מאמר שיטה

חשיפת שינוי זרחון באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל SDS-PAGE של תג פוס ובדיקת קינאז במבחנה

DOI:

10.3791/68884

⸱

8 באוגוסט 2025

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 2Medical School of Nanjing University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר נהלים לאיתור שינויים בשינויי זרחון של חלבוני מטרה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל Phos-tag בדגימות קליניות ובבדיקות קינאז במבחנה .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרחון הוא שינוי קלאסי לאחר תרגום המווסת את תפקוד החלבון. חלבונים מכילים בדרך כלל מספר אתרי זרחון פוטנציאליים, הניתנים לשינוי על ידי קינאזות שונות במקומות שונים. חקר שינויי זרחון של חלבוני מטרה במחלה דורש לעתים קרובות נוגדנים ספציפיים לפוספו. עם זאת, אפשרויות מסחריות עשויות להיות מוגבלות לאתר יחיד או לא זמינות לחלוטין. כאן, מתוארת שיטה לאיתור שינויים בשינויי זרחון של חלבוני מטרה בדגימות קליניות באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל Phos-tag ולזיהוי אתרי זרחון מפורטים באמצעות מבחני קינאז במבחנה . חלבונים זרחניים הקשורים ל-Phos-tag מציגים שיעורי נדידה איטיים יותר באלקטרופורזה של ג'ל SDS-PAGE, מה שמאפשר ניתוח כמותי למחצה של שינויי זרחון ברקמות מחלה בהתבסס על עוצמת הפיקסלים הממוצעת של הרצועות הנודדות לאט. על ידי שילוב של Phos-tag SDS-PAGE עם אימונובלוטינג באמצעות נוגדנים ספציפיים לפאן כנגד מספר חלבונים מועמדים, חוקרים יכולים לזהות ביעילות חלבוני מטרה עם שינויי זרחון. לאחר סינון קינאזות מועמדים, מבוצעות בדיקות קינאז במבחנה עם חלבון המטרה, והתוצרים הזרחניים המתקבלים נתונים לספקטרומטריית מסה לזיהוי מדויק של האתר. שיטה זו אינה דורשת נוגדנים ספציפיים לחלבון זרחני, המאפשרים סריקה בקנה מידה גדול של דגימות רקמה כדי לזהות מצבי זרחון משתנים במחלה. יתר על כן, ניתן להשתמש באתרי הזרחן שזוהו לפיתוח נוגדנים ספציפיים לניתוח כמותי ולוקליזציה ברקמות המחלה, ולספק תובנות עמוקות יותר לגבי תפקידיהם התפקודיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרחון הוא שינוי מפתח לאחר תרגום לווסת את הלוקליזציה התת-תאית, פעילות הקינאז ופעילות השעתוק של חלבונים. יותר מ-500 גנים של חלבון קינאז נמצאו בגנום האנושי, המעורבים בהעברת אותות, ביטוי גנים ואינטראקציה בין חלבוןלחלבון 1. זרחון ודפוספורילציה נמצאים בשליטת קינאזות שונות, הניתנות להפיכה במהירות כדי לווסת את הידבקות התאים, התפשטות התאים והתמיינות התאים2. עם זאת, שינויים חריגים בזרחון חלבונים אחראים למחלות אנושיות רבות, כולל גידולים, הפרעות אוטואימוניות, ניוון עצבי ותת-פוריות 3,4,5.

פרופיל פוספו-פרוטאומי של דגימות קליניות מניב חלבונים זרחניים מועמדים מרובים6. כדי לחשוף את שינויי הזרחן העיקריים במחלות אנושיות, יש צורך בשיטה קלה ויעילה לאיתור מצב הזרחן של חלבוני מטרה ספציפיים. זרחון באתרים שונים יכול להוביל לשינויים תפקודיים מובהקים בחלבון. לפיכך, שימוש בנוגדנים ספציפיים לזרחון המכוונים לאתרים מסוימים של חומצות אמינו הוא ללא ספק השיטה הטובה ביותר לאיתור שינויים בזרחון חלבון. עם זאת, נוגדנים ספציפיים לפוספו מאופיינים היטב נעדרים עבור חלבונים רבים. בנוסף, נדרשת גישה מתאימה יותר לזיהוי אתרי זרחון פוטנציאליים חדשים. זרחון בשאריות חומצות אמינו ספציפיות משנה לעתים קרובות את קצב הנדידה של חלבון באלקטרופורזה של ג'ל, ורצועות נודדות איטיות יותר יכולות לשקף שינויים במצב זרחון7. עם זאת, שינויי הניידות הללו הם בדרך כלל עדינים, מה שמקשה על ההבחנה ביניהם. Phos-tag הוא תרכובת כימית מסונתזת שתוכננה מתחום קטליטי של פוספטאז אלקליין כמודל, שיכול ללכוד שאריות Ser/Thr/Tyr ו-His/Asp/Lys זרחניות. לכן, צימוד תג זרחן מגביר ביעילות את הבדלי קצב הנדידה בין חלבונים זרחניים ולא זרחניים, תוך הבחנה בין וריאציות במספר אתרי הזרחן8.

