מאמר שיטה

חשיפת בקרה אלקטרומכנית של הומאוסטזיס רקמות באמצעות מכשיר מיקרופלואידית דו-שכבתי

DOI:

10.3791/68894

⸱

19 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Mechanobiology Institute, National University of Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4Research Center for Industries of the Future, Westlake University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור מכשיר מיקרופלואידית דו-שכבתי ייחודי לחקר הוויסות האלקטרומכני של הומאוסטזיס של רקמת האפיתל. המכשיר מפעיל זרמים חשמליים פיזיולוגיים סטטיים בניצב למישור הרקמה, ומשפיע על הידבקות תאים, התפשטות ושחול. הדמיית תאים חיים ומדידות מתח מכני חושפות מנגנונים של תהליכים אלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התנהגות התא וגורל התא מושפעים מזרמים חשמליים או שדות אנדוגניים או מופעלים חיצונית. ניתן ליישם אותות חשמליים סטטיים במכשירים מיקרופלואידיים מותאמים אישית כדי לחקות את הסביבה החשמלית בתהליכים פיזיולוגיים איטיים כגון התפתחות, ריפוי פצעים והומאוסטזיס. סוג חשוב של מחקרי חשמל תאים הוא בקרת נדידת התאים על ידי זרמים גלווניים סטטיים במישור בתעלות מיקרופלואידיות פשוטות המחקות זרמי פצע, עם צפיפות זרם של ~0.1-1000 A/m2. עם זאת, בשל גיאומטריה לא תואמת, מכשירים אלה אינם מתאימים לחקר השפעות חשמליות בהומאוסטזיס של רקמות, כאשר תאים מאמצים קוטביות אפיקו-בסיסית והפרש פוטנציאל טרנס-אפיתל (TEPD). כאן, אנו מפרטים מכשיר ייחודי מבוסס מיקרופלואידיקה המפעיל זרמי יונים פיזיולוגיים בניצב למישור שכבות תאי האפיתל המשולבות כדי להפריע ל-TEPD ולחקור את הוויסות החשמלי של מצבים יציבים של רקמות. ההתקנה עשויה מפולימר דו-שכבתי הניתן לריפוי UV המשובץ במצע ג'ל פוליאקרילאמיד רך המצופה בחלבון מטריצה חוץ-תאית לבחירה. מכשיר מיקרופלואידי זה מספק את הגיאומטריה הנכונה ואת המצע החדיר כדי לגרום לזרם יונים אחיד יחסית על פני שכבות התא בקנה מידה סנטימטרי. ההתקנה תואמת להדמיית תאים חיים קונפוקלית ומיקרוסקופ כוח משיכה כדי להסיק מתחים מכניים הנגרמים על ידי הזרמים הטרנס-אפיתליים. באופן מדהים, ההתפשטות, האקסטרוזיה והנדידה של תאים מושפעים באופן קולקטיבי בתוך האפיתל המתכנס בהתאם לכיוון זרם היונים, וגורמים למצב רקמה חדש המאופיין בעוצמות שונות של אינטראקציה בין תאים לתאים, אירועי תאים (מוות והתפשטות) ומבני רקמות. ניתן להבין את התנהגויות התאים הנשלטות חשמלית כלחץ מכני המושרה חשמלית ותגובת תאים. מכשיר ופרוטוקול מיקרופלואידיים חדשניים אלה מספקים את הכלי והתיעוד הנדרשים לקהילות המכנוביולוגיה והביו-הנדסה לחקור השפעות חשמליות בהומאוסטזיס רקמות ולפתח יישומים חדשים של הנדסת רקמות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אותות ביו-אלקטריים הם גורמים ביופיזיקליים חשובים התורמים לשליטה בהתנהגות התא. הדוגמה המפורסמת ביותר היא פוטנציאל הפעולה בתאי עצב ובתאי לב, המעבירים אותות חשמליים למרחקים ארוכים (עד מטר) ובתדרים גבוהים (עד מאות הרץ)1. ניתן להשתמש בפולסים חשמליים המופעלים עם אלקטרודות כדי לעורר ירי פוטנציאלי פעולה והם שימושיים במחקר וביישומים רפואיים2. אותות ביו-חשמליים אנדוגניים בתהליכים פיזיולוגיים איטיים כגון התפתחות, ריפוי פצעים והומאוסטזיס 3,4,5,6,7,8 נמדדו גם הם 9,10 לאורך תקופות של שעות עד ימים. דוגמה חשובה היא שכבות אפיתל קונפלואנט השומרות באופן פעיל על הפרש פוטנציאל טרנס-אפיתל (TEPD) הנע בין כמה לעשרות מילי-וולט 4,11. חתך או פצע בשכבות המשולבות הללו מייצר זרם קצר חשמלי, המונע על ידי הפעילות החשמלית של הרקמה12,13. זרמים מלופפים של עד עשרות μA/cm2 ושדות חשמליים של עד מאות mV/mm דווחו בטכניקות שונות. מחקרים מצביעים על כך שהאותות החשמליים הללו מייצרים רמז כיווני לתאים לנדוד לעבר אתרי פצע או זיהום החשובים לתהליך הריפוי 3,6,14. באופן כללי, גם אותות חשמליים סטטיים (או משתנים לאט) וגם אותות חשמליים המשתנים במהירות חשובים ומעוררים תגובות שונות של תאים או רקמות.

בתחום האותות המשתנים לאט, תופעה חשובה אחת היא תהליך ההגירה המונע חשמלית המכונה "גלוונוטקסיס". ניתן ליישם זרמים גלווניים מבוקרים במישור במכשירים מיקרופלואידיים עם תעלות פשוטות כדי לחקות את זרמי הפצע בעוד שנדידת התאים נחקרת כפונקציה של צפיפות הזרם15,16. שדות חשמליים של 0.1-1000 וולט/מ"ר (צפיפות זרם מקבילה של 0.1-1000 A/m2) נמצאו כמניעים נדידת תאים בסוגי תאים רבים בסביבה זו במבחנה 17, בעוד שמסלולי איתות קנוניים לכימוטקסיס (נדידת תאים מונחית על ידי שיפועים כימיים), כגון PI3K, היו מעורבים בגלוונוטקסיס 7,18. ניתן לייצר מכשירים מיקרופלואידיים "חשופים" לחקר גלוונוטקסיס בטכניקות ליתוגרפיה רכה ומיקרו-ייצור סטנדרטיות19. התקנים אלה כוללים בדרך כלל מצע פולידימתיל-סילוקסן (PDMS) חד-ערוצי-המחובר לשקופית זכוכית (גודל חתך תעלה: מאות מיקרומטרים, אורך: סנטימטרים). אלקטרודות המשמשות לאספקת הזרם הסטטי מותקנות הרחק מאזור התא, ומחוברות עם או בלי גשרי מלח. חיבור גשר המלח עשוי להתבצע על ידי חורים מנוקבים דרך מצע ה-PDMS, מחברים מיקרופלואידיים וצינורות מלאים באגר. מגלשת הזכוכית הפשוטה (בדרך כלל בעובי 170 מיקרומטר) מתחת לתעלה תומכת גם בהדמיית תאים חיים ברזולוציה גבוהה במהלך ניסויי הגלוונוטקסיס, שהיא תכונה חיונית לחקר התהליך.

