מאמר שיטה

מוטגנזה מבוססת CRISPR-Cas9 בנמטודה אנטומופתוגנית Steinernema hermaphroditum ושימור קווי מוטנטים

954 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68932

⸱

30 בדצמבר 2025

 , 
1Division of Biosphere Sciences and Engineering, Carnegie Institution for Science

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מדגים הנדסת גנום בתיווך CRISPR-Cas9 ב-Steinernema hermaphroditum, נמטודה אנטומופתוגנית (EPN: חרק-טפילי) ומודל גנטי מתפתח. הטכנולוגיה המתוארת שימושית ליצירת מוטנטים, ומאפשרת הבהרה של פונקציות גנים בביולוגיית הנמטודות הרלוונטיות לסימביוזה הדדית וטפילית.

תקציר

נמטודות אנטומופתוגניות (EPNs) בסוג Steinernema ו-Heterorhabditis שומרות על אינטראקציות הדדיות עם חיידקים סימביוטיים Xenorhabdus ו-Photorhabdus, בהתאמה. יחד, זוגות הנמטודה-חיידק הללו מדביקים והורגים מארחי חרקים שהם בעיקר זחלים מסדרות הפרפרים והקולאופטרה, ויוצרים מערכת משולשת ניתנת לניתוח הבסיס המולקולרי של הדדיות וטפילות. צעד מרכזי לניצול מלא של מודל זה הוא פיתוח כלים גנטיים יציבים ובין-דוריים ב-EPNs. כאן, אנו מדגימה פלטפורמת עריכת גנום אמינה של CRISPR–Cas9 בדגם המתפתח Steinernema hermaphroditum, מין שנשמר בקלות ב-vivo וב-vitro, והוא רגיש מאוד להזרקה מיקרו-גונדלית. חשוב לציין שהרבייה ההרמפרודיטית שלה מייעלת מאוד את יצירתם ותחזוקת קווי מוטנטים הומוזיגוטיים. אנו מספקים פרוטוקול מפורט להפרעה גנטית יעילה וממוקדת באמצעות אספקה מבוססת מיקרוהזרקה של קומפלקסי ריבונוקלאופרוטאין Cas9. כהוכחת מושג, שינינו את הגן המשמור המקושר לשריר unc-22, ויצרנו פנוטיפ עוויתות אופייני המאשר מוטגנזה ממוקדת במערכת זו. פלטפורמת CRISPR–Cas9 זו פותחת דלת למניפולציה גנטית יציבה ב-S. hermaphroditum, כגון ביטוי גנים טרנספריסטיים, ומספקת מסגרת שניתן להרחיב למינים נוספים של EPN בעלי חשיבות חקלאית ואקולוגית.

מבוא

נמטודות אנטומופתוגניות (EPNs) הן טפילים הורגי חרקים היוצרות שותפויות הדדיות ייחודיות למין עם הסימביונטים החיידקייםשלהם 1. EPNs מורכבים משתי משפחות: Steinermatidae ו-Heterorhabditidae, אשר מתקשרות עם חיידקים גרם-שליליים של Photorhabdus ו-Xenorhabdus, בהתאמה 2,3. בשלב הצעיר המדבק החופשי (IJ) של נמטודות שטיינרנמה, חיידקי Xenorhabdus מאוחסנים בכיס מעי של הנמטודה הידוע ככלי הקידוח, וכאשר החדירה של מארח החרק לתוך ההמוקול, החיידקים משתחררים, ולאחר מכן הם מתרבים והורגים את החרק באמצעות ספטיקמיה 3,4. בקשר הדדי זה, החיידקים מייצרים תרכובות אנטי-מיקרוביאליות וקוטלי חרקים, שמגנים מפני תגובת החיסון של המארח ומספקות תמיכה תזונתית לנמטודה5. בתמורה, החיידקים נהנים מההגנה שמספק מארח הנמטודה מפני מיקרובים סביבתיים ומסייעים בהפצה לטרף חרקים חדש 6,7.

בעשורים האחרונים, השותפות בין שטיינרנמה לקסנורהבדס הוקמה כמערכת ניסויית עוצמתית לחקר היבטים שונים של אינטראקציות טפיליות והדדיות, כגון התנהגויות חיפוש מארח של חרקים3, קולוניזציה חיידקית במארח הנמטודה8, והתנהגויות אדפטיביות של חיידקים סימביוטיים המאפשרות את המעברים שלהם בין נמטודותלבעלי חיים מארחים חרקים. ה-EPNs הם גם מינים חשובים בקיימות הקרקע ומשמשים כסוכני הדברה אורגניים לקידום פריון חקלאי10,11.