מתודולוגיה זו מבוססת Phos-tag לאיתור שינויים בזרחון חלבון מטרה בדגימות רקמה מציעה יתרונות מובהקים על פני גישות קונבנציונליות. באופן מכריע, הוא מבטל את הדרישה לנוגדנים ספציפיים לפוספו, ובמקום זאת משתמש בנוגדנים סטנדרטיים ספציפיים לחלבון בדרגת WB לזיהוי. הצורות הזרחניות והלא זרחניות של חלבוני המטרה נפתרות כרצועות נפרדות במהלך תג הזרחן SDS-PAGE, מה שמאפשר הערכה כמותית למחצה של שינויים ברמת הזרחן במצבי מחלה באמצעות ניתוח השוואתי של עוצמת הלהקה. זרימת העבודה בפרוטוקול זה כוללת: (1) הפרדת SDS-PAGE של דגימות חלבון, (2) בדיקת אימונו-בלוט למטרות זרחניות, (3) בדיקות קינאז במבחנה עם קינאזות מועמדות שאומתו על ידי נוגדנים פוספו-Ser/Thr. ניתוח ספקטרומטריית מסה עוקב (שנערך על ידי פלטפורמת שירות חיצונית) מזהה אתרי זרחון כדי לאפשר פיתוח נוגדנים ספציפיים לאתר; המתודולוגיה המפורטת אינה כלולה בפרוטוקול הנוכחי. יש לציין כי גישה זו יושמה בהצלחה לאיתור שינויים בזרחון Nur77 בדגימות קליניות, זיהוי Mst1 קינאז כמווסת במעלה הזרם של זרחון Nur77 ופיתוח נוגדן פוספו-ספציפי לאתר לזיהוי קליני של זרחון בתראונין 366 של Nur779. לכן, גישה זו מוכיחה את עצמה כבעלת ערך מיוחד בשלבי מחקר ראשוניים בעת חקירת חלבונים מועמדים מרובים, מכיוון שהיא מאפשרת סינון בקנה מידה גדול של שינויים בסטטוס הזרחן על פני מטרות רבות באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ועדות הביקורת המוסדיות בבית החולים נאנג'ינג מגדל תוף אישרו את המחקר בבני אדם (2013-408081-01). הפרוטוקול הנוכחי נקבע באמצעות רקמת רירית הרחם כמודל מייצג. עם אופטימיזציה מתאימה, ניתן להרחיב מתודולוגיה זו לדגימות קליניות אחרות, כולל אך לא רק רקמות גידול למיצוי חלבון וניתוחים עוקבים. ביופסיית רירית הרחם מבוצעת בשלב אמצע ההפרשה מנשים פוריות (קבוצת ביקורת) ונשים עם כישלון חוזר של השתלת עוברים העוברות הפריהחוץ גופית-העברת עוברים (קבוצת מחלה). כל המטופלים נתנו הסכמה מדעת לפני הליך הדגימה. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת דוגמאות

  1. שטפו את דגימות הרקמה הטריות שהתקבלו פעמיים עם PBS מקורר מראש כדי להסיר תאי דם, והפרידו כ-100 מ"ג רקמה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  2. הנח את הרקמה בצינור טחינה תחתון עגול של 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של מאגר ליזה של חלבון רקמות (150.0 מילימול/ליטר NaCl, 1.0% NP-40, 50.0 ממול/ליטר Tris pH 8.0, 0.5% נתרן דאוקסיכולאט, קוקטייל מעכב פרוטאז וקוקטייל מעכב פוספטאז 2 ו-3).
  3. הגדר את מהירות מפזר הרקמות המהיר לרמה 5 (מתוך 6 רמות), וטחן את הרקמה למשך 10 שניות, ולאחר מכן 30 שניות של דגירה על קרח. חזור על תהליך זה 5 פעמים כדי להשיג רקמה הומוגנית.
  4. לייז את ההומוגנאט על ידי סיבוב איטי על שייקר ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ו-13,000 × גרם למשך 10 דקות, ולאסוף את הסופרנטנט.
  5. קבע את ריכוז החלבון בשיטת BCA.
  6. קח בסך הכל 300 מיקרוגרם חלבון, התאם לנפח שווה וערבב עם 4× מאגר דגימת חלבון Laemmli. דנטורציה של התערובת על ידי חימום ב-95 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות, קירורה לטמפרטורת החדר ולאחר מכן טעינתה לניתוח נוסף.
    הערה: לפני שלב 2, מומלץ לבצע ניתוחי כתמים מערביים קונבנציונליים כדי לזהות את החלבון המעניין באמצעות סך הנוגדנים כדי להעריך את רמות הביטוי.

2. הכנת ג'ל של ג'ל Phos-tag SDS-PAGE

  1. הכן 100 מ"ל 30% w/v אקרילאמיד/N, N'-מתילן-ביסקרילאמיד תמיסה מעורבת על ידי הוספת 29.0 גרם אקרילאמיד ו-1.0 גרם N, N'-מתילן-ביסקרילאמיד.
    הערה: יש לשמור על 4 מעלות צלזיוס בחושך.
  2. הכן תמיסת Tris-HCl של 1.5 mol/L (pH 8.8), תמיסת Tris-HCl של 0.5 mol/L (pH 6.8), תמיסת SDS של 10% w/v ותמיסת אמוניום פרסולפט של 10% w/v כפי שנעשה בשימוש ב-SDS-PAGE קונבנציונאלי.
  3. הכן תמיסת Phos-tag של 5.0 mmol/L ותמיסה של 10 mmol/L MnCl2 ספציפית לג'ל SDS-PAGE של Phos-tag.
  4. הכן תמיסת ג'ל ממיסה, במקרה של הכנת תמיסת 10 מ"ל עם ג'ל פוליאקרילאמיד 6 w/v% עם תמיסת 50 μM Phos-tag ו-100 μM MnCl2, על ידי ערבוב של 2 מ"ל 30% (w/v) תמיסה מעורבת אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד, 2.5 מ"ל 1.5 מול/ליטר תמיסת Tris/HCl (pH 8.8), 0.1 מ"ל 5.0 מילימול / ליטר תמיסת פוס-טאג, תמיסת 0.1 מ"ל 10 מילימול/ליטר MnCl2 , 0.1 מ"ל תמיסת SDS של 10% (w/v), 10 מיקרוליטר של TEMED ו-5.14 מ"ל של מים מזוקקים.
  5. מערבל בעדינות את תמיסת הג'ל הממיס המוכנה כדי להבטיח הומוגניות, ולאחר מכן הנח את צינור תמיסת הג'ל במייבש ואקום והחל ואקום (0.1 מגה פיקסל) למשך 2 דקות עד שלא יישארו בועות גלויות.
  6. מוסיפים 50 מיקרוליטר של 10% אמוניום פרסולפט ומערבבים בעדינות אך ביסודיות.
  7. הכניסו מיד את התמיסה לתוך קלטת הג'ל המורכבת עד שהיא מגיעה ל~1 ס"מ מתחת לקצה העליון של הצלחת הקצרה. הימנע מהכנסת בועות.
  8. שכבו בזהירות 0.5 מ"ל מים מזוקקים על גבי הג'ל כדי לא לכלול אוויר ולהבטיח ממשק שטוח. אפשר פילמור בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות.
  9. במקביל, הכינו תמיסת ג'ל סטנדרטית של Tris-HCl (4.5% w/v ג'ל פוליאקרילאמיד) על ידי ערבוב של 0.6 מ"ל 30% (w/v) תמיסה מעורבת אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד, 1 מ"ל 0.5 מול/ליטר תמיסת Tris-HCl (pH 6.8), 40 מיקרוליטר 10% (w/v) תמיסת SDS, 4 מיקרוליטר TEMED ו-2.33 מ"ל מים מזוקקים. מערבולת בעדינות ודגה.
  10. ודא שהג'ל התמצק לחלוטין (הטה את קלטת הג'ל כדי להתבונן בהטיה של שכבת הנוזל העליונה תוך אישור חוסר התנועה של ממשק הביניים). שופכים בזהירות את כיסוי המים ואז מסננים לחלוטין.
  11. הוסף 20 מיקרוליטר של 10% אמוניום פרסולפט לתמיסת ג'ל הערימה המוכנה, ערבב בעדינות ופיפטה אותו מיד על גבי הג'ל הממיס.
  12. הניחו בזהירות מסרק של 10 או 15 בארות בתמיסת הג'ל הערימה, והימנעו מבועות. אפשר לג'ל הערימה להתפלמר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    הערה: הכינו תמיד את הג'ל ממש לפני השימוש. יש למטב את ריכוזי ה-Phos והאקרילאמיד עבור כל חלבון מעניין.

3. אלקטרופורזה של תג Phos SDS-PAGE

  1. הרכיבו את ציוד האלקטרופורזה ומלאו את תאי האלקטרודות במאגר ריצה Tris/Glycine/SDS קונבנציונאלי.
  2. טען דגימת חלבון של 30 מיקרוגרם לכל באר באמצעות מיקרופיפטה.
  3. בצע אלקטרופורזה בתנאי זרם קבוע (30 mA/gel) עד שהברומופנול הכחול מגיע לתחתית הג'ל הממיס.
  4. השרו את הג'לים במאגר העברת SDS-PAGE ללא מתנול עם 5 מ"מ EDTA למשך 10 דקות פעמיים כדי להסיר קטיונים דו-ערכיים.
  5. העבירו את החלבונים על קרום ה-PVDF ב-90 וולט למשך 90 דקות באמצעות מערכות ספיגה רטובות/מיכלים.

4. אימונובלוטינג ואנליזה

  1. חסום את הממברנה בתמיסה של 5% של חלב רזה או אבקת חלבון סרום בקר (מדולל בתמיסת 1×Tris-Borate-Sodium Tween-20, TBST) בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  2. יש לדלל את הנוגדן העיקרי כנגד חלבון המטרה ביחס מתאים ולדגור עם הממברנה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. שוטפים את הממברנה 3 פעמים עם TBST, 10 דקות לכל שטיפה, בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
  4. דגרו את הממברנה עם נוגדן משני מצומד HRP בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  5. שוטפים את הממברנה 3 פעמים עם TBST, 10 דקות לכל שטיפה, בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
  6. דגירה עם מצע הכימילומינסנציה המשופר בחושך למשך דקה אחת, ולאחר מכן חשיפה.
  7. צלם את התמונות באמצעות מערכת תיעוד ג'ל אוטומטית, וכימת את רצועות המטרה (נדידה איטית של חלבון מטרה זרחני וחלבון מטרה שאינו זרחני הנודד במהירות) לעוצמת גווני אפור באמצעות תוכנת ImageJ.
    הערה: לא ניתן להשתמש בכתמים מערביים של ג'ל Phos-Tag לביצוע הקצאות משקל מולקולריות.
  8. חשב את היחס בין רצועות זרחניות הנודדות לאט לרצועות שאינן זרחניות הנודדות במהירות עבור כל מדגם, ונתח את ההבדל הסטטיסטי של אחוז הזרחן בין הקבוצות.

5. משקעים חיסוניים של חלבון המטרה

  1. בנה פלסמידים לביטוי המקודדים תגי אפיטופ מתויגים ב-FLAG (או תגי אפיטופ חלופיים, כולל אך לא רק HA, GFP, GST או His) מוטציות פוספו-מוטציות מסוג בר או ספציפיות לאתר של חלבון המטרה.
  2. Transfect תאי HEK293 עם פלסמידים לביטוי באמצעות Lipofectamine 3000 על פי פרוטוקול היצרן.
  3. תאי ליז במאגר ליזה של חלבון רקמה של 1 מ"ל כמתואר בשלב 1 כדי לחלץ חלבון סופרנטנט.
  4. דגרו את הסופרנטנט עם 20 מיקרוליטר של ג'ל זיקה Anti-FLAG M2 למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם סיבוב.
  5. צנטריפוגה (1000 × גרם, 3 דקות), אוספים חרוזי אגרוז ושוטפים עם 10 נפחי עמודות של TBS כדי להסיר חלבונים לא קשורים במיוחד.
  6. ממיסים פפטיד FLAG ב-TBS לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם/מ"ל.
  7. הסר את חלבון ההיתוך FLAG הקשור מג'ל הזיקה נגד FLAG M2 על ידי פליטה תחרותית עם חמישה נפחים של עמודה אחת של תמיסת פפטיד FLAG (השתמש בתמיסה של 100 מיקרוליטר עבור חרוזי אגרוז של 20 מיקרוליטר) למשך 5-10 דקות עם ערבוב עדין.
  8. צנטריפוגה (1000 × גרם, 3 דקות) ולאסוף סופרנטנט.
    הערה: אם הקינאז ידוע, המשך לשלב 6; אחרת, זהה תחילה קינאזות פוטנציאליות באמצעות סינון דו-היברידי של שמרים או חיזוי ביואינפורמטיקה (למשל, באמצעות PhosphositePlus או מערכת חיזוי מבוססת קבוצה) לפני שתמשיך לשלב 6.

6. בדיקת קינאז במבחנה לזיהוי חומצות אמינו זרחניות

  1. הכן מאגר קינאז (30 מיקרוליטר לתגובה): 40 מ"מ HEPES pH7.6, 10 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ EGTA, 1 מ"מ DTT, 2.5 מ"מ β-גליצרופוספט, 200 מיקרומטר ATP, 100 ננוגרם של קינאז פעיל, חלבון היתוך FLAG משקע חיסוני.
  2. דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתרמו-מיקסר עם ערבול עדין.
  3. עצור את התגובות על ידי הוספת 10 מיקרוליטר 4× מאגר Laemmli, ודנאציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  4. בצע אלקטרופורזה קונבנציונלית של SDS-PAGE באמצעות חלבון היתוך FLAG משקע חיסוני המגיב עם או בלי קינאז פעיל.
  5. בדיקה עם נוגדן Anti-phospho-Thr ונוגדנים Anti-phospho-Ser לזיהוי חומצות אמינו זרחניות. בדיקה עם נוגדן נגד דגל כבקרה (ראה טבלת החומרים).
  6. השלם את הניתוח והניתוח כמתואר בשלב 4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרופיל הפוספו-פרוטאומי הראשוני של דגימות אנושיות מקבוצת הביקורת וקבוצת המחלה זיהה את Nur77 כמועמד לחלבון זרחני דיפרנציאלי. כדי להעריך את היעילות של Phos-tag SDS-PAGE בזיהוי זרחון חלבון Nur77, בוצע ניסוי Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE. לאחר מיצוי חלבון כולל מדגימות רקמה, 30 מיקרוגרם של חלבון נטען והופרד על ידי אלקטרופורזה של ג'ל Mn2+-Phos-tag, ואחריו העברה לקרום PVDF. אימונובלוטינג בוצע באמצעות נוגדן ראשוני Nur77 ואחריו נוגדן משני נגד ארנב מצומד HRP, עם זיהוי על ידי כימילומינסנציה ECL. נצפו שתי רצועות נפרדו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגישה המבוססת על Phos-tag לאיתור שינויים בזרחון של חלבוני מטרה ברקמות קליניות מציעה יתרונות משמעותיים למחקר זרחון חלבונים. חלבונים זרחניים מציגים ניידות אלקטרופורטית מופחתת עקב קשירת Phos-tag, המאפשרת סינון תפוקה גבוהה של מצב הזרחן של חלבונים מועמדים ללא צורך בנוגדנים ספציפיים לפוספו. זה חשוב במיוחד עבור פרופיל ראשוני בקנה מידה גדול של חלבונים מועמדים מרובים. ניתן לתעדף חלבונים עם שינויים בזרחון לבדיקת קינאז במבחנה הבאה כדי לזהות אתרי זרחון ספציפיים.

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים פוטנציאליים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82271698) והקרן למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (BK20231117).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% תמיסת SDSSangon BiotechB548118
10x Tris/Glycine/SDSBIO-RAD
1610732 4 פעמים;   מאגר דגימת חלבון LaemmliBIO-RAD1610747
אקרילאמידסנגון ביוטקA601032
אמוניום פרסולפטסנגון ביוטקA100486
אנטי-FLAG M2 ג'ל זיקהMilliporeA2220
ערכת כימילומינסנציה משופרתThermoFisher32106
נוגדןFLAG CST14793
דגל  פפטידMilliporeF3290
נוגדן משני מצומד HRPBioworld TechnologyBS13278
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015
Mini Trans-Blot CellBIO-RAD1703930
Mini-PROTEAN Tetra תא אלקטרופורזה אנכיתBIO-RAD1658005
Mst1 נוגדןCST3682
N, N'-methylene-bisacrylamideSangon BiotechA600025
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine(TEMED)Sangon BiotechA610508
נוגדן Nur773960
SigmaP5726לעיכוב פוספטאזות חלבון טירוזין, חומצה ו פוספטאזות אלקליין
קוקטייל מעכב פוספטאז 3SigmaP0044לעיכוב חלבון פוספטאז 2A, פוספטאזות אלקליין, חלבון פוספטאזות 1 ו-2A
נוגדן פוספו-סריןSigmaP5747
נוגדן פוספו-תראוניןSigmaP6623
פוס-טאג אקרילאמידWako304-93526להכנת Phos-tag SDS PAGE ג'ל
Pierce BCA ערכת בדיקת חלבוןThermo 23227
קוקטייל מעכב פרוטאזSigmaS8830EDTA-Free, טבליות, לעיכוב סרין, ציסטאין, אספרטי ומטאלופרוטיזות
ממברנת PVDF Roche3010040001
ThermoMixerEppendorf2231001127
מפזר רקמותIKAT 10 כדי להשיג רקמה הומוגנית
Tris-HCl Buffer (0.5M, pH 6.8)Sangon BiotechB546020
Tris-HCl Buffer (1.5M, pH 8.8)Sangon BiotechB546019
Vacuum DesiccatorThermoFisher5311-0250להסרת תמיסת הג'ל
ובטא;-MercaptoethanolSigmaM3148
קוקטייל מעכב פוספטאז CST 2

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science (New York, N.Y.). 298 (5600), 1912-1934 (2002).
  2. Lim, S., et al. Regulation of mitochondrial functions by protein phosphorylation and dephosphorylation. Cell Biosci. 6, 25(2016).
  3. Pang, K., et al. Role of protein phosphorylation in cell signaling, disease, and the intervention therapy. MedComm. 3 (4), e175(2022).
  4. Bollu, L. R., Mazumdar, A., Savage, M. I., Brown, P. H. Molecular Pathways: Targeting protein tyrosine phosphatases in cancer. Clin Cancer Res. 23 (9), 2136-2142 (2017).
  5. Martin, L., et al. Tau protein kinases: involvement in Alzheimer's disease. Ageing Res Rev. 12 (1), 289-309 (2013).
  6. Bhardwaj, S., et al. Integrating the analysis of human biopsies using post-translational modifications proteomics. Protein Sci. 33 (4), e4979(2024).
  7. Kristjansdottir, K., Wolfgeher, D., Lucius, N., Angulo, D. S., Kron, S. J. Phosphoprotein profiling by PA-GeLC-MS/MS. J Proteome Res. 7 (7), 2812-2824 (2008).
  8. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
  9. Cai, X., et al. Mst1-mediated phosphorylation of Nur77 improves the endometrial receptivity in human and mice. EBioMedicine. 88, 104433(2023).
  10. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E. Improved Phos-tag SDS-PAGE under neutral pH conditions for advanced protein phosphorylation profiling. Proteomics. 11 (2), 319-323 (2011).
  11. Shih, H. H., et al. An ultra-specific avian antibody to phosphorylated tau protein reveals a unique mechanism for phosphoepitope recognition. J Biol Chem. 287 (53), 44425-44434 (2012).
  12. Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay. J Vis Exp. (135), e57674(2018).
  13. Mehla, J., Caufield, J. H., Uetz, P. Mapping protein-protein interactions using yeast two-hybrid assays. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (5), 442-452 (2015).
  14. Ayati, M., Yilmaz, S., Blasco Tavares Pereira Lopes, F., Chance, M., Koyuturk, M. Prediction of kinase-substrate associations using the functional landscape of kinases and phosphorylation sites. Pac Symp Biocompu. 28, 73-84 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים