מאמר שיטה

מודל עכבר מבוסס הליכון לחקירת גלי חום עם ניטור רציף של טמפרטורת העור

DOI:

10.3791/68922

⸱

14 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Fudan University, 2Department of Endocrinology, Jinshan Hospital, Fudan University, 3Institutes of Biomedical Sciences, School of Life Sciences, Inner Mongolia University, 4Department of Endocrinology and Metabolism, Zhongshan Hospital, Human Phenome Institute, Fudan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מבסס מודל עכברי של גלי חום בגיל המעבר על ידי שילוב של כריתת שחלות עם תרמוגנזה הנגרמת על ידי פעילות גופנית וניטור רציף של טמפרטורת עור הזנב ברזולוציה גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גלי חום פוגעים משמעותית באיכות החיים של נשים בגיל המעבר, אך המנגנונים העצביים הבסיסיים והטיפולים היעילים עדיין אינם מובנים היטב. אתגר מרכזי בתחום זה היה היעדר מודלים אמינים של בעלי חיים ושיטות לא פולשניות לניטור רציף של טמפרטורת העור. כאן, פותח מודל עכבר המשלב כריתת שחלות עם תרמוגנזה הנגרמת על ידי פעילות גופנית כדי לחקור גלי חום. באמצעות לוגר טלמטרי המאובטח על ידי שרוול זנב מודפס בתלת מימד, טמפרטורת עור הזנב נוטרה באופן רציף במצב נטול מתח. בנוסף, מצלמות אינפרא אדום סיפקו שיטה משלימה לניטור ייצור ופיזור חום, מה שמאפשר הערכה מקיפה יותר של טמפרטורת הגוף. באמצעות מודל זה, עכברים שעברו שחלות נמצאו מציגים עליות גבוהות יותר בטמפרטורת העור וטמפרטורת גוף נמוכה יותר, ומחקים למעשה את פנוטיפ גלי החום שנצפה בגיל המעבר. גישה זו מבססת מודל מדויק לניטור גלי חום ותהיה בעלת ערך לחוקרים בוויסות חום, מדעי המוח ומחקרים קליניים על גיל המעבר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גלי חום הם בין התסמינים השכיחים והמשבשים ביותר של גיל המעבר, ופוגעים משמעותית באיכות החיים1. אפיזודות אלה מאופיינות בעלייה פתאומית בטמפרטורת העור ואחריה ירידה חולפת בטמפרטורת הליבה של הגוף2, המלווה לעתים קרובות בקצב לב מוגבר, חרדה וסחרחורת3. למרות השפעתם העמוקה, הטיפולים היעילים נותרומוגבלים, מה שמדגיש את הצורך בהבנה עמוקה יותר של המנגנונים הבסיסיים שלהם.

שלב קריטי בחקר גלי חום הוא פיתוח מודלים אמינים של בעלי חיים המשכפלים במדויק תפקוד לקוי של ויסות חום. נכון לעכשיו, הגישה העיקרית כוללת כריתת שחלות (OVX), הגורמת לשינוי בטמפרטורת העור והליבה של הגוף5. עם זאת, שינויים אלה לרוב אינם עקביים, מכיוון שהם יכולים להתבלבל על ידי מתח או תנודות בטמפרטורת הסביבה6. יתר על כן, לכידת אירועים ספורדיים דמויי גלי חום נותרה מאתגרת. שיטות אלטרנטיביות משתמשות בחומרים פרמקולוגיים (למשל, סנקטיד, קפסאיצין, טמוקסיפן או נלוקסון) כדי לעורר הרחבת כלי דם עורית חריפה במכרסמים 7,8,9. בעוד שתרכובות אלו מייצרות עלייה מהירה ומדידה בטמפרטורת העור, המתן הפולשני שלהן וההשפעות התלויות במינון מסבכים את הפרשנות של תגובות ויסות חום. יתר על כן, עדיין לא ברור אם הרחבת כלי הדם הנגרמת על ידי תרופות מסכמת באופן מלא את התנאים הפיזיולוגיים של גלי חום טבעיים. לפיכך, יש צורך בדחיפות במודל בעלי חיים מעודן ואמין יותר.

פעילות גופנית היא מודולטור ידוע של טמפרטורת הגוף ונקשרה לאינדוקציה של גלי חום בבני אדם10. כמה מחקרים מינפו פעילות גופנית כפויה בעכברים כדי לחקות דפוסי פיזור חום הדומים לגלי חום 11,12,13. למרות שגישה זו מספקת אמצעי לא פולשני לעורר תנודות טמפרטורה, ניטור טמפרטורת העור בעכברים פעילים, במיוחד באמצעות תרמוגרפיה אינפרא אדום, הוא מאתגר מבחינה טכנית. בנוסף, הערכה מקיפה של תסמינים דמויי גלי חום דורשת רישום רציף וארוך טווח של טמפרטורת הזנב (העור) וטמפרטורת הליבה של הגוף.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותח מודל עכבר אופטימלי המשלב כריתת שחלות עם פעילות גופנית המושרה על ידי הליכון כדי לעורר באופן אמין תגובות רגולטוריות תרמיות דמויות גלי חום. בניסוי, עכברי C57BL/6J בגילאי 8-10 שבועות שוכנו בתנאים סטנדרטיים (מחזור אור-חושך 12:12, 22 מעלות צלזיוס ±1 מעלות צלזיוס, 50% ±-10% לחות). יתר על כן, לוגר טמפרטורה טלמטרי המאובטח על ידי שרוול זנב מודפס בתלת מימד תוכנן לאפשר ניטור טמפרטורת זנב רציף ונטול מתח בעכברים הנעים בחופשיות. תרמוגרפיה אינפרא אדום שולבה גם כדי לספק נתונים משלימים על ייצור ופיזור חום. מודל זה ישמש כלי רב ערך לחקירת המנגנונים של גלי חום ולהערכת התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות אלה תוכננו עבור דגמי עכברים. מחקרי עכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פודאן (2021JS0040). לפני יישום הפרוטוקול, בעלי חיים שוכנו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. במחקר זה, עכברי C57BL/6J נקבות בנות 8 עד 10 שבועות, במשקל 20-23 גרם, שוכנו בתנאים סטנדרטיים (מחזור אור-חושך של 12:12 שעות, 22 מעלות צלזיוס ±-1 מעלות צלזיוס, 50% ±-10% לחות). פרטי הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה לניסויים

  1. הכן עשר עכברים נקבות בנות 8-10 שבועות השוכנות בתנאים סטנדרטיים (12:12 מחזור אור-חושך, 22 מעלות צלזיוס ±1 מעלות צלזיוס, 50% ± 10% לחות) עם מזון ומים אד ליביטום .
  2. הקצה עכברים באופן אקראי לקבוצות OVX ודמה (n = 5/קבוצה). בית מקובץ כדי לסייע בסנכרון מחזורי אסטרוס.
  3. הגדרת פרוטוקול הליכון
    1. פתח את תוכנת בקרת ההליכון "TSE TreadMill (USB) 5.1.7_2" במחשב המחובר (איור משלים 1).
    2. אתחול קובץ ניסיוני חדש על-ידי בחירה באפשרות File > Initialize a New File משורת התפריטים.
    3. תכנת את פרוטוקול הריצה:
      1. הגדר את הקטע הראשון: תאוצה של 0-20 שניות מ-0-0.17 מ'/ש'.
      2. הגדר את הקטע השני: מהירות קבועה של 20-150 שניות ב-0.17 מ'/ש'.
      3. הגדר את הקטע השלישי: תאוצה של 150-170 שניות מ-0.17-0.25 מ'/ש'.
      4. הגדר את הקטע הסופי: מהירות קבועה של 170-600 שניות ב-0.25 מ'/ש'10,12.
        הערה: אל תשתמש בגירוי חשמלי בניסוי זה כדי למנוע לחץ נוסף.

2. ניטור מחזור אסטרוס

  1. מרחו ספוגיות נרתיקיות על שקופית צביעה מדי יום באותה שעה בכל יום במשך 8 ימים רצופים על ידי שטיפה עם 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי באמצעות פיפטה.
  2. דגימות ייבוש אוויר על שקופיות למשך 24 שעות במכסה אדים.
  3. טבלו בקצרה את הדגימות ב-100% מתנול בטמפרטורת החדר.
    זהירות: מתנול רעיל בשאיפה, בליעה או מגע בעור. השתמש במכסה אדים מאוורר היטב, ללבוש כפפות ניטריל ולהימנע מניצוצות/להבות.
  4. יש לדלל צבע מסחרי של 20× Giemsa ל-1× באמצעות PBS.
  5. מכתים את השקופיות הקבועות של המתנולעם 1× Giemsa בחושך למשך 1-2 שעות.
  6. בדוק את הציטולוגיה הנרתיקית כדי לקבוע את שלבי הייחום על סמך מחקרים אלה14,15.
  7. המשיכו בניסויים כאשר העכברים נמצאים בפרואסטרוס (איור 2B).
    הערה: טפל בעכברים בעדינות כדי למנוע הפרעה במחזור הנגרמת על ידי מתח. הימנע מהחדרה עמוקה של קצות הפיפטות כדי למנוע הריון מדומה.

3. ניתוח כריתת שחלות

  1. רשום את משקל העכברים והרדים את העכברים באיזופלורן. השתמש בכרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה במהלך הפעולה.
  2. לגלח את השיער באזור הגבי לרוחב לפני הרגליים האחוריות ולחטא עם 70% אתנול ויוד לחלופין למשך 3 פעמים.
  3. בצע חתך פרה-חולייתי באורך 1 ס"מ על העור והשתמש במכשיר קהה כדי להפריד את העור מרקמת השריר הבסיסית. לאחר מכן, בצע את החתך בדופן השריר. חשפו את רפידות השומן בשחלות בעזרת מקלות כותנה.
  4. קשירה של כלי דם בשחלות עם תפרים. שחלות כריתה עם מספריים כירורגיים16.
  5. סגור את החתך בשכבות, בשרירים ובעור עם תפרים שאינם נספגים. נקו את העור סביב אזור הניתוח בעדינות עם מי מלח כדי להסיר דם יבש או שאריות קרצוף חיטוי.
  6. לבקרות דמה, חתכו חתיכה מכרית השומן מבלי לגעת בשחלות.
  7. עקוב אחר בריאות העכברים מדי יום במשך 7 ימים לאחר הניתוח.
    הערה: ודא שהעכברים מוחזקים על כרית חימום בסביבות 35 מעלות צלזיוס לאורך כל תהליך ההרדמה.

4. השתלת לוגר טמפרטורת ליבה

  1. תכנות ואתחול לוגרים (איור משלים 2).
    1. הכנס את לוגר הטמפרטורה אנכית לתחנת העגינה.
    2. לחץ על מקליט > התחבר בשורת התפריטים של התוכנה.
    3. בחר Edit > New Measurement Seq. Def. משורת התפריטים.
    4. בחר מרווחי הקלטה מרובים מאפשרויות מצב ההקלטה.
    5. הגדרת פרמטרים: תאריך התחלה: [YYYY-MM-DD HH:MM], תאריך סיום: [YYYY-MM-DD HH:MM], מרווח הקלטה: 5 דקות.
    6. הוסף את הגדרת מרווחי הזמן לרצף.
    7. לחץ על מקליט > התחל רצף מדידה חדש.
  2. בהרדמה יש לגלח ולחטא את עור הבטן.
    הערה: ניתן לבצע הליך השתלת לוגר טמפרטורת בטן זה יחד עם ניתוח OVX כדי למנוע ניתוחים מרובים.
  3. בצע חתך עור בקו האמצע של 2 ס"מ כ-1 ס"מ מתחת לסרעפת.
  4. הרחב את החתך לאורך הלינאה אלבה כדי לפתוח את חלל הצפק.
  5. הכנס בעדינות את לוגר טמפרטורת הליבה לחלל הבטן לאורך המישור הסגיטלי.
    הערה: מיקום נכון הוא קריטי לקריאות טמפרטורה מדויקות. הימנע ממיקום שטחי ליד העור, מכיוון שטמפרטורת הסביבה עלולה להפריע למדידות.
  6. לתפור את החתך בבטן באמצעות תפרים 5-0 שאינם נספגים.
  7. לחטא את הבטן בתמיסת יוד.
    הערה: עקוב מקרוב אחר בעל החיים במהלך ההתאוששות. שמרו על סביבה חמה באמצעות כרית חימום עד שהעכברים ערים לחלוטין.

5. חיבור לוגר טמפרטורה רכוב על הזנב

  1. תכנות ואתחול לוגר (עיין בהליך שלב 4.1, שינוי מרווח ההקלטה ל-2 דקות).
  2. נקה את הזנב בעזרת החלקת אתנול. חיטוי שרוול התלת מימד עם 70% אתנול והדק את לוגר הטמפרטורה בתוך השרוול.
  3. מרחו דבק מהיר על השרוול. מקם את חוטב העצים במרחק של 1 ס"מ מבסיס הזנב (איור 1A). ודא שפני הזיהוי של חוטב העצים נמצאים במגע הדוק עם העור. ודא שהלוגר מקובע בצד הגחון של הזנב כדי למזער את עומס התנועה.
  4. החזק אותו במקומו בלחץ למשך 2 דקות. השתמש בהרדמה קצרה במידת הצורך למיקום מדויק.
    הערה: עקוב אחר נפיחות בזנב או ניתוק חוטב עצים לאחר ההצבה מדי יום. מכשיר המחובר כהלכה יכול להישאר טוב לפחות 3 ימים.

6. ריצה על הליכון ואיסוף נתונים

  1. אקלום עכברים להליכון במהלך שלב האור למשך 3 ימים באמצעות הפרוטוקול בשלב 1.3.
    1. הניחו עכברים בנפרד על חגורת ההליכון הנייחת. הקדישו 10 דקות לחקר הסביבה והרגלה.
    2. בצע את הפרוטוקול:
      1. לחץ על כפתור המדידה . לחץ על התחל כדי לאתחל את ההליכון.
      2. בחר התחל פרופיל כדי להתחיל את פרוטוקול הריצה המתוכנת.
  2. חבר את לוגר טמפרטורת הזנב 24 שעות לפני ניסויים להרגלה טובה (ראה שלב 5).
  3. הליכון פועל בשלב האור של יום הניסוי:
    1. רשום את טמפרטורת הבסיס למשך 30 שניות באמצעות מצלמת אינפרא אדום 10 דקות לפני האימון. טמפרטורת הליבה נרשמת בו זמנית באמצעות לוגר טמפרטורת הבטן המושתל.
    2. הפעל עכברים על ההליכון לפי הפרוטוקול בשלב 1.3.
      הערה: ודא שעכברים פועלים ברציפות במשך 600 שניות. אם עכברים מפסיקים לרוץ, יש לעודד בעדינות את המשך התנועה באמצעות מברשת שיער.
    3. לאחר ריצת הליכון, העבירו עכברים לכלובים נקיים. מדוד את טמפרטורת הזנב באמצעות תרמוגרפיה אינפרא אדום ב-0 דקות, 5 דקות, 10 דקות ו-15 דקות לאחר האימון.

7. ניתוח נתונים

  1. לנתוני אינפרא אדום וטמפרטורת ליבה:
    1. חשב את נקודת ההתחלה כטמפרטורה הממוצעת לפני האימון.
    2. שרטוט ΔT (נקודת בסיס של טמפרטורה לאחר האימון) עבור כל נקודת זמן.
  2. לנתוני לוגר טמפרטורת הזנב:
    1. השתמשו בממוצע של 10 דקות לפני האימון כקו בסיס.
    2. חשב ΔT במרווחים של 2 דקות למשך 15 דקות לאחר האימון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח מערכת ניטור תרמו-רגולטורית אמינה

כדי ליצור מודל אמין למדידת טמפרטורת הליבה והעור, תוכנן שרוול זנב מותאם אישית שהודפס בתלת-ממד כדי לחבר בצורה מאובטחת לוגר טמפרטורה במרחק של 1 ס"מ מבסיס הזנב (איור 1A), המאפשר מדידה רציפה ומדויקת של פיזור החום במהלך גלי חום המופעלים על ידי פעילות גופנית.

מערכת זו אפשרה ניטור טמפרטורת זנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מבסס מודל עכברי מעשי וכמותי לחקר גלי חום בגיל המעבר, תוך התייחסות לפער קריטי בתחום. השילוב של כריתת שחלות עם תרמוגנזה הנגרמת על ידי פעילות גופנית מסכם בהצלחה את מאפייני הליבה של גלי חום אנושיים, כלומר, עלייה מהירה בטמפרטורת עור הזנב ואחריה ירידה בטמפרטורת הליבה של הגוף18. מודל זה משלב ומרחיב את החוזקות של גישות קיימות על ידי הגברת שינויי טמפרטורה ומתן שליטה זמנית מדויקת על אינדוקציה של גלי חום. ככזה, הוא מספק פלטפורמה חזקה לחקירת המנגנונים הנוירוביולוגיים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו רוצים להודות לחברי המעבדה על סיועם בכתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי כספים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין 32171144, והפרויקט הלאומי למחלות כרוניות לא מדבקות - מדע וטכנולוגיה לאומי (2024ZD0530300).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
לוגר טמפרטורה מושתל לבעלי חייםסטאר-אודיDST ננו-טי
עכברי C57BL/6Jג'ם פארמטקN000013
תמיסת מכתים של Giemsaביוטייםג0133
תמונות תרמיות אינפרא אדום VarioCAMראש VC HD 980
מערכות הליכוןTSETreadmill_6M

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stearns, V., et al. Hot flushes. Lancet. 360 (9348), 1851-1861 (2002).
  2. Gombert-Labedens, M., Kristine, V., Andrea, F., Maloney, S. K., Baker, F. C. Effects of menopause on temperature regulation. Temperature. 12 (2), 92-132 (2025).
  3. Kronenberg, F. Menopausal hot flashes: A review of physiology and biosociocultural perspective on methods of assessment. J Nutr. 140 (7), 1380S-1385S (2010).
  4. Koysombat, K., Mcgown, P., Nyunt, S., Abbara, A., Dhillo, W. S. New advances in menopause symptom management. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 38 (1), 101774(2024).
  5. Kobayashi, T., et al. Elevation of tail skin temperature in ovariectomized rats in relation to menopausal hot flushes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 278 (4), R863-R869 (2000).
  6. Krajewski-Hall, S. J., Blackmore, E. M., Mcminn, J. R., Rance, N. E. Estradiol alters body temperature regulation in the female mouse. Temperature (Austin). 5 (1), 56-69 (2018).
  7. Krull, A. A., Larsen, S. A., Clifton, D. K., Neal-Perry, G., Steiner, R. A. A comprehensive method to quantify adaptations by male and female mice with hot flashes induced by the neurokinin B receptor agonist senktide. Endocrinology. 158 (10), 3259-3268 (2017).
  8. Merchenthaler, I., et al. The effect of estrogens and antiestrogens in a rat model for hot flush. Maturitas. 30 (3), 307-316 (1998).
  9. Zhang, Z., et al. Estrogen receptor alpha in the brain mediates tamoxifen-induced changes in physiology in mice. Elife. 10, e63333(2021).
  10. Witkowski, S., et al. Acute increases in physical activity and temperature are associated with hot flash experience in midlife women. Menopause. 31 (7), 600-607 (2024).
  11. Ban, Y. -H., et al. A hop extract Lifenol improves postmenopausal overweight, osteoporosis, and hot flash in ovariectomized rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2018 (1), 2929107(2018).
  12. Shuto, H., et al. Forced exercise-induced flushing of tail skin in ovariectomized mice, as a new experimental model of menopausal hot flushes. J Pharmacol Sci. 98 (3), 323-326 (2005).
  13. Wilhelms, D. B., et al. CGRP is critical for hot flushes in ovariectomized mice. Front Pharmacol. 9, 1452(2018).
  14. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  15. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicol Pathol. 43 (6), 776-793 (2015).
  16. Rowe, A. A., Issioui, Y., Johnny, B., Wert, K. J. Murine orchiectomy and ovariectomy to reduce sex hormone production. J Vis Exp. (201), e64379(2023).
  17. Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: Characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. 80 (2), 84-97 (2007).
  18. Freedman, R. R. Physiology of hot flashes. Am J Hum Biol. 13 (4), 453-464 (2001).
  19. Zhang, Z., et al. Estrogen-sensitive medial preoptic area neurons coordinate torpor in mice. Nat Commun. 11 (1), 6378(2020).
  20. Ekambaram, G., Sampath Kumar, S. K., Joseph, L. D. Comparative study on the estimation of estrous cycle in mice by visual and vaginal lavage method. J Clin Diagn Res. 11 (1), Ac05-Ac07 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים