מאמר שיטה

הערכת ההשפעה של גורמי SASP על התפשטות תאים סרטניים באמצעות ניתוח השוואתי של שלוש מתודולוגיות שונות

DOI:

10.3791/68883

⸱

19 בספטמבר 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Gazi University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מעריך את ההשפעות הפרוליפרטיביות של גורמי פנוטיפ הפרשה הקשורים להזדקנות (SASP) מתאי HeLa מזדקנים על תאי HeLa שאינם מזדקנים באמצעות שלושה מודלים במבחנה עם ניטור בזמן אמת. היתרונות והמגבלות של כל שיטה הושוו באופן שיטתי כדי להבין טוב יותר את האינטראקציות בין תאים בסרטן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי סרטן מזדקנים המושרים על ידי כימותרפיה מפרישים גם גורמים שונים, הנקראים פנוטיפ הפרשה הקשור להזדקנות, כדי לווסת את המיקרו-סביבה החוץ-תאית שלהם. מחקרים קודמים דיווחו כי גורמי SASP אלה מפעילים השפעות פרקריניות מזיקות על התאים הסובבים, כולל קידום התפשטות, מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), אנגיוגנזה ונדידה. מספר טכניקות של תרבית משותפת במבחנה נמצאות בשימוש נרחב להבנת התהליכים התאיים הנובעים מאינטראקציה על ידי גידול אותם וסוגים שונים של תאים יחד. כאן, ההשפעות הפוטנציאליות של גורמי SASP המופרשים על ידי תאי HeLa מזדקנים על תאי HeLa שאינם מזדקנים נחקרו באמצעות שלוש גישות משלימות במבחנה . הגישה הראשונה כללה תרבית משותפת של תאים מזדקנים ולא מזדקנים כדי לחקור את האיתות הפרקריני המתווך על ידי ה-SASP. בגישה השנייה, מדיה מותנית שנאספה מתאי סרטן מזדקנים רוכזה ולאחר מכן שימשה לבחינת השפעת המדיה המותנית עם ניטור בזמן אמת של התפשטות. בשיטה השלישית, תאים מזדקנים ולא מזדקנים תורבבו זה לצד זה כדי להעריך את ההשפעות הצמודות של SASP באמצעות מגע ישיר בין תאים. כל שלושת המודלים הניסיוניים הראו בעקביות שגורמי SASP שיפרו משמעותית את התפשטותם של תאי סרטן שאינם מזדקנים. יש לציין כי תרבית משותפת של תאים מזדקנים הגדילה את שיעור ההתפשטות ב-64.6%, ומדיה מרוכזת פי 3 המותנית ב-SASP הגדילה את התפשטות הגזע ביותר מ-50% בהשוואה לביקורת. הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות הראתה עלייה של 49.3% במספר התאים החיוביים ל-GFP בתנאים סמוכים. שיטות אלה אפשרו ביחד הערכה כמותית ואיכותית של שינויים פרוליפרטיביים הנגרמים על ידי SASP. הניתוח ההשוואתי של גישות אלה מדגיש את החוזקות והמגבלות שלהן, ומספק תובנות חשובות לגבי ההשפעות הפרקריניות של תאים מזדקנים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באורגניזמים רב-תאיים, תאים מתקשרים באמצעות איתות פרקרין וג'וקסטקרין על ידי החלפת מסרים עם המיקרו-סביבה שלהם, ובכך משפיעים זה על התנהגותו של זה. תקשורת זו יכולה להתרחש ישירות, באמצעות מנהור ננו-צינורות וצמתים מרווחים, או בעקיפין באמצעות הפרשת מולקולות כימיות מסיסות כגון ציטוקינים, גורמי גדילה וכימוקינים לתוך המטריצה החוץ-תאית. מנגנוני איתות אלה ממלאים תפקידים חיוניים בוויסות תהליכים פיזיולוגיים שונים, כולל התפתחות רקמות ותגובות תאי חיסון, ומעורבים גם בפתוגנזה של מחלות רבות, כגון סרטן, HIV, יתר לחץ דם ואלצהיימר1.

בשנות ה-60 של המאה ה-20, לאונרד הייפליק גילה שלפיברובלסטים אנושיים רגילים יש יכולת מוגבלת להשתכפל במבחנה2. מצב התפשטות תאים מוגבל זה המתפתח עקב קיצור טלומראז נקרא הזדקנות שכפול. מחקרים מאוחרים יותר גילו שצורות שונות של לחץ תאי יכולות גם לעורר הזדקנות תאית. נקבע כי טיפולים נפוצים בסרטן כגון כימותרפיה והקרנות גורמים גם להזדקנות תאית הן בתאי סרטן והן בתאי סטרומל, הנקראים הזדקנות הנגרמת על ידי טיפול 3,4. הזדקנות תאית והזדקנות הם תהליכים הקשורים מבחינה היררכית; הם מייצגים תהליכים ביולוגיים מובחנים. הצטברות תאים מזדקנים באורגניזם תורמת להזדקנות על ידי קידום דלקת, תפקוד לקוי של רקמות והתפתחות מחלות הקשורות לגיל. עם זאת, הזדקנות מקיפה מגוון רחב הרבה יותר של אירועים ומנגנונים מערכתיים בהשוואה להזדקנות5.

