מאמר שיטה

דיסקציה של רקמות הגולגולת של דג הזברה לאחר צביעה בכחול אלציאני

DOI:

10.3791/68900

⸱

12 בספטמבר 2025

 , 
1Tata Institute of Fundamental Research

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מציג הליך פשוט וקל לביצוע לצביעה וניתוח סחוסי גולגולת פנים בזחל דג זברה בן 5 ימים. בעזרתו ניתן לחקור את האנטומיה, הצורה והגודל של מבנים אלה בתנאי התפתחות שונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג הזברה, בהתחשב בשקיפות האופטית שלו, הוא מודל חולייתנים מצוין לחקר המנגנונים שבאמצעותם נוצרים סחוסים גולגולתיים בעובר. ניתן לסווג סחוסי גולגולת באופן כללי לשתי קבוצות, הנוירוקרניום והוויסקרוקרניום, אשר בתורם ניתן לחלק לקבוצות סחוס רבות הנחוצות לתמיכה במוח ולהוות את מנגנון ההזנה והנשימה, בין היתר. פרוטוקול זה יתאר תחילה הליך צביעה פשוט ומבוסס בדגי זברה כדי לדמיין את קבוצות הסחוס הללו, ואחריו מתודולוגיה לניתוח והפרדה של הנוירו-קרניום והוויסקרוקרניום. מנתיחות אלה ניתן להשיג בקלות מדדי צורה וגודל פשוטים, ובפרוטוקול זה זה מודגם לחיך, שהוא חלק מהנוירוקרניום הקדמי, רקמה המושפעת לעתים קרובות ברוב הפרעות הגולגולת בבני אדם. ניתן לשכפל את הפרוטוקול בצורה פשוטה גם במסגרות מוגבלות במשאבים, ובכך לספק כלי חינוכי רב ערך לסטודנטים לתואר ראשון להכיר את המורפולוגיה של הגולגולת.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסחוס הגולגולתי בבעלי חוליות יוצא מאוכלוסיית תאים רב-פוטנטית הנקראת תאי הפסגה העצבית הגולגולתית1. תאים אלה מוגדרים תחילה בשוליים הגביים של הצלחת העצבית בעוברים מוקדמים, אשר לאחר מכן נודדים למרחקים גדולים כדי להגיע לאזור הגולגולת ולקשתות הלוע לפני שהם מבדילים 2,3. מנגנוני האיתות המניעים את הנדידה וההתמיינות הזו נשמרים ברובם בקרב בעלי חוליות 4,5. למרות זאת, הארגון, הגודל והצורה של אלמנטים בודדים של סחוס נבדלים בין המינים, מה שמוליד מורפולוגיות גולגולתיות מגוונות6. דג הזברה, במיוחד, התגלה כמערכת מודל רבת עוצמה לחקר מורפוגנזה גולגולתית, בהתחשב באופי השקוף של העוברים עד לשלבי הזחל. באמצעות הליכי צביעה פשוטים לסימון הסחוס, המורפולוגיה של מבנים גולגולתיים רבים בדגי הזברה אופיינה תחת הפרעות שונות למסלולי איתות 7,8,9 כמו גם כאשר עוברים או זחלים נחשפים למזהמים נפוצים הקיימים בסביבה10. הצביעה הכחולה האלצ'יאנית המתוארת כאן לסימון הסחוס כרוכה בשימוש בתנאים לא חומציים שתוקנו על ידי ווקר וקימל11, אשר שימש לאחר מכן על ידי מעבדות דגי זברה רבות העובדות על התפתחות הגולגולת 5,12,13,14,15,16,17,18,19 כולל תיאור השימוש במסגרות תיכון20., צביעה ללא חומצה שומרת על המבנים הגרמיים שלמים, ומאפשרת צביעת סחוס ועצמות יחד באמצעות כחול אלציאני ואדום אליזרין, בהתאמה. עם זאת, חסר פרוטוקול מפורט לצביעה כמו גם לביצוע דיסקציה מדויקת של סחוסי הגולגולת, במיוחד לסיוע לביצוע מחקרים כאלה במסגרות מוגבלות במשאבים.

למרות שמבנה שלד הפנים בדג זברה בוגר מורכב למדי, המורכב מ-43 עצמות שמקורן בסחוס21, סחוס הגולגולת בזחל 5 ימים לאחר ההפריה (dpf), שזה עתה רכש את היכולת להאכיל, הוא פשוט יחסית וניתן לחלק אותו באופן כללי לנוירוקרניום גבי וויסקרוקרניום גחוני4. מבנים אלה תומכים במוח, תורמים למנגנון ההזנה ויוצרים סחוסים תומכים לרקמות הזימים. הפרוטוקול המתואר כאן יאפשר צביעת סחוסי דג הזברה בכחול אלציאני, ואחריו נוהל מפורט לניתוח הנוירו-קרניום והוויסקרוקרניום למבנים נפרדים, שיאפשר בסופו של דבר אפיון קפדני של הצורה והגודל של סחוסים שונים במבנים אלה. כדוגמה, אנו מודדים את הממדים של האזור הקדמי של החך (גג הפה) שנקרא צלחת אתמואידית, שהיא חלק מהנוירוקרניום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התחזוקה של דג הזברה ונהלי הניסוי ששימשו במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בעלי חיים, באמצעות הפניה TIFR/IAEC/2023-1.

1. הכנת ריאגנטים

  1. מדיית E3:
    1. הכן 50x מלאי 1 על ידי ערבוב 3.25 גרם נתרן פוספט דו-בסיסי (0.458 מ"מ Na2HPO4), 0.29 גרם אשלגן דימימן פוספט (0.042 מ"מ KH2PO4), 11.93 גרם נתרן כלורי (4.084 מ"מ NaCl) ו-0.48 גרם אשלגן כלורי (0.128 מ"מ KCl) ב-1 ליטר מים מזוקקים.
    2. הכן 50x מלאי 2 על ידי ערבוב של 2.43 גרם סידן כלורי (0.33 מ"מ CaCl2) ו-4.07 גרם מגנזיום גופרתי (0.33 מ"מ MgSO4) ב-1 ליטר מים מזוקקים.
    3. להכנת 500 מ"ל של מדיה 1x E3, ל-480 מ"ל מים מזוקקים, הוסף 10 מ"ל כל אחד מהמניות 1 ו-2 (pH = 7.4).
      הערה: ללבוש כפפות במהלך הכנת פתרונות אלה.
  2. 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-1x PBS (תמיסת מלח עם חוצץ פוספט):
    1. יש לחמם מראש 100 מ"ל של 1x PBS ב-68 מעלות צלזיוס. מוסיפים 4 גרם PFA ומדגרים את התמיסה ב-68 מעלות צלזיוס עם ערבוב תקופתי עד להמסה מלאה של ה-PFA.
      הערה: ללבוש כפפות ומסכה בזמן הכנת המגיב הזה, רצוי מתחת למכסה אדים מכיוון ש-PFA רעיל מאוד.
  3. תמיסת 0.05% MS-222 (הידועה בכינויה טריקאין):
    1. הכינו ציר טריקאין 4% ב-E3 ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. כדי להכין 10 מ"ל של ציר טריקאין, הוסף 0.40 גרם של MS-222 ב-7 מ"ל של E3. נענע בעדינות את הצינור המכיל את התמיסה כדי לערבב ולהרכיב את הנפח ל -10 מ"ל. כדי לייצר 50 מ"ל של תמיסת טריקאין של 0.05%, הוסף 625 מיקרוליטר ממלאי 4% ל-49.375 מ"ל של E3.
      הערה: ללבוש כפפות ומסכה בזמן הכנת מגיב זה.
  4. תמיסת מלאי כחול של 0.4% אלסיאן ב-70% אתנול
    1. להכנת 2 מ"ל מתמיסת המלאי, ממיסים 8 מ"ג כחול אלציאני ב -1 מ"ל של 50% אתנול. מחממים את התמיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות עם ערבוב תקופתי להמסה. לאחר שהכתם מתמוסס, השלימו את התמיסה ל-70% אתנול על ידי הוספת 900 מיקרוליטר של 100% אתנול ו-100 מיקרוליטר מים מזוקקים.
      הערה: ניתן לאחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורת החדר עד שבועיים.
  5. תמיסת כתמים - 0.02% כחול אלציאני, 200 מ"מ מגנזיום כלוריד (MgCl2) ו-70% אתנול
    1. להכנת 5 מ"ל של תמיסת כתם כחול אלציאני, הוסף 1 מ"ל של 1 M MgCl2, 3.5 מ"ל של 100% אתנול ו-250 מיקרוליטר של 0.4% ציר כחול אלציאני (8 מ"ג של כחול אלציאן ב-2 מ"ל של 70% אתנול) ל-250 מיקרוליטר מים וערבב היטב.
      הערה: הכן את תמיסת הכתמים טרייה לקבלת תוצאות הצביעה הטובות ביותר.
  6. תמיסת אקונומיקה:
    1. מערבבים נפחים שווים של 3% מי חמצן (H2O2) ו -2% אשלגן הידרוקסיד (KOH). להכנת 2 מ"ל תמיסת אקונומיקה, מערבבים 1 מ"ל של 3% מי חמצן ו -1 מ"ל של 2% אשלגן הידרוקסיד.
      הערה: הכן תמיסה זו טרייה לפני שתתחיל בשלב זה. מכיוון ש-H2O2 רגיש לאור, הגן עליו מפני חשיפה לאור ככל האפשר. ללבוש כפפות בזמן הטיפול ב-H2O2 ו-KOH.
  7. פתרון I: 20% גליצרול + 0.25% KOH
    הערה: מכיוון שגליצרול הוא צמיג מאוד, יש להשתמש בפיפטה בזהירות. ללבוש כפפות בזמן הכנת פתרונות אלה.
    1. להכנת 5 מ"ל תמיסה I, הוסף 2 מ"ל של 50% גליצרול ו -625 מיקרוליטר של 2% KOH ל -2.375 מ"ל מים וערבב היטב.
  8. פתרון II: 50% גליצרול + 0.25% KOH
    1. להכנת 5 מ"ל תמיסה II, הוסף 3.570 מ"ל של 70% גליצרול ו -625 מיקרוליטר של 2% KOH ל -805 מיקרוליטר מים וערבב היטב.
  9. פתרון אחסון: 50% גליצרול + 0.1% KOH
    1. להכנת 5 מ"ל תמיסת אחסון, הוסיפו 3.570 מ"ל של 70% גליצרול ו -250 מיקרוליטר של 2% KOH ל -1.180 מ"ל מים וערבבו היטב.
  10. 3% אגרוז
    1. ממיסים 3 גרם אגרוז ב 100 מ"ל מים מזוקקים. מיקרוגל עד שהתמיסה תתבהר.
  11. 0.1% PBST (0.1% בין 20 ב-1x PBS)
    1. להכנת 1 ליטר של 1x PBS, הוסף 8 גרם NaCl, 0.20 גרם KCl, 1.44 גרם Na2HPO4 ו-0.24 גרם KH2PO4 ב-1,000 מ"ל מים מזוקקים. מערבבים את התמיסה ומכוונים את ה-pH ל-7.4. כדי לייצר 500 מ"ל של 0.1% PBST, הוסף 5 מ"ל של 10% טווין 20 עד 495 מ"ל של 1x PBS.
  12. תמיסת DAPI של 0.50 μg/mL
    1. הכינו מלאי DAPI של 10 מ"ג/מ"ל ב-1x PBS. כדי ליצור 10 מ"ל של תמיסת DAPI של 0.50 מיקרוגרם/מ"ל, הוסף 0.50 מיקרוליטר מהמלאי ל-10 מ"ל של 1x PBS ונער במרץ כדי להבטיח שה-DAPI יתמוסס לחלוטין.
      הערה: ללבוש כפפות בעת הכנת פתרונות אלה. הגן על DAPI מפני אור מכיוון שהוא רגיש לאור. ניתן לאחסן את מלאי ה-DAPI ב-4 מעלות צלזיוס למשך יותר משנה.

2. איסוף עוברים

  1. הקימו זוגות של דגי זברה זכרים ונקבות במיכלי רבייה בערב שלפני הדרישה לעוברים, כאשר הדג הזכר והנקבה מופרדים על ידי מחסומים.
  2. הסר את המחסומים למחרת בבוקר ואסוף עוברים תוך 15-20 דקות לאחר הסרת המחסומים.
    הערה: העיתוי של הסרת המחסום מועיל בבימוי של עוברים וזחלים של דג הזברה.
  3. מעלים את העוברים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים ל-5 dpf.
    הערה: הקפד להחליף את מדיית E3 באצווה טרייה של E3 שחומם מראש ב-28.5 מעלות צלזיוס אחת ליומיים.

3. מכתים כחולים אלציאניים

הערה: ללבוש כפפות בזמן ביצוע ניסוי זה

  1. הרדמו 20-25 זחלי דג זברה בני 5 ימים באמצעות 0.05% טריקאין בצינור מיקרו-צנטריפוגה (MCT) בנפח 2 מ"ל.
  2. לאחר שהזחלים מפסיקים לנוע, מה שבדרך כלל לוקח ~4-5 דקות, הסר את חומר ההרדמה וקבע אותם ב-1.5 מ"ל של 4% PFA בטמפרטורת החדר (RT) על נדנדה ב-60 סל"ד למשך שעתיים.
  3. הסר כמה שיותר מהקיבוע באמצעות פיפטה והוסף לדגימה 1.5 מ"ל של 50% אתנול. דגירה למשך 10 דקות תוך כדי נדנוד ב-60 סל"ד ב-RT.
  4. הסר כמה שיותר מהאתנול באמצעות פיפטה והוסף 1.5 מ"ל מתמיסת הכתם הכחול של אלציאן.
  5. דגרו את הזחלים הקבועים בתמיסת הכתם למשך 18-20 שעות על נדנדה ב-60 סל"ד ב-RT.
    הערה: דגירה למשך זמן קצר או ארוך יותר עלולה להוביל לכך שאזורים מסוימים בסחוס יהיו מוכתמים או מוכתמים יתר על המידה, בהתאמה. כאן, נראה ש-18-20 שעות של צביעה עובדות בצורה הטובה ביותר להמחשה ברורה של הנוירוקרניום והוויסקרוקרניום של זחל בן 5 ימים.
  6. הסר את תמיסת הכתם, הוסף 1.5 מ"ל מים מזוקקים ודגר למשך 1-2 דקות על נדנדה ב-RT.
    הערה: ניתן להפסיק את הצביעה בשלב זה כדי לדמיין את גבולות התאים בסחוסים המנותחים. עם זאת, החיסרון של הפסקת פרוטוקול הצביעה בשלב זה מבלי לבצע את שלבי הניקוי הבאים הוא שגבולות הנוירו-קרניום והוויסקרוקרניום עדיין יישארו מעט מטושטשים, וזה הופך להיות מאתגר יותר לבצע את הדיסקציות בצורה מדויקת.
  7. הוסף 1 מ"ל מתמיסת האקונומיקה לדגימה ודגירה למשך 20 דקות ב-RT בשטח פתוח ללא כל כיסוי מעל הצלחת או הבארות.
    הערה: אל תכסה את ה-MCT בשלב זה מכיוון שהתגובה בין מי חמצן לאשלגן הידרוקסיד מייצרת גז חמצן, מה שעלול לגרום לכיסוי לקפוץ אם הוא סגור.
  8. הסר את תמיסת האקונומיקה ובצע את השלבים הבאים לניקוי רקמות.
    1. הוסף 1.5 מ"ל של תמיסה I לדגימה ושמור על נדנדה ב-60 סל"ד למשך 40 דקות ב-RT.
    2. הסר את תמיסה I והוסף 1.5 מ"ל של תמיסה II לדגימה והשאר על נדנדה ב-60 סל"ד למשך שעתיים ב-RT.
      הערה: שלבי הניקוי מסייעים בהסרת הכתם העודף, משפרים את הבהירות האופטית של הדגימות ובכך מסייעים בביצוע החיתוכים ביעילות. טפל בדגימות בזהירות תוך שינוי פתרונות, שכן כל נזק יכול להשפיע על הניתוח העתידי של המורפולוגיה שלהן.
  9. הסר את פתרון II והוסף 1.5-2 מ"ל של תמיסת האחסון. בגלל נוכחותו של גליצרול, דגימות מוכתמות שוקעות בהדרגה לתחתית תוך 10 דקות.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות מוכתמות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך יותר משנה.

4. דיסקציה של שלד הגולגולת

  1. ממיסים את תמיסת האגרוז 3% במיקרוגל עד שהתמיסה מתבהרת.
    הערה: אין להתחמם יתר על המידה מכיוון שהתמיסה עלולה לבעבע מהבקבוק. בדוק היטב את הפתרון בעת ביצוע שלב זה.
  2. מצפים צלחת פטרי 90 מ"מ באגרוז 3% על ידי יציקת האגרוז המותך עד ששליש מעומק צלחת הפטרי מכוסה ומאפשר לה להתמצק. נתיחות יבוצעו בצלחת פטרי זו.
    הערה: ניתן להכין את מנות הפטרי בציפוי אגרוז שבוע מראש ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ציפוי האגרוז מספק מצע רך יותר עליו ניתן לבצע את הנתיחות מבלי לפגוע במלקחיים.
  3. נקו את המלקחיים לשימוש עם 70% אתנול ונגבו אותם עם פיסת נייר מעבדה סטנדרטית.
  4. בעזרת פיפטת פסטר מעבירים 3-4 זחלים מוכתמים יחד עם 0.5 מ"ל תמיסת אחסון לצלחת הפטרי המצופה אגרוז.
    הערה: פתרון האחסון מבטיח בהירות אופטית רבה יותר לביצוע החיתוכים בהשוואה לביצוע אותו הדבר ב-E3.
  5. כוונו זחל מוכתם על הצד הצדדי שלו (איור 1A) וגרדו בזהירות את החלמון מגוף הזחל באמצעות המלקחיים
    הערה: איור 1B מראה עובר שבו החלמון הוסר. זה נוהג טוב להעביר את העובר המגורד בחלמון לצלחת פטרי חדשה לפני שתמשיך בשלבי דיסקציה נוספים כך שמסת החלמון הדביקה המרחפת סביב לא תפריע לדיסקציה.
  6. לאחר הסרת החלמון, החזיקו את הזחל באזור הזנב שלו בעזרת מלקחיים אחד והשתמשו בשני כדי להסיר בזהירות את העיניים.
    הערה: איור 1C מראה עובר עם החלמון והעיניים הוסרו. יש להסיר את העיניים בזהירות מכיוון שקרבתן לשלד הגולגולת עלולה להפריע לדיסקציה שלהן.
  7. בעזרת המלקחיים, משוך וצבט בזהירות את המוח ורקמות אחרות בגב אל הנוירוקרניום. החזיקו את הזחל ללא תנועה עם זוג מלקחיים אחד, והשתמשו בזוג המלקחיים השני כדי לבצע חתך באמצע (איור 1C, חץ אדום), ולאחר מכן צבטו את הרקמות (איור 1D).
    הערה: בעת ביצוע שלב זה, היזהר בהסרת הרקמות קרוב יותר לאזורים הקדמיים ביותר של הנוירוקרניום, מכיוון שהסחוס עלול להתנתק איתן.
  8. הפרד את ראש הזחל משאר הגוף. אזור הראש לאחר שלב זה מכיל בעיקר את הנוירוקרניום ואת הוויסקרוקרניום המחוברים זה לזה בשתי נקודות - בקצוות הקדמיים והאחוריים - יחד עם כמה רקמות קטנות ולא מוכתמות המחוברות למבנים הגולגולתיים האלה (איור 1E).
    הערה: קשה להסיר לחלוטין את הרקמות הלא מוכתמות המחוברות ישירות לנוירוקרניום ולוויסקרוקרניום. למרות שכמה רקמות שיוריות יהיו נוכחות, נוכחותן לא תשפיע על ניתוח צורה או גודל במורד הזרם מכיוון שהן אינן מוכתמות.
  9. נתקו בזהירות את שני הקשרים בין הנוירוקרניום לוויסקרוקרניום כדי להפריד ביניהם (איור 1F, קווים מקווקווים אדומים). ראו איור 2 לתמונות של הנוירוקרניום והוויסקרוקרניום, שניהם בעוברים שלמים וגם בעוברים מנותחים.
  10. על מגלשת זכוכית נקייה מוסיפים טיפה או שתיים של 100% גליצרול. בעזרת מלקחיים, העבירו בזהירות את הנוירוקרניום או הוויסקרוקרניום המנותחים לשקופית זו. השתמש במלקחיים כדי להניח בעדינות כיסוי על רקמות אלה, כדי לוודא שלא נוצרות בועות, ולאטום את החלקת הכיסוי על כל השקופיות עם לק.
    הערה: ניתן לאחסן שקופיות אלו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך יותר משנה מבלי לאבד את הכתם.

5. כימות מידות הלוח האתמואיד

  1. רכשו תמונות של החך באמצעות מצלמה שמחוברת למיקרוסקופ הסטריאו (איור 2D). בהיעדר מצלמה ברמה מדעית, חבר סמארטפון רגיל למיקרוסקופ הסטריאו כדי לרכוש תמונות.
  2. לצורך כמות, טען את התמונה של חיך לתוך FIJI22 ולאחר מכן, השתמש בכלי הקו כדי למדוד את הרוחב והגובה של לוחית האתמואיד במיקרונים (ראה איור 3A-C) ולקבוע את הממדים באמצעות רזולוציית הפיקסלים של המצלמה.
  3. צייר קו מתאר סביב לוחית האתמואיד ולחץ על נתח | הגדרת מידות | כדי להשיג את השטח של הלוח האתמואיד (איור 3D,E).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלד הגולגולת של דג הזברה הוא סחוסי לחלוטין עד 5 ימים לאחר ההפריה (dpf) ולכן ניתן לצבוע אותו באמצעות כחול אלציאני, שהוא צבע בסיסי המסוגל להיקשר לגליקוזאמינוגליקנים הנמצאים בשפע בסחוסים23. התוצאה היא שהסחוס נצבע בכחול (איור 1) כך שניתן להבחין בינו לבין רקמות אחרות שנמצאות בזחל באמצעות מיקרוסקופ סטריאו סטנדרטי שזמין ברוב סביבות המעבדה לתואר ראשון. ברגע שהחלמון נגרד (איור 1B) והעיניים מוסרות (איור 1C), אפשר לראות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מומים גולגולתיים מהווים את רוב כל המומים המולדים בבני אדם, ולעתים קרובות מובילים לתמותת תינוקות. עם זאת, האטיולוגיה הבסיסית ברוב האנומליות של הגולגולת עדיין לאהובהרה. מבני גולגולת פנים הם מורכבים בכל בעל חוליות נתון, ומנקודת מבט של הגדרת תואר ראשון, הדרישה הראשונה היא אפוא שיהיה כלי חינוכי המספק לסטודנטים סקירה כללית של מבנים מובחנים באזור הגולגולת. עם זאת, גישה לעובר יונקים במסגרות כאלה אינה אפשרית ברוב ההקשרים. דג הזברה, לעומת זאת, משמש כמערכת מודל קלה יותר לתחז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר קאלידס קוהלה ולצוותו על תחזוקת מתקן הדגים. SRN מכיר בתמיכה כספית מהמחלקה לאנרגיה אטומית (DAE), ממשלת הודו (מזהה פרויקט מס. RTI4003, DAE OM מס' 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 מיום 11.02.2020), תוכנית קבוצת השותפים של אגודת מקס פלאנק (M.PG. A MOZG0010) ומענק מחקר סטארט-אפ של מועצת המחקר למדע והנדסה (SRG/2023/001716). אנו מודים לד"ר שווטה ורמה מהמעבדה על הערות מאירות עיניים. אנו מודים ל-Swetha Nagarajan ול-Upal Chatterjee על העזרה ביצירת דמויות לכתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרוזלונזה ביו-סיינס50004לציפוי צלחות פטרי
כחול אלצ'יאני 8G סיגמא-אולדריץ'א3157להכתמת סחוסים
סידן כלוריד דיהידראטסיגמא-אולדריץ'12022להכנת מאגרים
מצלמהאולימפוסDP28לרכישת תמונות
DAPIרוש מדעי החיים10236276001לסימון גרעינים
אתנולהאניוול32221ממס לכתם כחול אלציאני
פיג׳יגרסה: ImageJ 1.54f
מלקחייםדומונטדומונטלביצוע נתיחות
גליצרולMP ביו-רפואי193996להכנת שטיפות והרכבת דוגמאות 
מי חמצןMP ביו-רפואי194057להכנת תמיסת אקונומיקה
מגנזיום כלוריד הקסהידרטSARD ביוסיינססSBRC0217להכנת מאגרים
מגנזיום גופרתי הפטהידרטסיגמא-אולדריץ'M2773להכנת מאגרים
MS-222 (טריקאין)סיגמא-אולדריץ'א5040להרדמת זחלים
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ'עמ' 9541להכנת מאגרים
אשלגן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'484016להכנת מאגרים
אשלגן פוספט מונו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'עמ' 0662להכנת מאגרים
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S3014להכנת מאגרים
נתרן פוספט דו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'71640להכנת מאגרים
סטריאוסקופאולימפוסSZX61לביצוע נתיחות
Tween-20 (טווין-20)היימדיהTC287חומר ניקוי, המשמש לחדירה לתאים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe. Development. 142 (2), 242-257 (2015).
  2. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Dev Dyn. 249 (1), 88-111 (2020).
  3. Hammond, N. L., Dixon, M. J. Revisiting the embryogenesis of lip and palate development. Oral Dis. 28 (5), 1306-1326 (2022).
  4. Mork, L., Crump, G. Zebrafish craniofacial development: a window into early patterning. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 235-269 (2015).
  5. Swartz, M. E., SheehanRooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
  6. Selleri, L., Rijli, F. M. Shaping faces: genetic and epigenetic control of craniofacial morphogenesis. Nat Rev Genet. 24 (9), 610-626 (2023).
  7. Beaty, T. H., et al. Evidence for geneenvironment interaction in a genome wide study of nonsyndromic cleft palate. Genet Epidemiol. 35 (6), 469-478 (2011).
  8. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat Rev Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
  9. Reynolds, K., Kumari, P., Sepulveda Rincon, L., Gu, R., Ji, Y., Kumar, S., Zhou, C. J. Wnt signaling in orofacial clefts: crosstalk, pathogenesis and models. Dis Model Mech. 12 (2), dmm037051(2019).
  10. Raterman, S. T., Metz, J. R., Wagener, F. A. D. T. G., Von den Hoff, J. W. Zebrafish models of craniofacial malformations: interactions of environmental factors. Front Cell Dev Biol. 8, 600926(2020).
  11. Walker, M., Kimmel, C. A twocolor acidfree cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
  12. Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat Genet. 40 (3), 290-298 (2008).
  13. Melvin, V. S., Feng, W., HernandezLagunas, L., Artinger, K. B., Williams, T. A morpholinobased screen to identify novel genes involved in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 242 (7), 817-831 (2013).
  14. Spoorendonk, K. M., Hammond, C. L., Huitema, L. F. A., Vanoevelen, J., SchulteMerker, S. Zebrafish as a unique model system in bone research: the power of genetics and in vivo imaging. J Appl Ichthyol. 26, 219-224 (2010).
  15. Farmer, D. T., et al. A comprehensive series of Irx cluster mutants reveals diverse roles in facial cartilage development. Development. 148 (16), dev197244(2021).
  16. Rochard, L., Monica, S. D., Ling, I. T. C., Kong, Y., Roberson, S., Harland, R., Halpern, M., Liao, E. C. Roles of Wnt pathway genes wls, wnt9a, wnt5b, frzb and gpc4 in regulating convergentextension during palate morphogenesis. Development. 143 (14), 2541-2547 (2016).
  17. Liu, S., Narumi, R., Ikeda, N., Morita, O., Tasaki, J. Chemicalinduced craniofacial anomalies caused by disruption of neural crest cell development in a zebrafish model. Dev Dyn. 249 (7), 794-815 (2020).
  18. Zinck, N., FranzOdendaal, T. A. Accurate wholemount bone and cartilage staining requires acidfree conditions. Anat Rec. 304 (5), 958-960 (2021).
  19. Stenzel, A., et al. Distinct and redundant roles for zebrafish her genes during mineralization and craniofacial patterning. Front Endocrinol. 13, 1033843(2022).
  20. Tomasiewicz, H. G., Hesselbach, R., Carvan, M. J., Goldberg, B., Berg, C. A., Petering, D. H. Zebrafish as a model system for environmental health studies in the grad classroom. Zebrafish. 11 (4), 384-395 (2014).
  21. Cubbage, C. C., Mabee, P. M. Development of the cranium and paired fins in the zebrafish Danio rerio (Ostariophysi, Cyprinidae). J Morphol. 229 (2), 121-160 (1996).
  22. Schindelin, J. Fiji: an opensource platform for biologicalimage analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Tuckett, F., MorrissKay, G. Alcian Blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives. Histochem J. 20 (3), 174-182 (1988).
  24. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140 (1), 76-81 (2013).
  25. Goodwin, A. F., et al. From bench to bedside and back: improving diagnosis and treatment of craniofacial malformations utilizing animal models. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 459-492 (2015).
  26. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  27. Ding, J., et al. Using alizarin Red staining to detect chemically induced bone loss in zebrafish larvae. J Vis Exp. (178), e63251(2021).
  28. Klingenberg, C. P., Barluenga, M., Meyer, A. Shape analysis of symmetric structures: quantifying variation among individuals and asymmetry. Evolution. 56 (10), 1909-1920 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Light Sheet Microscopy

מאמרים קשורים