מאמר שיטה

זיהוי התנהגות נוטה להצטברות בתאי סרטן השד המוטנטים P53 V157F באמצעות פלואורסצנציה מרובת נקודות של תיופלבין T

DOI:

10.3791/68921

⸱

30 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, I-Shou University, 2School of Chinese Medicine for Post Baccalaureate, I-Shou University, 3Department of Medical Science and Biotechnology, I-Shou University, 4Department of Biomedical Engineering, I-Shou University, 5Department of Pathology, E-Da Hospital, 6Department of Physical Therapy, I-Shou University, 7Department of Occupational Therapy, I-Shou University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי סרטן השד Hs578T המכילים את מוטציית p53 V157F מציגים פלואורסצנציה גבוהה משמעותית של ת'יופלבין T בהשוואה לתאי MCF7, מה שמעיד על שיפור בהצטברות חלבונים. מדידות פלואורסצנציה מרובות נקודות משפרות את דיוק הגילוי והאמינות בזיהוי אגרגטים עשירים ב-β-sheet, ומדגישות את חשיבות מוטציות p53 המועדות להצטברות במחקר סרטן ובפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדכא הגידול p53, המקודד על ידי גן TP53 , ממלא תפקיד מרכזי בשמירה על יציבות גנומית. מוטציות של TP53 , במיוחד וריאנטים של נקודות חמות, נמצאות בכ-50% מהסרטן האנושי ועלולות להוביל לאובדן תפקודים מדכאי גידולים או לרכישת תכונות רווח תפקוד, כולל הצטברות למבנים דמויי פריון.

במחקר זה, הערכנו את נטיית ההצטברות של מוטציית P53 V157F בתאי סרטן השד Hs578T בהשוואה לתאי MCF7 המבטאים p53 מסוג פראי. הצטברות החלבונים הוערכה באמצעות צביעת Thioflavin T (ThT) ואחריה כימות פלואורסצנציה בבדיקות לוח של 96 בארים. התאים צוברו בתמיסת ThT/Hoechst, נשטפו ונותחו באמצעות קורא מיקרופלט תחת פרמטרים מוגדרים של גירור/פליטה. ניתוח כמותי שהשתמש בקריאות פלואורסצנציה חד-נקודה וארבע נקודות הראה כי תאי Hs578T הראו עלייה של פי 3.20 עד 4.26 בעוצמת הפלואורסצנציה של ThT ביחס ל-MCF7, מה שמעיד על רמות גבוהות משמעותית של אגרגטים עשירים בדפי β או דמויי אמילואידים. מדידות רב-נקודתיות אישרו את הנוכחות הנרחבת והעקבית של אגרגטים חלבונים על פני הבאר. ממצאים אלו תומכים בשימוש בקריאת לוחות רב-נקודתיות לזיהוי מדויק של הצטברות חלבונים במבחנים מבוססי תאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גן TP53, שמקודד את חלבון מדכא הגידול p53, עובר מוטציה בכ-50% מסוגי הסרטן האנושיים 1,2. מוטציות כאלה לא רק מבטלות את הפונקציות המדכאות גידולים של p53, אלא גם מקדמות בווריאציות נקודות חום מסוימות היווצרות אגרגטים דמויי פריון 3,4. צורות מצטברות אלו של מוטנטים p53 רוכשות לעיתים תכונות רווח תפקוד, כולל עמידות מוגברת לטיפולים אנטי-סרטניים 5,6. לכן, זיהוי אילו מוטציות בנקודות חמות p53 נוטות להצטברות הוא קריטי להכוונת פיתוח אסטרטגיות טיפול יעילות בסרטן p53-מוטנטי 7,8.

במחקרים הקודמים שלנו שמנו לב שמוטציות ספציפיות ב-p53 בקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC) ובקווי תאי סרטן השד מציגות אותות צביעה חזקים של תיאופלבין T (ThT), המצביעים על נוכחות חלבונים מצטברים. ThT הוא צבע בנזותיאזול שנקשר במיוחד למבנים עשירים בעמילואידים β, ומייצר פלואורסצנציה מוגברת בעת קישור9. לדוגמה, קו התאים Detroit 562 HNSCC, הנושא את מוטציית p53 R175H, הציג אותות פלואורסצנציה ThT חזקים10. באופן דומה, שני קווי תאים נוספים של HNSCC, TW01 ו-HONE-1, ששניהם נושאים את מוטציית P53 R280T, הראו גם הם צביעת ThT בולטת11. במקרים אלו, אותות ThT התמקמו יחד עם p53, ותמכו בנוכחות מצטברת של p5310,11.

בתאי סרטן השד, MDA-MB-231 (מוטציה ב-P53 R280K) ו-T47D (מוטציה ב-L194F) הראו גם הם צביעת ThT חזקה עם קו-לוקליזציה שקופה של p53/ThT12. לעומת זאת, תאי MCF7, שמבטאים p53 מסוג פראי, ותאי MDA-MB-468 (מוטציית P53 R273H) הראו רק אותות ThTחלשים 12. באופן דומה, תאי OECM-1 HNSCC עם מוטציה p53 V173L הראו רמות נמוכות של צביעת ThT10.

בהשוואה לשיטות אחרות לזיהוי אגרגציה של חלבונים - כגון בדיקות מלכודת מסנן, מיקרוסקופיית אלקטרונים להעברת חשמל (TEM) או צביעת חיסון עם נוגדנים ספציפיים לאגרגט - ניתוח הפלואורסצנציה ThT מציע מספר יתרונות. היא אינה הרסנית, מהירה, וישמה הן לתאים חיים והן לתאים קבועים ללא עיבוד נרחב. בעוד שבדיקות מלכודת מסנן לוכדות ביעילות אגרגטים בלתי מסיסים, הן דורשות דנאטורציה קשה ואינן מתאימות לשימוש בתאים חיים13. TEM מספק ויזואליזציה ישירה של מורפולוגיית הסיבים אך דורש עבודה רבה ובעל תפוקה נמוכה14. צביעת חיסון ספציפית לאגרגט מאפשרת זיהוי במקום באמצעות נוגדנים תלויי קונפורמציה, אם כי זמינות וספציפיות נוגדנים עלולות להגביל15. לעומת זאת, פלואורסצנציה ThT – במיוחד בשילוב עם קריאת לוחות רב-נקודתיים – מציעה גישה פשוטה, כמותית ואמינה מרחבית לזיהוי מבנים עשירים בגיליונות β או דמויי אמילואידים.

שיקולים מעשיים הם גם מפתח לשחזוריות. פלואורסצנציה ThT מתואמת ליניארית עם ריכוז עמילואידים בטווח ריכוז רחב (0.2-500 מיקרומון), ואות השיא מושג בדרך כלל ב-20-50 מיקרומטר, תלוי בחלבון – אם כי הפלואורסצנציה העצמית של ThT יכולה להופיע ב-≥5 מיקרומטר, וריכוזים גבוהים יותר עשויים להשפיע על קינטיקת האגרגציה16. לכן, מומלץ בדרך כלל ריכוז ThT עובד סביב 10-20 מיקרומול כדי לאזן את הרגישות תוך מזעור ההשפעות הפוטנציאליות על תהליכי האגרגציה16. בפרוטוקול שלנו, המאגר של 1,000 פעמים ThT (12. mM) מדולל ביחס של 1:1,000 ליצירת ריכוז עבודה של כ-12. μM, שנמצא בטווח המומלץ.

ThT נקשר באופן מועדף למבנים עשירים ב-β יריעות אמילואידיות, האופייניים לסיבי אמילואידים. ספציפיות זו נובעת מהאינטראקציה של הצבע עם הארכיטקטורה החוצה-β של סיבי עמילואיד, כאשר המשטחים הנוצרים על ידי β גדילי הצבע מספקים אתרי קישור ל-ThT. כתוצאה מכך, ייתכן ש-ThT לא יזהה ביעילות אגרגטים אחרים שמקופלים בצורה שגויה או לא אמילואידים שאינם מציגים מבנה עשיר ב-β גיליונות17. לכן, בעוד ש-ThT הוא כלי חשוב לזיהוי סיבי עמילואיד, מומלץ להשתמש בשיטות אימות משלימות - כגון קו-לוקליזציה עם אימונופלואורסצנציה p53 או גישות ביופיזיקליות - כדי לאמת את זהות וספציפיות האגרגטים שזוהו10,18.

מחקרי חיזוי מבניים מצביעים על כך שמוטציית p53 V157F מאמצת קונפורמציה רגישה יותר להצטברות מאשר חלבון מסוג פראי19. במחקר זה השווינו אותות פלואורסצנציה ThT בין תאי סרטן השד Hs578T, הנושאים את מוטציית p53 V157F הנוטה להצטברות, לבין תאי סרטן השד MCF7 המבטאים סוג פראי מסוג p53. באמצעות בדיקת צביעת ThT מבוססת קורא לוחות רב-נקודתי, ניסינו להעריך את נטיית ההצטברות של p53 V157F ביחס ל-p53 מסוג פראי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. זריעת תאים

  1. כדי להעריך את כחיות התאים, מערבבים 10 מיקרוליטר של Trypan Blue עם 10 מיקרוליטר של תאים שהוחזרו ב-1x Phosphate-Buffered Salline (DPBS) של Dulbecco בצינור מיקרוצנטריפוגה וערבבו היטב.
  2. טעין 10 מיקרוליטר מהתערובת על סלייד מונה, ואז סופר את התאים החיים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
  3. בהתבסס על ספירת הכדאיות, זרעו 30,000 תאים בריאים בכל באר לתוך לוח תרבית של 96 בארות, כאשר באר אחת מוגדרת כבקרה ללא צביעה ושלוש הבארות הנותרות משמשות לצביעה.

2. דגירה

  1. הנח את צלחת הגידול בתנורCO2 ודוגר 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

3. הכנת ציר צביעת ThT טרי (1,000 פעמים)

  1. שקלו 0.02 גרם (20 מ"ג) של אבקת ThT והמסו אותה ב-5.0 מ"ל מים דה-יוניים. ערבבו היטב עד שהאבקה נמסת לחלוטין.
    הערה: תכשיר זה מניב תמיסת מלאי ThT פי 1,000 בריכוז סופי של 4 מ"ג/מ"ל, השווה ל-12.5 מ"מ (ל-ThT משקל מולקולרי ~318.85 גרם למול). תמיסה של 4 mg/mL שווה ל-4 g/L. חלוקה של 4 g/L ב-318.85 g/mol נותנת 0.0125 mol/L, או ~12.5 mM).

4. הכנת בופר צביעת ThT עם נגד-צבע גרעיני

  1. הכינו את תמיסת הצביעה על ידי הוספת החומרים הבאים ל-1 מ"ל של 1x DPBS וערבבו בעדינות כדי להבטיח אחידות.
    1. הוסף 1 מיקרוליטר של 1,000 פעמים ThT טרי, מה שנותן ריכוז ThT סופי של 12.5 מיקרומולר (1x).
    2. מוסיפים 1 מיקרוליטר של תמיסת מאגר Hoechst 33342 של 1 מ"ג/מ"ל, ומקבלים ריכוז סופי של ~1 מיקרוגרם/מ"ל (=1.6 מיקרומון).

5. צביעה

  1. הסר את מדיום הגידול מכל באר. הוסף 100 מיקרוליטר מבופר הצביעה ThT/Hoechst המוכן לכל באר צביעה. הוסיפו 100 מיקרוליטר של 1x DPBS לשליטה ללא צבע.

6. דגירה

  1. הנח את הצלחת במקום חשוך בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות.

7. כביסה

  1. שאפו בזהירות או השליכו את תמיסת הכתם מכל באר, תוך זהירות שלא להפריע לשכבת התא.
  2. הוסיפו 100 מיקרוליטר של 1× DPBS לכל באר ואפשרו השרייה עדינה של 30 שניות אופציונלית.
  3. שאפו בזהירות או השליכו את תמיסת הכביסה של DPBS.
  4. חזור על השטיפה על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 1x DPBS טרי לכל באר, שוב מאפשר השריה עדינה של 30 שניות אופציונלית, ואז זרוק את תמיסת השטיפה של DPBS.
  5. לאחר השטיפה השנייה, הוסיפו 100 מיקרוליטר של 1x DPBS טרי לכל באר.

8. מדידת פלואורסצנציה

  1. לפני קריאת אות הפלואורסצנציה, הסר את המכסה מלוח 96 הבארות. מדדו פלואורסצנציה באחת משתי שיטות: קריאה בנקודה אחת או קריאה בארבע נקודות.
  2. הכניסו את פלטת 96 הבארים לקורא מיקרופלט, ומדדו פלואורסצנציה באמצעות ההגדרות הבאות: פלואורסצנציה ThT: עירור ב-450 ננומטר, פליטה ב-490 ננומטר; Hoechst 33342 פלואורסצנציה: עירור ב-360 ננומטר, פליטה ב-460 ננומטר; הגדרות הקורא: רעידה: 5 שניות לפני הקריאה; הכוונה לקריאה: קריאה מובילה; זמן אינטגרציה: 140 מילישניות; גובה קריאה: 1.00 מ"מ; נקודות לכל מערךl: 1 (נקודת קצה) או 4 (סריקת באר); הגדרת סריקת באר: (הגדרת צפיפות: 2; ריווח נקודות: 2.5).

9. ניתוח נתונים

  1. חשב את אגרגציית החלבונים כך:
    figure-protocol-1
  2. נרמל את עוצמת הפלואורסצנציה של ThT על ידי קביעת היחס בתאי MCF7 כ-1 (בקרה בסיסית).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לחקור נוכחות של אגרגטים חלבונים עשירים ב-β יריעות בתאי סרטן השד, קווי תאי MCF7 ו-Hs578T נחשפו לצביעת ThT ולאחר מכן לכימות פלואורסצנטי. כפי שמוצג באיור 1, תאים הוזרעו בארבעה בארות של לוח של 96 בארות, כאשר באר אחת מסומנת כבקרה לא מוכתמת. שלושת הבארות הנותרות הוכתמו ב-ThT לפי הפרוטוקול הסטנדרטי. הפלואורסצנציה נמדדה בשתי גישות: (1) קריאה בנקודה אחת שנלקחה ממרכז כל באר, ו-(2) קריאה של ארבע נקודות שהתקבלה על ידי ממוצע אותות מארבעה מיקומים שונים בתוך כל באר כדי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר זורעים תאים בלוחות של 96 בארות, לעיתים קשה להשיג פיזור אחיד על פני הבאר, שכן ניעור עדין או נקישה על הפלטה כדי לפזר את התאים אינו תמיד אפשרי. התפלגות לא אחידה זו עלולה לגרום לשונות בעוצמת האות ברחבי הבאר. קריאת פלואורסצנציה מרובת נקודות חשפה שונות משמעותית בין אזורים שונים באותה באר, מה שהדגיש הטיה זו ואת הפוטנציאל לתוצאות מטעות כאשר נמדדת נקודה אחת בלבד. הסתמכות על נקודת קריאה מרכזית אחת עלולה להמעיט בהטרוגניות האות ולהסתיר הבדלים עדינים בפלואורסצנציה של ThT בין קווי תאים או תנאי טי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים בהכרת תודה על הסיוע הטכני שניתנה על ידי המעבדה הבסיסית לרפואה בפקולטה לרפואה, אוניברסיטת אי-שו. עבודה זו נתמכה במענקים מבית החולים E-DA [EDAHJ114001 ל-C.-C.C.] ומהמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה בטייוואן [NSTC 112-2813-C-214-032-B to B.-H. C]

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
לוח גידול עם 96 בארותפשוטPC396-0100
סלייד נגדInvitrogenC10228
Countess II FL מונה תאים אוטומטיתרמו פישר סיינטיפיק AMQAF1000
dPBSפשוטCC704-0500
צינור אפנדורףפשוטPC101-5000
Hoechst 33342AAT ביוקווסט17530
ספקטרמקס iD3מכשירים מולקולריים735-0391 
תיאופלבין טיסיגמא-אלדריץ'T3516
טרייפן בלוInvitrogenT10282

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binayke, A., Mishra, S., Suman, P., Das, S., Chander, H. Awakening the "guardian of genome": Reactivation of mutant p53. Cancer Chemother Pharmacol. 83 (1), 1-15 (2019).
  2. Chen, C. C., et al. A simple and affordable method to create nonsense mutation clones of p53 for studying the premature termination codon readthrough activity of ptc124. Biomedicines. 11 (5), 1310(2023).
  3. Rangel, L. P., Costa, D. C., Vieira, T. C., Silva, J. L. The aggregation of mutant p53 produces prion-like properties in cancer. Prion. 8 (1), 75-84 (2014).
  4. Kim, S., An, S. S. Role of p53 isoforms and aggregations in cancer. Medicine (Baltimore). 95 (26), e3993(2016).
  5. Zhou, G., et al. Gain-of-function mutant p53 promotes cell growth and cancer cell metabolism via inhibition of ampk activation. Mol Cell. 54 (6), 960-974 (2014).
  6. Zhang, C., et al. Gain-of-function mutant p53 in cancer progression and therapy. J Mol Cell Biol. 12 (9), 674-687 (2020).
  7. De Oliveira, G. aP., et al. The status of p53 oligomeric and aggregation states in cancer. Biomolecules. 10 (4), 548(2020).
  8. Wang, H., Guo, M., Wei, H., Chen, Y. Targeting p53 pathways: Mechanisms, structures, and advances in therapy. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 92(2023).
  9. Sulatskaya, A. I., Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K. Interaction of thioflavin t with amyloid fibrils: Stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye. J Phys Chem B. 115 (39), 11519-11524 (2011).
  10. Cai, B. H., et al. Nampt inhibitor and p73 activator represses p53 r175h mutated HNSCC cell proliferation in a synergistic manner. Biomolecules. 12 (3), 438(2022).
  11. Cai, B. H., et al. Chlorophyllides repress gain-of-function p53 mutated hnscc cell proliferation via activation of p73 and repression of p53 aggregation in vitro and in vivo. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (3), 167662(2025).
  12. Wu, K. -Y., et al. Synergistic anticancer activity of hsp70 inhibitor and doxorubicin in gain-of-function mutated p53 breast cancer cells. Biomedicines. 13 (5), 1034(2025).
  13. Nasir, I., Linse, S., Cabaleiro-Lago, C. Fluorescent filter-trap assay for amyloid fibril formation kinetics in complex solutions. ACS Chem Neurosci. 6 (8), 1436-1444 (2015).
  14. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly: Insights from scanning transmission electron microscopy. J Struct Biol. 173 (1), 1-13 (2011).
  15. Kayed, R., et al. Fibril specific, conformation dependent antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is absent in prefibrillar oligomers. Mol Neurodegener. 2, 18(2007).
  16. Xue, C., Lin, T. Y., Chang, D., Guo, Z. Thioflavin t as an amyloid dye: Fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation. R Soc Open Sci. 4 (1), 160696(2017).
  17. Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of thioflavin-t binding to amyloid fibrils. Biochim Biophys Acta. 1804 (7), 1405-1412 (2010).
  18. Yang-Hartwich, Y., et al. P53 protein aggregation promotes platinum resistance in ovarian cancer. Oncogene. 34 (27), 3605-3616 (2015).
  19. Lei, J., et al. Insights into allosteric mechanisms of the lung-enriched p53 mutants v157f and r158l. Int J Mol Sci. 23 (17), 10100(2022).
  20. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  21. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
  22. Yoshimura, Y., et al. Distinguishing crystal-like amyloid fibrils and glass-like amorphous aggregates from their kinetics of formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14446-14451 (2012).
  23. Yang, D. S., et al. Mesoscopic protein-rich clusters host the nucleation of mutant p53 amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (10), e2015618118(2021).
  24. Hackl, E. V., Darkwah, J., Smith, G., Ermolina, I. Effect of acidic and basic ph on thioflavin t absorbance and fluorescence. Eur Biophys J. 44 (4), 249-261 (2015).
  25. Bom, A. P., et al. The p53 core domain is a molten globule at low ph: Functional implications of a partially unfolded structure. J Biol Chem. 285 (4), 2857-2866 (2010).
  26. Ano Bom, A. P., et al. Mutant p53 aggregates into prion-like amyloid oligomers and fibrils: Implications for cancer. J Biol Chem. 287 (33), 28152-28162 (2012).
  27. Muller, P., Ceskova, P., Vojtesek, B. Hsp90 is essential for restoring cellular functions of temperature-sensitive p53 mutant protein but not for stabilization and activation of wild-type p53: Implications for cancer therapy. J Biol Chem. 280 (8), 6682-6691 (2005).
  28. Arsic, N., et al. Δ133p53β isoform pro-invasive activity is regulated through an aggregation-dependent mechanism in cancer cells. Nat Commun. 12 (1), 5463(2021).
  29. Zhao, L., Punga, T., Sanyal, S. Delta133p53alpha and delta160p53alpha isoforms of the tumor suppressor protein p53 exert dominant-negative effect primarily by co-aggregation. Elife. 14, RP106469(2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

P53Thioflavin TTP53Hs578T

מאמרים קשורים