תאים מזדקנים מאופיינים בכך שהציטופלזמה המורחבת שלהם גדולה משמעותית ובעלת מורפולוגיה שטוחה בהשוואה לתאים רגילים6. לתאים מזדקנים אלה יש פעילות ליזוזומלית מוגברת והם חיוביים לפעילות β-גלקטוזידאז (SA-β-gal) הקשורה להזדקנות, אנזים ליזוזומלי שנשאר פעיל גם ב-pH חומצי 6.0. צביעת SA-β-gal היא הסמן הביולוגי הנפוץ ביותר לזיהוי תאים מזדקנים7. הגדלה ומורפולוגיה לא סדירה של גרעינים נצפות בדרך כלל בתאים העוברים הזדקנות. בנוסף, תאים אלה מאופיינים בסידורים מחדש ייחודיים של כרומטין הנקראים מוקדים הטרוכרומטיים הקשורים להזדקנות (SAHF) המתווכים מעצר מחזור תא בלתי הפיך 8,9.

למרות שתאי סרטן מזדקנים איבדו בסופו של דבר את יכולתם להתרבות, הם נותרו ברי קיימא ופעילים מבחינה מטבולית. ידוע שתאים מזדקנים מפרישים גם גורמים שונים כדי לווסת את המיקרו-סביבה החוץ-תאית של הגידול שלהם, הנקראים פנוטיפ הפרשה הקשור להזדקנות (SASP)10,11. גורמי SASP אלה כוללים גורמי איתות מסיסים (אינטרלוקינים, כימוקינים וגורמי גדילה), פרוטאזות מופרשות וחלבונים בלתי מסיסים המופרשים/רכיבי מטריצה חוץ-תאית (ECM). באופן קולקטיבי, גורמים אלה מפעילים השפעות פרקריניות מזיקות, כולל קידום התפשטות תאים סרטניים, נדידה, פלישה ואינדוקציה של מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT)4,12. בנוסף, תופעות לוואי הנגרמות על ידי כימותרפיה יוחסו בחלקן להצטברות תאים מזדקנים13. לכן, חקירת האינטראקציה בין תאים מזדקנים ולא מזדקנים הפכה לתחום מחקר חשוב בהקשר של טיפול בסרטן. במיוחד ניתוח גורמי SASP, במיוחד הרכבם וההשפעות על המיקרו-סביבה הסרטנית, נחשב לאסטרטגיה מבטיחה לזיהוי מולקולות מטרה חדשות לטיפול בסרטן וגילוי תרופות חדשות למולקולות אלו.

טכניקות תרבית משותפת במבחנה שימשו זה מכבר לחקר ההבנה של אינטראקציות בין תאים14. במאמר מתודולוגי זה, המטרה הייתה להעריך את הפעילות הפרוליפרטיבית האפשרית של גורמים המופרשים מתאים מזדקנים על תאים סרטניים שאינם מזדקנים באמצעות שלוש שיטות שונות. בנוסף, הושוו התוצאות שהתקבלו משלוש השיטות השונות, והוערכו באופן ביקורתי היתרונות והחסרונות של כל גישה.

ראשית, הוקם מודל תרבית משותפת בין תאי HeLa מזדקנים לתאי HeLa שאינם מזדקנים כדי לנטר את השינויים האפשריים בהתפשטות תאים סרטניים בזמן אמת באמצעות מערכת ניתוח תאים בזמן אמת12. מערכת זו מורכבת משתי צלחות להערכת אינטראקציות תא-תא. לתצוגת הלוח האלקטרוני, היוצרת את השכבה התחתונה, יש משטח שבו נזרעים תאי מטרה, עם מיקרואלקטרודות הממוקמות בתחתית הצלחת. ההתנגדות החשמלית שנוצרת על ידי הידבקות תאי מטרה למשטח זה מתבטאת על ידי הפרמטר המדיד Cell Index (CI). ערך ה-CI פרופורציונלי למספר התאים ולמידת ההידבקות למשטח15. בנוסף, תצוגת הלוח האלקטרוני מאפשרת בדיקה מורפולוגית של תאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. תוספת הצלחת האלקטרונית, היוצרת את השכבה העליונה, היא האזור בו נזרעים תאי אפקטור. החלק התחתון של צלחת זו מכוסה בקרום חדיר למחצה בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר. גורמים המופרשים מתאי אפקטור יכולים לעבור דרך הממברנה ולהשפיע על תאי המטרה בתצוגת הלוח האלקטרוני. אם אינטראקציה זו מגרה את התפשטות התאים, הדבר נצפה כעלייה בערך ה-CI. לפיכך, ניתן להעריך אינטראקציות בין תאים באופן כמותני.

בשיטה השנייה, מדיה מותנית שנאספה מתאי HeLa מזדקנים רוכזה ונוספה לתאי HeLa שאינם מזדקנים. ההשפעה הפוטנציאלית על תאים אלה נוטרה באמצעות מערכת ניתוח תאים בזמן אמת.

בשיטה השלישית תוכנן לבצע תרבית משותפת של תאי ה-HeLa המזדקנים ותאי ה-GFP-HeLa הלא מזדקנים ישירות בדו-ממד ולעקוב אחר השינויים האפשריים בתאי סרטן בזמן אמת תחת מיקרוסקופ.

מטרת ניסוי זה היא להקים שלושה מודלים לחקר האינטראקציה בין תאי HeLa מזדקנים לתאי HeLa שאינם מזדקנים ולעקוב אחר שינויים אפשריים בהתפשטות תאי סרטן בזמן אמת. לפיכך, ניתן לחקור בקלות את ההשפעה של גורמי SASP המופרשים על ידי תאי סרטן מזדקנים על תאי סרטן אחרים. בהתאם לכך, היתרונות והמגבלות של שלוש הגישות הוערכו באופן שיטתי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל הליכי תרבית התאים נערכו בתנאי בטיחות ביולוגית ברמה II+ (BSL2+) בתוך ארון בטיחות מוסמך. דוקסורוביצין הוא חומר כימותרפי מסוכן. יש לבצע את כל ההליכים בארון מאושר ברמת בטיחות ביולוגית II+ (BSL2+) תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE), כולל מעילי מעבדה וכפפות. יש לאסוף את כל הפסולת המכילה דוקסורוביצין, כולל מדיה ומקבעים, במיכלי פסולת מסוכנת ייעודיים ומסומנים בבירור ולהשליך באמצעות מערכת ניהול הפסולת המסוכנת המוסדית.

1. מודל 1: קו-קולטורציה באמצעות מערכת ניתוח תאים בזמן אמת

  1. תרבית תאים והשראת הזדקנות (ימים 1-2)
    1. זרע 8 x 105 תאי HeLa לתוך בקבוק תרבית T25 המכיל 5 מ"ל של מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), פניצילין (100 יחידות / מ"ל) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) ותאי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO2.
    2. למחרת, החלף את מדיום התאים ב -5 מ"ל של מדיום שלם טרי. טפל בתאים עם דוקסורוביצין 300 ננומטר ישירות על ידי הוספה למדיום כדי לגרום להזדקנות תאית. שמור על בקבוק T25 בחממה עם 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
  2. זריעת תאים לא מזדקנים (יום 4)
    1. זרע 8 x 105 תאי HeLa לא מטופלים (בקרה לא מזדקנת) בבקבוק T25 חדש ב-5 מ"ל של DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) ונשמר באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  3. אישור השראת הזדקנות (יום 5)
    1. כדי לקבוע אם 72 שעות של טיפול בדוקסורוביצין גרמו להזדקנות, בצע צביעת SA-β-gal6. בצע בדיקה זו על קבוצה נפרדת של תאים שאינם בשימוש בניסויים העיקריים. לתוצאות שהתקבלו, ראה איור 1A,B.
    2. מדוד IL-6 במדיה המותנית של תאי HeLa סרטניים מזדקנים כדי להעריך את פעילות ההפרשה שלהם. טפל בתאים עם דוקסורוביצין במשך 72 שעות, ולאחר מכן הדגירה במדיום נטול סרום ונטול פנול אדום למשך יומיים נוספים. לנרמל את המדיה המותנית שנאספה למספר תאים ולמדוד רמות IL-6.
      הערה: IL-6 הוא ציטוקין סימן היכר של SASP12. תוצאות מדידת IL-6 מוצגות באיור 1C.
  4. הגדרת מערכת ניתוח תאים בזמן אמת (יום 5)
    1. הפעל את מערכת ניתוח התאים בזמן אמת לפני זריעת התאים. הפעל את תוכנת RTCA 2.0. לחץ על כפתור Exp Notes (איור 2) והזן פרטי ניסוי.
    2. לחץ על לוח זמנים כפתור והוסף שני שלבים. הצעד הראשון הוא הרקע. השלב השני הוא לנטר את התפשטות התאים כל 15 דקות במשך 72 שעות.
    3. בחר את השלב הראשון ולחץ לשחק כדי להקליט את עכבת הרקע על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של מדיום שלם לכל באר של תצוגת הלוח האלקטרוני.
  5. זריעת תאים בתצוגת הצלחת האלקטרונית (יום 5)
    1. בדוק הן תאי HeLa שטופלו בדוקסורוביצין (זקנים) והן תאי HeLa לא מטופלים (לא זקנים) תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה באמצעות הגדלה פי 10 לפני זריעת תאים. תחת המיקרוסקופ, לתאים מזדקנים יש מורפולוגיה מוגדלת הרבה יותר מאשר לתאים רגילים.
    2. שטפו את תאי ה-HeLa המזדקנים והלא מזדקנים עם 5 מ"ל של PBS סטרילי שחומם מראש, ולאחר מכן שאפו.
    3. הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין שחומם מראש ושמור על הצלוחיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות כדי לנתק תאים. נטרל את הטריפסין עם 5 מ"ל של DMEM מלא בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל).
    4. צנטריפוגה של התאים ב-500 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדוריות התא ב-5 מ"ל של DMEM מלא בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל).
    5. ספרו את התאים הקיימים בשיטת אי הכללת הצבע הכחול של טריפן באמצעות המוציטומטר.
    6. זרעי תאי HeLa לא מזדקנים בצפיפות של 5 x 103 תאים/באר בכל באר של תצוגת צלחת אלקטרונית אחת ב-100 מיקרוליטר של DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל).
    7. מקם את תצוגת הלוח האלקטרוני בעריסת מערכת ניתוח התאים בזמן אמת כדי לאפשר לתאים להיצמד למשטח הצלחת בחממה.
    8. בחרו את הצעד השני בכפתור לוח הזמנים ולחצו על כפתור ההפעלה כדי להתחיל במדידת עכבה באמצעות תוכנת RTCA 2.0 למשך 72 שעות (איור 2).
  6. זריעת תאים לתוך תוספת הצלחת האלקטרונית
    1. תאי זרעים בצלחת אלקטרונית אחת מכניסים בארות ב-60 מיקרוליטר של DMEM מלא בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל).
    2. תאי זרע על הלוח האלקטרוני בשלוש הגדרות ניסוי שונות: קבוצה 1 (בקרה שלילית): אין תאים שנזרעו (מדיה בלבד)
      קבוצה 2: 2 × 104 תאי HeLa לא מזדקנים
      קבוצה 3: 1 × 105 תאי HeLa מזדקנים
    3. שמור על תוספת צלחת אלקטרונית ב-37 מעלות צלזיוס בחממה עם 5% CO2 למשך 6 שעות לחיבור.
  7. תרבית משותפת של תאים
    1. לחץ על השהה לאחר 6 שעות של זריעת תאים. שאפו בעדינות את מדיום התרבית מכל באר של תצוגת הצלחת האלקטרונית כדי להסיר סרום ותאים שאינם נדבקים.
    2. שטפו בארות פעמיים עם PBS מחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס.הוסף 140 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום לכל באר של תצוגת הצלחת האלקטרונית.
    3. קח את תוספת הצלחת האלקטרונית ושאף את מדיום התרבית. שטפו בארות בעדינות עם PBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס פי 2 והוסיפו 60 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום.
    4. מקם את תוספת הצלחת האלקטרונית לתוך הצלחת האלקטרונית view ולחץ בעדינות כלפי מטה עד שהתוספת יושבת במלואה בבאר.
    5. הכנס את הלוח המשולב למערכת ניתוח התאים בזמן-אמת ולחץ על Play כדי לחדש את הניטור בזמן-אמת של ערכי אינדקס התא במרווחים של 15 דקות באמצעות התוכנה (איור 2).
    6. כבו את מערכת ניתוח התאים בזמן אמת כאשר זמן הניסוי נגמר (איור 3A).
  8. תאי הדמיה על גבי תוספת לוחית אלקטרונית
    הערה: מכיוון שיש קרום בבאר הכנסת הצלחת האלקטרונית, לא ניתן לדמיין את התאים שנזרעו כאן על הממברנה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. לכן, כדי לבחון אם התאים שמרו על כדאיות עד סוף הניסוי ואם התאים המזדקנים שמרו על שלמותם המבנית, הם נצבעו ב-DAPI (איור 3B).
    1. הסר את תוספת הצלחת האלקטרונית מהצלחת האלקטרונית view. צבעו את התאים בתוספת הצלחת האלקטרונית עם DAPI ובדקו את נוכחות התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי16. ידוע כי גרעיני התאים המזדקנים גדולים יותר מאלה של תאים רגילים. לכן, על סמך הגדלים הגרעיניים של התאים הצבועים ב-DAPI, קבע איזו באר נזרעה עם תאים לא מזדקנים ואילו עם תאים מזדקנים.
  9. הדמיה של תאים בתצוגת הלוח האלקטרוני
    1. בחן ישירות את תצוגת הלוח האלקטרוני תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה באמצעות הגדלה פי 10 (איור 3B). מכיוון שארבע שורות של חיישני מיקרו-אלקטרודות הוסרו ממרכז כל באר בתצוגת הלוח האלקטרוני, חלל 6 נוצר כדי לאפשר ניטור תאים במיקרוסקופיה.
  10. ניתוח נתונים
    1. נרמל את ערכי ה-CI בנקודת הזמן שבה ה-e-plate view והכנסת ה-e-plate משולבים ומוכנסים למערכת ניתוח התאים בזמן אמת.
    2. לחץ על כפתור ניתוח נתונים כדי לחשב את קצב ההתפשטות והכמות באמצעות אינדקס התא המקסימלי ונתוני השיפוע המתקבלים ממערכת ניתוח התאים בזמן-אמת (איור 2). לאחר מכן, נתחו את הנתונים באמצעות תוכנה סטטיסטית מתאימה (איור 3C,D).

2. מודל 2: בדיקת טיפול במדיה מותנית באמצעות מערכת ניתוח תאים בזמן אמת

  1. תרבית תאים והשראת הזדקנות (ימים 1-2)
    1. זרע 35 x 104 תאי HeLa לכל באר של 6 לוחות באר המכילים 2.5 מ"ל של מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) ותאי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO2.
    2. למחרת, החלף את מדיום התאים ב -2.5 מ"ל של מדיום שלם טרי. טפל בתאים עם דוקסורוביצין 300 ננומטר ישירות על ידי הוספתו למדיום כדי לגרום להזדקנות תאית. שמור על צלחת 6 הבארות בחממה עם 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
  2. זריעת תאים לא מזדקנים (יום 4)
    1. זרע 35 x 104 תאי HeLa לא מטופלים (בקרה לא מזדקנת) לכל באר של צלחת חדשה בת 6 בארות ב-2.5 מ"ל DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) ונשמר באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  3. בצע אישור של אינדוקציה של הזדקנות כמתואר בשלב 1.3.
  4. הכנת מדיום מותנה מתאי HeLa מזדקנים ולא מזדקנים
    1. בדוק הן תאים שטופלו בדוקסורוביצין (תאים מזדקנים) והן תאי HeLa לא מטופלים (תאים לא מזדקנים) תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה. תחת המיקרוסקופ, לתאים מזדקנים יש מורפולוגיה מוגדלת הרבה יותר מאשר לתאים רגילים.
    2. שאפו את מצע התרבות משתי 6 צלחות הבאר (תאי HeLa מזדקנים ולא מזדקנים). שטפו את התאים פעמיים עם PBS מחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס כדי להסיר שאריות סרום ופסולת תאים.
    3. הוסף 2 מ"ל של DMEM ללא סרום בתוספת פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) לכל באר. דגרו את התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 48 שעות.
  5. איסוף וריכוז מדיה מותנית (יום 7)
    1. אסוף את המדיה הממוזגת מכל באר לצינורות סטריליים בתא בטיחות למינר.
    2. נסה את התאים וספור את התאים בשיטת אי הכללת צבע כחול טריפן באמצעות המוציטומטר כדי לנרמל מדיה מותנית למספרי תאים.
    3. התאם את המדיה הממוזגת, מנורמלת בהתאם למספר התא, לנפח סופי של 2 מ"ל עם DMEM ללא סרום בתוספת פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) בצינורות סטריליים של 2 מ"ל.
    4. צנטריפוגה של המדיה המותנית שנאספה ב-1,000 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאים, ואחריה צנטריפוגה ב-10,000 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להשיג את הסופרנטנט המובהר.
    5. צנטריפוגה של המדיה הממוזגת באמצעות יחידות סינון אולטרה-צנטריפוגליות של 2 מ"ל ב-4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ב-3,000 x גרם כדי לרכז אותה. הליך זה מרכז את המדיה המותנית של 2 מ"ל עד פי 5 מ-400 מיקרוליטר המרוכזים של מדיה מותנית.
    6. יש לדלל את 40 המיקרוליטר המתקבלים של מדיה ממוזגת במדיום טרי ללא סרום כדי להכין מדיה מרוכזת פי 1, 2 ו-3 בצינורות סטריליים בתא בטיחות למינר.
      הערה: מכיוון שהמדיום שנשאר על התאים במשך 48 שעות מתרוקן עקב צריכה סלולרית, המדיה המותנית שנאספה ומרוכזת מדוללת לאחר מכן במדיום חדש.
  6. זריעת תאים לתצוגת צלחת אלקטרונית
    1. הגדר את מערכת ניתוח התאים בזמן אמת כמתואר בשלבים 1.1-1.4.שטוף תאי HeLa שאינם מזדקנים עם PBS מחומם מראש, ולאחר מכן שאוף.
    2. הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין שחומם מראש ושמור על הצלוחיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות כדי לנתק תאים. נטרל את הטריפסין עם 5 מ"ל של DMEM מלא בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל).
    3. צנטריפוגה של התאים ב-500 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדוריות התא ב-5 מ"ל של DMEM מלא בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל).
    4. ספרו את התאים הקיימים בשיטת אי הכללת הצבע הכחול של טריפן באמצעות המוציטומטר.
    5. זרעי תאי HeLa לא מזדקנים בצפיפות של 5 x 103 תאים לבאר בכל באר של צלחת אלקטרונית אחת ב-200 מיקרוליטר של DMEM מלא בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל).
    6. מקם את תצוגת הלוח האלקטרוני בעריסת מערכת ניתוח התאים בזמן אמת כדי לאפשר לתאים להיצמד למשטח הצלחת בחממה.
    7. בחר את השלב השני בלחצן לוח הזמנים ולחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל במדידת עכבה באמצעות תוכנת RTCA 2.0 (איור 2). לחץ על כפתור ההשהיה בתוכנה לאחר 6 שעות של ציפוי תאי HeLa לא-מזדקנים (איור 2).
    8. שאפו בעדינות את מדיום התרבית מכל באר של תצוגת הצלחת האלקטרונית כדי להסיר סרום ותאים שאינם נדבקים. יש לשטוף בארות פעמיים עם PBS מחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס.
    9. הוסף את המדיה הממוזגת שחוממה מראש ל-37 מעלות צלזיוס לקבוצות המתאימות:
      קבוצה 1: מדיה טרייה
      קבוצה 2: 1x מדיה מותנית של תאי HeLa לא מזדקנים
      קבוצה 3: 2x מדיה מותנית של תאי HeLa לא מזדקנים
      קבוצה 4: 3x מדיה מותנית של תאי HeLa לא מזדקנים
      קבוצה 5: 1x מדיה מותנית של תאי HeLa מזדקנים
      קבוצה 6: 2x מדיה ממוזגת של תאי HeLa מזדקנים
      קבוצה 7: 3x מדיה ממוזגת של תאי HeLa מזדקנים
    10. הכנס את תצוגת הלוח האלקטרוני למערכת ניתוח התאים בזמן-אמת ולחץ על הפעל כדי לחדש את הניטור בזמן-אמת של ערכי אינדקס התא במרווחים של 15 דקות למשך 48 שעות (איור 2).
    11. כבו את מערכת ניתוח התאים בזמן אמת כאשר זמן הניסוי נגמר (איור 4A).
  7. הדמיה של תאים בתצוגת הלוח האלקטרוני
    1. בחן ישירות את תצוגת הלוח האלקטרוני תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 10 (איור 4B). מכיוון שארבע שורות של חיישני מיקרו-אלקטרודות הוסרו ממרכז כל באר בתצוגת הלוח האלקטרוני, נוצר מקום כדי לאפשר ניטור תאים על ידי מיקרוסופיה.
  8. ניתוח נתונים
    1. לנרמל את ערכי ה-CI בנקודת הזמן שבה המדיה המותנית המרוכזת ניתנה לתאי ה-HeLa הלא מזדקנים.
    2. לחץ על כפתור ניתוח נתונים כדי לחשב את קצב ההתפשטות והכמות באמצעות אינדקס התא המקסימלי ונתוני השיפוע המתקבלים ממערכת ניתוח התאים בזמן-אמת (איור 2). לאחר מכן, נתחו את הנתונים באמצעות תוכנה סטטיסטית מתאימה (איור 4C,D).

3. מודל 3: ניטור בזמן אמת של אינטראקציה בין תא לתא

  1. תרבית תאים והשראת הזדקנות (ימים 1-2)
    1. זרע 8 x 105 תאי HeLa לתוך בקבוק תרבית T25 המכיל 5 מ"ל של מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), פניצילין (100 יחידות / מ"ל) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) ותאי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO2.
    2. למחרת, החלף את מדיום התאים ב -5 מ"ל של מדיום שלם טרי. טפל בתאים עם דוקסורוביצין 300 ננומטר ישירות על ידי הוספה למדיום כדי לגרום להזדקנות תאית. שמור על בקבוק T25 בחממה עם 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
  2. זריעת תאים לא מזדקנים (יום 4)
    1. זרע 8 x 105 תאי GFP-HeLa (בקרה לא מזדקנת) בבקבוק T25 חדש ב-5 מ"ל של DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) ונשמר באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    2. זרע 8 x 105 תאי HeLa (בקרה לא מזדקנת) בבקבוק T25 חדש ב-5 מ"ל של DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) ונשמר באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  3. בצע אישור על השראת הזדקנות כמתואר בשלב 1.3 (יום 5).
  4. תרבית משותפת של תאים
    1. בדוק תאים שטופלו בדוקסורוביצין, GFP-HeLa לא מטופל ותאי HeLa לא מטופלים תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה לפני זריעת תאים. תחת המיקרוסקופ, לתאים מזדקנים יש מורפולוגיה מוגדלת הרבה יותר מאשר לתאים רגילים.
    2. שטפו את כל שלושת צלוחיות T25 עם 5 מ"ל PBS סטרילי מחומם מראש, ואז שאפו. הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין שחומם מראש ושמור על הצלוחיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות כדי לנתק תאים.
    3. נטרל את הטריפסין עם 5 מ"ל של DMEM מלא בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל).
    4. צנטריפוגה של התאים ב-500 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדוריות התא ב-5 מ"ל של DMEM מלא בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל).
    5. ספרו את התאים הקיימים בשיטת אי הכללת הצבע הכחול של טריפן באמצעות המוציטומטר. תאי זרעים ב-200 מיקרוליטר של DMEM מלא בתוספת 10% סרום בקר עוברי, פניצילין (100 U/ml) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל).
    6. תאי זרע על μ - החלקה בגובה 8 בארות תחת שלוש הגדרות ניסוי שונות:
      קבוצה 1: 7 x 103 תאי GFP-HeLa
      קבוצה 2: 18 x 103 תאי HeLa לא מזדקנים + 7 x 103 תאי GFP-HeLa
      קבוצה 3: 18 x 103 תאי HeLa מזדקנים + 7 x 103 תאי GFP-HeLa
    7. שמור על μ ההחלקה למשך 8 שעות לחיבור ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5% CO2. לאחר 8 שעות, שטפו את התאים עם PBS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) פי 2 כדי למנוע את השפעת הסרום על התאים.
    8. הוסף 200 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום המכיל פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) לכל באר.
  5. הגדרת מיקרוסקופ
    1. הפעל את בקר הטמפרטורה ואת בקר CO2 ואפשר למערכת הדגירה העליונה להתייצב למשך 30 דקות.
    2. בדוק את הגדרות הריכוז והטמפרטורה של CO2 באופן ידני וודא שמגיעים לתנאים פיזיולוגיים (5% CO2, 37 °C).
    3. הפעל את מיקרוסקופ הקרינה ההפוך ואפשר למערכת להשלים כיול עצמי. הפעל את מקור האור הקרינה. הפעל את תוכנת ההדמיה והניתוח כדי לשלוט בפרמטרי הדמיה וברכישת תמונה.
  6. הדמיית דולג זמן
    1. הנח את השקופית על תא הדגירה העליון של המיקרוסקופיה הקרינה ההפוכה עם מצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה. פתחו את התוכנה ובחרו במצבי חלק X, Y, Z ו-T, ובצעו ניסויים בהגדרות רכישה (איור 5A).
    2. בחר אובייקט פי 20 עם ניגודיות גבוהה עבור הדמיית פלואורסצנציה וניגודיות פאזה (איור 5A). הוסף את ערוצי ניגודיות הפאזה והפלואורסצנציה (מסנן FITC) כדי לאפשר הדמיה בשני האופנים (איור 5A).
    3. לחץ על כפתור חי כדי להתחיל הדמיית תאים חיים, ולאחר מכן הבא את התאים למיקוד תחת ניגודיות פאזה (איור 5A). פתח את חלון z-stack וסמן את מיקום התאים המעניינים (המכילים גם תאי HeLa מזדקנים/לא מזדקנים וגם תאי GFP HeLa). נווט את ה-stage בין בארות באמצעות בקר ה-stage האוטומטי, המאפשר מיקום מדויק של האזורים שנבחרו לסימון מיקום (איור 5A).
      הערה: באופן זה, ניתן לבחור יותר מאזור אחד באותה באר של שקופית.
    4. העבר את הערוץ לתעלת הקרינה כדי להתחיל בהדמיה פלואורסצנטית. הגדר את הגדרות החשיפה (89.506 אלפיות השנייה), הגבר (10) ועוצמה (136) המתאימות (איור 5A).
      הערה: פרמטרים אלה משתנים בהתאם לעוצמת הקרינה של התאים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי.
    5. בחר מרווח z-stack של μm, הגדר את המיקום העליון והתחתון והגדר את מחסנית z תחת ניגודיות פאזה (איור 5A). לחץ על עצור כדי לסגור את האפשרות Live.
    6. הגדר את משך הזמן (48 שעות) ואת מרווח הזמן (30 דקות) באמצעות השדות משך זמן ומרווח זמן להדמיית קיטועי זמן.
    7. לחץ על התחל כדי להתחיל בהדמיה במשך 48 שעות (איור 5A). שמור את הפרויקט לאחר 48 שעות (איור 5A).
    8. בכל נקודת זמן (0 שעות ו-48 שעות), בחר את המסגרת הטובה ביותר מערימת ה-z, וייצא את התמונה (איור 5A).
    9. ספרו את התאים החיוביים ל-GFP ב-0 שעות ו-48 שעות, חישבו את אחוז העלייה בתאים חיוביים ל-GFP ונתחו את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה (איור 1D,E).
  7. יצירת סרט
    1. לחץ על הצג גלריה כדי להציג את כל התמונות שצולמו מאורגנות לפי נקודות זמן ושכבות z-stack (איור 5B).
    2. עבור כל נקודת זמן, לחץ לחיצה ימנית על התמונה הממוקדת ביותר מערימת ה-z המתאימה ובחר בחר אגודלים בשורה. שמור את המסגרות שנבחרו (איור 5B).
    3. חזור על תהליך זה בנפרד עבור כל עמדה. כדי לסייע בבחירת התמונות הממוקדות ביותר, השתמש בפונקציה Find Best Focused Frames. שמור תמונות שנבחרו באמצעות האפשרות Save Selected Frames. התמונות השמורות מועלות אוטומטית לקטע Open Project.
    4. לחץ לחיצה ימנית על הסרט ובחר ייצוא תמונה לאחר שרצפי התמונות נטענים במלואם.
    5. נווט אל סרט הכרטיסייה בחלון הייצוא, הגדר את קצב הפריימים הרצוי (פריימים לשנייה), בחר אפשרויות נוספות כגון סרגל קנה מידה, חותמת זמן וכו', במידת הצורך, וסיים את הייצוא על ידי בחירת יעד באמצעות האפשרות עיון (איור 5B, וידאו 1, וידאו 2 ווידאו 3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערך ניסויים מייצג זה חקר את ההשפעות הפוטנציאליות של פנוטיפ ההפרשה הקשור להזדקנות שמקורו בתאי סרטן מזדקנים על תאי סרטן אחרים. לכן, אושר לראשונה אם טיפול בדוקסורוביצין במשך 72 שעות יכול לגרום להזדקנות בתאי HeLa באמצעות צביעת SA-β-Gal. בתאים מזדקנים, האנזים הליזוזומלי β-גלקטוזידאז נשאר פעיל גם ב-pH נמוך ומבקע את המצע הכרומוגני X-gal, ויוצר משקע כחול17. לפיכך, נוכחותם של תאים מוכתמים בכחול מעידה על אינדוקציה של הזדקנות תאית. הטיפול בדוקסורוביצין הוביל לאינדוקציה מובהקת סטטיסטית של הזדקנות בתאי HeLa ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות דינמיות של תאים סרטניים במיקרו-סביבה שלהם חיוניות להתקדמות הגידול, מה שמשפיע על השראת גרורות והתפתחות גידול משני. כמו כן, דווח כי סרטן מזדקן ותאי סטרומה מווסתים את המיקרו-סביבות של הגידול באמצעות הגורמים המופרשים מתאים מזדקנים4. גורמים אלה מעוררים התפשטות תאים, נדידה, פלישה, התמיינות ומגבירים את העמידות לתרופותמרובות 4,13. לפיכך, הבנת ההשפעה של SASP על תאי הסרטן הסובבים חיונית להבנת המיקרו-סביב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי יחידת הפרויקט המדעי של אוניברסיטת גאזי (קוד מענק: TOA-2021-7321) ו-TUBITAK (קוד מענק: 122S564 ו-223S969).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
&מיקרו;-שקופית 8 באר גבוההfigure-materials-1bidi80806
0.05% Trypsin-EDTA (1X)גיבקו25300-054
יחידות סינון צנטריפוגליות Amicon Ultra (Ultracel-3K)מיליפורUFC200324
חממת CO2 (37 מעלות; C, 5% CO<תת->2תת->)סניו
CO2-Controller 2000 Pecon 
DMEMגיבקו41966-029
דוקסורוביציןטוקריס2252
לוחית E INSERT 16 ACEA Biosciences/Agilent6 465 382 001
E-plate VIEW 16 ACEA Biosciences/Agilent300 601 140
FBSגיבקוA5256701
תאי הלהfigure-materials-2מכון AP, אנקרה, טורקיהHÜ KÜ K לא: 90061901 
Leica DMi8 מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך&nb;לייקה
סליין ממוגן בפוספט (PBS)גיבקו70011-044
ערכת צביעה קשורה להזדקנות &בטא;-גלקטוזידאז (SA-β-gal) איתות סלולרי9860s
מערכת דגירה של שלב ראשיPecon 
Temp-controller 2002-2 Pecon 
צבע כחול של טרייפןסיגמאT8154
xCELLigence RTCA DP system ACEA Biosciences/Agilent

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 196(2024).
  2. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 25, 585-621 (1961).
  3. Ewald, J. A., Desotelle, J. A., Wilding, G., Jarrard, D. F. Therapy-induced senescence in cancer. J Natl Cancer Inst. 102 (20), 1536-1546 (2010).
  4. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent Cells in Cancer Therapy: Friends or Foes. Trends Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  5. Wang, J., et al. The Common Hallmarks and Interconnected Pathways of Aging, Circadian Rhythms, and Cancer: Implications for Therapeutic Strategies. Research (Wash D C). 8, 0612(2025).
  6. Simay, Y. D., Ozdemir, A., Ibisoglu, B., Ark, M. The connection between the cardiac glycoside-induced senescent cell morphology and Rho/Rho kinase pathway. Cytoskeleton (Hoboken). 75 (11), 461-471 (2018).
  7. Ozdemir, A., Simay Demir, Y. D., Yesilyurt, Z. E., Ark, M. Senescent cells and SASP in cancer microenvironment: New approaches in cancer therapy. Adv Protein Chem Struct Biol. 133, 115-158 (2023).
  8. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  9. Heckenbach, I., et al. Nuclear morphology is a deep learning biomarker of cellular senescence. Nat Aging. 2 (8), 742-755 (2022).
  10. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  11. Kuilman, T., Peeper, D. S. Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. Nat Rev Cancer. 9 (2), 81-94 (2009).
  12. Simay Demir, Y. D., Ozdemir, A., Sucularli, C., Benhur, E., Ark, M. The implication of ROCK 2 as a potential senotherapeutic target via the suppression of the harmful effects of the SASP: Do senescent cancer cells really engulf the other cells. Cell Signal. 84, 110007(2021).
  13. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discov. 7 (2), 165-176 (2017).
  14. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Multifunction co-culture model for evaluating cell-cell interactions. Methods Mol Biol. 1202, 29-36 (2014).
  15. Ozdemir, A., et al. Cardiac glycoside-induced cell death and Rho/Rho kinase pathway: Implication of different regulation in cancer cell lines. Steroids. 109, 29-43 (2016).
  16. zdemir, A., Ibisoglu, B., Simay, Y. D., Polat, B., Ark, M. Ouabain induces Rho-dependent rock activation and membrane blebbing in cultured endothelial cells. Mol Biol. 49 (1), 138-143 (2015).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Simay Demir, Y. D., et al. Antimigratory effect of pyrazole derivatives through the induction of STAT1 phosphorylation in A549 cancer cells. J Pharm Pharmacol. 73 (6), 808-815 (2021).
  19. Ariffin, N. S. The CellProfiler pipeline analysis of cell migration. Acta Histochem. 125 (7), 152074(2023).
  20. Li, D., et al. Decoding the crossroads of aging and cancer through single-cell analysis: Implications for precision oncology. Int J Cancer. 157 (5), 807-818 (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Senescent CellsConditioned MediaCo CultureHeLa

מאמרים קשורים