למרות ההתפתחות המהירה של כלים גנטיים בחיידקים סימביוטיים Xenorhabdus ו-Photorhabdus12, כלים גנטיים עקביים ב-EPN היו נדירים. מיקרוהזרקה לגונדה הוכנסה בהצלחה הן ב-Heterorhabditis והן בנמטודות Steinernema 13,14. בעבר, מיקרוהזרקה גונדלית ב-Heterorhabditis bacteriophora שימשה להעברת RNA דו-גדילי באופן עקבי להפלת גנים בקרב הדור הראשון של צאצאים13,15. לאחרונה, פותחה עריכת גנום CRISPR-Cas9 בשטיינרמה, שסופקה באמצעות מיקרוהזרקה גונדלית, וגרמה למוטציות מדויקות, יציבות ותורשתיות14.

מין אחד של Steinernema, S. hermaphroditum, הוכח כגמיש מאוד ובעל פוטנציאל רב כאורגניזם מודל גנטי מתפתח 4,14. במקור בודדה מהקרקע באינדונזיה16 ובודדה מחדשבהודו 17, S. hermaphroditum היא הרמפרודיטית באופן עקבי, עם מספר קטן של זכרים בכל דור, שתי תכונות שמאפשרות התאמה של כלים גנטיים מהנמטודה המודל הקלאסית C. elegans4. בנוסף, הגנום של S. hermaphroditum רוצף והורכב לכרומוזומים, מה שמפשט את המשימה של זיהוי אתרי יעד פוטנציאליים של Cas9 ועיצוב פריימרים18.

במהלך הזרקת מיקרו של EPN, תערובת הזרקה המכילה מגיבים מתאימים, כגון dsRNA, חלבון Cas9 או RNA מנחה, מועברת לגונאדה של הנמטודה הסינציציאלית באמצעות מחט שנמשכה מנימי קוורץ. הנפח והלחץ המתאימים של ההזרקה יוצרים 'זרימה' נראית לעין של נוזל לאורך זרוע הגונדה. מכיוון שלנמטודות אלו יש זוג גונדות סינציציאליות המורכבות מגרעיני נבט החולקים את אותו ציטוזול19, שיטת המיקרוהזרקה זו מאפשרת גישה למספר תאי נבט לעריכה לפני מתרחשת ציטוקינזיס, ומפרידה את גרעיני קו הנבט לביציות מתפתחות20. למרות שמיקרוהזרקה לגונדות משמשת כטכניקה עקבית למודולציה גנטית במספר מינים של נמטודות שאינן מודליות 14,21,22,23,24,25, חשוב להתאים את טכניקות ההזרקה למבני הגונדות המתאימים, שלב החיים והמצב הפיזיולוגי של כל מין נמטודה כדי להבטיח הצלחה ויעילות גבוהה בהלידה. טכניקות התאוששות לאחר ההזרקה ותחזוקת קווי מוטנטים חשובות כדי להבטיח שטכניקה זו תהיה חסכונית.

מחקר זה מדגים פרוטוקול עריכת גנום CRISPR-Cas9 ב-Steinernema hermaphroditum. הזרקת המיקרו הגונדלית מתוארת אצל הבוגר הצעיר, שלב שהוא עמיד להזרקה בלחץ גבוה ופתוח לעריכת גנים14. בנוסף, מסופקות שיטות מפורטות המתארות את תחזוקת קווי מוטנטים תורשתיים ויציבים, הן באמצעות שימור קריופטיבי והן באמצעות הפצה דרך חרקים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת נמטודות לפני הזרקת מיקרו

  1. הכינו פלטות גדילת נמטודות (NGM) שזרעו בחיידקים Xenorhabdus griffiniae ו-Comamonas aquaticus.
    הערה: גדלו נמטודות S. hermaphroditum על החיידק הסימביוטי המקומי שלהם Xenorhabdus griffiniae לפני הזרקת מיקרו כדי למקסם את צמיחת הנמטודות ולשקם בעלי חיים שהוזרקו מהחיידק Comamonas aquaticus כדי להגביר את ההישרדות לאחר ההזרקה14.
    1. חיידק סטריק X. griffiniae על לוחות אגר LB-פירובט (2.5 גרם תמצית שמרים, 5 גרם טריפטון, 2.5 גרם כלוריד נתרן, 0.5 גרם נתרן פירובאט, 7.5 גרם אגר ב-500 מ"ל מים) ודגר אותו לילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    2. חיידק פסים של C. aquaticus על לוחות אגר LB ודגר במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    3. בחר מושבה אחת של חיידקים כדי לחסן מדיום נוזלי כהה של LB (5 גרם תמצית שמרים, 10 גרם טריפטון, 5 גרם כלורי נתרן ב-1 ליטר מים). גידול תרבית חיידקים בלילה (מקסימום 16 שעות) עם אוורור (X. griffiniae ב-30 מעלות צלזיוס ו-C. aquaticus ב-37 מעלות צלזיוס).
    4. הכינו אגר NGM: (3 גרם NaCl, 2.5 גרם פפטון, ו-20 גרם אגר מתווספים ל-975 מ"ל מים, עם 1 מ"ל כולסטרול, 1 מ"ל 1 M CaCl2, 1 מ"ל 1 M MgSO4, 25 מ"ל 1 M KPO4 לאחר אוטוקלב) 10 מ"ל לכל צלחת פטרי בגודל 60 מ"מ x 15 מ"מ.
    5. חיידקי זרעים: הוסיפו כמה טיפות של תרבית חיידקים ללילה על כל צלחת אגר NGM, נערו בעדינות כדי לפזר את טיפות החיידקים לטלאי.
    6. דגרו לוחות NGM שזרעו על ידי חיידקים בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לאגר להתייבש ולחיידקים לגדול.
      הערה: יש להשתמש בצלחות עם זרעי X. griffiniae בהקדם האפשרי; לוחות C. aquaticus יכולים להיאחסן בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שבועות.
  2. סידור הנמטודות
    הערה: בחרו את שלב J3 של הרמפרודיט בלילה שלפני ההזרקה ואת הצעירים ביום ההזרקה.
    1. קטף או חתיכה של נמטודות S. hermaphroditum על לוחות ה-NGM המוכנים שנזרעו ב-X. griffiniae. דגרו בטמפרטורה של 25-28 מעלות צלזיוס לצמיחה מיטבית.
    2. בלילה שלפני הזרקת מיקרו, קטף את שלב J3 של הרמפרודיטים על אגר NGM עם זריעות X. griffiniae. כפי שמוצג באיור 1A, שלב J3 מוערך לפי גודל הנמטודה ומורפולוגיית הגונדות והפות.
    3. ביום ההזרקה המיקרו, קטף הרמפרודיטים צעירים בוגרים (איור 1B).

2. הכנת CRISPR-Cas9 להזרקה מיקרו

  1. בחירת CRNA של CRISPR ואחסון מגיב
    1. חלצו את רצף הגנים היעד מהגנום הייחוס של Steinernema hermaphroditum באמצעות BlastP, PRJNA982879.
    2. בחר רצף אקסון קודד מוקדם, אם אפשר, רצוי האקסון הראשון, והזן את הרצף ל-CRISPRScan באמצעות הגדרות ברירת מחדל26 ליצירת רשימה של RNA אפשרי של CRISPR (crRNAs).
    3. לפוצץ את ה-crRNA העליונים נגד הגנום של S. hermaphroditum כדי לוודא שרק crRNA ייחודיים ייבחרו.
      הערה: אופציונלי: לאשר את רצף אזור היעד בגנום באמצעות הגברת PCR וריצוף סנגר לפני תכנון crRNA, כדי להבטיח קישור יעיל של crRNA.
    4. אחסן את ה-RNA של ה-CRISPR (crRNAs) ואת ה-RNA האוניברסלי שמפעיל טרנס-אקטיבציה (tracrRNAs) ב-100 מיקרומולר כל אחד בבופר דופלקס בטמפרטורה של -80°C.
    5. אחסן חלבון Cas9 ב-10 מ"ג/מ"ל בטמפרטורה של -20°C או -80°C. אחסן 1 מטר KCl בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. יצירת כרית אגרוז 2% להזרקה (מותאם מ-Berkowitz ואחרים. 27)
    1. המיס 2% אגרוז במים באמצעות מיקרוגל.
    2. העבר 50 מיקרוליטר של אגרוז מותך לזכוכית כיסוי (48 x 60 מ"מ מס' 1). מיד כסו את טיפת האגרוז בכוס כיסוי נוספת.
    3. תן לאגרוז להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הסר את הכיסוי העליונה. תייגו את הצד הקדמי של משטח האגרוז.
      הערה: אופציונלי: אפו את פד האגרוז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לייבש עוד יותר את משטח האגרוזה.
    4. אחסן את כריות האגרוז של 2% בטמפרטורת החדר למשך חודשים עד שנים.
  3. הכנת מחט
    1. יצר מחטי קוורץ באמצעות הפרמטרים הבאים על מושך פילמנט לייזר. עם מושך המחטים ששימש במחקר זה, התוכנית המוצעת היא כדלקמן: חום: 700, פילמנט: 4, מהירות: 60, עיכוב: 145, משיכה: 175.
    2. שלפו את מחטי הקוורץ (OD: 1.0 מ"מ, מזהה: 0.7 מ"מ) מיד לפני ההזרקה או מראש, ואחסנו אותן בקופסת אחסון פיפטות.
      הערה: לחילופין, הצלחנו גם להזריק מחטים בורוסיליקט (OD: 1.2 מ"מ, מזהה: 0.68 מ"מ). שימו לב שגדלים שונים של מחטים יתאימו לגדלים שונים של מחזיקי מחטים.