תפקידם של אותות חשמליים אנדוגניים בשמירה על הומאוסטזיס של רקמות מובן הרבה פחות מזה בריפוי פצעים. סיבה חשובה אחת היא היעדר כלים מתאימים לחקר ההשפעות הללו ברקמות שלמות. המכשיר המיקרופלואידי לגלוונוטקסיס אינו מתאים למטרה זו בשל הגיאומטריה שלו, התומכת רק בזרמים חשמליים במישור. בהקשר של הומאוסטזיס אפיתליאלי, יש צורך במכשיר חדש כדי לשלוט ולהפריע לזרמים TEPD או מחוץ למישור על פני שכבת אפיתל מתכנסת. כדי להשיג את המטרה של יישום צפיפות זרם יונים אחידה יחסית על פני חד-שכבה, תכננו וייצרנו מכשיר מיקרופלואידי, עם חידושים בגיאומטריית המכשיר, שימוש בחומריםויכולות מדידה ביומכניות באתר. היכולת האחרונה חשובה מכיוון שהשפעות חשמליות עשויות להשפיע על התנהגות התא באמצעות צימוד עם מסלולי ביומכניקה ומכניוביולוגיה, אותם ניתן לחקור באמצעות תכונה זו.

מכשיר חדש זה מציג מספר תכונות חדשניות. הוא מתוכנן עם שתי שכבות במקום הערוץ היחיד שנמצא במכשירי הגלוונוטקסיס (חידוש בגיאומטריה), תוך שמירה על החיבור לתאי האלקטרודות בדומה לזה שבאחרון. לשכבה המיקרופלואידית הראשונה יש תעלות להכוונת זרמי יונים לאזור הרקמה (או הרחק ממנו), בעוד שלשכבה השנייה יש פתח שיכוון את הזרם הזה בניצב על פני האפיתל שיושב על גבי השכבה המיקרופלואידית השנייה הזו (איור 1A,B). טכניקות מיקרו-ייצור משמשות לייצור שכבות דקות מספיק כך שהדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה אפשרית למרות ערימת שכבות מיקרופלואידיות המגדילה את עובי הדגימה. עבור החידושים החשובים האחרים, הידרוג'ל סינתטי מפוליאקרילאמיד (PA) משולב במרכז המכשיר, אשר ממלא תפקיד מכריע (איור 1A,B). התכונות הפיזיקו-כימיות של ג'ל זה, כגון כימיה זמינה לציפוי חלבוני מטריצה חוץ-תאיים, חדירות ליונים, כמו גם גמישות ידועה, חיוניות בהתאמה לחיבור וצמיחה של תאים, יישום זרמים מחוץ למישור ומדידת מתח מכני20 במהלך גירוי חשמלי. מבני מחסום משולבים בשכבה 1 של אזור הרקמה לכליאה של תמיסת מבשר ג'ל PA, כפי שנעשה במכשירים מיקרופלואידיים קודמים21 (איור 1A,B). אחרון חביב, מכיוון שפילמור ג'ל PA מעוכב בחמצן במשטחי PDMS חדירים לגז חמצן, חומר נוסף22 משמש לייצור מכשירים, שיכול לאפשר פילמור והדבקה הדוקה של ג'ל PA. כל התכונות החדשניות חיוניות להפעלת המכשיר החדש.

בסך הכל, המחקר המעמיק של אותות ביו-חשמליים סטטיים או משתנים לאט בהומאוסטזיס של רקמות שלמות מתאפשר באמצעות מכשיר חדש זה, שהפרוטוקול שלו יפורט להלן. הפרוטוקול והתוצאות המוזכרות כאן מתמקדים בקו תאי האפיתל של Madin Darby Canine Kidney II (MDCK II), כולל אירועי התא (התפשטות, מוות ושחול ונדידה) ושינויים מבניים ברקמות הנגרמים על ידי הזרם החשמלי. מחקרים אלה מאלפים גם לחוקרים המעוניינים ליישם טכניקה זו כדי לחקור את הוויסות החשמלי של הובלת אפיתל ואינדוקציה של אירועי תאים ושינויים בגורל התא בשכבות תאים ובמערכות מורכבות יותר, כגון תאים ראשוניים ואורגנואידים דו-ממדיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה מספק שלבים לבניית מערך המפעיל זרמים חשמליים סטטיים ומפריע ל-TEPD של אפיתל קונפלואנט ולחקר השפעותיו באמצעות טכניקות הדמיה של תאים חיים ומכניביולוגיה (איור 1). המערך מורכב מהתקנים העשויים משבבים מיקרופלואידיים המחוברים למחסניות, תוספות ומחזיקים כדי לאכלס התקנים מרובים עבור ניסויים מרובים במיקרוסקופ, זוג תאי אלקטרודות המחוברים למד מקור והתקנים, ומכסה תא תא חי לשמירה על תנאי תא חיים נאותים (איור 1C). ניתן למצוא את עקרונות העיצוב ושרטוטי קבצי ה-CAD של המחסנית ורכיבים חשובים אחרים של ההתקנה בקובץ משלים 1. השלבים כוללים: 1) ליתוגרפיה רכה PDMS; 2) ייצור שבבים והרכבת מכשירים; 3) השלמת ההתקנה; ו-4) גידול חד-שכבתי וניסויים בתאים חיים. מידע מפורט לגבי הריאגנטים והחומרים המשמשים בפרוטוקול זה ניתן בטבלת החומרים.

1. ליתוגרפיה רכה PDMS

הערה: סעיף זה מפרט ייצור אלסטומרים PDMS מפרוסות SU-8 (איור 2A, B) ליציקה של שכבות מבוססות דבק הניתנות לריפוי UV של השבב המיקרופלואידי.

  1. ליתוגרפיה רכה PDMS
    1. ייצור פרוסה נפרדת מבוססת SU-8 לכל שכבה מיקרופלואידית, שכבה 1 ו-2, תוך שימוש בטכניקות פוטוליתוגרפיה (קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3).
      הערה: ייצור פרוסות עשוי להימשך חודש אם נשלחת בקשה למתקן מיקרו-ייצור/חדר נקי. ניתן להשתמש גם בטכניקת תחריט סיליקון לייצור פרוסות.
    2. סילן את פרוסת הסיליקון כדי לאפשר פירוק PDMS19.
      1. נקה את הוופל בעזרת אקדח ניפוח אוויר חנקן בלחץ. הפעל את פני השטח של הוופל על ידי הפעלת תהליך פלזמת חמצן קצר (30 שניות, 30 וואט בזרימת גז של 20 סמ"ק O2 בלחץ כור של 1-3 מבר)23.
      2. פיפטה 200 מיקרוליטר של Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane במכסה פלסטיק נקי (קוטר 60 מ"מ, גובה 15 מ"מ). שים את המכסה ליד הוופל במייבש הוואקום (רק לסילניזציה). הפעל את משאבת הוואקום והמתן 1-2 שעות, בעוד הסילאן המאודה מופקד כשכבה חד-שכבתית על פרוסת הסיליקון.
        זהירות: סילאן הוא קורוזיבי ורעיל. ללבוש כפפות ומשקפי מגן, ולפעול במכסה אדים כדי להבטיח פעולה בטוחה.
        הערה: ניתן להשתמש בפרוסה חדשה בסילאן לייצור 10-20 חתיכות של תבניות PDMS. זמן הוואקום תלוי במצב משאבת הוואקום. סילניזציה מוגזמת גורמת לעובי לא אחיד ומביאה למראה מעונן, שיש להימנע ממנו. אחסן רקיק בתאים מבוקרי לחות כאשר אינו בשימוש. ניתן לבדוק את מבני ה-PDMS העשויים מפרוסות חדשות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM).
    3. מערבבים היטב מספיק שרף PDMS בסיס וחומר קישור צולב (w:w = 10:1, ו-70-80 גרם) למשך מספר דקות בצלחת פטרי (קוטר 150 מ"מ, גובה 25 מ"מ). ודא שנוצרות בועות קטנות באופן אחיד בתערובת, מה שמאשר תערובת טובה. מעבירים את התערובת לצינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל וצנטריפוגה בחום של 550 x גרם למשך 3 דקות כדי להסיר בועות אוויר ביסודיות.
      הערה: נוזל PDMS דביק וקשה לניקוי; היזהר בעת המזיגה. נקה עם איזופרופנול אם משטחי הספסל מזוהמים על ידי תערובת PDMS שנשפכה.
    4. שפכו בעדינות את תערובת ה-PDMS על הוופל בכלי פלסטיק או זכוכית (קוטר 150 מ"מ, גובה 25 מ"מ) עם תחתית שטוחה, ולאחר מכן דחפו את הוופל כלפי מטה כדי לטהר את ה-PDMS מתחתית הוופל. תערובת דגה עם משאבת ואקום.
      הערה: חשוב לטהר PDMS נוזלי מתחתית הוופל; שכבת PDMS עבה בתחתית מקשה על הוצאת הוופל מכלי הפלסטיק, מה שמגדיל את ההסתברות להתנפצות הוופל. לחלופין, אפשר לחתוך את ה-PDMS לאורך קצה הוופל ולשמור את הוופל בצלחת הפטרי. ודא עובי PDMS של כ-1.5 מ"מ עבור שכבה 1 כדי להבטיח גמישות של התבנית בשלבי ייצור מאוחרים יותר. ודא עובי PDMS של כ-2.5 מ"מ עבור שכבה 2 כדי להפחית את ההסתברות לצניחה בשלבי ייצור מאוחרים יותר. עובי ה-PDMS נמדד על ידי סרגל לאחר חיתוך תבניות ה-PDMS לצורות הדרושות.
    5. מרפאים את ה-PDMS בתנור בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ומוודאים שהמנה מונחת בצורה אופקית ככל האפשר במהלך התהליך. הניחו לתבנית ה-PDMS ולרקיק להתקרר לטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את תבנית ה-PDMS בשלמותה מהפרוסה באמצעות להב כירורגי חד ופינצטה מרופדת.
      הערה: היזהר לא לשרוט את פני הרקיק. בדוק אם נוצרות שאריות PDMS על משטח הפרוסות כאשר PDMS מתקלף. זה מאותת שיש לסנן מחדש את משטח הפרוסות .
    6. חותכים את תבנית ה-PDMS לבלוקים המכילים את התכונות המעניינות ומאחסנים את הבלוקים הללו בצלחות פטרי נקיות (קוטר 150 מ"מ, גובה 25 מ"מ) או בתא ואקום כאשר אינם בשימוש. תפעל את תבנית ה-PDMS מבלי לגעת בתכונות החיוניות.

