הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמה ותחזוקה של אורגנואידים של סרטן הערמונית שמקורם בחולה: פרוטוקול ניסיוני מפורט

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68912

⸱

14 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Jiangnan University Medical Center (Wuxi No. 2 People's Hospital), 2Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

במאמר זה

סיכום

הטרוגניות של סרטן הערמונית ועמידות לטיפול נותרו אתגרים. אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) המשמרים את מאפייני הגידול ההורי המרכזיים. מודל סטנדרטי זה תומך בבדיקת תרופות ובהתקדמות ברפואה מדויקת.

תקציר

סרטן הערמונית (PCa) הוא ממאירות הטרוגנית מאוד וגורם מוביל לתמותה הקשורה לסרטן בקרב גברים, עם אתגרים קליניים משמעותיים בהתמודדות עם עמידות לטיפול והתקדמות המחלה. למודלים פרה-קליניים קיימים, כגון קווי תאים דו-ממדיים (2D) ו-xenografts שמקורם בחולה (PDX), יש מגבלות בסיכום נאמן של המורכבות של PCa, כולל הטרוגניות של הגידול, איתות תלוי קולטן אנדרוגן (AR) ואינטראקציות מיקרו-סביבתיות. כדי להתמודד עם פער זה, מחקר זה מציג פרוטוקול חזק וניתן לשחזור להקמת אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) המשמרים את המאפיינים הגנטיים, הפנוטיפיים וההיסטולוגיים של גידולי ההורים. שיטה זו מאפשרת תרבית של אורגנואידים מ-PCa מקומי ומתקדם כאחד, ומספקת מודל רלוונטי מבחינה ביולוגית לחקר מנגנוני מחלה, תגובה לתרופות וגילוי סמנים ביולוגיים. התוצאות מדגימות את יכולתו של הפרוטוקול לייצר אורגנואידים ממגוון דגימות קליניות, עם יישומים בבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה ורפואה מדויקת. על ידי הצעת זרימת עבודה סטנדרטית הנותנת מענה לאתגרים טכניים מרכזיים, מחקר זה מדגיש את החשיבות של PDOs ככלים רב-תכליתיים לקידום מחקר סרטן הערמונית ולפיתוח אסטרטגיות טיפוליות יעילות יותר.

מבוא

סרטן הערמונית (PCa) נותר אחת הממאירות השכיחות ביותר בקרב גברים ברחבי העולם, שני רק לסרטן הריאות בתמותה הקשורה לסרטן. על פי מחקרים אפידמיולוגיים אחרונים, השכיחות העולמית של PCa עולה בהתמדה, וצפוי שמספר המקרים החדשים של סרטן הערמונית מדי שנה יעלה מ-1.4 מיליון בשנת 2020 ל-2.9 מיליון עד 20401. למרות ההתקדמות בגילוי מוקדם ופיתוח טיפולים חדשים, כולל טיפול במניעת אנדרוגנים (ADT) ותרופות ממוקדות, סרטן הערמונית נותר אתגר קליני משמעותי בשל אופיו ההטרוגני וההתפתחות הבלתי נמנעת של עמידות לטיפול, במיוחד בשלבים מתקדמים2. סרטן ערמונית עמיד לסירוס (CRPC), המופיע לאחר כישלון ADT, מייצג צורה קטלנית של המחלה, המאופיינת בתוצאות הישרדות גרועות ואפשרויות טיפול מוגבלות3. לכן הבנת המנגנונים המולקולריים המניעים את התקדמות המחלה ועמידותה היא חיונית לזיהוי יעדים טיפוליים חדשים ולשיפור תוצאות המטופלים.

פיתוח מודלים פרה-קליניים המחקים במדויק את המורכבות של סרטן הערמונית האנושי הוא קריטי לקידום המחקר בתחום זה. תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות, למרות שנעשה בהן שימוש נרחב, אינן מצליחות לשחזר את ההטרוגניות התאית, ארכיטקטורת הגידול והמיקרו-סביבה שנצפתה in vivo4. כתוצאה מכך, התועלת התרגומית של מודלים אלה מוגבלת, במיוחד לחקר התקדמות הגידול, עמידות לתרופות והאינטראקציות הדינמיות בין תאים סרטניים למיקרו-סביבת הגידול5. לעומת זאת, קסנוגרפטים שמקורם בחולה (PDX) ותרביות אורגנואידים התגלו ככלים מתוחכמים יותר המגשרים על הפער בין קווי תאים קונבנציונליים לגידולים קליניים 4,5,6.

מערכות תרבית אורגנואידים חוללו מהפכה במודלים של סרטן. מבנים תלת מימדיים (תלת מימדיים) אלה נגזרים מרקמות המטופל ויכולים לשמור על המאפיינים ההיסטולוגיים, הגנומיים והפנוטיפיים של הגידול המקורי 7,8,9,10. חשוב לציין, אורגנואידים של סרטן הערמונית משמרים מאפיינים קריטיים של הטרוגניות המחלה, כולל איתות AR, עמידות לטיפול וחוסר יציבות גנומית, מה שהופך אותם לכלים אידיאליים למחקר תרגומי11. בהשוואה למודלים של PDX, אורגנואידים חסכוניים יותר, ניתנים להרחבה וניתנים למניפולציה גנטית, מה שמקל על בדיקת תרופות בתפוקה גבוהה, גילוי סמנים ביולוגיים ומחקרים פונקציונליים. פלטפורמות אורגנואידים כבר הראו תוצאות מבטיחות בגידולים ממאירות אחרים, כולל סרטן המעי הגס, השד והלבלב, מה שמדגיש את הפוטנציאל שלהן לאונקולוגיה מותאמת אישית 4,12.

עם זאת, הקמה ותחזוקה של אורגנואידים של סרטן הערמונית (PCOs) מציגה אתגרים טכניים ייחודיים. אפיתל הערמונית תלוי מטבעו באיתות אנדרוגנים ובתמיכה במטריצה חוץ-תאית (ECM), מה שמחייב תנאי תרבית מיוחדים. יתר על כן, סרטן הערמונית מציג מגוון רחב של התנהגויות קליניות, החל מגידולים מקומיים רגישים להורמונים ועד CRPC אגרסיבי מאוד ועמיד לטיפול, מה שמסבך עוד יותר את התפתחות מערכות אורגנואידים הניתנות לשחזור11,12. פרוטוקולים מוצלחים ליצירת PCO חייבים לטפל במורכבויות הביולוגיות הללו על ידי אופטימיזציה של שלבי מפתח, כולל עיבוד רקמות, עיכול אנזימטי, הטמעת ECM והשלמה עם גורמי גדילה קריטיים, הורמונים ומולקולות קטנות. פרוטוקולים כאלה חיוניים להבטחת נאמנות האורגנואידים לגידולי ההורים שלהם ולהקלה על יישומם בניתוחים במורד הזרם.

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט וניתן לשחזור להקמה ותחזוקה ארוכת טווח של PDOs. זרימת העבודה שלנו משתרעת על פני כל התהליך, החל מרכישת רקמות ועיבוד של ביופסיה ודגימות כירורגיות ועד למעבר אורגנואידים, שימור בהקפאה והחייאה (איור 1). פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה כדי לשמר את השלמות הפנוטיפית והגנומית של רקמות סרטן הערמונית, ומאפשר מערכות תרבית תלת מימדיות חזקות המתאימות למגוון רחב של יישומים, כולל פרופיל גנומי, בדיקת תגובה לתרופות ובדיקות פונקציונליות. יש לציין כי השיטה שלנו מטפלת במכשולים טכניים נפוצים, כגון שיעורי הצלחה נמוכים בתרבית אורגנואידים, צמיחה לא אופטימלית וקשיים במעבר לאחר מכן, ומספקת הנחיות סטנדרטיות, ובכך מקלה על שחזור בין מעבדות.

לפיתוח מודלים אורגנואידים אמינים של סרטן הערמונית יש משמעות עצומה הן למחקר בסיסי והן למחקר תרגומי13. מערכות אלו מציעות פלטפורמה רבת עוצמה לפענוח מנגנוני מחלה, זיהוי מטרות טיפוליות חדשות וקידום גישות רפואה מדויקת המותאמות לחולים בודדים. על ידי טיפול בפערים טכניים קיימים ומתן פרוטוקול מקיף, עבודתנו שואפת להאיץ את האימוץ של טכנולוגיית אורגנואידים בחקר סרטן הערמונית ולתמוך במאמצים הגלובליים להילחם במחלה מאתגרת זו14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים העממי וושי מס' 2 (מספר אישור: Y-38 (2023)). כל המשתתפים סיפקו טפסי הסכמה מדעת בכתב. נתוני המטופלים עברו ביטול זיהוי כדי להבטיח הגנה על הפרטיות בהתאם לסטנדרטים אתיים.

1. איסוף דוגמאות

  1. רכישת רקמות
    1. הכנה לפני הדגימה
      1. קריטריונים להכללה: ודא שלכל המשתתפים יש אבחנה מאושרת של סרטן הערמונית, כפי שנקבע על ידי בדיקה פתולוגית או הדמיה. להפיק דגימות גידול מכריתה כירורגית, ביופסיה או דגימות קליניות אחרות. ודא שכל המשתתפים הם בני 18 ומעלה ואין להם ממאירויות אחרות, כדי למנוע הפרעות פוטנציאליות מסוגי סרטן אחרים בחקר סרטן הערמונית. מכל המשתתפים, אספו הסכמה מדעת בכתב להשתתף במחקר ואפשרו להשתמש בדגימות שלהם למחקר מדעי.
      2. קריטריונים לאי-הכללה: אל תכלול חולים שהדגימות שלהם אינן מכילות מספיק רקמת גידול לתרבית או ניתוח. לא לכלול מטופלים שחוזרים בהם מהסכמתם או שאינם מסוגלים לספק את הדגימות הנדרשות במהלך המחקר.
    2. דגימות ביופסיה של מחט ליבת הערמונית: השתמש במחט מיוחדת כדי להשיג דגימות מרקמת הערמונית. יש להניח מיד את הרקמה בתמיסת שימור (תמיסת מעכב סלע בינונית + DMEM/F-12 מתקדמת DMEM/F-12) (דילול 1:2000)) ולהעביר אותה למעבדה על קרח, תוך הבטחת אספקה תוך 24 שעות.
      הערה: התמקד במדויק ברקמת סרטן הערמונית ובצע דגימה מרובת אתרים על פני אזורים אנטומיים שונים. בצע 1-2 פנצ'רים לכל אתר, כל אחד מניב ≥ דגימות ליבה של 1 ס"מ.
    3. דגימות כריתה רדיקלית של הערמונית: לאחר האיסוף, יש להניח במהירות את הדגימות בתמיסת שימור (adDMEM/F-12 בינוני + תמיסת מעכב סלע (דילול 1:2000)) ולהוביל על קרח, תוך הבטחת אספקה למעבדה תוך 24 שעות.
      הערה: ניתן להשיג שברי רקמות נוספים באמצעות כריתה רדיקלית של הערמונית15.
      אסוף דגימות ≥ 1 גרם (קוטר ≈ 5 מ"מ), תוך מזעור זיהום על ידי רקמה רגילה. תיאום טרום ניתוחי עם רופאים כדי לציין: 1) ליבת הגידול; 2) רקמה פרי-גידולית; 3) שליטה רגילה. תן עדיפות לשברים יציבים עם שינוי צבע אפור-צהוב. אם נעדר, יישם דגימה אקראית שיטתית. עיין בטבלה 1 למידע על איסוף דוגמאות.
  2. עיבוד מדגם
    1. תיוג וסיווג: סמן בבירור את דגימות הרקמה שנאספו (כולל שם המטופל, מספר האשפוז, שם הרקמה, אתר הרקמה וסוג הרקמה).
    2. שימור בהקפאה: עבד דגימות רקמה באופן מיידי (≤ 12 שעות לאחר האיסוף). מניחים את הדגימות בתמיסת שימור מקוררת מראש (4 מעלות צלזיוס) (adDMEM/F-12 בינוני + תמיסת מעכב סלעים (דילול 1:2000)) ומאחסנים אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. המשך בשלבים ניסיוניים נוספים תוך 4-6 שעות לקבלת תוצאות מיטביות.
  3. הובלה ואחסנה
    1. הובלת שרשרת קרה: העבר את דגימות הרקמה למעבדה בתנאי טמפרטורה נמוכה.
    2. רישום דגימה: עם ההגעה למעבדה, יש לאמת ולרשום את פרטי הדגימה בפירוט, כולל המידע האישי הבסיסי של המטופל, סוג הרקמה, שם ואתר הדגימה.
  4. קבלה ובדיקה במעבדה:
    1. בדיקת מדגם: פתח את הדגימות בארון בטיחות ביולוגית ובדוק אם יש אובדן, זיהום או חריגות גלויות.
    2. ניתוח לדוגמא: חלץ את הדגימה והניח אותה בצלחת תרבית. השתמש במספריים לרקמות או באזמל כדי לחלק את הדגימה לחתיכות קטנות (כ-1-3 מ"מ³) לשימוש בניסויים הבאים.

2. פרוצדורות ניסוייות

  1. הכנת תרחיפי תאי רקמה ראשוניים
    1. שימור: הנח את גושי הרקמות שנאספו לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטיים סטריליים של 50 מ"ל, וודא שהרקמות מסווגות לפי סוג. סמן כל צינור בהתאם. הוסף תמיסת שימור (adDMEM/F-12 בינוני + תמיסת מעכב סלע (דילול 1:2000)) לכל צינור עד שהרקמה שקועה לחלוטין. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף.
      הערה: סוגי רקמות צריכים לכלול רקמות גידול וגם רקמות שאינן גידוליות. תוויות לדוגמה צריכות לכלול בדרך כלל את מספר הרשומה הרפואית.
    2. הפרדת רקמות: בעזרת פינצטה מעוקרת, העבירו את דגימות רקמת סרטן הערמונית לתבנית תרבית בינונית. שטפו את הטישו 2-3 פעמים עם 2 מ"ל של תמיסת מלח פוספט (D-PBS) של Dulbecco כדי להסיר דם ופסולת. הסר בזהירות רקמת שומן, שרירים ורכיבים אחרים שאינם אפיתל באמצעות פינצטה עדינה, תוך שמירה על אזורי האפיתל בלבד. לאחר מכן, טוחנים את הרקמה הנקייה לשברים קטנים בגודל של כ- 1-3 מ"מ³ בעזרת מספריים.
      הערה: הסרה מוחלטת של רכיבים שאינם אפיתל היא קריטית עבור יישומים במורד הזרם, שכן זיהום רקמת סטרומה או שומן עלול להפחית את היעילות והספציפיות של בידוד התאים. שמור על תנאים סטריליים לאורך כל ההליך כדי למזער את הסיכון לזיהום מיקרוביאלי.
    3. עיכול רקמות: העבירו את חלקי הרקמה המוכנים לצינורות עיבוד רקמות. הוסף את תמיסת העיכול של רקמת הגידול (טבלה 2) לכל צינור. הפעל את מכשיר העיכול (מכשיר הכנת תרחיף חד-תאי) באמצעות תוכנית דיסוציאציה של רקמות בינוניות-קשות לדיסוציאציה אנזימטית-מכנית.
      הערה: פרוטוקול העיכול הוא כדלקמן: סיבוב קדימה ב-200 סל"ד למשך 3 שניות, סיבוב הפוך ב-200 סל"ד למשך 3 שניות, סיבוב קדימה ב-300 סל"ד למשך 4 שניות, סיבוב הפוך ב-300 סל"ד למשך 4 שניות, סיבוב קדימה ב-600 סל"ד למשך 5 שניות, סיבוב הפוך ב-600 סל"ד למשך 5 שניות, סיבוב קדימה ב-400 סל"ד למשך 3 שניות, סיבוב הפוך ב -400 סל"ד למשך 3 שניות. רצף זה מהווה מחזור אחד, אותו יש לחזור שלוש פעמים. לאחר השלמת שני המחזורים הראשונים, המשיכו בסיבוב איטי ב-20 סל"ד למשך כ-25 דקות. משך הזמן עשוי להשתנות בהתאם לתנאי הניסוי. עכל את הרקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות עד שעה.
    4. הפסקת עיכול: הוסף נפח שווה או כפול של מדיום adDMEM/F-12 בתוספת FBS לתרחיף התא כדי לסיים את הפעילות האנזימטית.
      הערה: אם נותרו שאריות לא מעוכלות, אספו את הסופרנטנט, הוסיפו אנזימי עיכול טריים לשאריות והמשיכו בעיכול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות נוספות. עקוב אחר התהליך מעת לעת, ושלב תרחיפי תאים משני שלבי העיכול.
    5. סינון: הרטיבו מראש מסננת תאים של 100 מיקרומטר עם 1 מ"ל של מדיום adDMEM/F-12, ולאחר מכן סננו את מתלה התאים. שטפו את צינור עיבוד הרקמות ואת מסננת התאים פעמיים עם 5 מ"ל של מדיום adDMEM/F-12 בתוספת תמיסת מעכב סלעים (דילול 1:2000). אוספים את המסנן לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 50 מ"ל. העבירו את המתלים דרך מסננת של 70 מיקרומטר ואספו את כל מתלי התאים לתוך צינור חדש של 50 מ"ל.
      הערה: ניתן להתאים את מספר שלבי הסינון וגודל הנקבוביות של המסננות בהתאם למאפייני המדגם.
    6. ליזיס תאי דם אדומים: צנטריפוגה את תרחיף התאים שנאסף ב-200 × גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס. השליכו בזהירות את הסופרנטנט, ואז השעו מחדש את כדור התא ב-2 מ"ל של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות. דגרו את המתלה על קרח למשך 2-3 דקות.
      הערה: ניתן להתאים את זמן הדגירה לליזה של כדוריות דם אדומות על סמך יעילות הליזה. דגירה ממושכת עלולה להוביל למוות מוגבר של תאים. מומלץ לעקוב אחר הדגימה במיקרוסקופ כדי להבטיח ליזה מלאה של כדוריות הדם האדומות ללא נזק מוגזם לסוגי תאים אחרים.
    7. סיים את הליזיס: הוסף 6 מ"ל של מדיום adDMEM/F-12 בתוספת תמיסת מעכב סלע (דילול 1:2000) לתרחיף התא. מעבירים את התערובת לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי בנפח 15 מ"ל וצנטריפוגה בחום של 200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט. שטפו את כדור התא 1-2 פעמים עם אותו מדיום משלים והעבירו את תרחיף התא הסופי לצינור אפנדורף של 1.5 מ"ל.
    8. הערכת כדאיות: מערבבים 10 מיקרוליטר של תרחיף התא עם נפח שווה של תמיסה כחולה טריפאן וצופים בכדאיות התא תחת מיקרוסקופ.
      הערה: אם נצפות כמויות משמעותיות של תאים מתים או פסולת, בצע צנטריפוגה במהירות נמוכה ב-50 x g למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס כדי להסיר אותם לפני שתמשיך בספירה.
    9. ספירת תאים: השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום adDMEM/F-12, דללו את התרחיף לפי הצורך (בדרך כלל בדילול של 1:20), והניחו 6 מיקרוליטר מהתרחיף המדולל על המוציטומטר כדי לספור תאים במיקרוסקופ.
    10. אוסף גלולות תאים: צנטריפוגה בטמפרטורה של 200 x גרם, 25 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות. אוספים את גלולת התא הסופית לתוך צינור אפנדורף בנפח 1.5 מ"ל.

3. הקמת אורגנואידים מתרחיפים ראשוניים של תאים

  1. זריעה: קבע את הנפח הנדרש של ג'ל מטריצה על סמך ספירת התאים. בעזרת קצות פיפטה מקוררים מראש (מאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס), העבירו בזהירות את הנפח המתאים של ג'ל מטריצה לגלולת התא. ערבבו בעדינות את תערובת התאים-ג'ל על קרח, הימנעו מהיווצרות בועות אוויר כדי להבטיח זריעה אחידה ושלמות ג'ל מטריצה אופטימלית.
    הערה: יש להפשיר את ג'ל המטריצה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני השימוש. ודא שכל כלי הטיפול, כולל קצות פיפטות וצינורות, מקוררים מראש כדי למנוע ג'לציה מוקדמת.
  2. ציפוי: הוציאו את תערובת הג'ל של מטריצת התאים על צלחת תרבית בעלת הידבקות נמוכה של 24 בארות, ומרחו כ-30 מיקרוליטר לטיפה. ודא שכל טיפה מכילה יותר מ-10,000 תאים כדי לתמוך ביצירת מבנה תלת מימדי (תלת מימד) יעיל.
    הערה: הימנע מדילול יתר של ג'ל המטריצה. כדי לשמור על שלמות מבנית ולתמוך ביצירת תרבית תלת מימדית, ג'ל המטריצה צריך להוות יותר מ-70% מהנפח הכולל של התערובת. אורגנואידים שמקורם בביופסיה אנושית ודגימות כריתת ערמונית הם שווי ערך באופיים, נבדלים בעיקר בתפוקת תאים בת קיימא, וצפיפות זריעה זהה יושמה בפרוטוקול זה.
  3. דגירה: הנח את צלחת התרבות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 5 דקות, מה שמאפשר לג'ל המטריצה להתמצק ראשונית. הפוך את הצלחת ותן לה לשבת במשך 20 דקות כדי לשמור על ג'ל המטריצה בצורת תלת מימד. הוסף 800-1000 מיקרוליטר של מדיום תרבית (טבלה 3) לכל באר. החלף את מדיום התרבות כל 2-3 ימים.
    הערה: ודא שג'ל המטריצה אינו מופרע במהלך שלב ההיפוך כדי לשמור על המבנה התלת-ממדי.

4. מעבר אורגנואיד

  1. איסוף והכנה של אורגנואידים: בעזרת קצה פיפטה מקורר מראש, יש לשבש מכנית את ג'ל המטריצה כדי לפצל את אשכולות האורגנואידים. יש לשטוף כל באר 1-2 פעמים בתמיסת מעכב adDMEM/F-12 בינוני + סלע (דילול של 1:2000). מעבירים את האשכולות המקוטעים יחד עם מדיום התרבית לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מ"ל. צנטריפוגה בחום של 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
    הערה: כאשר אורגנואידים מגיעים לקוטר של 100 מיקרומטר (בדרך כלל ביום התרבית 14). אם נפח בינוני מוגזם מפריע להפרעה מכנית, שאפו חלק מהמדיום לפני פירוק האשכולות. לקבלת שאריות ג'ל מטריצה שנדבק למשטח הצלחת, יש לגרד בעדינות באמצעות קצה פיפטה ולשטוף 2-3 פעמים בתמיסת מעכב adDMEM/F-12 בינוני + סלע (דילול 1:2000). יש לאגד את כל השטיפות עם האיסוף הראשוני לקבלת תפוקה מקסימלית.
  2. דיסוציאציה אורגנואידית: השעו מחדש את הגלולה המתקבלת ב-2 מ"ל של תמיסת אנזים דמוית טריפסין רקומביננטית שחוממה מראש. פיפטה למעלה ולמטה כדי ליזום דיסוציאציה, ואז דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות. עקוב אחר דיסוציאציה תחת המיקרוסקופ כל 5 דקות עד שאשכולות תאים קטנים (כ-5-6 תאים בכל אשכול) שולטים בשדה, ולאחר מכן המשך לשלב הבא.
    הערה: הפסקת העיכול בזמן היא חיונית כדי למנוע דיסוציאציה יתר ולשמירה על כדאיות התאים. תצפית מיקרוסקופית תכופה מבטיחה שהעיכול נעצר בזמן האופטימלי להיווצרות אשכולות.
  3. הפסקת העיכול: הפסקת העיכול על ידי הוספת נפח שווה או כפול של מדיום adDMEM/F-12 בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) כדי להרוות את הפעילות האנזימטית. צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
  4. הסרת ג'ל מטריקס: השעו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של תמיסת התאוששות תאים ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20-40 דקות כדי להמיס שאריות ג'ל מטריצה. צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט וחזרו על הכביסה פעמיים עם מדיום adDMEM/F-12 כדי לחסל רכיבי מטריצה שיוריים. העבירו את הגלולה הסופית לצינור אפנדורף סטרילי בנפח 1.5 מ"ל להמשך עיבוד.
    הערה: דגירה בטמפרטורה נמוכה היא קריטית לדה-פולימריזציה יעילה של ג'ל מטריקס תוך שמירה על שלמות התא. צמצם את הזמן מחוץ לסביבה הקרה כדי למנוע ג'לציה מוקדמת.
  5. זריעה ותרבות: המשך בזריעה מחדש של אשכולות האורגנואידים המנותקים בהתאם להליכים המתוארים בשלבים 3.1-3.3. הקפידו על צפיפות תאים נכונה ויחס ג'ל מטריצה לרפורמציה אופטימלית של מבנה תלת מימד.
    הערה: פרוטוקולים מפורטים לשימור בהקפאה של אורגנואידים, הפשרה, הטבעה מחדש ועיבוד היסטולוגי זמינים לפי בקשה.

5. שימור בהקפאה אורגנואידית

  1. איסוף אורגנואידים: הסר את צלחת התרבות מהחממה ופרק מכנית אגרגטים הידרוג'ל אורגנואידים באמצעות קצה פיפטה מקורר מראש. העבירו את האגרגטים המנותקים יחד עם מדיום התרבות לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מ"ל. שטפו את הבארות 2-3 פעמים עם מדיום adDMEM/F-12, תוך שילוב השטיפות עם המתלה הראשוני. צנטריפוגה בחום של 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנטנט.
    הערה: כדי להבטיח תפוקה מקסימלית, יש לשבש בעדינות את אגרגטים האורגנואידים מבלי לגרום לנזק מוגזם. יש לשלב את כל השטיפות עם האוסף הראשוני כדי להפחית את אובדן האורגנואידים בתהליך האיסוף.
  2. דיסוציאציה אנזימטית: הוסף 2-4 מ"ל של תמיסת אנזים רקומביננטית דמוית טריפסין מחוממת מראש לכדור האורגנואיד בצינור חרוטי וערבב בעדינות את התרחיף. דגרו את המתלה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות. עקוב אחר תהליך הדיסוציאציה באופן מיקרוסקופי כל 5 דקות.
    הערה: במידת הצורך, פיפטה בעדינות כדי לסייע בפירוק אשכולות גדולים יותר לאגרגטים קטנים יותר (כ-5-6 תאים לכל אשכול). זמני עיכול קצרים יותר נדרשים לשימור בהקפאה כדי למנוע דיסוציאציה יתר ואובדן כדאיות התאים. תצפית תכופה מבטיחה שהעיכול יופסק בשלב המתאים כדי לשמור על שלמות האורגנואידים.
  3. הפסקת עיכול: הוסף נפח שווה או גדול יותר של מדיום adDMEM/F-12 בתוספת FBS כדי לעצור את הפעילות האנזימטית. צנטריפוגה בחום של 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
    הערה: אם הגלולה נקייה מג'ל מטריצה שיורי, המשך לשלב 5.5 לשימור בהקפאה. אם זיהום ג'ל מטריקס נמשך, המשך לשלב 5.4.
  4. הסרת ג'ל מטריקס (אופציונלי): בצע את ההליך המתואר בשלב 4.4 כדי להסיר את ג'ל המטריצה. השעו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של תמיסת התאוששות התאים ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20-40 דקות. צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט וחזרו על תהליך הכביסה 1-2 פעמים כדי להבטיח הסרה מלאה של ג'ל המטריקס.
    הערה: הסרת שאריות ג'ל מטריצה היא קריטית כדי להבטיח שרק תאים מנותקים יישמרו בהקפאה. הסרת ג'ל לא מלאה עלולה להשפיע על הכדאיות והשלמות המבנית של האורגנואידים בעת ההפשרה.
  5. שימור בהקפאה: השעו מחדש את כדור התא ב-1.5 מ"ל של מדיום הקפאה אורגנואיד על ידי פיפטינג עדין כדי להבטיח השעיה אחידה. העבירו את המתלה לקריוביאל ואחסנו אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימור לטווח קצר. לאחר 24 שעות, העבירו את הבקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח הארוך.
    הערה: ודא שמדיום השימור בהקפאה מעורבב היטב עם התאים כדי למנוע הקפאה לא אחידה, שעלולה להוביל לנזק לתאים. יש להעביר בקבוקונים לחנקן נוזלי מיד לאחר תקופת האחסון לטווח הקצר כדי להבטיח שימור לטווח ארוך ולמנוע פירוק תאים.

6. התאוששות אורגנואידים

  1. הפשרת אורגנואידים משומרים בהקפאה: הסר קריאוביאלים המכילים אורגנואידים מחנקן נוזלי או מאחסון של -80 מעלות צלזיוס. טבלו מיד את הבקבוקון באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס וערבבו בעדינות עד שהתוכן מופשר במלואו. לאחר השלמת ההפשרה, העבירו את תרחיף האורגנואיד לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מ"ל באמצעות קצה פיפטה מקורר מראש (-20 מעלות צלזיוס).
    הערה: הפשרה מהירה ואחידה היא קריטית כדי למזער נזק לתאים הנגרם על ידי קריו. השתמש בקצות פיפטה מקוררים מראש כדי למנוע התחממות מוקדמת ורפורמציה של ג'ל מטריצה במהלך ההעברה.
  2. הסרת חומר קריופרוטקטנט: הוסף בזהירות 1-2 מ"ל של מדיום adDMEM/F-12 לאורך דופן הצינור החרוטי כדי לדלל את חומר ההקפאה בהדרגה. מערבבים בעדינות על ידי היפוך. צנטריפוגה בחום של 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
    הערה: הימנע מפיפטינג או מערבולת נמרצת בשלב זה, מכיוון ששינויים אוסמוטיים פתאומיים ולחץ מכני עלולים לפגוע בכדאיות האורגנואידים. גישת דילול איטי ממזערת את ההלם הסלולרי.
  3. כביסה והשעיה: הוסף 1 מ"ל של מדיום adDMEM/F-12 טרי לגלולה. השעו מחדש את התאים בעדינות באמצעות קצה פיפטה מקורר מראש (-20 מעלות צלזיוס) כדי למנוע הידבקות מוקדמת של ג'ל המטריקס. העבירו את המתלה לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    הערה: שמירה על טמפרטורה נמוכה במהלך הכביסה חיונית למניעת הרכבה מחדש המושרה תרמית של רכיבי ג'ל מטריקס, מה שעלול לעכב את הרפורמציה האורגנואידית שלאחר מכן.
  4. אוסף: צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט. חזור על שלב הכביסה 2-3 פעמים כדי להבטיח הסרה מלאה של שאריות קריופרוטקטנט ומזהמים.
  5. זריעה ותרבות: השעו מחדש את גלולת התא הסופית במדיום תרבית אורגנואידים שהוכן בהתאם לצרכי הניסוי. המשך בזריעה בהתאם לפרוטוקול המתואר בשלבים 3.1-3.3, תוך הבטחת פרופורציה נכונה של ג'ל מטריצה וצפיפות תאים כדי לתמוך בהקמה מחדש של מבנה תלת מימד.
    הערה: כדאיות התאים וההתאוששות לאחר ההפשרה תלויים מאוד בטיפול עדין, דילול נכון של חומרי הקפאה והקמה מחדש מיידית של סביבת ג'ל מטריצה תלת-ממדית תומכת.

7. עיבוד טרום אנליזה לאפיון אורגנואידים

  1. קצירת אורגנואידים: פירוק מכני של אגרגטים כאשר קוטר האורגנואידים מגיע ל-70-100 מיקרומטר והעביר אותם לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל מדיום לתרבית שלאחר מכן. שטפו את הבארות 2-3 פעמים עם מדיום adDMEM/F-12 ושלבו את השטיפות עם תרחיף האורגנואיד. צנטריפוגה בחום של 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנטנט.
    הערה: עבור אוספים בקנה מידה קטן (למשל, 1-2 בארות), השתמש בצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל כדי להבטיח טיפול יעיל ולהפחית את אובדן הדגימה. היזהר כדי להימנע משיבוש המבנים האורגנואידים במהלך דיסוציאציה.
  2. השעיה מחדש: השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום adDMEM/F-12 והעבירו לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
    הערה: ודא שהגלולה מושעה ביסודיות לפני הצנטריפוגה כדי למנוע גושים וכדי להקל על עיבוד אחיד בשלבים הבאים.
  3. כביסה וקיבוע: הוסף 1 מ"ל של D-PBS לגלולה וערבב בעדינות על ידי פיפטינג או היפוך. צנטריפוגה בחום של 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט וחזרו על שלב הכביסה 1-2 פעמים. מקבעים את הגלולה עם 1-2 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ודוגרים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: בצע בזהירות את שלבי הכביסה כדי להבטיח הסרה יסודית של שאריות מדיום ומזהמים אחרים. הקיבוע בפרפורמלדהיד הוא חיוני לשימור מורפולוגיה אורגנואידית לניתוח שלאחר מכן.
  4. כביסה לאחר קיבוע: צנטריפוגה של הדגימות ב-200 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט. שטפו את הדגימות הקבועות 2-3 פעמים עם D-PBS, ערבבו בעדינות על ידי היפוך אצבעות או היפוך עדין כדי להבטיח פיזור נכון של מאגר הכביסה ולמנוע אובדן אורגנואידים.
    הערה: שטיפה נכונה לאחר קיבוע חיונית להסרת עודפי פרפורמלדהיד ולהפחתת כתמי רקע ביישומים במורד הזרם, כגון אימונוהיסטוכימיה.
  5. קיבוע מחדש של אתנול: השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של 70% אתנול מערבבים בעדינות על ידי לחיצה על האצבע, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו סופרנטנט.
    הערה: קיבוע אתנול בשלב זה מסייע בשמירה על שלמות האורגנואידים והכנת הדגימות להטמעה או לעיבוד נוסף. הקפידו על מתלה אחיד באתנול כדי למנוע קיבוע לא אחיד.
  6. פינוי ג'ל מטריקס (אופציונלי): אם נשאר ג'ל מטריצה שיורי בגלולה, עקוב אחר הפרוטוקול המתואר בשלב 4.4 כדי להסיר אותו. שלב זה כולל השעיית הגלולה בתמיסת התאוששות תאים ודגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20-40 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ושטיפות מרובות כדי להבטיח הסרת ג'ל מלאה.
    הערה: הסרת ג'ל מטריצה חשובה במיוחד לניתוח או הדמיה היסטולוגית במורד הזרם, שכן ג'ל שיורי עלול להפריע לחיתוך וניתוח רקמות.
  7. הטמעת אגרוז: הכן כ-6 מ"ל של 2% אגרוז על ידי התכה ב-96 מעלות צלזיוס במהלך קיבוע אתנול אורגנואיד. מערבבים 100 מיקרוליטר מהאגרוז המומס עם גלולת האורגנואיד, ומבטיחים היווצרות בועות אוויר מינימליות. מעבירים את התערובת לתבנית, מתמצקים ב-4 מעלות צלזיוס, ואז מעבדים להטמעת פרפין.
    הערה: יש לחמם מראש את קצות הפיפטה (עם קצוות גזומים) כדי למנוע סתימה. הטמעת אגרוז מקלה על שימור מבנה האורגנואידים תוך מתן טיפול וחתך קלים. הימנע מהיווצרות בועות במהלך הערבוב כדי להבטיח הטבעה אחידה וחיתוך רקמות אופטימלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מאפייני גידול מורפולוגיים ודינמיים של אורגנואידים של סרטן הערמונית שמקורם בחולה
אורגנואידים של סרטן הערמונית שמקורם בחולה הוקמו בהצלחה מרקמות גידול טריות שנאספו במהלך הליכים קליניים. היווצרות אורגנואידים ראשונית נצפתה בדרך כלל תוך 5-7 ימים מהתרבית (איור 2). תחת מיקרוסקופ שדה בהיר, אורגנואידים הפגינו תכונות מורפולוגיות מובהקות, ויצרו ספרואידים קומפקטיים ומוגדרים היטב או מבנים דמויי בלוטה. אורגנואידים שמקורם בדגימות אדנוקרצינומה הראו ארגון ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הקמת PDOs עבור PCa מייצגת התקדמות קריטית במודלים פרה-קליניים, המציעה יתרונות משמעותיים על פני תרביות תאים דו-ממדיות קונבנציונליות ו-PDXs16. השיטה המוצגת במחקר זה מאפשרת יצירת אורגנואידים המסכמים נאמנה את המאפיינים ההיסטולוגיים, הגנטיים והפנוטיפיים של הגידול המקורי. על ידי שימור הטרוגניות של הגידול, כולל איתות AR וארכיטקטורה תאית, האורגנואידים מספקים פלטפורמה רלוונטית יותר מבחינה ביולוגית לחקר התקדמות סרטן הערמונית, עמידות לטיפול ותגובות טיפוליות מותאמות אישית

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים בהכרת תודה על תמיכתם של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 82172831) ופרויקט המחקר המרכזי של ועדת הבריאות ותכנון המשפחה המחוזית של ג'יאנגסו (מענק מס' X20240121).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
A 83-01טוקריס2939
adMEM/F12גיבקו12634010
ארון בטיחות ביולוגיתג'ינאן שינביישי ביוטכנולוגיה בע"מ
פתרון לשחזור תאיםקורנינג354253
צנטריפוגהחברת טכנולוגיית החיים של שנזן רויוודה בע"מM1416R
צינורות צנטריפוגהנאנג'ינג iResearch Biotechnology Co., Ltd
Cultrex PathClear BMR& D3533-010-02
BME עם גורם גדילה מופחת של Cultrex, סוג 2R& D3533-005-02
מיכלי גידול (לוחות עם 24 בארות עם הידבקות נמוכה)תרמוNunc-174930-ZX
DHTISOREAG521-18-6
איזון אלקטרונינאנג'ינג iResearch Biotechnology Co., Ltd
סרום בקר עובריגיבקו10099141
גלוטמין פלוס-200 מ״מR& DB90210
HEPESR& D1254/10
חממת תרבית תאים לחה (37°°; C, 5% CO2)חברת הכלים המדעיים של שנחאי הטיאן בע"מHY-160SY
מקררנאנג'ינג iResearch Biotechnology Co., Ltd
מנות תרבות בגודל בינוניאבסיןABS7005
תוספת מדיה N21-MAX (50X)R& DAR008
N-אצטילציסטאיןסיגמאA9165-5G
ניקוטינאמידR& D3533-010-02
נורמוסיןאינויווגןאנט-אן-אן-2
מכשיר פיפטינג עם עזר פיפטחברת Nanjing Hotspot Scientific Instrument בע"מ
פיפטותחברת Nanjing Hotspot Scientific Instrument בע"מ
פרימוסיןאינויווגןאנט-PM-2
rhEGFR& D236-EG-01M
rhFGFR& D233-FB-025
rhFGF-10R& D345-FG-025
rhNogginR& D6057-NG-100
rhR-ספונדין 1R& D4656-RS-100
SB 202190טוקריס1264
מכשיר הכנת מתלים חד-תאייםהנעה אחוריתDSC-400
מספריים/סכין רקמותנאנג'ינג iResearch Biotechnology Co., Ltd
טריפל אקספרסגיבקו126A04013
ערכת ניתוק גידולים, אנושימילטני ביוטק130-095-929
פינצטהנאנג'ינג iResearch Biotechnology Co., Ltd
אמבט מיםצ'אנגג'ואו ג'ונגג'יה לייצור כלים ניסיוניים בע"מHH-600
Y-27632 דיהידרוכלורידR& D1254/10

מקורות

  1. James, N. D., et al. The lancet commission on prostate cancer: planning for the surge in cases. Lancet. 403 (10437), 1683-1722 (2024).
  2. Knutson, T. P., et al. AR alterations inform circulating tumor DNA detection in metastatic castration resistant prostate cancer patients. Nat Commun. 15 (1), 10648(2024).
  3. Haffner, M. C., et al. Framework for the pathology workup of metastatic castration-resistant prostate cancer biopsies. Clin Cancer Res. 31 (3), 466-478 (2025).
  4. Fang, Z., Li, P., Du, F., Shang, L., Li, L. The role of organoids in cancer research. Exp Hematol Oncol. 12 (1), 69(2023).
  5. Sachs, N., Clevers, H. Organoid cultures for the analysis of cancer phenotypes. Curr Opin Genet Dev. 24, 68-73 (2014).
  6. Zhou, L., Zhang, C., Zhang, Y., Shi, C. Application of organoid models in prostate cancer research. Front Oncol. 11, 736431(2021).
  7. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  8. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  9. Puca, L., et al. Patient-derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nat Commun. 9 (1), 2404(2018).
  10. Pamarthy, S., Sabaawy, H. E. Patient-derived organoids in prostate cancer: improving therapeutic efficacy in precision medicine. Mol Cancer. 20 (1), 125(2021).
  11. Karkampouna, S., et al. Patient-derived xenografts and organoids model therapy response in prostate cancer. Nat Commun. 12 (1), 1117(2021).
  12. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  13. Neal, J. T., Kuo, C. J. Organoids as models for neoplastic transformation. Annu Rev Pathol. 11, 199-220 (2016).
  14. Waseem, M., Wang, B. D. Organoids: an emerging precision medicine model for prostate cancer research. Int J Mol Sci. 25 (2), (2024).
  15. Moschovas, M. C., Patel, V. Neurovascular bundle preservation in robotic-assisted radical prostatectomy: how I do it after 15,000 cases. Int Braz J Urol. 48 (2), 212-219 (2022).
  16. Li, Y., Qin, M., Liu, N., Zhang, C. Organoid development and applications in gynecological cancers: the new stage of tumor treatment. J Nanobiotechnology. 23 (1), 20(2025).
  17. Xiang, D., et al. Building consensus on the application of organoid-based drug sensitivity testing in cancer precision medicine and drug development. Theranostics. 14 (8), 3300-3316 (2024).
  18. Van Hemelryk, A., et al. Patient-derived xenografts and organoids recapitulate castration-resistant prostate cancer with sustained androgen receptor signaling. Cells. 11 (22), 3632(2022).
  19. Zhao, H., et al. Patient-derived bladder cancer organoids as a valuable tool for understanding tumor biology and developing personalized treatment. Adv Sci (Weinh). 12 (13), e2414558(2025).
  20. Polak, R., Zhang, E. T., Kuo, C. J. Cancer organoids 2.0: modelling the complexity of the tumour immune microenvironment. Nat Rev Cancer. 24 (8), 523-539 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אורגנואידים מהחולהתרבית אורגנואידיםעיכול רקמת גידולהשקה בג'ל מטריקסתחזוקת אורגנואידיםסריקת תרופותרפואה מותאמת אישיתביטוי קולטן אנדרוגןגילוי סמנים ביולוגיים
הקמה ותחזוקה של אורגנואידים של סרטן הערמונית שמקורם בחולה: פרוטוקול ניסיוני מפורט
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.