535(2020).
  24. Braud, V. M., et al. Expression of llt1 and its receptor CD161 in lung cancer is associated with better clinical outcome. Oncoimmunology. 7 (5), e1423184(2018).
  25. Mathewson, N. D., et al. Inhibitory CD161 receptor identified in glioma-infiltrating T cells by single-cell analysis. Cell. 184 (5), 1281-1298.e26 (2021).
  26. Guo, L., et al. Association of increased B7 protein expression by infiltrating immune cells with progression of gastric carcinogenesis. Medicine (Baltimore). 98 (8), e14663(2019).
  27. Quan, Q., et al. Expression and clinical significance of PD-L1 and infiltrated immune cells in the gastric adenocarcinoma microenvironment. Medicine (Baltimore). 102 (48), e36323(2023).
  28. Varaden, D., Moodley, J., Onyangunga, O. A., Naicker, T. Morphometric image analysis of placental c-type lectin domain family 2, member d (clec2d) immuno-expression in hiv associated pre-eclampsia. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol X. 3, 100039(2019).
  29. Chen, S., et al. B7-h3 and CD47 co-expression in gastric cancer is a predictor of poor prognosis and potential targets for future dual-targeting immunotherapy. J Cancer Res Clin Oncol. 149 (18), 16609-16621 (2023).
  30. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma. Nature. 513 (7517), 202-209 (2014).
  31. Cristescu, R., et al. Molecular analysis of gastric cancer identifies subtypes associated with distinct clinical outcomes. Nat Med. 21 (5), 449-456 (2015).
  32. Thorsson, V., et al. The immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830.e14 (2018).
  33. Tumeh, P. C., et al. Pd-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  34. Lopez De Rodas, M., et al. Biological and clinical significance of tumour-infiltrating lymphocytes in the era of immunotherapy: A multidimensional approach. Nat Rev Clin Oncol. , (2025).
  35. Myojin, Y., et al. Multiomics analysis of immune correlatives in hepatocellular carcinoma patients treated with tremelimumab plus durvalumab. Gut. , (2025).
  36. Marvel, D., Gabrilovich, D. I. Myeloid-derived suppressor cells in the tumor microenvironment: Expect the unexpected. J Clin Invest. 125 (9), 3356-3364 (2015).
  37. Sautès-Fridman, C., Petitprez, F., Calderaro, J., Fridman, W. H. Tertiary lymphoid structures in the era of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 19 (6), 307-325 (2019).
  38. Ye, Z., et al. Gastric cancer-derived exosomal let-7 g-5p mediated by serpine1 promotes macrophage m2 polarization and gastric cancer progression. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 2(2025).
  39. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  40. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  41. Xiong, S., Dong, L., Cheng, L. Neutrophils in cancer carcinogenesis and metastasis. J Hematol Oncol. 14 (1), 173(2021).
  42. Mantovani, A., Locati, M. Tumor-associated macrophages as a paradigm of macrophage plasticity, diversity, and polarization: Lessons and open questions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (7), 1478-1483 (2013).
  43. Niu, X., et al. Autophagy in cancer development, immune evasion, and drug resistance. Drug Resist Updat. 78, 101170(2025).
  44. Ikeda, H., et al. Immune evasion through mitochondrial transfer in the tumour microenvironment. Nature. 638 (8049), 225-236 (2025).
  45. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat Rev Immunol. 9 (3), 162-174 (2009).
  46. Pan, Y., et al. The protective and pathogenic role of Th17 cell plasticity and function in the tumor microenvironment. Front Immunol. 14, 1192303(2023).
  47. Smyth, M. J., et al. Perforin-mediated cytotoxicity is critical for surveillance of spontaneous lymphoma. J Exp Med. 192 (5), 755-760 (2000).
  48. Galon, J., et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313 (5795), 1960-1964 (2006).
  49. Galon, J., Bruni, D. Approaches to treat immune hot, altered, and cold tumours with combination immunotherapies. Nat Rev Drug Discov. 18 (3), 197-218 (2019).
  50. Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LLT1PD L1T CD8

מאמרים קשורים