הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

הערכת השונות הצירקדית בגורמי הגדילה של פיברין עשיר בטסיות: מחקר פיילוט

509 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68902

⸱

24 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Periodontology, Faculty of Dentistry, University of Çukurova, 2Private Practice, 3Department of Biology, Faculty of Medicine, University of Çukurova

במאמר זה

סיכום

מחקר זה בוחן את השונות הצירקדית בשחרור גורמי גדילה מפיברין עשיר בטסיות דם (PRF) ובוחן מתאמים עם רמות הקורטיזול, במטרה לייעל את התזמון של הליכי התחדשות מבוססי PRF.

תקציר

לפיברין עשיר בטסיות דם (PRF) יש יישומים קליניים נרחבים ברפואת שיניים, במיוחד בהתחדשות רקמות רכות וקשות, ריפוי שקעי מיצוי, טיפול במומים חניכיים, הגדלת סינוסים והליכים מוקוגינגיבלים. PRF הוא חומר ביולוגי עשיר בגורם גדילה שמקורו בטסיות דם ומוכן באמצעות פרוטוקול צנטריפוגה חד-שלבי. מחקר זה נועד להעריך האם גורמי גדילה שמקורם ב-PRF מציגים שונות צירקדית בין שעות הבוקר והערב. השתתפו 20 מתנדבים בריאים, כל אחד מהם סיפק שש דגימות דם ורידיות, שלוש ב-08:00 ושלוש ב-20:00. מכל נקודת זמן, נעשה שימוש בשפופרת אחת לספירת דם מלאה, אחת לניתוח קורטיזול בסרום ואחת להכנת PRF (צנטריפוגה ב-708 x גרםלמשך 12 דקות). גורמי גדילה (IGF-1, PDGF, FGFR, VEGF, TGFβ-1) ב-PRF נמדדו לאחר 24 שעות ו-72 שעות באמצעות ELISA. הרמות שלהם הושוו בין נקודות זמן והיו בקורלציה עם רמות הקורטיזול בסרום. רמות FGFR היו גבוהות משמעותית לאחר 72 שעות מאשר לאחר 24 שעות בדגימות ערב. עם זאת, לא נמצאו הבדלים משמעותיים עבור IGF-1, PDGF, VEGF או TGFβ-1 בין בוקר לערב. רמות הקורטיזול היו בקורלציה שלילית עם PDGF לאחר 72 שעות בדגימות בוקר ועם IGF-1 לאחר 72 שעות בדגימות ערב; עם זאת, לא נצפו מתאמים משמעותיים אחרים. ממצאים אלה מצביעים על כך שתזמון איסוף הדם אינו משפיע באופן משמעותי על תכולת גורם הגדילה PRF, מה שמעיד על גמישות בפרוטוקולים הקליניים לגבי תזמון הדגימה.

מבוא

פיברין עשיר בטסיות דם (PRF) הוא תרכיז טסיות מהדור השני הנפוץ ברפואת שיניים רגנרטיבית בשל מקורו האוטולוגי, קלות ההכנה ותכולתו הפעילה ביולוגית1. PRF, שנוצר על ידי צנטריפוגה של דם מלא ללא נוגדי קרישה, מספק מטריצת פיברין עשירה בטסיות דם ולויקוציטים המפרישים גורמי גדילה כגון גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF), גורם גדילה טרנספורמטיבי-בטא-1 (TGF-β1), גורם גדילה דמוי אינסולין-1 (IGF-1), גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF) וקולטן גורם גדילה פיברובלסטים (FGFr). ביומולקולות אלו ממלאות תפקידים מרכזיים בשגשוג תאי, אנגיוגנזה, שיפוץ מטריצה חוץ-תאית והתחדשות רקמות2. בהשוואה לפלזמה עשירה בטסיות דם (PRP), הדורשת נוגדי קרישה והפעלה אקסוגנית, PRF מיוצר בתהליך חד-שלבי, נטול נוגדי קרישה, המניב פיגום פיברין פיזיולוגי עם לויקוציטים וטסיות דם כלואים. ארכיטקטורה זו תומכת בשחרור איטי ומתמשך יותר של גורמי גדילה וציטוקינים, מה שעשוי לשפר את יציבות הפצע ותיקון רקמות מוקדם תוך הפחתת מורכבות הטיפול והעלות 1,2. יתר על כן, היעדר נוגדי קרישה ומפעילים ממזער את השונות הקשורה למניפולציה ועשוי לשמר טוב יותר את התנהגות הטסיות המקורית, ומציע יתרונות מעשיים לשימוש ליד הכיסא וסטנדרטיזציה בין מפעילים2.

למרות השימוש הקליני הנרחב בו, הדינמיקה הזמנית של הרכיבים הביו-אקטיביים של PRF נותרה לא מובנת היטב. השעון הביולוגי, מחזור ביולוגי פנימי של 24 שעות, משפיע על מערכות פיזיולוגיות שונות, כולל תפקוד חיסוני, הפרשת הורמונים ופרמטרים המטולוגיים 3,4. קורטיזול, ההורמון הביולוגי העיקרי, מגיע לשיאו בשעות הבוקר המוקדמות ויורד בהדרגה במהלך היום5. חשוב לציין, מחקרים הראו שפעילות טסיות הדם, יכולת הצבירה והספירה עשויות להיות מווסתות גם על ידי מנגנונים צירקדיים, עם השלכות על קרישה וריפוי פצעים6.

מכיוון ש-PRF נגזר ישירות מדם היקפי, התזמון הביולוגי של איסוף הדם עלול להשפיע על מצב הפעלת טסיות הדם ועל שחרור גורמי הגדילה לאחר מכן במהלך פילמור פיברין. למרות שהשינויים היומיים בספירת טסיות הדם וגורמי הגדילה בפלזמה עשירה בטסיות נותחו בעבר על ידי Aoto et al.7, אין מחקרים הבוחנים באופן שיטתי אם PRF שהוכן בזמנים שונים של היום מציג הבדלים מדידים בהרכב מקדמי הגדילה שלו. לכן, מחקר פיילוט זה נועד לחקור את השונות הצירקדית של גורמי גדילה שמקורם ב-PRF על ידי השוואת דגימות שנאספו בבוקר ובערב מאנשים בריאים. בנוסף, הערכנו את רמות הקורטיזול בסרום בכל נקודת זמן וחקרנו את המתאמים שלהן עם שחרור גורם גדילה PRF. הבנת שונות זמנית כזו עשויה לסייע באופטימיזציה של פרוטוקולים קליניים ולתרום לסטנדרטיזציה של טיפולים רגנרטיביים מבוססי PRF. השערת האפס של מחקר זה הייתה כי התזמון הצירקדי של איסוף הדם אינו משפיע באופן משמעותי על ריכוז גורמי הגדילה המשתחררים מפיברין עשיר בטסיות דם (PRF); עם זאת, בהתבסס על הוויסות הצירקדי הידוע של פעילות טסיות הדם והפרשת ההורמונים, הועלתה בתחילה השערה כי זמן איסוף הדם (בוקר לעומת ערב) עשוי לשנות את תכולת גורם הגדילה PRF. מנקודת מבט קלינית, הבהרה אם תכולת גורם הגדילה PRF רגישה לשונות הצירקדית חשובה לסטנדרטיזציה של פרוטוקולים רגנרטיביים. אם שחרור גורם הגדילה נשאר יציב במידה רבה לאורך היום, הרופאים יכולים להיות רגועים כי עיתוי ניקור הוורידים עשוי שלא להשפיע באופן מהותי על תוצאות הטיפול, ובכך לאפשר גמישות בתזמון ההליכים. לעומת זאת, אם מופיעים הבדלים עדינים בגורמים נבחרים, כגון אלה המעורבים באנגיוגנזה או תיקון רקמות, ניתן לייעל את תזמון איסוף הדם במקרים בהם רצוי פוטנציאל התחדשות מקסימלי, למשל, במצבי ריפוי בסיכון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה נערך במחלקה לפריודונטיה בפקולטה לרפואת שיניים, אוניברסיטת צ'וקורובה, אדנה, טורקיה, בהשתתפות 20 מתנדבים בריאים. לפני ההכללה, כל המשתתפים קיבלו מידע על המטרה, המתודולוגיה והנהלים של המחקר, והתקבלה הסכמה מדעת בכתב. האישור האתי ניתן על ידי ועדת האתיקה למחקר קליני בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת צ'וקורובה (אישור מס': 125/55, תאריך: 16.09.2022). כל ההליכים, כולל הנחיות בטיחות ביולוגיות חיוניות לטיפול בדם אנושי והוראות לסילוק פסולת עבור חומרים מסוכנים ביולוגיים וריאגנטים כימיים, בוצעו בהתאם להנחיות NIH-CDC8. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. בחירת משתתפים

המשתתפים שנכללו במחקר היו אנשים בריאים בגילאי 18 עד 25, ללא כל מחלה מערכתית ידועה, והפגינו שיתוף פעולה הולם במהלך ההליכים. אנשים לא נכללו אם הייתה להם בעיה מערכתית כלשהי, היו בהריון או הניקות, או השתמשו בתרופות או חומרים הורמונליים כלשהם שיכולים להשפיע על פרמטרים המטולוגיים או הורמונליים.

2. איסוף דם והקצאת קבוצות

בסך הכל נאספו שש דגימות דם ורידיות של 10 מ"ל מכל משתתף, שלוש בבוקר (08:00) ושלוש בערב (20:00). במחקר נעשה שימוש בצינורות PRF סטריליים מזכוכית נטולת תוספים (10 מ"ל). בפגישת הבוקר, צינור 1 שימש לספירת דם מלאה (CBC), צינור 2 לניתוח קורטיזול בסרום, וצינור 3 להכנת PRF ואחריו ניתוח גורמי גדילה. במפגש הערב, שפופרת 4 שימשה ל-CBC, שפופרת 5 לניתוח קורטיזול בסרום, ושפופרת 6 להכנת PRF וניתוח גורמי גדילה. בהתבסס על זמן איסוף הדם, הדגימות חולקו לשתי קבוצות: קבוצה 1 כללה PRF טהור שהוכן מדם בוקר (08:00), וקבוצה 2 כללה PRF טהור שהוכן מדם ערב (20:00).

הכנה 3. PRF

דגימות הדם צנטריפוגות ב-708 x גרם למשך 12 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות צנטריפוגה המצוידת ברוטור בזווית קבועה של 40 מעלות וצינורות זכוכית של 10 מ"ל. למכשיר ששימש היה רדיוס רוטור מתכוונן בין 88 מ"מ ל-110 מ"מ; במחקר זה נבחר רדיוס של 88 מ"מ כדי לתקנן את הפרוטוקול. לא נעשה שימוש בנוגדי קרישה במהלך ההליך. לאחר הצנטריפוגה, ה-PRF שהתקבל הוערך באופן מקרוסקופי כדי להבטיח היווצרות תקינה, המאופיינת במשטח חלק והומוגני, צורה אלסטית וגלילית ועקביות קומפקטית ומוצקה.

4. ניתוח ELISA של גורם גדילה

קרישי PRF הופרדו בזהירות משכבת כדוריות הדם האדומות באמצעות מספריים סטריליים. כל קריש נשקל, ומדיום תרבית RPMI-1640 נוסף ביחס של 1:1 המבוסס על משקל (g = mL) על מנת לתקנן את סביבת הדגירה על פני כל הדגימות ולהבטיח דיפוזיה עקבית של גורמי גדילה מסיסים ממטריצת ה-PRF. יחס זה מאפשר מיצוי פרופורציונלי המבוסס על גודל הקריש, וממזער את השונות בריכוזי גורמי הגדילה עקב מסות קרישה לא שוות. הדגימות הודגרו בשייקר אורביטלי ב-100 סל"ד ו-3 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ו-72 שעות כדי לקדם דיפוזיה אחידה של גורמי גדילה ממטריצת ה-PRF למדיום התרבית. לאחר הדגירה, הסופרנטנטים נאספו ואוחסנו בטמפרטורה של -8 מעלות צלזיוס עד לניתוח. ריכוזי גורמי הגדילה כומתו באמצעות ערכות ELISA מסחריות, כולל FGFR, VEGF, IGF-1, PDGF ו-TGF-β1, בהתאם לפרוטוקול ההכנה של היצרן 9,10.

5. מדרגות אליסה

תקנים ודגימות (100 מיקרוליטר כל אחד) נוספו לבארות והודגרו בטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר מכן נשטפו בארות שלוש פעמים עם מאגר כביסה. לאחר מכן, 100 מיקרוליטר של נוגדן עם תווית ביוטין נוספו לכל באר והודגרו בטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, ולאחר מכן שלוש שטיפות נוספות. לאחר מכן, נוספו 100 מיקרוליטר של תמיסת חזרת פרוקסידאז (HRP) והודגרו בטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר שלוש כביסות נוספות נוספו 100 מיקרוליטר של מגיב מצע והודגרו למשך 15 דקות. לבסוף, 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירה נוספו לכל באר, והספיגה נמדדה ב-450 ננומטר.

6. ניתוח סטטיסטי

משתנים קטגוריים באו לידי ביטוי כתדירויות ואחוזים, בעוד שנתונים מספריים הוצגו כממוצע ± סטיית תקן או חציון (מינימום-מקסימום), לפי הצורך. נורמליות המשתנים המספריים הוערכה באמצעות מבחן שפירו-וילק. משתנים שלא עמדו בהנחת הנורמליות, במיוחד ריכוזי גורמי הגדילה ורמות הקורטיזול, נותחו באמצעות מבחנים לא פרמטריים, כולל מבחן הדירוג החתום של Wilcoxon להשוואות זוגיות ומקדם מתאם הדירוג של ספירמן עבור אסוציאציות. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת IBM SPSS Statistics. ערך p <0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. כל ההשוואות נערכו בתוך הביקורת לשונות בין-אישית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כל 20 המשתתפים המתנדבים (10 נשים ו-10 גברים, בגילאי 18 עד 25) השלימו את המחקר ללא אובדן מדגם. תוצאות ספירת דם מלאה אישרו כי טסיות דם ופרמטרים המטולוגיים היו בטווחי ייחוס נורמליים בכל הדגימות, מה שאישר את אמינות תכשירי ה-PRF.

השוואה בין מדדי דם בין בוקר לערב
רמות הקורטיזול היו גבוהות משמעותית בדגימות בוקר בהשוואה לערב (p < 0.001), מה שמשקף את השעון הביולוגי הפיזיולוגי. ספירת WBC הייתה גבוהה יותר בדגימות ערב (p = 0.001), בעוד שערכי RBC, HGB ו-HCT היו גבוהים משמעותית בבוקר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בהתבסס על הוויסות הצירקדי הידוע של פעילות טסיות הדם והפרשת ההורמונים, הועלתה בתחילה השערה כי זמן איסוף הדם (בוקר לעומת ערב) עשוי לשנות את תכולת גורם הגדילה PRF. מחקר זה נועד לבדוק האם קיימת שונות זמנית כזו, ואם כן, האם היא קשורה לרמות הקורטיזול בסרום ולפרמטרים המטולוגיים. המחקר תוכנן כמחקר פיילוט כדי לחקור את השונות הצירקדית בשחרור גורמי גדילה שמקורם ב-PRF. לכן, לא נערך חישוב גודל מדגם רשמי. עם זאת, ניתוח כוח פוסט-הוק מצביע על כך שהמדגם הנוכחי (n = 20) מספק נתונים ראשוניים מספיק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכונת צנטריפוגהדואו913023410238
ערכות ELISAמבחן עדין, ווהאן FineBiotech ושות', בע"מ IGF-1 (מספר קטלוגי: EH0165)
ערכות ELISAמבחן עדין, ווהאן FineBiotech ושות', בע"מ PDGF (מס' קטלוגי: EH3531)
ערכות ELISAמבחן עדין, ווהאן FineBiotech ושות', בע"מ FGFR (מס' קטלוגי: EH0715)
ערכות ELISAמבחן עדין, ווהאן FineBiotech ושות', בע"מ VEGF (מס' קטלוגי: EH0327)
ערכות ELISAמבחן עדין, ווהאן FineBiotech ושות', בע"מ TGF ובטא; 1 (מס' קטלוגי: EH0287)
צינורות PRFfigure-materials-16370

מקורות

  1. Dohan, D. M., et al. Platelet-rich fibrin (PRF): A second-generation platelet concentrate. Part I: Technological concepts and evolution. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101 (3), e37-e44 (2006).
  2. Ehrenfest, D. M. D., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: From pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27 (3), 158-167 (2009).
  3. Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nat Rev Immunol. 13 (3), 190-198 (2013).
  4. Haus, E., Smolensky, M. Biological clocks and shift work: Circadian dysregulation and potential long-term effects. Cancer Causes Control. 17, 489-500 (2006).
  5. Weitzman, E. D., et al. Twenty-four hour pattern of the episodic secretion of cortisol in normal subjects. J Clin Endocrinol Metab. 33 (1), 14-22 (1971).
  6. Scheer, F. A., et al. The human endogenous circadian system causes greatest platelet activation during the biological morning independent of behaviors. PLoS One. 6 (9), e24549(2011).
  7. Aoto, K., et al. Circadian variation of growth factor levels in platelet-rich plasma. Clin J Sport Med. 24 (6), 509-512 (2014).
  8. Richmond, J. Y., McKinney, R. W. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , US Government Printing Office. (2009).
  9. Hyslop, P. A., Bender, M. H. Methods for sample preparation for direct immunoassay measurement of analytes in tissue homogenates: ELISA assay of amyloid β-peptides. Curr Protoc Neurosci. 18 (1), 7.20.21-7.20.27 (2002).
  10. ELISA sample preparation protocol. , FineTest. (2022).
  11. Karolczak, K., et al. Plasma concentration of cortisol negatively associates with platelet reactivity in older subjects. Int J Mol Sci. 24 (1), 717(2022).
  12. Bass, J., Takahashi, J. S. Circadian integration of metabolism and energetics. Science. 330 (6009), 1349-1354 (2010).
  13. Atkinson, G., Todd, C., Reilly, T., Waterhouse, J. Diurnal variation in cycling performance: Influence of warm-up. J Sports Sci. 23 (3), 321-329 (2005).
  14. Petrovsky, N., Harrison, L. C. The chronobiology of human cytokine production. Int Rev Immunol. 16 (5-6), 635-649 (1998).
  15. Hilderink, J. M., et al. Within-day biological variation and hour-to-hour reference change values for hematological parameters. Clin Chem Lab Med. 55 (7), 1013-1024 (2017).
  16. Xie, Y., et al. FGF/FGFR signaling in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 181(2020).
  17. Farooq, M., Khan, A. W., Kim, M. S., Choi, S. The role of fibroblast growth factor (FGF) signaling in tissue repair and regeneration. Cells. 10 (11), 3242(2021).
  18. Murgo, E., Falco, G., Serviddio, G., Mazzoccoli, G., Colangelo, T. Circadian patterns of growth factor receptor-dependent signaling and implications for carcinogenesis. Cell Commun Signal. 22 (1), 319(2024).
  19. McCarthy, T. L., Centrella, M., Canalis, E. Cortisol inhibits the synthesis of insulin-like growth factor-I in skeletal cells. Endocrinology. 126 (3), 1569-1575 (1990).
  20. Dong, J., et al. The proliferative effect of cortisol on bovine endometrial epithelial cells. Reprod Biol Endocrinol. 17, 1-9 (2019).
  21. Moraes, L. A., et al. Ligand-specific glucocorticoid receptor activation in human platelets. Blood. 106 (13), 4167-4175 (2005).
  22. Deutsch, V., et al. Sustained leukocyte count during rising cortisol level. Acta Haematol. 118 (2), 73-76 (2007).
  23. Lightman, S. L., Conway-Campbell, B. L. The crucial role of pulsatile activity of the HPA axis for continuous dynamic equilibration. Nat Rev Neurosci. 11 (10), 710-718 (2010).
  24. Gabbitas, B., Pash, J. M., Delany, A. M., Canalis, E. Cortisol inhibits the synthesis of insulin-like growth factor-binding protein-5 in bone cell cultures by transcriptional mechanisms. J Biol Chem. 271 (15), 9033-9038 (1996).
  25. Gado, M., Baschant, U., Hofbauer, L. C., Bad Henneicke, H. to the bone: The effects of therapeutic glucocorticoids on osteoblasts and osteocytes. Front Endocrinol. 13, 835720(2022).
  26. Raica, M., Cimpean, A. M. Platelet-derived growth factor (PDGF)/PDGF receptors (PDGFR) axis as target for antitumor and antiangiogenic therapy. Pharmaceuticals. 3 (3), 572-599 (2010).
  27. Li, J., Forhead, A., Dauncey, M., Gilmour, R., Fowden, A. Control of growth hormone receptor and insulin-like growth factor-I expression by cortisol in ovine fetal skeletal muscle. J Physiol. 541 (2), 581-589 (2002).
  28. Al-Sharabi, N., et al. Proteomic analysis of mesenchymal stromal cells secretome in comparison to leukocyte- and platelet-rich fibrin. Int J Mol Sci. 24 (17), 13057(2023).
  29. Coucke, B., et al. Leukocyte- and platelet-rich fibrin for enhanced tissue repair: An in vitro study characterizing cellular composition, growth factor kinetics and transcriptomic insights. Mol Biol Rep. 51 (1), 954(2024).
  30. Chtourou, H., Souissi, N. The effect of training at a specific time of day: A review. J Strength Cond Res. 26 (7), 1984-2005 (2012).
  31. Kang, Y. H., et al. Platelet-rich fibrin is a bioscaffold and reservoir of growth factors for tissue regeneration. Tissue Eng Part A. 17 (3-4), 349-359 (2011).
  32. Miron, R. J., et al. Use of platelet-rich fibrin in regenerative dentistry: A systematic review. Clin Oral Investig. 21, 1913-1927 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

עיתוי איסוף דםהכנת PRFצנטריפוגציה בצעד אחדקורטיזול בנסיבאנליזת ELISAרגנרציה של רקמה רכהרגנרציה של רקמה קשה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.