2. ייצור שבבים והרכבת מכשירים

הערה: השתמש בפולימר בעל צמיגות נמוכה הניתן לריפוי UV (טווח ספיגת UV מרבי 350-380 ננומטר) כדי לייצר את השבב המיקרופלואידי באמצעות יציקת PDMS. דבק הניתן לריפוי UV מאפשר שילוב של הידרוג'ל פוליאקרילאמיד (PA) כמצע תאים שקוף, חדיר ליונים ואלסטי. המאפיינים של ג'ל PA תומכים בו כחיישן מתח מכני של רקמות המאפשר הדמיית תאים חיים וגירוי זרם סטטי. השבב יחובר סוף סוף למחסנית המאכלסת מדיום תרבית ומתחברת לתאי אלקטרודות.

  1. הכנת בסיס כיסוי זכוכית
    1. ציין את הכמות הנדרשת של כיסויי זכוכית מלבניים (170 מיקרומטר) עם חותך יהלום לגודל של 37 × 24 מ"מרבוע, כדי להתאים למידות המחסנית (קובץ משלים 4).
      הערה: לכיסוי יש עובי של 170 מיקרומטר התואם להדמיה ברזולוציה גבוהה, אך הוא שביר ודורש טיפול זהיר. ללבוש כפפות והגנה על העיניים. השלך את כיסויי הזכוכית המלבניים מיד אם מופיעים סדקים גלויים, מכיוון ששבבים מכיסויי הזכוכית המלבניים הללו עלולים להוות סכנת דליפה. לחלופין, הזמינו כיסויים בגודל הנכון מיצרני כיסויים. הימנע מלגעת במשטחים של כיסויי זכוכית מלבניים בידיים חשופות והשאיר כתמים שעלולים לפגוע באיכות ההדמיה.
    2. הכניסו את הכיסויים המלבניים לצלחת פטרי נקייה ללא חפיפה, והעבירו אותם לתא פלזמה. לגרום למצב ואקום, אך הכניסו מעט אוויר בסוף. הפעל את משטחי כיסויי הזכוכית המלבניים באמצעות פלזמת אוויר (30 שניות עד 5 דקות, 29.6 וואט, תלוי במצב הציוד)
      הערה: יש להשתמש רק בצדדים החשופים במלואם לפלזמה (כלומר, משטחים עליונים) בשלב הבא (שלב 2.1.3). השלם את שלב 2.1.3 תוך 30 דקות לאחר החשיפה לפלזמה. החדר אמור להופיע בצבע ורוד-סגול בשלב זה אם נוצרה פלזמת אוויר. אם שלבי ההדבקה האחרונים מצליחים, צמצם את משך הפלזמה מטעמי נוחות.
    3. הכן 10 מ"ל של תמיסת טיפול פני השטח העשויה מ-0.3% חומצה אצטית ו-0.5% 3-(trimethoxysilyl) פרופיל מתאקרילט מומס ב-100% אתנול. טפלו בכיסויי זכוכית מלבניים עם תמיסה זו בצלחת פטרי (קוטר 150 מ"מ, גובה 25 מ"מ) למשך 5 דקות על שייקר, כדי לאפשר הדבקה טובה עם שכבות מיקרופלואידיות מבוססות דבק הניתנות לריפוי UV. ודא שכיסויי הזכוכית המלבניים שקועים במלואם בתמיסה, ושני הצדדים מטופלים.
      זהירות: תמיסת הטיפול במשטח היא קורוזיבית. טפל בזה במכסה אדים.
    4. שוטפים כיסויי זכוכית מלבניים עם 100% אתנול שלוש פעמים, מבלי לתת להם להתייבש במהלך התהליך. כיסויי זכוכית מלבניים יבשים מחליקים בזה אחר זה עם גז חנקן ואקדח מכה. ודא קצב נשיפה מספיק שמסיר בצורה נקייה טיפות נוזלים ממשטחי בסיס הכיסוי, ומונע כתמים נוזליים. אחסן כיסויי זכוכית מלבניים בצלחת פטרי נקייה (קוטר 150 מ"מ, גובה 25 מ"מ).
      הערה: השתמש באקדח נשיפה כדי לכוון את זרימת האוויר במקביל לבסיסי הכיסוי והימנע משימוש בקצב נשיפה מוגזם כדי למנוע התנפצות משקפיים.
  2. ייצור שכבה 1 (איור 2C)
    1. מניחים ומשטחים תבנית PDMS נקייה שכבה 1, עם הפנים כלפי מעלה, על מכסה פלסטיק נקי (קוטר 60 מ"מ, גובה 15 מ"מ). פיפטה 500 מיקרוליטר דבק נוזלי לריפוי UV על התבנית לאט, מרטיב בזהירות את כל המבנים הבולטים בעזרת מרית. הסר בועות אוויר עקב תהליך ההרטבה.
      הערה: ניתן להכין תבניות PDMS נקיות באמצעות סרט להסרת אבק או שאריות דבק הניתנות לריפוי UV, או על ידי ניקוי באתנול. לאמצעי זהירות נוסף, שמור תבניות PDMS בתאי ואקום כאשר אינן בשימוש.
    2. לחץ בעדינות כלפי מטה את הכיסוי על תבנית ה-PDMS. מנע מעודפי דבק הניתנים לריפוי UV להרטיב את הצד העליון של הכיסוי, מכיוון ששאריות דבק הניתנות לריפוי UV יכולות למנוע החלקה נקייה ושטוחה. הסר עודפי דבק הניתן לריפוי UV בעזרת מגבי מעבדה.
      הערה: חשוב לוודא שהתכונות של תבנית ה-PDMS המועברת לשכבת הדבק הניתנת לריפוי UV יתיישרו עם המחסנית שאליה היא תודבק. לשם כך, סמן את הכיסוי בעט סימון מסיס שבו ימוקמו מרכזי בארות המחסנית (שלוש מהן). השתמש בסימנים אלה כדי ליישר את הכיסוי עם תכונות תבנית ה-PDMS בעת לחיצה על מכסה הזכוכית המלבני כלפי מטה.
    3. רפא חלקית את המבנה תחת אור UV מואר באופן אחיד (363-370 ננומטר, 224 מגוואט/ס"מ2) למשך 10 שניות. נגב את הסימנים עם 75% אתנול מאוחר יותר. החזק את המבנה בחוזקה על משטח ישר, וקלף ממנו את תבנית ה-PDMS שכבה 1 לאט.
      הערה: אשפרה חלקית מאפשרת היווצרות שכבת דבק מוצקה מספיק הניתנת לריפוי UV, המאפשרת קילוף של תבנית ה-PDMS בשלב זה. זה גם מקל על הדבקה עם שכבה 2 שנרפא חלקית בשלבים הבאים לייצור מבנה דבק דו-שכבתי הניתן לריפוי UV. תבנית PDMS שכבה 1, שהוכנה בעובי של 1.5 מ"מ (שלב 1.2.4), מבטיחה גמישות PDMS מספקת המפחיתה את ההסתברות להתנפצות הכיסוי הדק בתהליך הקילוף. ניתן לעשות שימוש חוזר בתבנית PDMS עד עשר עד עשרים פעמים, ולאחר מכן עשויה להיות שכבה לבנבנה של שאריות דבק הניתנות לריפוי UV על פני ה-PDMS, מה שמפחית את עובי המבנה. השתמש בתבניות PDMS חדשות במקרה זה.
  3. ייצור שכבה 2 (איור 2D)
    1. הנח תבנית PDMS נקייה משכבה 2, עם הפנים כלפי מטה, על לוח PDMS שטוח (עובי לוח של > 2.5 מ"מ כדי להבטיח קשיחות גבוהה). הקש בעדינות על התכונות מלמעלה באמצעות פינצטה. שימו לב לממשק להתכהות או ניגודיות אופטית מתחת לתכונות - זה מצביע על מגע תקין.
      הערה: עמודי התמיכה המקיפים את המאפיינים העיקריים (שני פתחים עגולים וחריץ) חיוניים למניעת צניחת משטח תבנית ה-PDMS.
    2. מלאו את החלל בין תבנית ה-PDMS ללוח בדבק נוזלי הניתן לריפוי UV באמצעות אפקט נימי. רפא חלקית את המבנה באור UV (363-370 ננומטר, 224 mW/cm2) למשך 10 שניות.
    3. קלף בעדינות את שכבת הדבק המרוכבת הניתנת לריפוי UV ואת תבנית ה-PDMS מלוח ה-PDMS בעזרת פינצטה מרופדת רכה. חתוך קצוות עודפים של שכבת הדבק הניתנת לריפוי UV בעזרת מספריים חדים במידת הצורך.
  4. מליטה בשכבה 1 ו-2 (איור 2E)
    1. הנח שכבה 1 המחוברת לכיסוי זכוכית מלבני על משטח ישר. יישר את שכבה 2 (שעדיין מחוברת לתבנית ה-PDMS שלה) עם שכבה 1 ולחץ על שתי השכבות בחוזקה, כדי להבטיח ש"צללים" יופיעו מתחת לתכונות.
    2. רפאו את המבנה באור UV (363-370 ננומטר, 224 mW/cm²) למשך 10 שניות כדי לחבר את שכבות 1 ו-2, היוצרות את המבנה הדו-שכבתי של השבב המיקרופלואידי. מקלפים בעדינות את תבנית ה-PDMS מהשבב.
      הערה: כדי להבטיח קילוף מוצלח של תבנית PDMS מהשבב, השתמש בפינצטה כדי להפריד כל עמוד תמיכה ב-PDMS מהדבק הניתן לריפוי UV שכבה 2 בשלב 2.4.1. פעולה זו עוזרת להפחית את ההדבקה הכללית בין תבנית ה-PDMS לשכבה 2, החשובה לקילוף.
  5. שילוב ג'ל פוליאקרילאמיד (איור 2F)
    הערה: לפני סעיף זה, הכינו כמה שבבים הנדרשים לניסוי מרובה.
    1. הכן תמיסת מבשר ג'ל PA על ידי ערבוב עדין של המרכיבים בטבלה שלהלן, המתאימה לקשיחות ג'ל PA לבחירה24 (עיין בטבלה 1). היזהר לא להכניס בועות אוויר במהלך הפיפטינג מכיוון שחמצן מעכב ג'לציה.
      זהירות: TEMED ו-APS רעילים. עבדו במכסה אדים ולבשו כפפות.
      הערה: נדרשים פיפטינג וטיפול זהירים מכיוון שמעורבים כמויות קטנות של נוזלים (1 מיקרוליטר TEMED עבור 1 מ"ל של תמיסת מבשר ג'ל PA). נוקשות ג'ל יכולה להשפיע על התנהגות התאים כפי שמוצג במחקרים מכאנוביולוגיה רבים. בחר את הנוקשות המתאימה ביותר לניסויים שלך. חרוזים פלואורסצנטיים משמשים כסמנים פידוציאליים לעיוות ג'ל והסקת מתח מכני. תמיסת חרוז מערבולת לפני פיפטינג התמיסה לתמיסת מבשר הג'ל PA. מומלץ לא לערבב את הנפח הקטן של TEMED אחרון מכיוון שתמיסות קודמן ג'ל PA מתחילות לג'ל כאשר מוסיפים את שני היוזמים וקשה לערבב נפחים קטנים ביסודיות במהלך זמן קצר זה.
    2. פיפטה מיד 10 מיקרוליטר מתמיסת מבשר הג'ל PA באמצע אזור הרקמה ועל גבי החריץ של שכבה 2 (איור 1B, 2F). לחץ בעדינות כלפי מטה בעזרת כיסוי זכוכית עגול (קוטר 10 מ"מ) ליצירת ג'ל שטוח. התבונן בתמיסת הרשות הפלסטינית זורמת לשכבה 1 דרך החריץ ועצור בשורת עמודי המחסום.
      הערה: נפח 10 מיקרוליטר של תמיסת קודמן ג'ל PA מייצר ג'ל בעובי 100 מיקרומטר מעל שכבה 2. שנה נפח זה בהתאם לעובי הג'ל הנדרש. פיפטה את התמיסה על השבב בהקדם האפשרי, מכיוון שתמיסת ה-PA מתחילה להתפלמר לאחר הוספת יוזמים. לחץ על התמיסה במידת הכוח הנכונה כדי למנוע מהתמיסה לעלות על גדותיה על פני עמודי המחסום ולחסום את התעלה. השלך את השבב אם הערוצים חסומים. עבור כמוסות ג'ל רכות עם קשיחות של 5 kPa ומטה, השתמש בחומר דוחה מים מזכוכית כדי לטפל בכיסויי הזכוכית העגולים כדי להפוך את הכיסויים להידרופוביים. בפרט, טבלו את הכיסויים בחומר דוחה מי זכוכית למשך 5 דקות, שטפו עם 100% אתנול 3 פעמים וייבשו בגז חנקן. זה מקל על קילוף הכיסוי מהג'ל הפולימרי מאוחר יותר מבלי להרוס את הג'ל.
    3. רפא מיד את השבב המיקרופלואידי, תחת אור UV (363-370 ננומטר, 224 mW/cm2) למשך 5 דקות. המתן לפחות ~ שעה עד שג'ל PA יתמצק במלואו.
      הערה: זה ירפא את השבב במלואו תוך מתן אפשרות לג'ל PA הפולימרי להיקשר למבנה. יש להשלים את שלבים 2.5.1, 2.5.2 ו-2.5.3 ברצף מהיר.
    4. דגרו את השבב ביסודיות ב-HEPES (0.1 M, pH 7.4) למשך שעה אחת או יותר לפחות כדי להרטיב את הג'ל ולשחרר את ההידבקות בין הכיסוי לג'ל. הסר בעדינות את זכוכית הכיסוי בעזרת פינצטה חדה.
      הערה: עבור ג'לים רכים יותר עם קשיחות של 5 kPa ומטה, הגדל את תקופת הדגירה עד 10 שעות על שייקר כדי להבטיח הסרה נקייה של זכוכית הכיסוי מהג'ל מבלי לשבש את מבנה הג'ל. לעיתים, עשויים להיווצר דפוסים מבניים של כמה עשרות ומאות מיקרומטרים בין בסיס הכיסוי המלבני לשכבה 1 המבוססת על דבק הניתן לריפוי UV. דפוסים אלה יכולים להפריע להדמיית שדה בהיר אך יש להם השפעות מינימליות על הדמיה פלואורסצנטית. ניתן לשפר זאת על ידי הפעלת פלזמה של כיסויים מלבניים כמו בשלב 2.1.2.
  6. הדבקת שבב ומחסנית (איור 2F)
    1. יש להניח מחסנית פוליקרבונט נקייה באיכות רפואית (Supplementary File 4) על משטח ישר, כשהחלק התחתון פונה כלפי מעלה. יבש את הג'ל על השבב עם מגבוני מעבדה מהצד. יישר את השבב, עם הפנים כלפי מטה, עם המחסנית.
      הערה: בעת בדיקת עיצובי מחסניות חדשים, ניתן להשתמש בשיטות עיבוד שבבי או הדפסת תלת מימד. כאשר העיצוב מוגדר, ניתן להשתמש בהזרקה כדי לייצר כמויות גדולות של המחסנית.
    2. דבק הניתן לריפוי UV לתוך החריצים שבין השבב למחסנית, אשר יתמלא באמצעות אפקט נימי. ריפוי עם אור UV (363-370 ננומטר, 224 mW/cm2) למשך 5 דקות.
      הערה: היזהר להימנע מדבק הניתן לריפוי UV שעולה על גדותיו לתוך התעלות, או לצד השני של בסיס הכיסוי.
  7. הסרת תמיסת PA לא מפולימרת
    1. השתמש בפקק PDMS ובמזרק כדי לשאוב כ-5 מ"ל של HEPES (0.1 M, pH 7.4) דרך תעלות פינוי הפסולת כדי לשטוף את תמיסת מבשר ג'ל PA הלא פולימרי הרעילה לתאים.
    2. דגרו את הג'ל במכשיר עם 2 מ"ל HEPES (0.1 M, pH 7.4) לכל מכשיר, והניחו אותו על שייקר למשך 1-2 ימים, כדי להבטיח הסרה מלאה של תמיסת מבשר ג'ל PA לא פולימרית.

3. השלמת ההתקנה

הערה: עם ייצור ההתקנים, השלם את ההתקנה (איור 1C) על ידי ציפוי ג'ל PA בחלבון ECM לזריעת תאים, חיבור ההתקנים לתא האלקטרודות לגירוי חשמלי, והנחת ההתקנים בתוספות, מחזיקים ומכסה תא תא חי לניסויי הדמיה מרובים של תאים חיים.

  1. הכנת רכיבים מעוקרים
    1. כל רכיבי ההתקנה מלבד המכשיר (טבלת החומרים) צריכים להיות סוניקציה בסדר הבא: תחילה במי סבון למשך 30 דקות, לאחר מכן במי MQ למשך 30 דקות, ולבסוף באתנול 75% למשך 30 דקות. לאחר מכן, יבשו אותם בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס וטפלו בהם באור UV בטמפרטורה של 200-280 ננומטר בארון בטיחות ביולוגית למשך 30 דקות כדי להשיג עיקור.
  2. פונקציונליזציה של ג'ל PA עם חלבון ECM
    1. עקר את המכשירים באור UV (200-280 ננומטר) בארון בטיחות ביולוגית.
    2. הכן את הכמות הנדרשת של 50 מיקרוגרם/מ"ל תמיסת עבודה של קולגן I ב-1x DPBS על קרח.
      הערה: שמור על מלאי קולגן I על קרח כדי למנוע ג'לציה. 100-150 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של קולגן I נדרשת לכל מכשיר לטבילה מלאה של הג'ל. יש להשתמש בעדינות בתמיסות קולגן I כדי למנוע היווצרות סיבים.
    3. הכן את הכמות הנדרשת של תמיסת עבודה Sulfo-SANPAH (SS) על קרח. כל טיפול בג'ל דורש כ-80 מיקרוליטר של תמיסת עבודה SS, כאשר תמיסת מלאי SS של 2 מיקרוליטר (מומסת ב-DMSO נטול מים) מדוללת ב-80 מיקרוליטר HEPES קר (ממקרר 4 מעלות צלזיוס, 0.1 מ', pH 7.4).
      הערה: SS רגיש ללחות; הימנע מעיבוי לחות על המוצר על ידי איזון בקבוקוני המלאי לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה. השתמש ב-SS ללא שקילה לקבלת הביצועים הטובים ביותר, והכן מלאי ב-DMSO נטול מים. השתמש בו בהקדם האפשרי. מאגר HEPES קר משמש להפחתת קצב ההידרוליזה של SS כהכנה לפתרון העבודה של SS. כל ג'ל דורש שני טיפולים עם תמיסת העבודה SS כדי להבטיח שמשטח הג'ל PA יתפקד היטב.
    4. יבש את הג'ל במכשיר על ידי טבילה במגבוני מעבדה בשולי הג'ל. פיפטה 80 מיקרוליטר של תמיסת עבודה SS על הג'ל, מה שמבטיח שמשטח הג'ל שקוע לחלוטין בתמיסת SS. טפל בג'ל ב-UV (363-370 ננומטר, 24.5 mW/cm2) למשך 5 דקות להפעלת SS. שטפו 3 פעמים עם HEPES קר (0.1 מ', pH 7.4).
      הערה: פיפטה בזהירות SS באמצע המחסנית כדי למנוע משיכת SS לקיר.
    5. חזור על שלב 3.2.4, אך שטוף שלוש פעמים עם 1x DPBS קר בסוף.
      הערה: שלבים 3.2.3 עד 3.2.5 צריכים להיעשות ברצף מהיר כדי למנוע הידרוליזה של SS. הג'ל השטוף אמור להופיע כגוון כהה יותר של אדום בשלב זה אם הפעלת פני השטח על ידי SS מוצלחת.
    6. תמיסת קולגן I של פיפטה 100 מיקרוליטר על ג'ל PA, מקפידה לטבול את הג'ל במלואו. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה, ולאחר מכן לשטוף את הקולגן הלא מחובר עם 1x DPBS שלוש פעמים. טבלו את הג'ל ב-1x DPBS לפני השימוש.
      הערה: ניתן לאחסן דגימה מצופה קולגן I במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים.
  3. חיבור מכשירים לתאי אלקטרודות
    1. חבר התקנים לתוספות באמצעות ברגים (איור 1C, סוג בורג: M3 X 10 מ"מ). לאחר מכן, אבטח עד ארבעה מכלולי הכנסת התקן למחזיק המיועד להרכבה על במת מיקרוסקופ (סוג בורג: M3 X 5 מ"מ).
      הערה: אם לא נעשה שימוש במספר המרבי של מכלולי הכנסת התקן, מומלץ למלא את כל שאר חריצי המחזיקים בהתקנים ריקים כדי לאטום את החלל כך שניתן יהיה לשמור על תנאי תא חיים טובים לניסויי ההדמיה מאוחר יותר. ניתן ליצור מכשירים ריקים פשוט על ידי הדבקת מחסניות לכיסויי זכוכית מלבניים חשופים.
    2. מלאו מכשירים במדיום תרבות (DMEM++, 2 מ"ל בכל אחת מהבארות הראשיות). משוך עוד 2 מ"ל של מדיום דרך תעלות פינוי הפסולת כדי לשטוף החוצה ולהחליף את ה-1x DPBS.
    3. הכן שני צינורות של 50 מ"ל עם מכסים בעלי חורים דרך לתפקד כתאי אלקטרודות. צור חורים בגודל ובכמות מתאימים כדי להתאים היטב את אלקטרודות הפלטינה וצינורות Tygon, ולחבר את תאי האלקטרודות למכשירים. מלאו כל תא אלקטרודה ב-45 מ"ל של מדיום תרבית.
      הערה: ניתן ליצור חורים בקלות על הכובעים באמצעות להבים כירורגיים חדים.
    4. הכן את החיבור בין תאי אלקטרודות והתקנים: חבר שני מחברי צינורות לכל מכשיר. חריץ תפס צינור על כל צינור Tygon (איור 1C). משוך את מדיום התרבות דרך הצינורות בעזרת מזרק והצמד אותם בחוזקה. חבר קצה אחד של הצינור המלא במדיום לתא האלקטרודות ואת השני למכשיר.
      הערה: הפחת את ההסתברות להופעת בועות בצינורות על ידי שימוש במדיום שחומם מראש ו/או הסרת הגז של המדיום בתא ואקום. מנע היווצרות בועות אוויר בממשק בין צינורות Tygon למחבר הצינור, צבט את קצות הצינורות כדי לבלוט את המשטח הבינוני החוצה לפני הטבילה במדיום בצינור, או צור חיבור פיזי למחברי הצינור.
    5. התאם את הגבהים היחסיים בין משטחי מדיום התרבות במכשירים ובתאי האלקטרודות באמצעות שקע מעבדה. שחרר את תפסי הצינורות ותן לכל המשטחים הבינוניים להתייצב לאותו גובה.
      הערה: זכור להדק את תפסי הצינורות בכל פעם שכל ההתקנה מועברת כדי למנוע הצפת נוזלים.
    6. בצע בקרת איכות על ידי מדידת ההתנגדות של כל מכשיר בנפרד באמצעות מד מקור חשמלי.
      הערה: הקפד לשחרר רק את תפס הצינורות של המכשיר שעבורו נמדדת ההתנגדות, תוך שמירה על התפסים של המכשירים האחרים מחוברים במקביל מהודקים היטב.

4. גידול חד-שכבתי וניסויים בתאים חיים

הערה: ליצור חד-שכבת קונפלואנט נכונה ולהשיג צפיפות זרם חשמלי מבוזרת באופן אחיד התלויה במפגש ובהתנגדות החשמלית של החד-שכבה. לאחר מכן, הבטיחו תנאים נאותים של תאים חיים במיקרוסקופ לניסויי הדמיה וגירוי חשמלי ארוכי טווח.

  1. גידול חד שכבתי
    1. נתק תאי MDCK באמצעות טריפסין מצלוחיות T25. צנטריפוגה למטה וספרו את הנפח הבינוני הדרוש להשגת 0.1 מיליון תאים. השעו את מספר התאים הזה וערבבו אותם היטב במדיום של 2 מ"ל בצינורות צנטריפוגה.
    2. זרקו את כל המדיום עמוס התאים לתוך הבאר על אזור הרקמה. הניחו לתאים לשקוע במשך 15 דקות לפני שהעבירו לאט את כל המערך לאינקובטור תרבית רקמות.
      הערה: עבור כל מכשיר, צפיפות זריעה של 0.1 מיליון תאים מתאימה ל-0.06 מיליון תאים לסנטימטר רבוע (6 × 104 תאים/ס"מ2). צפיפות הזריעה הזו דלילה מספיק, והתאים גדלים במשך יומיים לפני שהם מגיעים למצב קונפלואנט. תהליך זה מבטיח חד-שכבתי מקוטבת והומוגנית כהלכה, ללא צורך לשטוף תאים לא מחוברים מוגזמים העלולים להפריע לרקמה. חשוב להשאיר את שלב השיקוע ללא הפרעה כך שתהיה אפילו זריעה של התאים.
    3. אפשר לתאים לגדול בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 90% לחות) למשך 72 שעות כדי להגיע לצפיפות תאים של >~50 תאים/100 מיקרומטר2. בדוק מדי יום במיקרוסקופ ספסל, עם ניגודיות פאזה, כדי לעקוב אחר תהליך הצמיחה.
      הערה: עם מספר זה של תאים שנזרעו, תאי MDCK יגיעו למפגש של 70%-80% לאחר 24 שעות, מפגש מלא לאחר 48 שעות, ועלייה נוספת בצפיפות התאים והבשלת הרקמות עד 72 שעות. לאחר 24 שעות, אורך התא הממוצע הוא כ-10-20 מיקרומטר. לאחר 48 שעות, לצמתים בין תא לגוף התא יש ניגודיות ברורה בהדמיית ניגודיות פאזה. ניגודיות זו פוחתת באופן דרסטי לאחר 72 שעות.
  2. הדמיית תאים חיים
    1. בחר אפיפלואורסצנציה או מיקרוסקופ קונפוקלי בהתאם לצרכי הניסוי. כאשר תאים מבטאים או מוכתמים בסמנים פלואורסצנטיים, בחר קונפוקלי לתצפית תלת מימדית על צורת התא ועיוותים במצע הג'ל. לתצפית דו מימדית, בחר ניגודיות פאזה ואפיפלואורסצנטיות, המייצרים פחות פוטוטוקסיות. הפעל את מערכת התאים החיים שעה אחת לפני הבאת ההתקנה למיקרוסקופ, מה שמאפשר לחממה העליונה של המיקרוסקופ להתייצב ל-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-90% לחות.
      הערה: בקר מערכת התאים החיים מציג את התנאים בחממה העליונה וישמיע אזהרה כאשר התנאים אינם אופטימליים. מכיוון שמכסה החממה העליונה שונה מזה המסחרי בשל הצורך להכיל צינורות מכשירים הנמשכים כלפי חוץ, המערכת זקוקה לכיול מחדש כדי להבטיח תנאים טובים של תאים חיים לניסויים ארוכי טווח (מספר ימים עד שבוע). ניתן לבצע כיול על סמך המדריך למשתמש, ויש לשמור על מיקומי החיישנים זהים בניסויים כמו בתנאי הכיול. בדוק את קצב האידוי של המדיום בחממה העליונה, ואת תנאי ה-pH עם מדיום פנול אדום.
    2. התקן את ההתקנה על המיקרוסקופ, כאשר תאי האלקטרודות בצדדים. ודא שלמיקרוסקופ יש מספיק מקום לנוע ולא להיתקל בתאי האלקטרודות. ודא שגובה פני השטח הבינוניים מאוזן ובאותו גובה בין אלה שבמכשירים לתאי האלקטרודות.
      הערה: למשטח הבינוני בבארות המכשיר, שבו נמצא אזור הרקמה (איור 1C), יש השפעה משמעותית על הדמיית שדה בהיר וניגודיות פאזה. מניסקוס יגרום למיקוד אור לא רצוי. ודא שהמשטח הבינוני שטוח בשולי הבאר, אך שים לב שאידוי בינוני בתא התא החי יוביל לעיוות של משטח שטוח זה לאחר זמן מה. כדי להתגבר על בעיה זו, פתרון אחד הוא למקם כיסוי זכוכית שטוח במגע עם המשטח הבינוני כדי לשטח משטח זה. כיסוי זה צריך להיות בעל שטח קטן יותר מהבאר כך שהוא לא יחסום את חילופי הגזים, החשובים לצמיחת התאים. אפשרות נוספת היא לשכב שמן מינרלי בדרגת תרבית תאים על המדיום.
    3. הגדר תוכנה.
      1. בחר עדשות אובייקטיביות 10x או 20x להדמיה של רקמה שלמה עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, ועדשות אובייקטיביות 30x (WD 0.8 מ"מ, NA 1.05) להדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה יותר.
      2. להדמיה של רקמה שלמה, בחר מספר מיקומים כדי לכסות את האזור המלבני באזור הרקמה (איור 1A, למשל, 5 שורות על 5 עמודות, השורה האמצעית מכסה את החריץ, בעוד האחרות מחוץ לחריץ). בחר את ערוצי הפלואורסצנט והשדה הבהיר בהתאם לקווי התאים המשמשים בחלק התוצאה (ערוץ 488 עבור פלואורסצנטי ירוק וערוץ 561 עבור פלואורסצנטי אדום). בחר מרווח זמן של שעה אחת כדי להפחית את הפוטוטוקסיות בניסוי הדמיה ארוך טווח זה עד מספר ימים.
        הערה: ניתן לבחור עדשות אובייקטיביות אחרות, כגון 4x, אם יש צורך בתצוגה גדולה יותר של הרקמה כולה.
  3. גירוי חשמלי
    1. בדוק את מספר המכשירים, ההתנגדות היחסית של המכשיר והזרם החשמלי היעד של כל מכשיר. החליטו על הזרם החשמלי הכולל שיופק לכמה שעות עד שבוע בהגדרה הכוללת.
    2. מקור אות חשמלי במצב מהדק זרם. עבור 3 התקנים עם אותה התנגדות ערוץ, עם קבוצת בקרה אחת (ללא זרם חשמלי, מהדק צינורות), מצב זרם אפיקלי-בסיסי (AtB) אחד ומצב זרם בסיסי-אפיקלי (BtA) אחד (איור 1D), מספקים זרם כולל של 20 μA עם מד-מקור. זה מוביל ל-10 μA המסופק עבור כל מכשיר עם צפיפות זרם משוערת ~ 10 μA/cm2 שהיא רלוונטית מבחינה פיזיולוגית (פרטים נוספים בדיון).
      הערה: כרך המתח הכולל הוא בסביבות עשרות מילי-וולט, תלוי באורך צינור ה-Tygon. זרם חשמלי כזה יכול להיות מסופק ברציפות במשך מספר ימים עד שבוע. מחוון הפנול האדום ישנה את צבעו בתאי האלקטרודות (חומצי יותר בתא עם האלקטרודה החיובית), אך לא בחממה העליונה, המכוילת היטב. התאים יישארו בריאים כל עוד תנאי התאים החיים נשמרים היטב. חוקרים יכולים לשנות את המדיום באינקובטור השלב פעם ביומיים, ואת המדיום בתאי האלקטרודות אחת לכמה ימים. הדק את תפסי הצינורות בעת החלפת תאי האלקטרודות כדי למנוע הצפת מדיום. כפי שהוזכר בשלב 3.1.1, זכור שיהיה לך מכשיר ריק כדי לכסות את שטח המחזיק. זה מבטיח שתא התאים החיים במצב תקין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל התוצאות המוצגות כאן מותאמות מהפרסום הקודם4; לפרטים נוספים, עיין בפרסום זה.

פרוטוקול זה מאפשר יישום של זרם יונים חיצוני או שדה חשמלי בניצב למישור התאים או הרקמות. גירוי חשמלי זה מפריע להפרש הפוטנציאל החשמלי הטרנס-אפיתל האנדוגני (TEPD) ומאפשר לחקור את תפקידו של TEPD בשליטה על התנהגות הרקמות. בעקבות הפרוטוקול, תאי MDCK מסוג בר וערוכים גנטית (GFP-actin, H1-GFP ו-GFP-E-cadherin MDCK) נזרעו על המכשירים וגודלו למפגש במשך שלושה ימים. כדי לחקור את השפעת כיוון הזרם החשמלי, הונ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים ולוגיקה עיצובית לייצור מכשיר מיקרופלואידית חדשני לביצוע ניסויים בהפרעות פוטנציאל חשמלי טרנס-אפיתל ולחקר השפעות ביו-חשמליות באמצעות הדמיה של תאים חיים ושיטות מכניוביולוגיה. המשמעות של שיטה זו ברורה בהשוואה לשיטות קשורות אחרות. לדוגמה, שיטה קשורה אחת משתמשת בשבב מיקרופלואידית פשוט עם עיצוב ערוץ יחיד המפעיל זרם נייח במישור כדי לחקור גלוונוטקסיס (נדידת תאים כפונקציה של צפיפות הזרם)15,16. שני עיצובי השבב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ודא שכל המחברים חשפו כל ניגוד אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

XJ, PX, FF ו-TBS מכירים בדיונים מועילים עם ד"ר Xumei Gao, Xinru Yu וחברי קבוצה אחרים במעבדה לביופיזיקה של רקמות. אנו מודים למתקן השירות הטכנולוגי המותאם אישית (CTSF) באוניברסיטת ווסטלייק על הסיוע בשרטוט הסכמטי שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי קרן החינוך של ווסטלייק, מעבדת ווסטלייק למדעי החיים וביו-רפואה, ומרכז המחקר לתעשיות העתיד (RCIF) באוניברסיטת ווסטלייק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x DPBSג'יבקו14190144
3-(טרימתוקסיליל)פרופיל מתאקרילט, TPMסיגמא2530850יש לאחסן תחת חנקן לאחר הפתיחה.
שפופרת פלקון 50 מ"לקורנינג430829נקב 4 חורים במכסה צינור הבז בנפח 50 מ"ל, כדי לאפשר לאלקטרודה וצינורות לעבור דרך המכסה ולשקוע במדיום. עבור סט של מכשיר מיקרופלואידי, יש צורך לפחות 2 כובעים.
חומצה אצטיתסינופארם10000208
תמיסת אקרילאמיד, 40%סיגמא79061רעיל
משאבת אווירמעבדת OKOOKO-APרכיב של חממה במה במיקרוסקופ
אמוניום פרסולפט, APSאלאדיןA112447
מחסנית--המחסנית מיוצרת בהתאמה אישית, והעיצוב מתייחס לחומר משלים. חומר הגלם הוא PC Makrolon 2858 Medical Grade, וכאן תוכלו למצוא פרטים נוספים: https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US
קליפים--רוברט קליפ, לצינורות  בקוטר חיצוני של 4.5 מ"מ. https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144
קולגן Iקורנינג354236
מים DI Milli-Qמילי-קיו-
מדיום התרבית הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco, DMEM (גלוקוז גבוה)ג'יבקו11965092DMEM++ הוא DMEM עם 10%  נוספים; FBS (סיגמא-אולדריץ'), ו-100  יחידות/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין (Gibco).
כלוב שחור מארזמעבדת OKOH201רכיב של חממה במה במיקרוסקופ
מיקרוסקופ הפוך אפי-פלואורסנסאולימפוסIX83
אתנול מוחלטסינופארם10009218
סרום בקר עובריסיגמאF8318
חרוזים פלואורסצנטיים, 0.1 μ L, אדום (580/605)תרמוF8801
תא גזיםמעבדת OKOH201-PRIOR-SP200/400/600רכיב של חממה במה במיקרוסקופ
מערבל ידני גזמעבדת OKOמיקסר 2GFרכיב של חממה במה במיקרוסקופ
גנטיציןג'יבקו10131027GFP– actin ו-H1– GFP MDCK נשמרו באמצעות מדיה בתוספת 0.5  גנטיצין מ"ג/מ"ל (Gibco) כדי לקיים את ביטוי הגנים שלהם
הפססיגמא736459
איזופרופנולסינופארם80109218
קימוויפסקימברלי-קלארק פרופשיונלLH-70155מגב מעבדה
בורג ארוך יותר--בורג מכונת דיוק צלב ראש עגול מצופה ניקל, M3 x 10 מ"מ. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
מחבר מיקרו-נוזלי--התאמת איחוד ישר מפוליפרופילן, 1/16 אינץ'-10-32UNF.
מחזיק צלחות Multiwellמעבדת OKOH201 מגה-וואט מחזיק-NZ500רכיב של חממה במה במיקרוסקופ
N',N'-מתילן-ביסקרילאמיד, 2%סיגמא110269רעיל
נועה 73מוצרי נורלנד17-345דבק הניתן לריפוי UV
פניצילין-סטרפטומיצין, PS (10,000 יח'/מ"ל)ג'יבקו15140122
צלחת פטרי (150 מ"מ וחריפה; 25 מ"מ)קורנינג430599להתנגד ל-80 מעלות לפחות; C למשך שעתיים
הכלי Pico PlasmaDiener Electronic GmbH + Co. KGפיקו פלזמהלטיפול בפלזמה O2
מנקה פלזמההאריק פלזמהPDC-002לטיפול בפלזמת אוויר
צלחת פלסטיק (קוטר 60 מ"מ, גובה 15 מ"מ)קן705001
אלקטרודות פלטינהטיאנג'ין אאידה הנגשנגנק' 005קוטר 0.5 מ"מ, אורך 37 מ"מ 
Rain-X דוחה מים מקורי מזכוכיתITW מוצרים כימיים800002242
כיסוי מלבןמרינפלד0107222  1.5 שעות, 24 ואקוטי; 50 מ"מ2, 170 μ עובי מ '
כיסוי זכוכית עגולמרינפלד0111500  1.5H, עגול בקוטר 10 מ"מ
בורג קצר יותר--בורג מכונת דיוק צלב ראש עגול מצופה ניקל, M3 x 4 מ"מ. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
סולפו-SANPAH, ללא משקלתרמוא35395תמיסת מלאי SS: 20 מ"ג/מ"ל ב-DMSO נטול מים, 2 μ L לכל אחד; פתרון עבודה SS: 0.5 מ"ג/מ"ל SS ב-HEPES (0.1 מ', pH 7.4).
SYLGARD 184 ערכת אלסטומר סיליקוןדאו קורנינגH052KCM147התוצר הסופי הוא פולידימתילסילוקסן, PDMS. ערכה זו כוללת שרף PDMS בסיסי וחומר הצלבה. 
יחידת טמפרטורהמעבדת OKOH201-T-יחידה-BLרכיב של חממה במה במיקרוסקופ
טטרמתילאתילאנדיאמין, TEMEDסיגמא110189רעיל
תצוגת מסך מגעמעבדת OKOאוקו-טאץ'רכיב של חממה במה במיקרוסקופ
טרידקפלואורו-1,1,2,2-טטרה-הידרואוקטיל-1-טריכלורוסילןסיגמא78560459
טריפסין-EDTA (0.25%)ג'יבקו25200072
צינורות טיגוןטיגוןAJK00002קוטר חיצוני (OD) = 3.2 מ"מ, קוטר פנימי (ID) = 1.6 מ"מ
מנקה אולטראסוניצרפתKD-300DE
מכונת ריפוי LED UVGHUVGHS-MFLGמקור אור UV-LED, טווח פליטה: 363– 370 ננומטר, צפיפות הספק מקסימלית: 230 mW/cm2
מודול לחות ללא רעידותמעבדת OKOHM-VFרכיב של חממה במה במיקרוסקופ
VisiviewVisitron Systems GmbH-כלי הדמיה רכים יותר
רקיק1האוניברסיטה הלאומית של סינגפור, מתקן מיקרו-ייצור של המכון למכניקה-הוופל מיוצר בהתאמה אישית, והעיצוב מתייחס לחומר משלים.
רקיק2האוניברסיטה הלאומית של סינגפור, מתקן מיקרו-ייצור של המכון למכניקה-הוופל מיוצר בהתאמה אישית, והעיצוב מתייחס לחומר משלים.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , 4th ed, Garland Science. New York. (2002).
  2. Cogan, S. F. Neural stimulation and recording electrodes. Annu Rev Biomed Eng. 10 (1), 275-309 (2008).
  3. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through PI3K-γ and PTEN. Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).
  4. Saw, T. B., et al. Transepithelial potential difference governs wound healing by electromechanics. Nat Phys. 18 (9), 1122-1128 (2022).
  5. Ferreira, F., Moreira, S., Zhao, M., Barriga, E. H. Stretch-induced collective cell migration in vivo. Nat Mater. 24, 452-470 (2025).
  6. Kennard, A. S., Theriot, J. A. Osmolarity-independent electrical response to injury in zebrafish epidermis. Elife. 9, 62386(2020).
  7. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23 (7), 560-568 (2013).
  8. Levin, M., Thorlin, T., Robinson, K. R., Nogi, T., Mercola, M. Early step in left-right patterning. Cell. 111 (1), 77-89 (2002).
  9. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of surface electrical currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).
  10. Metcalf, M. M., Shi, R., Borgens, R. B. Endogenous ionic currents in embryos. J Exp Zool. 268 (4), 307-322 (1994).
  11. Barratt, L., Rector, F., Kokko, J., Seldin, D. Factors governing the Journal of Clinical Investigation. J Clin Invest. 53 (2), 454-464 (1974).
  12. Zhao, M., et al. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Semin Cell Dev Biol. 20 (6), 674-682 (2009).
  13. Barker, A., Jaffe, L., Vanable, J. Jr The glabrous epidermis in integrative and comparative physiology. Am J Physiol Integr Comp Physiol. 242 (3), R358-R366 (1982).
  14. Sun, Y., et al. Infection-generated electric field in gut epithelium guides migration of macrophages. PLoS Biol. 17 (4), e3000044(2019).
  15. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay in a microfluidic culture device. J Vis Exp. (68), e4193(2012).
  16. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and in vivo. Nat Protoc. 2 (6), 1479-1489 (2007).
  17. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions of cell signaling. J Cell Sci. 122 (23), 4267-4276 (2009).
  18. Meng, X., et al. PI3K-mediated electrotaxis of embryonic and adult fibroblasts exposed to physiological electric fields. Exp Neurol. 227 (1), 210-217 (2011).
  19. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  20. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  21. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  22. Stoecklin, C., et al. A new approach to design artificial 3D microenvironmental and rheological cues. Adv Biosyst. 2 (7), 1700237(2018).
  23. Khoo, B. L., et al. Expansion of patient-derived circulating tumor cells in a microfluidic culture device. Nat Protoc. 13 (1), 34-58 (2018).
  24. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Methods Cell Biol. 47, 11-16 (2010).
  25. Choudhury, M. I., et al. Kidney epithelial cells are active mechanosensors that drive physiological fluid pumps. Nat Commun. 13 (1), 2317(2022).
  26. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Roy, B., et al. Fibroblast rejuvenation by mechanical reprogramming in the National Academy of Sciences. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (19), 10131-10141 (2020).
  28. Tao, J., et al. Mechanical compression creates a quiescent muscle stem cell niche. Commun Biol. 6 (1), 43(2023).
  29. Iberite, F., Gruppioni, E., Ricotti, L. Skeletal muscle differentiation: Perspectives and challenges. NPJ Regen Med. 7 (1), 23(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים