הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה כימית בעלת תכולת מידע גבוהה במיוחד עם מיקרוסקופ קוהרנטי קוהרנטי נגד סטוקס ראמאן ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית דו-פוטונית

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68845

⸱

7 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מדגים פלטפורמת הדמיה מולטי-מודאלית המשלבת פיזור רמאן קוהרנטי נגד סטוקס בפס רחב (BCARS), פלואורסצנציה של עירור דו-פוטוני (TPEF) ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של פלואורסצנציה דו-פוטונית (2p-FLIM), המאפשרת הדמיה ביולוגית כימית בעלת תכולת מידע גבוהה במיוחד.

תקציר

ספקטרוסקופיה של טביעות אצבע של ראמאן והדמיית אורך חיים פלואורסצנטית הם כלים מתפתחים לחקר פרופילים מטבוליים של דגימות ביולוגיות. בעוד שספקטרוסקופיה של טביעת אצבע של ראמאן מזהה תנודות מולקולריות מהותיות המשקפות את ההרכב המולקולרי והסביבה הכימית של דגימה, הדמיית אורך חיים פלואורסצנטי מודדת שינויים באורך החיים במצב מעורר של פלואורופורים הרגישים לסביבות המיקרו שלהם. כאן, אנו מציגים פלטפורמת הדמיה רב-מודאלית המשלבת פיזור רמאן קוהרנטי בפס רחב נגד סטוקס (BCARS) ומיקרוסקופיה של הדמיית אורך חיים פלואורסצנטית דו-פוטונית (2p-FLIM) שיכולה לרכוש ספקטרום טביעות אצבע רמאן רלוונטי מבחינה ביולוגית ואותות אורך חיים פלואורסצנטי in vivo ובו זמנית. המידע הכימי העצום המתקבל מתמונות BCARS ו-2p-FLIM הרשומות מרחבית מאפשר לנו לאפיין את ההבדלים העדינים בין תאים תת-תאיים ולאמת את התוצאות החיוביות השגויות הפוטנציאליות שנוצרו על ידי הדמיה פלואורסצנטית בלבד. זה מודגם על ידי השוואה ישירה של אותות הקרינה של BCARS, 2p-FLIM ועירור דו-פוטוני (TPEF) המתקבלים בו זמנית מאותו אברון מוכתם בצבע ב-C. elegans החי והשלם המבטא סמן חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). בעבודה זו, אנו מציגים את ערכת ההתקנה של BCARS/2p-FLIM/TPEF, שלבי רכישת התמונה, עיבוד הנתונים ותוצאות מייצגות המראות כי שיטת ההדמיה הצולבת מאפשרת אפיון קפדני וזיהוי in vivo ברזולוציה תת-תאית. פרוטוקול זה מספק מסגרת להדמיה כימית ופלואורסצנטית בו-זמנית כדי לשפר את הדיוק של הפרשנות הביולוגית במערכות חיות מורכבות.

מבוא

אתגר אחד במחקרים ביולוגיים הוא לזהות במדויק חומרי בניין ביולוגיים במצבם הטבעי ובתוך הארכיטקטורה השלמה של תאים ורקמות. ספקטרוסקופיה של ראמאן מראה פוטנציאל חסר תקדים לאיתור מטבוליטים פנימיים ומינים כימיים בתוך דגימות ביולוגיות והוכרה לאחרונה ככלי מתפתח לפרופיל מטבולי של דגימות ביולוגיות1. על ידי ניתוח הפסגות של קבוצות מטבוליות שונות המוצגות בספקטרום טביעות האצבע של ראמאן, ראיות הולכות וגדלות מראות כי ניתן להשתמש בתכונות טביעת האצבע כדי לזהות את השלבים המוקדמים של מחלות כגון סרטן 2,3,4, הפרעות לב 5,6 ומחלות ניווניות 7,8 והיא שימושית במיוחד לטיפול בבעיות ביולוגיות בסיסיות 9,10 כולל הדמיה של מבנים תוך-תאיים ללא כל הפרעה בתיוג11, הבחנה בין מצבי תאים שונים12,13 וסיווג סוג התא 14,15,16. רוב המידע הכימי (> 90%) המקודד בספקטרום ראמאן נמצא באזור טביעות האצבע (500 עד 1800 ס"מ-1), מה שהופך אזור זה ללא ספק לשימושי ביותר להבחנה בין הרכבים כימיים בדגימות ביולוגיות17. עם זאת, אות הרמאן החלש בטווח תדרים זה הופך את היישומים של ספקטרוסקופיית טביעות אצבע של ראמאן למחקרים ביולוגיים למאתגרים, במיוחד עבור דגימות ביולוגיות חיות ושלמות1.

גישות הדמיית רמאן קוהרנטיות (CRI) מקצרות משמעותית את זמן הרכישה של אותות ראמאן, אך רובם רוכשים מקטעים ספקטרליים צרים יחסית ומותאמים לאותות מתיחת CH החזקים בין 2800 - 3100 ס"מ-1. CARS צר פס ופיזור רמאן מגורה (SRS) (איור 1A,B) משתמשים בשני פולסים של פיקו-שנייה, בדרך כלל כדי לרכוש חלק צר של אות CH החזק 18,19,20,21,22,23. גישות CRI מרובות, כגון CARS מרובה (איור 1C), משתמשות בשילוב של פולסים של פיקו-שנייה ו-~100 fs כדי להשיג טווח ספקטרלי בינוני (בדרך כלל ≤-400 ס"מ-1) בדרך כלל באזור CH 24,25,26,27,28,29,30. רכישת ספקטרום רמאן שלם רלוונטי ביולוגית (מ-600 - 3200 ס"מ-1) לפיקסל באמצעות גישות הדמיה אלה היא בדרך כלל אסורה מכיוון שרוב אותות טביעות האצבע חלשים פי 10-100 מאותות מתיחת CH31. בניגוד לרוב גישות ה-CRI, פיזור קוהרנטי קוהרנטי של פס רחב נגד סטוקס רמאן (BCARS) מותאם לרכישת פס רחב בזריקה אחת המכסה את טביעת האצבע ואזורי מתיחת CH 31,32,33. BCARS משתמש באינטראקציות תוך-פולסים של פולס fs ~10 כדי לעורר ביעילות רעידות בתדר נמוך (טביעת אצבע) (איור 1D), ומשתמש באותו מנגנון כמו Multiplex CARS, השילוב של פולס fs עם פולס ps כדי ליצור קוהרנטיות רטט באזור מתיחת CH (איור 1C)32,33. יתר על כן, אותות ה-BCARS מכוילים באופן מהותי בשל האינטראקציה שלהם עם הרקע הלא-תהודה (NRB), וכתוצאה מכך ספקטרום רמאן מלא כמותי ובלתי משתנה לכל פולס לייזר בכל פיקסל31, עם יכולת להשיג במהירות נתונים בעלי תכולת מידע גבוהה מתאים, רקמות שלמות ואורגניזמים ביולוגיים חיים 32,34,35,36,37,38,39.

ספקטרום ה-BCARS הגולמי הנרכש מכיל מה שנקרא "רקע לא תהודה" (NRB). ה-NRB הוא התרומה של התגובה האלקטרונית לפולסי הלייזר שאינה ספציפית מבחינה כימית. ה-NRB מפריע באופן קוהרנטי לאות התהודה הרטט, ופועל כמגבר הטרודין32. ה-NRB גם מעוות את ספקטרום הרמאן הבסיסי (איור 2A), אך ניתן לאחזר את ספקטרום הרמאן כל עוד נרכשים מקטעים ספקטרליים רציפים משמעותיים. נכון לעכשיו, אין שיטת עיבוד לאחר זמינה להפרדת אות ה-CARS התהודה מהרכיב הלא-תהודה באמצעות גישת CARS צרת פס. ניתן להשיג אחזור אות רמאן מאותות CARS בפס רחב על ידי שימוש ביחסי קרמרס-קרוניג (או התמרת הילברט)33,40 (איור 2B), אנטרופיה מקסימלית41,42, או למידת מכונה 43,44,45,46,47,48 גישות. שימו לב ששתי השיטות הראשונות מאחזרות באופן אנליטי את הפאזה (אות ה-Raman המהדהד) מספקטרום ה-BCARS הגולמי, גישות למידת המכונה יכולות להיות תלויות מאוד במכשור ובמודלים של האימון.

בעוד שמיקרוסקופ BCARS מאפשר אפיון ללא תווית של פרופיל מטבולי של דגימות ביולוגיות, אותו לייזר סופר-רציף (950 - 1200 ננומטר עבור מערך ה-BCARS המוצג בעבודה זו) המשמש ליצירת אותות BCARS יכול גם לרגש מגוון רחב של צבעים, כגון צבעים מבוססי רודמין, מבוססי בודיפ, מבוססי אלקסה פלואור וציאנין, וחלבונים פלואורסצנטיים שונים, כולל GFP ו-mCherry49, 50. בהשוואה לעירור פוטון יחיד באמצעות לייזרי גל רציף גלוי (CW), מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב-פוטוני, כגון מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של פלואורסצנציה דו-פוטונית (2p-FLIM) ומיקרוסקופ פלואורסצנטי עירור דו-פוטוני (TPEF), שימוש באור אינפרא אדום קרוב (NIR) מציע עומק חדירת דגימה עמוק יותר, יכולת חיתוך תלת מימדית מהותית, תמונות בעלות ניגודיות גבוהה ורזולוציה טובה בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית חדישה, מה שהופך אותו לכלי אטרקטיבי לביולוגי מחקר51,52. מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של הקרינה (FLIM) באמצעות גישת ספירת פוטונים בודדים בקורלציה בזמן (TCSPC) מזהה את אותות הדעיכה הקרינה הנרגשים שוב ושוב על ידי מקור לייזר מאופנן זמן53,54. ספקטרום הקרינה של פלואורופור נתון עשוי להשתנות עם גורמים סביבתיים כגון קוטביות ממס, אך שינויים אלה הם בדרך כלל עדינים. מצד שני, אורך החיים הקרינה משתנה לעתים קרובות לפי גורמים של שניים או יותר עם שינויים סביבתיים כגון ערכי pH55, צמיגות56, קוטביות57 וריכוז מינים יוניים58,59, אינטראקציות קשירה, נוכחות של מרווה או שינויים מבניים53,54. תכונה ייחודית זו של אורך החיים הקרינה מספקת ניגודיות אות נוספת בהדמיה פלואורסצנטית וטיפלה בהצלחה בבעיות של הפרעות אוטופלואורסצנטיות בהדמיית תאים ורקמות60, פירוק ערבוב פלואורופורים מרובים באמצעות גישת FLIM שנפתרה ספקטרלית61, אבחון סרטן וניטור טיפול62, זיהוי ללא תווית של הטרוגניות תאית63 ושינויים מטבוליים64,65.

בעבודה זו, אנו מציגים פלטפורמת הדמיה רב-מודאלית המשלבת BCARS, 2p-FLIM ו-TPEF. למיטב ידיעתנו, זו הפעם הראשונה שמציגה פלטפורמת הדמיה המאפשרת הדמיית BCARS ו-2p-FLIM/TPEF בו זמנית. אנו מדגימים את יכולות ההדמיה in vivo של מכשיר זה באמצעות אורגניזם מודל הניתן לעיבוד גנטי בשימוש נרחב, Caenorhabditis elegans (C. elegans). אנו מראים כי ספקטרום ה-BCARS, דעיכת 2p-FLIM של אדום הנילוס (צבע שומנים חיוני), ואותות GFP פלואורסצנטיים דו-פוטוניים של סמן שומנים מדווח (DHS-3::GFP) יכולים להיות נרכשים בו זמנית in vivo מתולעים מוכתמות באדום הנילוס. מדריך מעשי לגישת ההדמיה המוצג כאן כולל (i) הדגימה צריכה להיות שקופה אופטית ובעובי בדרך כלל פחות מ-100 מיקרומטר; (ii) מצב הצביעה יכול להיות שונה בהתאם לצבעים ולדגימות. בתוצאות צביעת הנילוס-אדום של C. elegans המוצגות כאן, ריכוז אדום הנילוס הוא ברמת ~μM, וזמן הצביעה יכול לנוע בין כמה שעות ללילה66; (iii) נדרשת דגימה חשוכה נדרשת סביבה כדי למנוע דליפת אור נראה לגלאי 2p-FLIM/TPEF. תנאי הדמיה אלה זהים לתנאי ההדמיה של רוב המיקרוסקופיה האופטית והפלואורסצנטית הלא ליניארית. בנוסף, ניתן ליישם את המערכת שלנו המודגמת כאן כדי לזהות צבעים אחרים ומדווחים פלואורסצנטיים בנוסף לאדום הנילוס ו-GFP על ידי הצגת לייזר Ti:Sapphire fs נוסף המכסה טווח של 700 -950 ננומטר עבור עירור הקרינה של שני פוטונים. לפיכך, בעוד שהתוצאות המייצגות המתוארות בפרוטוקול זה הן הדמיה in vivo של C. elegans מוכתמים בצבע המבטאים GFP, לפלטפורמת ההדמיה הביולוגית הכימית בעלת תכולת המידע הגבוהה במיוחד יש יישומים רחבים ומרחיקי לכת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ג . הכנת דגימות elegans וצביעה חיונית של הנילוס האדום

הערה: C. elegans שימש רבות לטכניקות הדמיה מרובות בשל השקיפות שלו בכל הגוף. ניתן לדמות בקלות את האיברים והרקמות הפנימיים בבעל החיים השלם ללא דיסקציה. בנוסף, אישור אתי אינו נדרש למחקר הכולל C. elegans, מכיוון שהם אינם נחשבים לחולייתנים ואינם כפופים לאותן תקנות אתיות כמו בעלי חיים גבוהים יותר כמו מכרסמים. חלק זה מתאר את הסנכרון של תולעי C. elegans והכנת דגימות מוכתמות באדום הנילוס להדמיה פלואורסצנטית. תולעים בוגרות מסונכרנות ליום אחד מתקבלות באמצעות פרוטוקול הטלת ביצים דו-דורי ומוכתמות באמצעות צלחות נילוס אדום-OP50 טריות.

  1. שמור על זני C. elegans (למשל, N2, LIU1 ldrIs1 [dhs-3p::d hs-3::GFP + unc-76(+)]) על צלחות סטנדרטיות של מדיום גידול נמטודות (NGM) שנזרעו עם חיידקי OP50 ב-20 מעלות צלזיוס.
  2. סנכרון התולעים
    1. בחר 10-20 תולעים בוגרות על צלחת NGM טרייה עם זרעי OP50.
    2. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 1-3 שעות כדי לאפשר הטלת ביצים.
    3. הסר את כל התולעים הבוגרות והשאיר רק את הביצים הטריות שהוטלו על הצלחת.
    4. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שהתולעים מגיעות לשלב הבוגר של יום אחד.
    5. חזור על השלבים לעיל לדור נוסף כדי לשפר את דיוק הסנכרון.
  3. הכן את תמיסת המלאי האדום של הנילוס
    1. ממיסים 15.92 מ"ג של נילוס אדום ב-10 מ"ל של DMSO לריכוז סופי של 5 מ"מ.
    2. יש לבצע סוניקציה למשך 10-30 דקות במידת הצורך כדי לסייע בהתמוססות.
  4. הכן צלחות מכתים Nile Red-OP50.
    1. ערבבו היטב את תמיסת חיידקי OP50 עם ציר הנילוס האדום כדי להשיג ריכוז סופי של 5 מיקרומטר לכל צלחת NGM. לדוגמה, ערבבו 10 מיקרוליטר של ציר הנילוס האדום עם 20 מיקרוליטר OP50 תמיסת חיידקים, ולאחר מכן מרחו מיד את כל התערובת על צלחת אגר NGM לא זרועה של 6 ס"מ (עם נפח ~10 מ"ל) כדי ליצור ריכוז סופי של אדום הנילוס של 5 מיקרומטר לכל צלחת NGM.
    2. מורחים את התערובת באופן שווה על צלחות NGM בגודל 6 ס"מ ללא זרעים.
    3. אחסן צלחות בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה כדי לאפשר צמיחת חיידקים וספיגת צבע.
  5. כתמים תולעים מסונכרנות
    1. העבירו 30-50 תולעים בוגרות מסונכרנות ליום אחד על כל צלחת מוכנה של הנילוס האדום-OP50.
    2. דגרו את התולעים בחושך בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות לפני ההדמיה.
  6. לשתק תולעים להדמיה
    1. מרחו טיפה של 100 מ"מ נתרן אזיד על כרית אגרוז 2% על שקופית מיקרוסקופ (כ-10-15 מיקרוליטר עבור 20 תולעים)
    2. מעבירים תולעים מוכתמות לטיפה של חומר ההרדמה (סודיום אזיד) ומכסים את התולעים בכיסוי לפני המיקרוסקופיה.
      הערה: כאשר קוטפים 10-20 בוגרים על צלחת NGM OP50 טרייה בשלב הראשון של סנכרון הטלת הביצים, בחרו רק את הבוגרים, אך לא ביצים או זחלים תועים. זאת כדי לוודא שכל הביצים הנותרות על הצלחות מיוצרות על ידי התולעים שנקטפו בחלון הזמן של 1-3 שעות להטלת ביצים. בנוסף, נתרן אזיד מסווג כחומר מסוכן, אם כי הוא דורש כמות קטנה מאוד להרדמת נמטודות. השימוש והסילוק של פסולת נתרן אזיד חייבים לפעול בהתאם להנחיות המחלקה לבריאות ובטיחות סביבתית מוסדית.

2. יצירת קרן בדיקה

הערה: פרוטוקול זה מתאר את יצירת קרן הבדיקה של פיקו-שנייה (ps) באמצעות מתנד פרמטרי אופטי (OPO) שנבנה בבית ואחריו דור הרמוני שני (SHG) עם מערכת לולאת משוב אותות ביתית כדי לייצב את הספק המוצא של קרן הבדיקה.

  1. הפעל את לייזר משאבת OPO 1030 ננומטר (איור 3A או לייזר משאבת OPO קרוב ל-1ps, ~ 3 W המוצג באיור 4) ואפשר לפחות שעתיים לשיווי משקל תרמי. תפוקה יציבה היא קריטית לפעולת OPO.
  2. הנח את הפלט לחלל OPO
    1. בחר את תקופת הפולינג המתאימה על גביש OPO PPLN (איור 3A) כדי להתאים לאורך גל אות היעד.
    2. כוונו את האלומה לתוך המראה המעוקלת הראשונה (CM) (איור 3A), היוצרת חלק מחלל ליניארי.
    3. ודא שהקרן עוברת דרך גביש ליתיום ניובט (PPLN) עם עמוד מעת לעת (איור 3A) כדי להקל על המרה אופטית פרמטרית כלפי מטה (איור 3B).
    4. ודא שהקרן משתקפת ממראה מעוקלת שנייה (CM) ולאחר מכן ממראה הקצה (EM) (איור 3A) כדי ליצור את לולאת החלל.
    5. הגדר את מצמד היציאה (OC) (איור 3A) כדי לחלץ את אלומת האות שנוצרה מהחלל.
  3. כוונן את הטמפרטורה של גביש OPO PPLN באמצעות בקר הטמפרטורה (TC) (איור 3A) כדי לבחור את אורך גל האות. אורך גל אות טיפוסי הוא 1530 ננומטר, המתאים להספק יציאה של כ-0.8 וואט בשאיבה עם 3 וואט ב-1064 ננומטר.
  4. אופטימיזציה של יישור OPO
    1. התאם את המיקום וההטיה של שני CMs ו-EM כדי למקסם את הספק הפלט ואיכות האלומה.
    2. התאם את אורך החלל כדי להעביר את ספקטרום האותות לתדר הרצוי.
  5. נתב את אלומת האות של OPO דרך סט של אופטיקה קולימציה ומיקוד והנח אותה לשלב ה-SHG.
    1. בחר את תקופת הפולינג המתאימה על גביש SHG PPLN (איור 3A) כדי להתאים לאורך גל אות היעד.
    2. שלוט במדויק בטמפרטורת הגביש באמצעות בקר טמפרטורה כדי למקסם את יעילות ה-SHG.
    3. כוונו את האלומה לתוך גביש SHG PPLN עבור דור הרמוני שני, תוך המרת אות OPO של 1530 ננומטר ל-765 ננומטר (איור 3C). יעילות ההמרה האופיינית של SHG היא כ-30% בתנאי יישור אופטימליים.
    4. הכנס מסנן מעבר קצר של 1300 ננומטר (SPF באיור 3A, מפרטים בטבלת החומרים) לאחר ה-SHG PPLN כדי להסיר שאריות אור בסיסי של 1530 ננומטר.
    5. קולימציה של אלומת 765 ננומטר המתקבלת באמצעות עדשה מתאימה (כמו L באיור 3A).
  6. יישם ייצוב כוח
    1. השתמש בחלון טריז (WW) כדי לדגום את אלומת ה-SHG ולכוון אותה לפוטו-דיודה (PD).
    2. ודא שלולאת משוב משווה את אות הפוטו-דיודה (PD באיור 3A) לערך ייחוס ומפעילה את ה-Picomotor במראה הקצה (EM) כדי לכוונן את אורך חלל ה-OPO בזמן אמת, ובכך לייצב את הספק הפלט SHG.
      הערה: כדי לקבוע את ערך הייחוס, סרוק תחילה את מיקום ה-EM באמצעות ה-Picomotor תוך הקלטת הספק הפלט של SHG. זהה את עוצמת השיא בפרופיל זה, ולאחר מכן הגדר את ערך הייחוס ל-90% מהשיא. בחירה זו מבטיחה כיוון ברור של תיקון משוב, המאפשר למערכת לפצות על מגמות עלייה וירידה בהספק ומייצב ביעילות את הספק היציאה לאורך זמן.

3. יצירת Supercontinuum (SC) עבור BCARS

הערה: התוכנית הפשוטה של מערכת רב-מודאלית מבוססת BCARS מוצגת באיור 4. פרוטוקול זה מתאר את יצירת קרן ה-SC.

  1. כוונן את הציוץ המקדים (פיזור עיכוב קבוצתי, GDD) ליציאת הדופק הפמטו-שנייה (fs) (1030 ננומטר, 150 fs, ~1 W) כדי לקבל רוחב פס SC רחב מספיק המכסה את אותות אזור טביעות האצבע (רוחב פס SC ≥ 1800 ס"מ-1). השג זאת על ידי התאמת ההפרדה של זוג סורגים (ראה איור 4), המאפשר שליטה מדויקת על הפיזור.
    הערה: היישום של GDD מקוזז מראש הוא חיוני ליצירת הפולס הרצוי ולאופטימיזציה של יצירת SC. ערך ה-GDD הנדרש עשוי להשתנות בהתאם למאפיינים הספציפיים של מערכת הלייזר בה נעשה שימוש.
  2. שלב טלסקופ קרן המורכב משתי עדשות עם אורכי מוקד זהים כדי להתאים את הסטייה של קרן המשאבה.
    הערה: כאשר הקרן עוברת על פני מטרים לפני שהיא נכנסת לסיב המתרחב, שליטה מדויקת בסטיית הקרן הופכת חיונית. שמירה על אלומה מקולמת במהלך מרחק זה היא קריטית כדי להבטיח יצירת SC יעילה.
  3. הגדר את היישור האוטומטי (איור 4) באמצעות תושבות מראה קינמטיות המצוידות במפעילי פייזו עבור היגוי אלומה. שלב אותם עם טריזים אופטיים וגלאי חישת מיקום (PSD) כדי לנטר ולתקן באופן פעיל את יישור האלומה.
  4. מקם את הרכיבים כך שהמרחק מהטריז למראה הראשונה יהיה שווה למרחק מהטריז ל-PSD הראשון. תצורה סימטרית זו מבטיחה יציבות מצביעה על הקרן לתוך הסיב המתרחב.
    הערה: יישור פעיל חיוני למקסום יעילות ההרחבה הספקטרלית ולמזעור הסיכון לנזק לכניסת סיבים.
  5. השתמש בצלחת חצי גל (HWP) ובמפצל קרן מקטב (PBS) כדי לשלוט בעוצמת הלייזר לפני הצימוד לסיב. סובב את ה-HWP כדי להתאים את זווית הקיטוב ביחס ל-PBS, ובכך לכוונן את הכוח המשודר. בעוד שרכיבים אלה אינם מוצגים באיור 4, הם קריטיים עבור יישור בטוח ובקרת הספק.
  6. חבר כ-1 וואט של עוצמת לייזר לסיב גביש פוטוני (PCF) בגודל 10 ס"מ (LMA-PM-5) באמצעות מצמד סיבים. הליך הצימוד הוא כדלקמן:
    1. ראשית, הפחת את עוצמת הלייזר ל-~20-50 mW במהלך היישור הראשוני כדי למנוע נזק לסיב.
    2. כוון את הקרן הקולימית לתוך הסיב, וודא שחלק מהאור יוצא מהצד השני. בצע אופטימיזציה של נתיב האלומה על ידי התאמת מיקומו כדי למקסם את הספק המוצא.
    3. הכנס את העדשה האספרית (איור 4), כוונן שוב את האלומה כדי למקסם את הספק היציאה.
    4. כוונן את מיקום ה-z של העדשה האספרית כדי להבטיח מיקוד מדויק על פן הסיבים.
    5. חזור על התאמות היישור והמיקוד באופן איטרטיבי כדי למקסם את יעילות הצימוד.
    6. הגדל את עוצמת הלייזר ל-1 וואט להפעלה.
  7. קולימציה של פלט הסופר-רצף בפס רחב (SC) המתקבל מה-PCF באמצעות מראה פרבולית מחוץ לציר (OAP) עם אורך מוקד f = 15 מ"מ, כפי שמוצג באיור 4.
    הערה: אופטיקה רפלקטיבית, כגון מראת OAP, מועדפת על קורות פס רחב כדי למזער סטייה כרומטית המוכנסת על ידי אלמנטים שבירה.
  8. הנח את יציאת הסופר-רצף בפס-רחב (SC) קולימציה לתוך מדחס פריזמה (איור 4) המורכב מזוג מנסרות Schott Flint (SF10).
    1. כוון את קרן ה-SC לקודקוד המנסרה הראשונה כדי ליזום פיזור ספקטרלי.
    2. מקם את המנסרה השנייה כך שהקרן המפוזרת תיכנס דרך קודקודה.
    3. התקן את שתי המנסרות על מערכת מסילות כדי לאפשר התאמה גסה של הפרדת הפריזמה. תרגם את המנסרה השנייה לאורך המסילה כדי להתאים את אורך הנתיב האופטי ואת הדחיסה הכוללת. ההפרדה למערכת זו היא 44 ס"מ.
    4. הרכיב את הפריזמה הראשונה על שלב תרגום ליניארי מדויק. התאם את עומק ההכנסה של המנסרה הראשונה כדי לכוונן את פיצוי הפיזור.
    5. התאם באופן איטרטיבי הן את הפרדת המנסרה והן את אורך ההחדרה של המנסרה השנייה כדי להשיג דחיסה זמנית אופטימלית של דופק ה-SC. קבע את הדחיסה הזמנית האופטימלית על ידי התאמת אות הערבוב המנוון של ארבעה גלים (DFWM) שנצפה בניסוי לתוצאות מדומות הלוקחות בחשבון פיזור עיכוב קבוצתי (GDD) ופיזור מסדר שלישי (TOD). גישה זו כוללת ביצוע סימולציה של תהליך יצירת הסופר-רצף, תוך שילוב ההשפעות של GDD ו-TOD, המספק התייחסות למאפיינים הזמניים והספקטרליים הצפויים של פולסי ה-SC הדחוסים בצורה אופטימלית. לאחר מכן, התאם באופן איטרטיבי את פרמטרי מדחס המנסרה כדי לפצות על ה-GDD וה-TOD הקיימים במערכת עד שאות ה-DFWM הניסיוני יתאים לתחזיות הסימולציה. תוצאה אופיינית של הפרופיל הספקטרלי של ה-SC מוצגת באיור 5.
      הערה: פיצוי פיזור נכון משפר את הקוהרנטיות הספקטרלית של ה-SC. תחת יישור אופטימלי, ליציאת SC יש הספק של כ-150 mW, אורך גל מרכזי סביב 1060 nm, ומשתרע על פני תחום ספקטרלי מ-950 עד 1200 ננומטר (המקביל ל-1800 ס"מ-1). ערכים אלה עשויים להשתנות מעט בהתאם ליישור וליעילות צימוד הסיבים.
  9. שלב את אלומות הבדיקה והסופר-רצף באמצעות מראה דיכרואית (ראה DM באיור 4). יישר אותם עם זוג חורים כדי להבטיח ששתי הקורות יהיו ליניאריות. מקד את הקרניים המשולבות על פוטו-דיודה בתדר גבוה (רוחב-פס של 1 GHz). לאיכות אות אופטימלית, יש לחפוף את שתי הקרניים הן בתחום המרחבי והן בתחום הזמן. התהליך הוא כדלקמן:
    1. כוון את היציאה מהפוטו-דיודה לאוסילוסקופ בתדר גבוה (רוחב-פס MHz 500). השתמש בהדק הלייזר כשעון הייחוס.
    2. חסום את קרן הגשושית ומדוד את פעימות ה-SC. רשום את ההבדלים הזמניים בין פולסי ה-SC לבין הפניה ללייזר.
    3. חסום את קרן ה-SC ומדוד את פעימות הבדיקה. כוונן את קו ההשהיה המכני (כפי שמוצג באיור 4) כך שפולסי הבדיקה חופפים לפולסי ה-SC בזמן. ודא ששתי הקורות מגיעות למקסימום שלהן בו זמנית.
    4. הסר את הפוטו-דיודה ותן לקרן להמשיך לתוך המיקרוסקופ.
      הערה: השלבים לעיל מתארים התאמה גסה לחפיפת קורות. אופטימיזציה נוספת ליישור מדויק יותר מכוסה בשלבים 6.1 עד 6.9.

4. הגדרת זיהוי הקרינה עבור 2p-FLIM ו-TPEF והכנסת לייזר Ti:Sapphire fs נוסף

  1. הפעל את לייזר Ti:Sapphire ואפשר לו להגיע לשיווי משקל תרמי. המתן כשעתיים כדי להבטיח הספק פלט יציב והצבעה על האלומה.
    הערה: במחקר זה, הדמיית TPEF ו-FLIM בוצעה באמצעות מקור SC, המספק כיסוי ספקטרלי רחב והספק מספיק לפלואורופורים כגון GFP ואדום הנילוס. לייזר Ti:Sapphire כלול במערכת כמקור עירור אופציונלי לפלואורופורים עם שיאי ספיגה של שני פוטונים מתחת ל-950 ננומטר, שאולי לא יתרגשו ביעילות על ידי ה-SC.
  2. הפעל את מנגנון נעילת המצב בלייזר Ti:Sapphire. אשר נעילת מצב יציבה באמצעות הצג המובנה.
  3. ציוץ מראש את פולסי Ti:Sapphire לדחיסה זמנית אופטימלית בדגימה באמצעות מדחס פריזמה. סדר את המנסרות בתצורה דומה לזו המתוארת בשלב 3.8 והתאם את אורך ההכנסה של המנסרה השנייה כדי לכוונן את משך הדופק.
    הערה: דחיסה זמנית נכונה מבטיחה עוצמת שיא ועירור דו-פוטוני יעיל במישור הדגימה.
  4. (אופציונלי) חבר את קרן Ti:Sapphire לסיב במצב יחיד השומר על קיטוב אם הלייזר ממוקם על שולחן אופטי נפרד. כוונן את אופטיקת צימוד הקלט ונטר את תפוקת הסיבים כדי למזער את הפסדי הצימוד.
  5. שלב את אלומת Ti:Sapphire עם הסופר-רצף (SC) ואלומות בדיקה באמצעות מראה דיכרואית (ראה את נקודת השילוב ב-PBS המוצגת באיור 3). יישר את הקורות בזהירות כדי להבטיח חפיפה מרחבית בדיכרואיקון והתפשטות משותפת לכיוון המיקרוסקופ.
  6. הנח את הקרניים המשולבות למיקרוסקופ וכוונן את החפיפה המרחבית שלהן. השתמש בדגימה פלואורסצנטית (למשל, שקופית עם חרוזי פוליסטירן פלואורסצנטיים של 1 מיקרומטר) כדי לאמת את היישור של קרן Ti:Sapphire ביחס לנתיב העירור של BCARS. כוונן את מראות היישור Ti:Sapphire כדי להבטיח שפליטת הקרינה ממוקמת במקביל לנקודת המוקד של BCARS באותו שדה הדמיה. אשר את הקולוקליזציה על ידי הדמיית החפיפה בין תמונות BCARS ו-TPEF המתקבלות בו זמנית, כאשר ההיסט המרחבי צריך להיות פחות מפיקסל אחד.
    הערה: השגת חפיפה מרחבית בין אותות פלואורסצנטיים ואותות BCARS חיונית לרישום תמונה רב-מודאלית.
  7. הכנס מראה דיכרואית לפני כניסת המיקרוסקופ כדי לשקף פלואורסצנטיות מפוזרת לאחור לעבר נתיב הזיהוי. בחר דיכרואי עם אורך גל חיתוך מתאים כדי להפריד ביעילות את הקרינה מאלומות העירור.
  8. הכנס מראה דיכרואית שנייה במורד הזרם בנתיב הפליטה כדי לפצל את אות הקרינה לשני ענפי זיהוי:
    1. שדר אורכי גל ≥ 550 ננומטר לגלאי FLIM.
    2. אורכי גל מחזירים ≤ 550 ננומטר לכיוון שפופרת מכפיל פוטו (PMT) לזיהוי פלואורסצנטיות נרגשת אנלוגית של שני פוטונים (TPEF).
      הערה: התקן מסנני פס פס בכל ענף זיהוי כדי לחסום אור עירור שיורי ולבודד פסי פליטה ספציפיים.
  9. חבר את פלט ה-PMT לקדם-ampחיים והזין את האות האנלוגי המוגבר להתקן רכישת נתונים (DAQ). שתף את טריגר הסנכרון הגלובלי ממערך השערים הניתן-לתכנות בשטח (FPGA) עם ה-DAQ כדי להבטיח יישור זמני על פני אופני הדמיה (איור 7).
  10. חבר את יציאת גלאי FLIM למודול ספירת פוטונים בודדים (TCSPC) בקורלציה לזמן.
    1. חבר את אות גלאי FLIM לכניסת ההתחלה של מודול TCSPC.
    2. חבר את פלט הסנכרון של לייזר Ti:Sapphire (או BCARS SC) לכניסת הייחוס של מודול TCSPC.
    3. חבר את הדק המצלמה הגלובלי (שנוצר על ידי ה-FPGA) לכניסת סנכרון המסגרת של מודול TCSPC כדי לסנכרן עם רכישת תמונה סרוקה.

5. הגדרת נתיב זיהוי BCARS

הערה: פרוטוקול זה מתאר הגדרת נתיב זיהוי נסרק עבור הדמיה היפרספקטרלית של סריקת קו. מראת הגלבו החד-ממדית סורקת את אלומת העירור לאורך ציר ה-y עם זמן השתהות של 2-4 אלפיות השנייה לפיקסל לשילוב אות מספיק. לאחר כל סריקת קו, שלב הדגימה מתקדם צעד אחד לאורך ציר ה-x. ביטול סריקה באמצעות מראת galvo משנית מסונכרנת חיוני לשמירה על רישום מרחבי עקבי של האות הספקטרלי במצלמה במהלך סריקת אלומה מהירה, ביטול הצלבת אות בין פיקסלים סמוכים ושמירה על נאמנות מרחבית-ספקטרלית39.

  1. הכניסו את הסופר-רצף (SC) ואת אלומות הבדיקה לסורק גלבו חד מימדי (1D) (כפי שמוצג באיור 4 ופרטים נוספים בהתייחסות39). מקם את מראת ה-galvo המצומדת לצמצם האחורי של אובייקט המיקוד כדי לאפשר סריקת אלומה מדויקת על פני שדה הראייה.
  2. הרחב כל אלומה באמצעות מרחיב אלומה רפלקטיבי (כפי שמוצג באיור 4) כך שיתאים לצמצם האחורי של מטרת העירור. זה מבטיח מיקוד אופטימלי ורזולוציה מרחבית מקסימלית במישור הדגימה.
    הערה: השתמש באופטיקה רפלקטיבית כדי למזער סטייה כרומטית ולשמור על התוכן הספקטרלי בפס רחב של קרן SC.
  3. מקם יעד יישור במישור הצמצם האחורי של מטרת העירור. כוונן את אלומות ה-SC והבדיקה כך ששתיהן יעברו דרך מרכז המטרה, תוך הבטחת יישור משותף לאורך הציר האופטי.
    הערה: חפיפה מרחבית מדויקת ממקסמת את עוצמת האות של BCARS ומבטיחה רזולוציה מרחבית מקסימלית בנקודת המוקד.
  4. מקד את הקרניים על הדגימה באמצעות אובייקט עירור NA גבוה (למשל, 1.2 NA, מטרת טבילה במים פי 60) המותקן על מיקרוסקופ הפוך.
  5. הכן דגימת יישור על ידי סנדוויץ' טיפת מים בין שני כיסויים ליצירת שקופית מיקרוסקופ אטומה. הנח את השקופית המוכנה על המיקרוסקופ stage והתאם את המיקוד כדי להביא את הדגימה לתצוגה.
  6. אסוף את האות שנוצר נגד סטוקס בשידור באמצעות מטרת איסוף הממוקמת מול נתיב העירור.
  7. יישם מערכת סריקה 4f (כפי שמוצג באיור 4) כדי לשמר מיפוי מרחבי של האות נגד סטוקס על שורות קבועות של הגלאי.
    1. העביר את מישור המוקד האחורי (BFP) של מטרת האיסוף על ציר מראת הסריקה של galvo באמצעות מערכת אופטית 4f. זה מורכב משתי עדשות צינור מדויקות (ראה טבלת חומרים), המסודרות כך:
      1. העדשה הראשונה ממוקמת באורך מוקד אחד (200 מ"מ) לאחר ה-BFP של מטרת האיסוף.
      2. העדשה השנייה ממוקמת באורך מוקד אחד לפני מראת הגאלבו.
    2. סנכרן את גלבו הסריקה עם גלבו הסריקה באמצעות מחולל צורות גל מבוקר FPGA.
    3. שלב פוטנציומטר דיגיטלי של 7 סיביות במערכת הבקרה FPGA כדי לאפשר התאמה של משרעת ה-galvo של הסריקה.
      הערה: מראת הסריקה מפצה על הסטיות הזוויתיות שהוצגו על ידי גלבו הסריקה הראשוני. על ידי התאמה דינמית של הזווית שלו בסנכרון, הוא מנטרל את תנועת האלומה, ומבטיח שהאות נגד סטוקס יישאר מיושר לאורך הציר האופטי המוביל לספקטרומטר. ייצוב זה חיוני לשמירה על רישום מרחבי בגלאי ולמניעת תזוזה רוחבית של התמונה הספקטרלית במהלך הסריקה.
  8. הגדר את מערכת ה-FPGA (ראה טבלת חומרים) לסנכרון סריקת galvo והפעלת המצלמה.
    1. צור יציאות אנלוגיות עבור גלבו הסריקה והסריקה.
    2. קבל טריגר של שלב קלט כדי לסמן את ההתחלה של כל סריקת שורה.
    3. לכידת מסגרת פלט אותות טריגר למצלמת מתכת-תחמוצת-מוליכים למחצה (sCMOS) המדעית המשלימה בכל עמדת סריקה.
    4. שליטה עצמאית במשרעת הסריקה כדי להתאים למטרות איסוף שונות.
      הערה: רכבת דופק FPGA טיפוסית כוללת אות כונן galvo סורק, אות כונן galvo לסריקה, כניסת טריגר Stage ושעון פיקסלים לתזמון פריימים מסונכרן.
  9. העבירו את האות הקולימציה נגד סטוקס דרך שני מסננים קצרים כדי לחסום את המשאבה השיורית ואור העירור SC.
  10. מקד את אות האנטי-סטוקס המסונן דרך חריץ הכניסה של הספקטרומטר ואל גלאי ה-sCMOS. כוונן את הזוויות של גלבו הסריקה וביטול הסריקה כדי להבטיח שהקרן נסרקת במקביל לציר הארוך של החריץ, תוך יישור מישור התמונה האופטי עם החריץ. יישור מדויק זה ממקסם את הרזולוציה הספקטרלית וממזער את הצלבת האותות הרוחביים על פני שורות הגלאי.
  11. הגדר את הספקטרומטר כך שיפזר את הספקטרום נגד סטוקס אנכית לאורך שורות המצלמה. בחר סורג מתאים (למשל, 300 קווים/מ"מ, בוהק ב-700 ננומטר) לכיסוי ספקטרלי אופטימלי.

6. אופטימיזציה של אותות וכיול רזולוציה ספקטרלית

  1. הפעל את תוכנת הרכישה הביתית והתחל בניטור אותות בזמן אמת ממצלמת sCMOS. תוכנת הרכישה נבנתה בבית ב-Python 3.8+ (Windows 10) עם תלות הכוללת מנהלי התקנים של Hamamatsu DCAM-API ו-Measurement Computing Universal Library, המוציאה נתונים בפורמט HDF5. התוכנה זמינה על פי בקשה סבירה מהמחבר המתאים.
  2. הכן דגימת כיול ספקטרלית על ידי הנחת טיפת בנזוניטריל בין שני כיסויים ליצירת שקופית אטומה. הנח את השקופית על במת המיקרוסקופ והביא אותה למיקוד באמצעות מטרת העירור.
  3. אתר את אות ה-BCARS במצלמת sCMOS. התאם את מיקום ה-z של מטרת האיסוף כדי למקסם את עוצמת האות נגד סטוקס.
  4. התאם את המיקום הרוחבי של מטרת האיסוף כדי להבטיח שהאור נגד סטוקס ממוקד כהלכה דרך חריץ הכניסה של הספקטרומטר. יישור זה מבטיח צימוד אופטימלי לספקטרומטר ונאמנות ספקטרלית משופרת.
  5. מטב את החפיפה המרחבית בין הסופר-רצף (SC) לאלומות הבדיקה במישור הדגימה. השתמש במראות בנתיב אלומת הגשושית כדי להתאים בעדינות את מיקומו הרוחבי ואת זווית האירוע.
  6. תרגם את קו ההשהיה האופטי בנתיב אלומת הגשושית כדי להבטיח חפיפה זמנית עם פולסי ה-SC. עקוב אחר עוצמת האות והתאם עד שהאות נגד סטוקס מקסימום, ומאשר סנכרון זמני תקין.
  7. זהה שיא רמאן חזק וחד בבנזוניטריל (למשל, 1002 ס"מ-1) בתמונת ה-sCMOS.
  8. הקלט את אורך הגל של הגשושית ואת מיקום הפיקסלים המתאים לה במצלמה. השתמש בקו ריילי (0 ס"מ-1 באורך גל הבדיקה) ובפסגות בנזוניטריל ראמאן ידועות ב-1002 ס"מ-1 ו-3073 ס"מ-1 כדי ליצור מיפוי ליניארי של פיקסלים למספר גל על פני גלאי sCMOS. קו ריילי מספק את ההתייחסות למספר גל אפס, בעוד שפסגות הבנזוניטריל קובעות את תוספת מספר הגל לפיקסל.
    הערה: מכיוון שהניתוח דורש רק מידע על מספרי גל יחסיים (מיפוי בין מיקום פיקסלים להזזת ראמאן), אין צורך בכיול אורך גל מוחלט באמצעות מנורות פליטה.
  9. הזן את מיפוי מספר הגל של הפיקסלים לתוכנת הרכישה. כיול זה אמור להישאר בתוקף אלא אם כן יבוצעו שינויים בנתיב האופטי, בהגדרת הסורג בספקטרומטר או ביישור.

7. רכישת אותות

  1. טען את דגימת C . elegans שהוכנה בשלבים 1.1 עד 1.6 על שלב המיקרוסקופ. אתר אזור עניין ומקד אותו באמצעות מטרת העירור.
  2. זהה אזור בשקופית שחסר אות פעיל ראמאן (רקע מים או כיסוי זכוכית חשופה) כדי לשמש כהתייחסות לרקע לא תהודה (NRB).
  3. אתר את אות ה-BCARS בגלאי sCMOS. כוונן את מיקום ה-z של מטרת האיסוף כדי למקסם את עוצמת האות נגד סטוקס.
  4. התאם את המיקום הרוחבי של מטרת האיסוף כדי להבטיח שהאור נגד סטוקס מיושר כראוי דרך חריץ הכניסה של הספקטרומטר.
  5. התחל את הסריקה המסונכרנת וביטול הסריקה של מראות galvo באמצעות ה-FPGA. כוונן את המשרעת של גלבו הסריקה באמצעות הפוטנציומטר הדיגיטלי עד לפיצוי מלא על הסטייה הזוויתית מהסריקה הראשונית. האות נגד סטוקס צריך להישאר מוגבל בתוך ~12 שורות במצלמה על פני כל טווח הסריקה.
  6. הגדר רצף רכישה זמני
    1. רכוש אות מתאם צולב בין ה-SC לפולסים של הבדיקה על ידי עיכוב דופק הבדיקה. כדי להשיג זאת, שרטט את אות ה-BCARS המשולב בשלושה צבעים לעומת עיכוב הזמן של דופק הבדיקה. האות החזק ביותר יופיע בזמן 0 כאשר פולסי ה-SC והבדיקה חופפים זמנית.
      הערה: מכיוון שמערכות הגילוי FLIM ו-TPEF חולקות את אותו הדק כמו BCARS, האותות שלהן נרכשים בו זמנית במהלך נקודת זמן זו.
    2. רשום בעיכוב מאוחר יותר של אלומת הבדיקה (למשל, 1-2 ps) עבור BCARS ועיכוב מאוחר יותר של קרן SC עבור רקע לא תהודה (ספקטרום NRB באיור 6A). כאשר מוחל עיכוב זמן על דופק הפס הצר (בדיקה), ניתן לדכא ביעילות את ה-NRB באות ה-CARS בשלושה צבעים, וכך ניתן לשפר את יחס האות לרעש67.
    3. רכוש תמונה כהה ללא חפיפה זמנית בין ה-SC לבדיקה כדי ללכוד את רעש הגלאי הבסיסי (התייחסות כהה).
    4. שמור את כל ה-BCARS, ה-NRB והתמונות הכהות, כולל המטא-נתונים בקובץ h5 יחיד.
  7. פרוטוקול עיבוד אותות BCARS
    1. פתח את תוכנת CRIkit268.
    2. טען את כל מערכי הנתונים הדרושים באמצעות כלי Open HDF כפי שמוצג באיור 6B: טען נתונים היפרספקטרליים של BCARS, הפניה ל-NRB והתייחסות כהה. בחר אזור תדר בתוך רוחב הפס של יצירת אותות BCARS באמצעות הכלי Freq Window (מ-400 ס"מ-1 עד ≥-3200 ס"מ-1 עבור מערכת BCARS המודגמת כאן).
    3. בצע שלבי עיבוד מקדים:
      1. השתמש בכלי Anscombe (כפי שמוצג באיור 6B) כדי לייצב את מערכי הנתונים של BCARS ו-NRB.
      2. השתמש בכלי De-noise כדי לבצע פירוק ערך יחיד (SVD): שמור על רכיבים עיקריים על סמך בדיקה חזותית. שמור על רכיבים המציגים התפלגויות מרחביות התואמות את המורפולוגיה של הדגימה והשליך רכיבים הנשלטים על ידי רעש לא מובנה או דמוי כתמים. שלב הפחתת רעשים זה משפר את יחס האות לרעש (SNR), במיוחד עבור תכונות ספקטרליות בעוצמה נמוכה.
      3. השתמש בכלי Inverse Anscombe כדי לשחזר את הנתונים לתחום המקורי שלהם.
        הערה: ניתן לדלג על שלבים אלה בעת ביצוע עיבוד בזמן אמת בעת רכישה.
    4. אחזר ספקטרום דמוי ראמאן באמצעות התמרת קרמרס-קרוניג (KK):
      1. פתח את כלי KK (כפי שמוצג באיור 6B).
      2. אפשר את Norm ל-NRB כדי להבטיח נורמליזציה של ייחוס ספקטרלי מתאים.
      3. הגדר פרמטרים כולל הטיית NRB, גורם כרית וממוצע פיקסלים בקצה.
      4. בצע את המרת KK כדי לקבל ספקטרום Raman שאוחזר.
    5. ביצוע תיקוני שגיאות לאחר KK
      1. תיקון שגיאות פאזה באמצעות החלקת Savitzky-Golay: פתח את כלי תיקון שגיאות הפאזה (איור 6B). התאם את גודל חלון ההחלקה ואת הסדר הפולינומי. בדוק את הספקטרום המקורי לעומת הספקטרום המתוקן באמצעות חלונית התצוגה המקדימה .
      2. תיקון שגיאות קנה מידה: פתח את הכלי לתיקון שגיאות קנה מידה (איור 6B). נרמל ספקטרום כדי לתקן קנה מידה של עוצמה יחסית על פני ערכת הנתונים. הבטח עקביות בממדים מרחביים וספקטרליים.
    6. כיול ציר ספקטרלי (אופציונלי, אם אינו מיושר): פתח את כלי הכיול (איור 6B). השווה את מספרי הגל הנמדדים לפסגות הייחוס הידועות. החל את השיפוע/יירוט המתוקן כדי ליישר מחדש את הציר הספקטרלי.
    7. הגדרה וחילוץ נתונים מאזורי עניין (ROI)
      1. השתמש בהיבט החזר ההשקעה. או Pt Spect. (איור 6B) לסימון אזורי עניין מרחביים או נקודות עניין בתמונת ה-BCARS.
      2. דמיין והשווה את התוכן הספקטרלי של החזר ROI שונה.
      3. ייצוא ספקטרום מאוחזר לניתוח כמותי או כימומטרי נוסף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 5 מציג את הספקטרום הנמדד של בדיקת הפס הצר ופולסי הסופר-רצף בפס רחב (SC) המשמשים לעירור BCARS. פולס הבדיקה, שנוצר באמצעות יצירת הרמוניה שנייה של אות ~1530 ננומטר ממתנד פרמטרי אופטי ביתי (OPO, איור 3), מרוכז ב-764.2 ננומטר עם רוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM) של 0.2 ננומטר, ומספק את הרזולוציה הספקטרלית ב-~6.8 ס"מ-1 בספקטרום ה-Raman המתקבל. פולס ה-SC, המופק על ידי צימוד פולס לייזר פמטו-שנייה 1030 ננומטר שציוץ מראש ל-PCF של 10 ס"מ (ראה טב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עבודה זו מדגימה בפירוט את הארכיטקטורה של BCARS ופלטפורמת הדמיה 2p-FLIM/TPEF. בעוד שלייזר 1030 ננומטר בעל יציאה כפולה משמש בהגדרה הנוכחית שלנו, רוב לייזרי הסיבים fs 1030 ננומטר בעלי הספק גבוה יכולים לשמש כמקור לייזר ראשי לבניית מיקרוסקופ BCARS. על ידי בחירה קפדנית של האורך והתקופה של גבישי OPO/SHG PPLN, ניתן להשיג יצירת דופק בדיקה של כמה ps עם משאבת תת-ps OPO 1030 ננומטר. למרות שמודגם כאן קצב חזרת לייזר גבוה יחסית (100 מגה-הרץ) או הספק שיא דופק נמוך יחסית, עדיין ניתן ליצור את אות ה-BCARS ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף ואין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

W-W.C. מודה על תמיכתו של ה-NIH (R21AG086974). M.T.C. מודה על תמיכת משרד האנרגיה האמריקני (DOE BERDE-SC0022121).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מצלמההמאמאטסואורקה-פיוז'ןsCMOS, 2304 ופעמים; 2304 פיקסלים
מטרת אוסף  אולימפוס  LUMPLFLN60XW  טבילה במים, 1.0 NA
ד"ק  חרוץ  MCC USB-1208HS  כרטיס רכישת נתונים
קו עיכוב  ניופורט  DL225  עיכוב מכני לדופק בדיקה
דיכרואיקון  סמרוק  FF925-DI01  שילוב של בדיקה ו-SC
דיכרואיקון  סמרוק  FF705-DI01  זיהוי פלואורסצנטיות במצב אפי
דיכרואיקון  ת'ורלאבס  DMLP550R  הפרדת אות FLIM ואות TPEF
מטרת עירור  אולימפוס  UPLSAPO60XWIR  טבילה במים, 1.2 NA
מסנן  סמרוק  FF01-1326/SP-25  דחה את הלייזר הבסיסי לאחר SHG
מסנן  סמרוק  FF01-758/SP  דחה את הלייזר הבסיסי לפני מצלמת BCARS
מסנן  ת'ורלאבס  FESH0650  דחה את הלייזר הבסיסי לפני אופן הקרינה
FLIM PMT  פיקוקוואנט  PMA היברידי  גלאי פוטון יחיד FLIM
FPGA  רדפיטאיה  STEMlab 125-14  סנכרון והפעלה של סריקה
גלבו  ת'ורלאבס  GVS101  לסריקה וביטול סריקה
סורג  קוהרנטי  LightSmyth 1040 ננומטר  1000 חורשות/מ"מ, ציוץ מקדים ל-SC
צלחת חצי גל  ת'ורלאבס  AHWP05M-980  בקרת קיטוב
קיי-קיוב  ת'ורלאבס  KPA101 מנהל התקן PSD עבור היישור האוטומטי
לייזר  מכשירים פוטנציאליים  FSX-כפול  לייזר פמטו-שנייה עם יציאה כפולה
לייזר  קוהרנטי  מירה-900  לייזר פמטו-שנייה לעירור פלואורסצנטי
PBS  ת'ורלאבס  PBS255  שילוב קרן ל-SC ובדיקה
PCF  ת'ורלאבס  LMA-PM-5  סיבי קריסטל פוטוניים 10 ס"מ לדור SC
משטרת  ת'ורלאבס  PDA100A2  לולאת משוב של OPO
תושבת מראה Piezo  ת'ורלאבס  פולאריס-K1S2P  מתאם פיזואלקטרי עבור היישור האוטומטי
קדם מגבר  אופטיקה אדמונד  59-179  מגבר מקדים TPEF
פריזמה  אופטיקה של למבדה מחקר  EQP-30SF10  דחיסת SC
PSD  ת'ורלאבס  PDQ80A  גלאי רגיש למיקום עבור היישור האוטומטי
ספקטרומטר  טלדין פרינסטון אינסטרומנטס  איזופליין 160  סורג 300 גרם/מ"מ, ממורכז ב- 700 ננומטר
במה  אסי  MS-2000  שלב 3 צירים ממונע
TCSPC  פיקוקוואנט  מולטי נבל 150  מכשיר ספירת פוטונים עבור FLIM
TPEF PMT  המאמאטסו  H9305-03  גלאי TPEF
עדשת צינור  ת'ורלאבס  TL200-2P2  משמש במערכת הסרת סריקה

מקורות

  1. Cutshaw, G., et al. The emerging role of Raman spectroscopy as an omics approach for metabolic profiling and biomarker detection toward precision medicine. Chem Rev. 123 (13), 8297-8346 (2023).
  2. Kong, K., Kendall, C., Stone, N., Notingher, I. Raman spectroscopy for medical diagnostics - from in vitro biofluid assays to in vivo cancer detection. Adv Drug Deliv Rev. 89, 121-134 (2015).
  3. Abramczyk, H., et al. Aberrant protein phosphorylation in cancer by using Raman biomarkers. Cancers (Basel). 11 (12), 2017(2019).
  4. Contorno, S., Darienzo, R. E., Tannenbaum, R. Evaluation of aromatic amino acids as potential biomarkers in breast cancer by Raman spectroscopy analysis. Sci Rep. 11 (1), 1698(2021).
  5. John, R. V., et al. Micro-Raman spectroscopy study of blood samples from myocardial infarction patients. Lasers Med Sci. 37 (9), 3451-3460 (2022).
  6. You, A. Y. F., et al. Raman spectroscopy imaging reveals interplay between atherosclerosis and medial calcification in the human aorta. Sci Adv. 3 (12), e1701156(2017).
  7. Carlomagno, C. Human salivary Raman fingerprint as biomarker for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 10 (1), 10175(2020).
  8. Morasso, C. F., et al. Raman spectroscopy reveals biochemical differences in plasma derived extracellular vesicles from sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Nanomedicine. 29, 102249(2020).
  9. Pezzotti, G. Raman spectroscopy in cell biology and microbiology. J Raman Spectrosc. 52 (12), 2348-2443 (2021).
  10. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  11. Hamada, K., et al. Raman microscopy for dynamic molecular imaging of living cells. J Biomed Opt. 13 (4), 044027(2008).
  12. Ichimura, T., et al. Non-label immune cell state prediction using Raman spectroscopy. Sci Rep. 6 (1), 37562(2016).
  13. Germond, A., Panina, Y., Shiga, M., Niioka, H., Watanabe, T. M. Following embryonic stem cells, their differentiated progeny, and cell-state changes during IPS reprogramming by Raman spectroscopy. Anal Chem. 92 (22), 14915-14923 (2020).
  14. Zahn, J., Germond, A., Lundgren, A. Y., Cicerone, M. T. Discriminating cell line specific features of antibiotic-resistant strains of Escherichia coli from Raman spectra via machine learning analysis. J Biophotonics. 15 (7), e202100274(2022).
  15. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  16. Nitta, N., et al. Raman image-activated cell sorting. Nat Commun. 11 (1), 3452(2020).
  17. Shipp, D. W., Sinjab, F., Notingher, I. Raman spectroscopy: techniques and applications in the life sciences. Adv Opt Photon. 9 (2), 315-428 (2017).
  18. Kong, C., et al. High-contrast, fast chemical imaging by coherent Raman scattering using a self-synchronized two-colour fibre laser. Light Sci Appl. 9 (1), 25(2020).
  19. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Dev Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  20. Fueser, H., Pilger, C., Kong, C., Huser, T., Traunspurger, W. Polystyrene microbeads influence lipid storage distribution in C. elegans as revealed by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Environ Pollut. , 294-118662 (2022).
  21. Lee, J., et al. Label-free multiphoton imaging of microbes in root, mineral, and soil matrices with time-gated coherent Raman and fluorescence lifetime imaging. Environ Sci Technol. 56 (3), 1994-2008 (2022).
  22. Sheng, M., et al. Single source CARS-based multimodal microscopy system for biological tissue imaging. Biomed Opt Express. 15 (1), 131-141 (2024).
  23. Zeng, Q., et al. Label-free Raman imaging for screening of anti-inflammatory function food. Food Chem X. 22, 101297(2024).
  24. Zhang, J., et al. High-throughput single-cell sorting by stimulated Raman-activated cell ejection. Sci Adv. 10 (50), eadn6373(2024).
  25. Yang, L., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Renteria, C. A., Boppart, S. A. Temporally optimized and spectrally shaped hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (7), 11474-11490 (2024).
  26. Pegoraro, A. F., Stolow, A. Chirp modulation stimulated Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (18), 31297-31310 (2024).
  27. Zhang, Y., et al. Rapid coherent Raman hyperspectral imaging based on delay-spectral focusing dual-comb method and deep learning algorithm. Opt Lett. 48 (3), 550-553 (2023).
  28. Sorrells, J. E., et al. Programmable hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Lett. 49 (9), 2513-2516 (2024).
  29. De la Cadena, A. Multiplex chemical imaging based on broadband stimulated Raman scattering microscopy. J Vis Exp. (185), e63709(2022).
  30. Zhang, S., He, Y., Yue, S. Coherent Raman scattering imaging of lipid metabolism in cancer. J Innov Opt Health Sci. 16 (3), 2230015(2023).
  31. Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nat Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
  32. Camp, C. H. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nat Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  33. Camp, C. H., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Quantitative comparable coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy: correcting errors in phase retrieval. J Raman Spectrosc. 47 (4), 408-415 (2015).
  34. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nat Chem Biol. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  35. Poorna, R., Chen, W. W., Qiu, P., Cicerone, M. T. Toward gene-correlated spatially resolved metabolomics with fingerprint coherent Raman imaging. J Phys Chem B. 127 (25), 5576-5587 (2023).
  36. Vernuccio, F., et al. Full-spectrum CARS microscopy of cells and tissues with ultrashort white-light continuum pulses. J Phys Chem B. 127 (21), 4733-4745 (2023).
  37. Murakami, Y., et al. Molecular fingerprinting of mouse brain using ultrabroadband coherent anti-stokes Raman scattering microspectroscopy empowered by multivariate curve resolution-alternating least squares. Chem Biomed Imaging. 2 (10), 689-697 (2024).
  38. Muddiman, R., Harkin, S., Butler, M., Hennelly, B. Broadband CARS hyperspectral classification of single immune cells. J Biophotonics. 18 (3), e202400382(2025).
  39. Dixon, J. Z., Chen, W. W., Xu, H., Audier, X., Cicerone, M. T. Broadband coherent anti-stokes Raman scattering microscopy for rapid, label-free biological imaging. Rev Sci Instrum. 96 (4), 043706(2025).
  40. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Opt Lett. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  41. Rinia, H. A., Bonn, M., Müller, M., Vartiainen, E. M. Quantitative CARS spectroscopy using the maximum entropy method: The main lipid phase transition. Chemphyschem. 8 (2), 279-287 (2007).
  42. Cicerone, M. T., Aamer, K. A., Lee, Y. J., Vartiainen, E. Maximum entropy and time-domain Kramers-Kronig phase retrieval approaches are functionally equivalent for CARS microspectroscopy. J Raman Spectrosc. 43 (5), 637-643 (2012).
  43. Houhou, R., et al. Deep learning as phase retrieval tool for CARS spectra. Opt Express. 28 (14), 21002-21024 (2020).
  44. Wang, Z., et al. Vector: Very deep convolutional autoencoders for non-resonant background removal in broadband coherent anti-stokes Raman scattering. J Raman Spectrosc. 53 (6), 1081-1093 (2022).
  45. Camp, C. H. Raman signal extraction from CARS spectra using a learned-matrix representation of the discrete Hilbert transform. Opt Express. 30 (15), 26057-26071 (2022).
  46. Junjuri, R., Saghi, A., Lensu, L., Vartiainen, E. M. Evaluating different deep learning models for efficient extraction of Raman signals from CARS spectra. Phys Chem Chem Phys. 25, 16340-16353 (2023).
  47. Vernuccio, F., et al. Non-resonant background removal in broadband CARS microscopy using deep-learning algorithms. Sci Rep. 14 (1), 23903(2024).
  48. Yao, B., et al. Recent progress in deep learning for improving coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Laser Photonics Rev. 18 (11), 2400562(2024).
  49. Bestvater, F., et al. Two-photon fluorescence absorption and emission spectra of dyes relevant for cell imaging. J Microsc. 208 (2), 108-115 (2002).
  50. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  51. Zhu, H., Fan, J., Du, J., Peng, X. Fluorescent probes for sensing and imaging within specific cellular organelles. Acc Chem Res. 49 (10), 2115-2126 (2016).
  52. Wu, L., Liu, J., Li, P., Tang, B., James, T. D. Two-photon small-molecule fluorescence-based agents for sensing, imaging, and therapy within biological systems. Chem Soc Rev. 50, 702-734 (2021).
  53. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chem Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  54. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
  55. Lin, H. J., Herman, P., Lakowicz, J. R. Fluorescence lifetime-resolved pH imaging of living cells. Cytometry A. 52 (2), 77-89 (2003).
  56. Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular rotor measures viscosity of live cells via fluorescence lifetime imaging. J Am Chem Soc. 130 (21), 6672-6673 (2008).
  57. Wang, B., et al. Bipolar and fixable probe targeting mitochondria to trace local depolarization via two-photon fluorescence lifetime imaging. Analyst. 140, 5488-5494 (2015).
  58. Despa, S., Vecer, J., Steels, P., Ameloot, M. Fluorescence lifetime microscopy of the Na+ indicator sodium green in HeLa cells. Anal Biochem. 281 (2), 159-175 (2000).
  59. Wilms, C. D., Eilers, J. Photophysical properties of Ca2+-indicator dyes suitable for two-photon fluorescence-lifetime recordings. J Microsc. 225 (3), 209-213 (2007).
  60. König, K. Review: Clinical in vivo multiphoton FLIM tomography. Methods Appl Fluoresc. 8 (3), 034002(2020).
  61. Scipioni, L., Rossetta, A., Tedeschi, G., Gratton, E. Phasor s-FLIM: a new paradigm for fast and robust spectral fluorescence lifetime imaging. Nat Methods. 18 (5), 542-550 (2021).
  62. Ouyang, Y., Liu, J., Wang, Z. M., Liu, Z., Wu, M. FLIM as a promising tool for cancer diagnosis and treatment monitoring. Nano Micro Lett. 13 (1), 133(2021).
  63. Shirshin, E. A., et al. Label-free sensing of cells with fluorescence lifetime imaging: The quest for metabolic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (9), e2118241119(2022).
  64. Liu, Z. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Sci Adv. 4 (3), eaap9302(2018).
  65. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  66. Chen, W. W., et al. Identifying lipid particle sub-types in live Caenorhabditis elegans with two-photon fluorescence lifetime imaging. Front Chem. 11, 1161775(2023).
  67. Littleton, B., Shah, P., Kavanagh, T., Richards, D. Three-color coherent anti-stokes Raman scattering with optical nonresonant background removal. J Raman Spectrosc. 50 (9), 1303-1310 (2019).
  68. Crikit2 software for BCARS data processing. , https://github.com/ccampjr/crikit2 (2025).
  69. Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol Cell Proteomics. 11 (8), 317-328 (2012).
  70. Hulsey-Vincent, H. J., Cameron, E. A., Dahlberg, C. L., Galati, D. F. Spectral scanning and fluorescence lifetime imaging microscopy enable separation and characterization of C. elegans autofluorescence in the cuticle and gut. Biol Open. 13 (12), bio060613(2024).
  71. Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A Python GUI for interactive phasor analysis of FLIM data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
  72. Weber, G. Resolution of the fluorescence lifetimes in a heterogeneous system by phase and modulation measurements. J Phys Chem. 85 (8), 949-953 (1981).
  73. Ranjit, S., Malacrida, L., Jameson, D. M., Gratton, E. Fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging data using the phasor approach. Nat Protoc. 13 (9), 1979-2004 (2018).
  74. Smolen, J. A., Wooley, K. L. Fluorescence lifetime image microscopy prediction with convolutional neural networks for cell detection and classification in tissues. PNAS Nexus. 1 (5), pgac235(2022).
  75. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  76. Vu, T., et al. Spatial transcriptomics using combinatorial fluorescence spectral and lifetime encoding, imaging and analysis. Nat Commun. 13 (1), 169(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימות זמן חיים של פלואורסצנציהספקטרוסקופיית טביעת אצבע רמוןמיקרוסקופיה דו-פוטוניתפרופיל מטבולירזולוציה סוב-תאיתדימות In VivoC. Elegansחלבון פלואורסצנטי ירוק
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.