3. מיקרוהזרקה של CRISPR-Cas9 ושיקום הנמטודות לאחר הזרקת מיקרו

  1. הכינו את תערובת המיקרו-הזרקה CRISPR-Cas9 (מותאמת מ-Wang ואח' 28)
    1. הכינו דופלקסים RNA מונחים חדשים על ידי ערבוב ה-crRNA שנבחרו ו-tracrRNA אוניברסלי ביחס 1:1, כלומר סך כל crRNA ל-tracrRNA בצינור PCR:
      crRNA #1 (100 מיקרומטר) - 1.5 מיקרו-ליטר
      crRNA #2 (100 מיקרומטר) - 1.5 מיקרוליטר
      tracrRNA (100 מיקרומטר) - 3.0 מיקרוליטר
      הערה: אם משתמשים ב-co-CRISPR, crRNA #1 מכוון לגן הסמן unc-22 , בעוד ש-crRNA #2 יכול להיות מוחלף ברצף אחר שמכוון לגן שני שמעניין אותו.
    2. דגר את צינור ה-PCR בתרמחזור בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ואז קרר לטמפרטורת החדר.
    3. הרכיבו את תערובת ההזרקה על ידי שילוב הדברים הבאים, ואז דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר:
      Cas9 (10 מ"ג/מ"ל) - 2 מיקרוליטר
      1M KCl - 0.58 מיקרוליטר
      דופלקסים של gRNA (מהשלב 3.1.1) - 2.7 מיקרוליטר
    4. מערבבים שלוש פעמים על ידי סיבוב צינור ה-PCR, ואחר כך סיבוב קצר (10-15 שניות) בצנטריפוגה קטנה כדי לאסוף את תכולת הצינור. אחרי המיקס הסופי, סובב למטה לזמן ארוך יותר, עד דקה.
  2. טען ושבר את המחט
    1. טעין את המחט ב-1-2 מיקרוליטר של תערובת הזרקה באמצעות קצה מיקרולודר.
    2. הרכיבו את המחט למחזיק הפיפטה (המחט), ואז שברו את הקצה על ידי גרירת המחט על חתיכת סרט דו-צדדי מכוסה בשמן הלוקרבון. בדקו את פתיחת המחט באמצעות פונקציית CLEAN של המיקרואינג'קטור .
  3. מיקרוהזרקה לבלוטות הסינציציאליות של נמטודה צעירה בוגרת
    1. העבר טיפה קטנה של שמן Halocarbon למשטח אגרוז 2%.
    2. מתחת לסטריאוסקופ הניתוח, יש להשתמש בחוט פלטינה דק (רך) כדי להרים נמטודת הרמפרודיט צעירה ולשטוף אותה בבופר M9 (לליטר: 3 גרם KH2PO4, 11.3 גרם Na2HPO4, 5 גרם NaCl, עם תוספת של 1 מ"ל 1 M MgSO4 לאחר האוטוקלב) להסרת חיידקים (ראו נמטודת צעירים באיור 1).
    3. העבר את הנמטודה השטופה למשטח אגרוז ומניח אותה בטיפת שמן הלוקרבון. השתמש בחוט פלטינה רך כדי להבריש בעדינות את הנמטודה עד שהחיה משתתקת.
    4. הנח בזהירות את כרית האגרוז על שלב המיקרו-אינקציה. כיוון הסינציטיום הגונדלי צריך להיות מצביע על המחט בזווית של כ-45°. תתחיל מהגדלה פי 5, ואז תעבור להגדלה של 20x ו-40x בהזרקות.
    5. ודאו שהמחט חודרת לסינציאום, ואז השתמשו בפונקציית CLEAN של המיקרואינגקטור כדי להכניס את תערובת ההזרקה בעוצמה של כ-99 psi עד שנצפתה זרימה ברורה של נוזל גונדלי שהוזרק כדי להבטיח שהמגיבים יגיעו לתאי הנבט בסינקיטיום הגונדלי.
    6. אם הזרוע הגונדלית השנייה נגישה, הזז את הבמה כדי למקם את המחט להזרקה לזרוע השנייה.
  4. החלמה מנמטודות לאחר ההזרקה
    1. מיד לאחר ההזרקה, יש להחזיר את החיה שהוזרקה ל-1-2 מיקרוליטר של בופר M9 על כרית האגרוז.
    2. בעזרת חוט פלטינה דק, הרם את הנמטודה המוזרקת ממשטח האגרוז ושוטף את השמן באמצעות בופר M9.
    3. שחזרו את הנמטודות על לוחות NGM עם דשא של חיידקי C. aquatica (הכנת לוחות NGM: ראו שלב 1.1), מה שמעלה את שיעור ההישרדות של הנמטודות לאחר ההזרקה14. דגרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
    4. למחרת, בודדו כל נמטודה שהוזרקה (P0) על צלחת NGM בודדת שזרעה ב-X. griffiniae. תנו לבעלי חיים P0 לייצר צאצאי F1 בלילה (בין אם על ידי הטלת ביצים או על ידי שקית) לפנוטיפינג וגנוטיפינג (ראו שלב 4).

4. סינון לאישור נוקאאוטים בתיווך CRISPR-Cas9

  1. מסך מבוסס ניקוטין (CAUTION) של F1 לפנוטיפ עוויתות כאשר משתמשים ב-unc-22 כסמן קו-CRISPR
    1. העבר צאצאי F1 מבעלי חיים P0 שהוזרקו לנקודה עם תמיסת ניקוטין 2%.
    2. בחר בעל חיים בודד רוטט מהנקוטה ומיד שחזר אותה על אגר NGM עם זרע X. griffiniae. בודדו כל F1 רוטט על לוח בודד ותנו לו לייצר בעלי חיים מסוג F2 לגנוטיפינג (ראו שלב 4.2).
  2. גנוטיפינג
    1. בחר שמונה צאצאים של F2 או F3 מכל קו מתנדנד של F1 לגנוטיפ. בעלי חיים אלו צפויים לכלול גם בעלי חיים הטרוזיגוטיים +/mut וגם בעלי חיים הומוזיגוטיים mut/mut .
    2. הכינו בופר חילוץ DNA טרי על ידי הוספת 20 מיקרוליטר פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל) ל-180 מיקרוליטר בופר ליזיס תולעת (50 מ"מ KCl, 10 מ"מ טריס pH 8.0, 2.5 מ"מ מ"מ מיג'קלר2, 0.45% NP-40, 0.45% טווין 20, 0.01% ג'לטין).
    3. הוסיפו נמטודות ל-10 מיקרוליטר של בופר חילוץ ה-DNA בצינורות PCR. דגרו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להפיק DNA גנומי.
    4. הגנוטיפ של הנמטודות על ידי הגברת אזור היעד של Cas9 ב-PCR לפי הוראות היצרן, תוך שימוש ב-1-2 מיקרוליטר ליזאט משלב 4.2.2. חשוב לאפשר מרווח רב, אם אפשר (לפחות 300 bp), בין אתרי החיתוך של Cas9 לבין אתרי הקישור של הפריימר למקרה שיתרחשו מחיקות גדולות.
      הערה: אלקטרופורזה בג'ל אגרוז יכולה לשמש לאישור הגברה מוצלחת לפני הריצוף.
    5. נקה את מוצר ה-PCR בהתאם להוראות היצרן כדי להבטיח ניתוח עקבות מדויק של ריצוף סנגר.
    6. רצף את אמפליקוני ה-PCR שנוצרו בשלב 4.2.4 באמצעות ריצוף סנגר ונתח את הכרומטוגרמות באמצעות תוכנית ICE29.
    7. אם מאושרים אללים מוטנטיים בשלב 4.2.6, חזור ללוח ה-F1 המקורי ובודד לפחות שמונה הרמפרודיטים על לוחות בודדים. אפשר לכל נמטודה בודדת לייצר צאצאים, ואז הגנוטיפ המוני של הצאצא כדי לאשר את ההומוזיגוטיות. קווים הומוזיגוטיים יכולים להישמר במעבדה כפי שמתואר בשלב 5.

5. תחזוקת קו CRISPR

הערה: ישנן שלוש שיטות עיקריות לתחזוקת קווים. אלה כוללים, הקפאה מבוססת טרהלוזה-DMSO (שלב 5.1), מעבר בתוך תולעי השעווה ( שלב 5.2), ותחזוקה במבחנה על לוחות NGM (שלב 5.3).

  1. שימור קריופורד של קווים מסוג פראי ומוטנטי ב-Trehalose-DMSO
    הערה: באמצעות שיטת שימור קריופרפורד טרהלוזה-DMSO4, ניתן לאחסן ביציבות לאורך זמן בטמפרטורה של מינוס 80°C ולשחזור על מדיום NGM. נמטודות מוקפאות בבקבוקים קריוגניים בנפח 2 מ"ל. הקפאה מיטבית מושגת באמצעות קירור הדרגתי באמצעות מיכל קצף פוליסטירן.
    1. גדלו את S. hermaphroditum ב-NGM עם זריעה ב-X. griffiniae (ראו שלב 1.1) עד שרוב האוכלוסייה תהיה J1 או הרמפרודיטים בשקית.
      הערה: הימנעו משלבים זיהומיים צעירים (IJ) כי הם לא קופאים היטב בשיטה זו.
    2. שטוף את תולעי הנמטודה מלוחות אגר NGM בבופר M9 ואסף בצינורות חרוטיים של 15 מ"ל עד סימן 5 מ"ל. ריכוז בצנטריפוגציה (1372 x גרם למשך 1-2:30 דקות מספיק).
    3. הסר את הסופרנטנט ושוטף פעם ב-5 מ"ל בופר הקפאה Trehalose-DMSO בטמפרטורת החדר באמצעות צנטריפוגה, בהתאם לפרמטרים שסופקו בשלב 5.1.2.
    4. החזירו את התולעים ל-5 מ"ל Trehalose-DMSO עם בופר הקפאה בטמפרטורת החדר. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כשהצינור מונח על צידו. זה מעלה את שיעור ההישרדות.
    5. לחלק 1 מ"ל לכל צינור ב-4 בקבוקים קריוגניים.
    6. הניחו בקבוקים בקופסאות קצף פוליסטירן במקפיא בטמפרטורה של -80°C.
    7. שבוע לאחר מכן, בדקתי הפשרה של אחד הבקבוקונים.
    8. העבר את שאר המבחנות לקופסאות מקפיא בטמפרטורה של -80°C ואחסן אותו לצמיתות.
    9. בדיקת הפשרה או התאוששות של S. hermaphroditum ממאגרים קפואים
      1. הוציאו בקבוקון מהמקפיא ותנו לו להפשיר לחלוטין בטמפרטורת החדר.
      2. שפכו את תכולת הנוזל על צלחת NGM טרייה. יש לשים לב שאין צורך בהוספת חיידק סימביוטי שכן המאגר הקפוא בדרך כלל מכיל מספיק חיידקים סימביוטיים. התולעים אמורות להתחיל להחלים תוך דקות עד שעות.
      3. התבוננו בתנועת הנמטודות וברבייהן. לאחר יום-יומיים, העבר מספר נמטודות לצלחות NGM חדשות שהוזרעו ב-X. griffiniae.
  2. תחזוקה ב-vivo דרך Galleria mellonella
    הערה: לצמיחה במצב חי, יש להפיץ קווי מוטנט של S. hermaphroditum דרך זחלי Galleria mellonella (תולעת שעווה) בשלב 5. שיטה זו שימושית במיוחד עבור קווים שאינם רלוונטיים לאחר שימור קריופאור. פרוטוקול מפורט ודומה של התרבות טבעית של נמטודות אנטומופתוגניות דרך חרקים ואמצעים נוספים לצמיחת EPN ניתן למצוא ב-(McMullen ואח' 30). בקצרה:
    1. אפשר לנמטודות למות ברעב ולהפוך ל-IJs על לוחות NGM.
    2. השתמש בבופר M9 כדי להסיר את ה-IJs מלוחות ה-NGM.
    3. העבר IJs כדי להדביק חרקי גלריה באמצעות מלכודת לבנה.
  3. לתחזוקה פנימית של לוחות NGM, עקוב אחר השלבים:
    1. לוחות NGM זרעים עם כ-100 מיקרוליטר של תרבית נוזלית טרייה של הסימביונט S. hermaphroditum , X. griffiniae.
    2. תנו לטלאי החיידקי להתייבש לחלוטין לפני העברת הנמטודות לצלחת.
    3. אחסן את הצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס והעבר את הנמטודות לצלחות שזרעו זה עתה בערך פעם בחודש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שני RNA של CRISPR תוכננו (זוהו לפי מספר אתר Pam - Pam 3 ו-Pam 5) שהתמקדו בהומולוג S. hermaphroditum של UNC-22 באתרים Pam14 שפורסמו בעבר (איור 2A). כל crRNA קומפלקס עם tracrRNA ליצירת RNA מדריך יחיד (sgRNA) ושולב ב-Cas9 ליצירת ריבונוקלאוספרוטאין כפי שמתואר בשלב 3.1. בפרוטוקול זה, שני crRNA תוכננו כדי למקד את אותו גן; עם זאת, אם משתמשים בשיטת co-CRISPR שפותחה לשימוש ב-C. elegans31, ניתן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מערכות מודל גנטי לא שגרתיות של בעלי חיים מספקות הזדמנויות חשובות לחקור את תפקוד הגנים האאוקריוטיים בהקשרים האקולוגיים והפיזיולוגיים שבהם תכונות אלו מופיעות באופן טבעי, לדוגמה, בנוכחות מארח טפילי או מיקרוביום טבעי של אורגניזם. בנמטודות אנטומופתוגניות (EPNs), מניפולציה גנטית התבססה על מקרים מסוימים של גישות מבוססות RNAi13,32. למרות ש-RNAi מאפשר מחקרים גנטיים פונקציונליים בחלק מהמינים, הוא מוגבל על ידי האופי החולף של dsRNA, והשתקת גנים עשויה ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים למרגרט מקפול-נגאי ואדוארד רובי על השימוש במיקרוסקופ הקונפוקלי שלהם. אנו מודים לאלקסיס (קודי) הרגדון וגרישה צ'ן על ההכשרה במיקרוסקופיה קונפוקלית, ולקרלי ר. מאיירס על העזרה בהשגת תמונות וניתוח סרטוני הרטט. אנו גם מודים לסטפני המפטון על הקצאת כספים לרכישת מערכת המיקרו-הזריקה. מכון קרנגי למדעים תמך בעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגר (80-100 רשת)פישר סיינטיפיקBP26411משמש גם בלוחות LB Pyruvate
אגרוזפישר סיינטיפיק16500500משמש גם בגנוטיפינג
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAIDT1072532
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3IDT1081058
מחטי בורוסיליקטמכשיר הדיוק העולמי1B120F-4
כלוריד סידן (CaCl2)סיגמא אולדריץ'C4901
כולסטרול  VWR4335 מ"ג/מ"ל באתנול
Comamonas aquatica (DA1877)
זכוכית כיסוי למשטח אגרוזמעבדות מחקר מוח#4860-1D48 x 60 מ"מ עובי no1
CRISPRScanhttps://www.crisprscan.org/
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אלדריץ'4723010.5 מ'
DNA Clean and Concentrator-5 מחקר זימוD4014
FemtoJet 4x Microinjector עם סט ראש אחיזה, מחזיק מחט בגודל 4 0אפנדורף/קליבר5253000017
זחלי גלריה מלונלה מדרגה 5GrubCohttps://www.grubco.com/index.cfm
מערכת הדמיית ג'לAzure400AZI400-01
צבע טעינת ג'לתרמו פישר סיינטיפיקB72
ג'לטין (2%)סיגמא אולדריץ'G1393
GelRedביוטיום#41003
פריימרים לגנוטיפ: אוליגו DNA, 25 ננומולIDTלא זמין
גיבקו בקטו פפטוןפישר סיינטיפיקDF0118-17-0
גיבקו בקטו טריפטוןפישר סיינטיפיקDF0123-17-3משמש גם בלוחות Dark LB, LB Pyruvate  
תמצית שמרי גיבקו בקטופישר סיינטיפיקDF0127-17-9משמש גם בלוחות Dark LB, LB Pyruvate  
סט ראש לאחיזה, מחזיק מחט בגודל 1 בגודל 4קליברEPE-5196083008(בשילוב עם מחט בורוסיליקט 1B120F-4)
שמן הלוקרבון 700סיגמא אולדריץ'H8898
מפרש תולעת חוט פלטינה קשה לתחזוקה יומיומיתטריטק ריסרץ'PT-9901
הסקת עריכות CRISPR (ICE)סינתגולא זמיןתוכנה המשמשת לניתוח רצפי סנגר לזיהוי אינדל
KClסיגמא אולדריץ'P9541
מושך מחט לייזר P-2000סאטרP-2000G
מגנזיום כלוריד (MgCl2)סיגמא אולדריץ'M8266
מגנזיום סולפט (MgSO4)סיגמא אולדריץ'M7506ל-M9 buffer, משמש גם ב-NGM
קצה מיקרולודר 2x96STקליבר930001007
מתאם הרכבה למיקרומניפולטור עבור Zeiss Axio Observer ו-Axiovert 200טריטק ריסרץ'NZ-19-2
מיקרוסקופטריטקSMT1
ניקוטיןסיגמא אולדריץ'N3876
NP-40תרמו פישר סיינטיפיק85124
בופר דופלקס ללא נוקלאזIDT11-01-03-01
OneTaq MasterMixNEBM0486
קופסת אחסון פיפטהסאטר אינסטרומנטסBX10
כלוריד אשלגן (KCl)סיגמא אולדריץ'793590
פוספט אשלגן, די-בסיסי (K2HPO4)סיגמא אולדריץ'P3786KOH עבור NGM
פוספט אשלגן, מונובסיסי (KH2PO4)סיגמא אולדריץ'P5655ל-M9 buffer, משמש גם ב-NGM
פרוטאנאז Kסיגמא אולדריץ'P6556
מחטי קוורץסאטר אינסטרומנטסQF100-70-10
S. hermaphroditium גנוםNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/
sh-unc-22 אלטרנטיבי CRISPR-Cas9 crRNAIDTלא זמין
נתרן כלוריד (NaCl)VWRSS0430משמש גם בלוחות M9, Dark LB, LB Pyruvate
פוספט נתרן, די-בסיסי (Na2HPO4.7H20)סיגמא אולדריץ'S9390עבור בופר M9
נתרן פירובטסיגמא אולדריץ'P2256משמש גם בלוחות LB Pyruvate 
מפרש תולעת חוט פלטינה רך להזרקה מיקרוSurepure Chemetals6824פלטינה 90%, אירידיום 10% חוט סגסוגת, קוטר 0.002 אינץ' ואורך 5 רגל
מחזיק מחט סטנדרטיטריטק ריסרץ'HI-7
Steinernema hermaphroditum
מיקרוסקופ סטריאולייקהאינבטה 3
טרהלוזקול-פרמרEW-88195-990.08 מ'
Tris פישר סיינטיפיקAM9855GpH 8.0
גיל 20סיגמא אולדריץ'P1379
מתאם הרכבה למיקרומניפולטור אנכיטריטק ריסרץ'NR2
Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)

מקורות

  1. Stock, S., Blair, H. G. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
  2. Murfin, K. E., et al. Nematode-bacterium symbioses--cooperation and conflict revealed in the "omics" age. Biological Bull. 223 (1), 85-102 (2012).
  3. Dillman, A. R., et al. An entomopathogenic nematode by any other name. PLoS Pathog. 8 (3), e1002527(2012).
  4. Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), iyab170(2022).
  5. Sergeant, M., et al. Identification, typing, and insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and characterization of the xpt toxin loci. Appl Environ Microbiol. 72 (9), 5895-5907 (2006).
  6. Walsh, K. T., Webster, J. M. Interaction of microbial populations in Steinernema (Steinernematidae, Nematoda) infected Galleria mellonella larvae. J Invertebr Pathol. 83 (2), 118-126 (2003).
  7. Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: The two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat Rev Microbiol. 5 (8), 634-646 (2007).
  8. Flores-Lara, Y., Renneckar, D., Forst, S., Goodrich-Blair, H., Stock, P. Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacterial vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae). J Invertebr Pathol. 95 (2), 110-118 (2007).
  9. Cao, M., Goodrich-Blair, H. Ready or Not: Microbial adaptive responses in dynamic symbiosis environments. J Bacteriol. 199 (15), e00883-e00916 (2017).
  10. Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. J Invertebr Pathol. 132 (C), 1-41 (2015).
  11. Campos-Herrera, R., et al. Intraspecific virulence of entomopathogenic nematodes against the pests Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) and Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). J Nematol. 53 (1), 1-14 (2021).
  12. Rill, A., Zhao, L., Bode, H. B. Genetic toolbox for Photorhabdus and Xenorhabdus: pSEVA based heterologous expression systems and CRISPR/Cpf1 based genome editing for rapid natural product profiling. Microb Cell Fact. 23 (1), 98(2024).
  13. Ratnappan, R., et al. RNAi-mediated gene knockdown by microinjection in the model entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora. Parasit Vectors. 9 (1), 160(2016).
  14. Cao, M. CRISPR-Cas9 genome editing in Steinernema entomopathogenic nematodes. bioRxiv. , (2023).
  15. Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. Culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes. J Vis Exp. (181), e63885(2022).
  16. Stock, S. P., Griffin, C. T., Chaerani, R. Morphological and molecular characterisation of Steinernema hermaphroditum n. sp. (Nematoda: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus. Nematology. 6 (3), 401-412 (2004).
  17. Bhat, A. H., Chaubey, A. K., Shokoohi, E., William Mashela, P. Study of Steinernema hermaphroditum (Nematoda, Rhabditida), from West Uttar Pradesh, India. Acta Parasitol. 64 (4), 720-737 (2019).
  18. Schwarz, E. M., et al. Genomes of the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum and its associated bacteria. bioRxiv. , (2025).
  19. Haglund, K., Nezis, I. P., Stenmark, H. Structure and functions of stable intercellular bridges formed by incomplete cytokinesis during development. Commun Integr Biol. 4 (1), 1-9 (2011).
  20. Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 2 (3), 100748(2021).
  21. Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathog. 13 (10), e1006675(2017).
  22. Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Sci Rep. 9 (1), 483(2019).
  23. Culp, E., et al. Genome editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 system. Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa003(2020).
  24. Hellekes, V., et al. CRISPR/Cas9 mediated gene editing in non-model nematode Panagrolaimus sp. PS1159. Front Genome Ed. 5, 1078359(2023).
  25. Patel, R., et al. The generation of stable transgenic lines in the human-infective nematode Strongyloides stercoralis. G3 (Bethesda). 14 (8), jkae122(2024).
  26. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: Designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nat Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  27. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), e833(2008).
  28. Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9. G3 (Bethesda). 8 (11), 3607-3616 (2018).
  29. Conant, D., et al. Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data. CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).
  30. McMullen, J. G. 2nd, Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). J Vis Exp. (91), e52096(2014).
  31. Kim, H., et al. A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).
  32. Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: A nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Dev Biol. 7 (1), 101(2007).
  33. Du, X., McManus, D. P., French, J. D., Jones, M. K., You, H. CRISPR/Cas9: A new tool for the study and control of helminth parasites. Bioessays. 43 (1), e2000185(2021).
  34. Quinzo, M. J., Perteguer, M. J., Brindley, P. J., Loukas, A., Sotillo, J. Transgenesis in parasitic helminths: A brief history and prospects for the future. Parasit Vectors. 15 (1), 110(2022).
  35. Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Peraza, J., Raymundo, K. L. T., Sternberg, P. W. Molecular identification of a peroxidase gene controlling body size in the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum. Genetics. 226 (2), (2024).
  36. Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans. Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים