מאמר שיטה

מידול פרמקופור למטרות עם ספריות ליגנד נרחבות: מחקר מקרה על SARS-CoV-2 Mpro

2.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68933

⸱

26 בספטמבר 2025

 ,  , 
1School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 2Investigadores por México, Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI), 3Research and Development in Biotherapeutics Unit (UDIBI), National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute, 4National Laboratory for Specialized Services of Investigation, Development and Innovation (I+D+i) for Pharma Chemicals and Biotechnological products, LANSEIDI-FarBiotec-CONAHCYT, 5Immunology Department, National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול לבניית מודל פרמקופור קונצנזוס על ידי שילוב תכונות מולקולריות ממספר ליגנדים. שיטה זו ישימה למאמצי גילוי תרופות המכוונים לכל מטרה ביולוגית עם קונפורמציות ידועות הקשורות לליגנד, ומאפשרת זיהוי של תכונות אינטראקציה מרכזיות לסינון וירטואלי ותכנון תרופות רציונלי.

תקציר

פרמקופורה מגדירה את הסידור המרחבי של תכונות מולקולריות הנדרשות לאינטראקציות אופטימליות בין תרכובת למטרה הביולוגית שלה. ניתן לגזור מודלים אלה על ידי ניתוח האינטראקציות הבין-מולקולריות בין מטרה לקבוצה של ליגנדים ידועים בקונפורמציות הקישור שלהם. פרמקופור קונצנזוס משלב תכונות משותפות ממספר ליגנדים, מפחית את הטיית המודל ומשפר את כוח החיזוי. עם זאת, יצירת פרמקופור קונצנזוס חזק ממערך ליגנד גדול ומגוון כימית מציב אתגרים טכניים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבניית פרמקופורים קונצנזוס באמצעות ConPhar, כלי אינפורמטיקה בקוד פתוח שנועד לזהות ולקבץ תכונות פרמקופוריות על פני קומפלקסים מרובים הקשורים לליגנד. הפרוטוקול כולל יצירת מודלים, חידוד ויישום לסינון וירטואלי של ספריות מולקולריות גדולות במיוחד. כמקרה מבחן, יישמנו את השיטה על הפרוטאז הראשי של SARS-CoV-2 (Mpro), תוך שימוש במאה מעכבים לא קוולנטיים שהתגבשו יחד עם המטרה. מודל הפרמקופור שנוצר לכד מאפייני אינטראקציה מרכזיים באזור הקטליטי של Mpro ואיפשר זיהוי של ליגנדים פוטנציאליים חדשים.

אסטרטגיה זו ישימה באופן נרחב לכל מטרה ביולוגית שעבורה קיימות קונפורמציות הקשורות לליגנד. הוא בעל ערך מיוחד עבור מטרות עם מערכי נתונים נרחבים של ליגנד ותומך בגילוי תרופות רציונלי על ידי ייעול הזיהוי של מועמדים חדשים עם פרופילי אינטראקציה רצויים.

מבוא

מידול פרמקופור הוא טכניקה בסיסית בתכנון תרופות בעזרת מחשב, המאפשרת זיהוי של תכונות מולקולריות חיוניות האחראיות לפעילות ביולוגית 1,2. פרמקופורה מגדירה את הסידור המרחבי של תכונות, כגון תורמי קשרי מימן, מקבלים, טבעות ארומטיות ואזורים הידרופוביים, הנדרשים לאינטראקציה מולקולרית בין ליגנד למטרה ביולוגית3. כאשר קיימים קומפלקסים מרובים של ליגנד-מטרה, בין אם מקריסטלוגרפיה ניסיונית או ממודלים מולקולריים, ניתן לשלב את דפוסי האינטראקציה המשותפים במודלים פרמקופוריים קונצנזוס, להגביר את חוסן המודל ולשפר את דיוק הסינון הווירטואלי 4,5.

למרות התועלת של תרופות קונצנזוס, הייצור שלהן נותר מאתגר מבחינה טכנית, במיוחד כאשר הליגנדים מגוונים מבחינה מבנית. מספר כלי תוכנה זמינים ליצירת פרמקופורים מליגנדים בודדים, אך חסרים נהלים סטנדרטיים לשילוב ערכות תכונות מרובות במודל קוהרנטי 6,7. יתרה מכך, פלטפורמות מעטות מציעות זרימות עבודה מקצה לקצה התומכות באשכולות, סינון וייצוא של תכונות בפורמטים התואמים לכלי סינון והדמיה8. מגבלות אלה הגבילו את האימוץ הרחב של פרמקופורים קונצנזואליים במאמצי גילוי תרופות בקנה מידה גדול.

כדי להתמודד עם הפער הזה, ConPhar פותח ככלי קוד פתוח חדשני שתוכנן במיוחד עבור מיצוי שיטתי, אשכולות ומידול קונצנזוס של תכונות פרמקופוריות מקבוצות נרחבות של קומפלקסים מיושרים מראש של ליגנד-מטרה. בניגוד לתוכנה קיימת, ConPhar מציעה כוונון פרמטרים גמיש, שילוב תכונות אוטומטי ותאימות לפורמטי פלט מרובים, מה שמקל על יצירת מודלים קונצנזוס חזקים המתאימים לצינורות סינון וירטואליים. כלי זה מתגבר על צווארי בקבוק קודמים בטיפול בספריות ליגנד גדולות ומגוונות מבחינה כימית, ומשפר את יכולת השחזור והמדרגיות בתהליכי עבודה של מידול פרמקופור.

כדי להדגים גישה זו, אנו מציגים פרוטוקול הניתן לשחזור לבניית מודלים פרמקופוריים קונצנזואליים מאוספים של קומפלקסים של ליגנד-מטרה. זרימת העבודה משלבת כלי קוד פתוח לחילוץ תכונות פרמקופור, אשכולות, הדמיה ויישומים במורד הזרם. כמקרה מבחן, יישמנו את הפרוטוקול על הפרוטאז הראשי של SARS-CoV-2 (Mpro), מטרה טיפולית קריטית עם נתונים מבניים נרחבים9. אספנו מערך נתונים של 100 ליגנדים לא קוולנטיים שהתגבשו יחד עם Mpro (ערכי PDB נכון ל-27 במאי 2025), למעט צורות apo וקומפלקסים מיותרים. תכונות פרמקופוריות בודדות חולצו ומוזגו למודל קונצנזוס באמצעות ConPhar, כלי שתוכנן במיוחד עבור אשכולות תכונות10. מקרה זה ממחיש את יכולתו של הפרוטוקול לחשוף דפוסי אינטראקציה שמורים ולתמוך בסינון רציונלי של ספריות גדולות במיוחד.

פרוטוקול

1. שיטה 1

  1. הכן ליגנדים ליצירת פרמקופור קונצנזוס
    1. יישר את כל קומפלקסי החלבון-ליגנד באמצעות תוכנת PyMOL11.
    2. חלץ כל קונפורמטור ליגנד מיושר ושמור אותו כקובץ נפרד בפורמט SDF.
      הערה: ניתן להשתמש בתבניות אחרות כגון MOL, MOL2 ו-PDB גם עבור הפרוטוקול המתואר כאן.
  2. צור קבצי JSON פרמקופור באמצעות פארמית12
    1. העלה כל קובץ ליגנד בנפרד לפארמיט באמצעות אפשרות טעינת תכונות (ראה טבלת חומרים לקישור לפארמיט).
    2. השתמש באפשרות Save Session כדי להוריד את קובץ ה-JSON של הפרמקופור המתאים.
  3. ארגון קבצי JSON לשימוש ב- ConPhar
    1. אחסן את כל קבצי ה-JSON שהורדת בתיקייה אחת. קבצים אלה יועלו לסביבת Google Colab בשיטה הבאה.

2. שיטה 2

  1. הגדרת סביבת Google Colab
    1. הפעל מחברת חדשה של Google Colab: פתח את Google Colab בדפדפן האינטרנט וצור מחברת חדשה והתאם את ההגדרות לשימוש בגרסה קודמת על ידי בחירה בזמן ריצה → שנה זמן ריצה → גרסת זמן ריצה 2025.07.
    2. התקן את Conda ו-PyMOL. הקוד הנדרש להתקנת Conda ו-PyMOL ב-Google Colab מסופק כאן בצורה נטויה לעיון, וסקריפט ההפעלה המלא זמין גם בקובץ תמיכה 1.
      # התקן את CondaColab: מאפשר תמיכה בסביבת Conda ב- Google Colab
      מ- IPython.utils import io
      ייבוא tqdm.notebook
      ייבוא מערכת הפעלה
      סה"כ = 100
      עם tqdm.notebook.tqdm(total=total) כ- pbar:
      עם io.capture_output() כפי שנלכד:
      # התקן את CondaColab
      !pip install -q condacolab
      ייבוא condacolab
      condacolab.install()
      pbar.update(10)
      # עדכן את נתיב Python לאיתור חבילות מותקנות
      ייבוא מערכות
      sys.path.append('/usr/local/lib/python3.7/site-packages/')
      pbar.update(20)
      # התקן את חבילת PyMOL באמצעות ממבה מערוץ שרדינגר
      %מעטפת ממבה להתקין -c Schrodinger pymol-bundle --כן
      pbar.update(90)
    3. ודא ביצוע מוצלח: הפעל את התא על ידי לחיצה על סמל ההפעלה או לחיצה על Shift + Enter. פס ירוק אופקי יופיע מעל התא לאחר ביצוע מוצלח (ראה איור 1).
  2. התקן את חבילת ConPhar Python וייבא את המודולים הנדרשים
    1. התקן וייבא את ConPhar. הקוד הנדרש להתקנת חבילת ConPhar ולייבוא המודולים הדרושים ב-Google Colab מסופק כאן בצורה נטויה לעיון, וסקריפט ההפעלה המלא זמין גם בקובץ תומך 1.
      # התקן את חבילת ניתוח הפרמקופור של ConPhar
      ייבוא Pymol
      !pip להתקין conphar
      מקונפר. פרמקופורים מייבאים parse_json_pharmacophore, show_pharmacophoric_descriptors, save_pharmacophore_to_pymol, save_pharmacophore_to_json compute_concensus_pharmacophore
      ייבוא מערכת הפעלה
      ייבוא פנדות כ-PD
      הערה: הצהרת היבוא מקונפר. פרמקופורים מחולקים למספר שורות לצורך בהירות, אך יש להזין אותם כקו רציף אחד. הכלי ConPhar (https://github.com/AngelRuizMoreno/ConcensusPharmacophore) נמצא בפיתוח פעיל. הפרוטוקול הנוכחי משתמש במהדורה יציבה (0.1.2), אשר אומתה עבור ההליך המתואר. אנו ממליצים למשתמשים להשתמש בגרסה זו כדי להבטיח שחזור.
    2. אישור התקנה מוצלחת: הפעל את התא על ידי לחיצה על סמל ההפעלה או לחיצה על Shift + Enter. הודעת אישור תופיע עם התקנה וייבוא מוצלחים של כלי ConPhar (ראה איור 2).
  3. טעינת מודלים בודדים של Pharmacophore מקובצי JSON
    1. צור תיקייה לקובצי JSON של תרופות. הקוד הנדרש ליצירת תיקייה לאחסון קבצי הקלט של הפרמקופור ב-Google Colab מסופק כאן בצורה נטויה לעיון, וסקריפט ההפעלה המלא זמין גם בקובץ תמיכה 1.
      # צור תיקיה לאחסון קבצי JSON קלט
      os.makedirs("JSON_FOLDER", exist_ok=True)
      הערה: פקודה זו יוצרת את התיקיה באופן אוטומטי אם היא עדיין לא קיימת.
    2. העלה קבצי JSON לתיקיה: לחץ על סמל התיקיה בחלונית השמאלית של Colab, פתח את התיקיה החדשה שנוצרה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור העלה. הוסף את קבצי ה-JSON הנדרשים (ראה איור 3).
      הערה: ודא שהקבצים עוקבים אחר הפורמט הצפוי שנוצר על ידי פארמיט.
  4. נתח ואחד תכונות פרמקופוריות
    1. חלץ תכונות פרמקופוריות מקבצים שהועלו. הקוד הנדרש כדי לנתח את קבצי ה-JSON שהועלו, לחלץ תכונות פרמקופוריות ולאחסן אותם ב-DataFrame יחיד ב-Google Colab מסופק כאן בצורה נטויה לעיון, וסקריפט ההפעלה המלא זמין גם בקובץ תומך 1.
      p4_table=pd. DataFrame()
      עבור קובץ ב- os.listdir('/content/JSON_FOLDER'):
      אם '.json' בקובץ:
      ניסה:
      p4,lig,rec=parse_json_pharmacophore(f"/content/JSON_FOLDER/{file}")
      p4['ligand']=file.replace('.json','')
      p4_table=pd.concat([p4_table,p4],ignore_index=True)
      למעט יוצא מן הכלל:
      לעבור
      p4_table
    2. הפעל את התא על ידי לחיצה על סמל ההפעלה או לחיצה על Shift + Enter כדי ליצור את מסגרת הנתונים המאוחדת (ראה איור 4). ה-DataFrame המאוחד שנוצר אוסף את כל התכונות הפרמקופוריות המופקות מליגנדים בודדים לטבלה מאוחדת, מה שמקל על אשכולות במורד הזרם וניתוח סטטיסטי.
      הערה: קובץ ה- Script כולל טיפול בסיסי בחריגות כדי לעקוף קבצי JSON בעלי מבנה פגום במהלך העיבוד כדי למנוע הפרעה לזרימת העבודה. בהתחשב במספר הגדול של הקבצים, בדיקת כל אחד מהם מראש אינה מעשית; במקום זאת, ניתן לשנות את קובץ ה- Script כדי להדפיס את שמו של כל קובץ שטעינתו נכשלת, כך שהמשתמש יוכל לבדוק ולתקן אותו בנפרד.
  5. צור ושמור את הקונצנזוס Pharmacophore
    1. הצג את כל המתארים הפרמקופוריים. הקוד הנדרש כדי להמחיש את המתארים הפרמקופוריים שחולצו מקבצי הקלט ב-Google Colab מסופק כאן בצורה נטויה לעיון, וסקריפט ההפעלה המלא זמין גם בקובץ תומך 1.
      show_pharmacophoric_descriptors(p4_table)
    2. הפעל את התא על ידי לחיצה על סמל ההפעלה או לחיצה על Shift + Enter כדי להמחיש את אשכולות התכונות הפרמקופוריות (ראה איור 5). תפוקות מקובצות תכונות מקבצות תכונות פרמקופוריות דומות על פני מספר ליגנדים על סמך מיקומם המרחבי, מה שמאפשר זיהוי של דפוסי אינטראקציה משומרים.
    3. שמור את מודל הפרמקופור בתבנית PyMOL. הקוד הנדרש ליצירה ושמירה של מודל הפרמקופור הקונצנזוס בפורמט תואם PyMOL ב-Google Colab מסופק כאן בצורה נטויה לעיון, וסקריפט ההפעלה המלא זמין גם בקובץ תומך 1.
      save_pharmacophore_to_pymol(p4_table, out_file='ConPhar_pymol.pse')
    4. הפעל את התא כדי להפיק את קובץ ה- .pse המתאים (ראה איור 6).
    5. שמור את מודל הפרמקופור בתבנית JSON. הקוד הנדרש ליצירה ושמירה של מודל הפרמקופור הקונצנזוס בפורמט תואם Pharmit ב-Google Colab מסופק כאן בצורה נטויה לעיון, וסקריפט ההפעלה המלא זמין גם בקובץ תומך 1.
      ​save_pharmacophore_to_json(p4_table,out_file=
      'ConPhar_pharmit.json')
    6. הפעל את התא כדי להפיק את .json המתאים file (ראה איור 6).
    7. צור פלטים ודנדרוגרמות מקובצות באשכולות תכונות. הקוד הנדרש ליצירת קבצי פרמקופור קונצנזוס מקובצים לפי סוג תכונה, כולל פורמטים תואמי PyMOL ו-Pharmit, והדמיות דנדרוגרמה ב-Google Colab מסופק כאן בצורה נטויה לעיון, וסקריפט ההפעלה המלא זמין גם בקובץ תומך 1.
      קונצנזוס,קישורים=compute_concensus_pharmacophore
      (p4_table,save_data_per_descriptor=True,out_folder='/content')
    8. הפעל את התא על ידי לחיצה על סמל ההפעלה או לחיצה על Shift + Enter (ראה איור 7). התוצאות מציגות הדמיות דנדרוגרמה, אשר בצורת עץ מייצגות את היחסים ההיררכיים בין תכונות פרמקופוריות מקובצות באשכולות, ועוזרות למשתמשים לפרש את מידת הדמיון והקרבה המרחבית בין אשכולות.
      הערה: שלב זה שומר קבצי פלט ואיורים מרובים בתיקייה שצוינה.
    9. ייצא את תוצאות הפרמקופור הקונצנזוס לקובץ CSV. הקוד הנדרש לשמירת טבלת הפרמקופור הסופית של הקונצנזוס בפורמט CSV ב-Google Colab מסופק כאן בצורה נטויה לעיון, וסקריפט ההפעלה המלא זמין גם בקובץ תומך 1.
      concensus.to_csv('consensus_result.csv', index=False)
    10. הפעל את התא על ידי לחיצה על סמל ההפעלה או לחיצה על Shift + Enter כדי לייצא את נתוני הפרמקופור הקונצנזוס לקובץ CSV בשם consensus_result.csv להמשך ניתוח (ראה איור 8).
      הערה: קובץ ה-CSV מקל על יישומים במורד הזרם כגון ניתוח סטטיסטי או הדמיה בתוכנת גיליון אלקטרוני.
  6. השתמש בקונצנזוס Pharmacophore להקרנה וירטואלית
    1. ייצא את פרמקופור הקונצנזוס בתבנית JSON. ודא שהקובץ כולל קואורדינטות מרחביות עבור כל התכונות. פורמט זה תואם ישירות לכלי סינון מבוססי אינטרנט כגון פארמית12. כדי לבצע סינון וירטואלי, העלה את קובץ ה-JSON של הפרמקופור לשרת פארמיט באמצעות אפשרות Load Features . השרת מאפשר חידוד של המודל על ידי שינוי, הוספה או הסרה של תכונות, כמו גם סינון מול ספריות מורכבות גדולות, כגון PubChem13או ZINC14.
      הערה: כל הסקריפטים הנדרשים לשחזור הניתוחים המתוארים במחקר זה מסופקים בקובץ תומך 1 וניתן לגשת אליהם גם באופן אינטראקטיבי באמצעות https://colab.research.google.com/drive/1Zj8DjazV6mJM-we9iOpoGTZt8JfW4I7D?usp=sharing. הקוראים מוזמנים ליצור עותק אישי של מחברת Colab כדי להריץ ולשנות את הניתוחים מבלי לשנות את התסריט המקורי.

figure-protocol-1
איור 1: צילום מסך של בלוק הקוד הראשון המשמש להגדרת סביבת Google Colab על ידי התקנת CondaColab. סרגל התקדמות כחול אופקי מופיע מעל התא במהלך הביצוע והופך לירוק עם השלמתו המוצלחת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-2
איור 2: צילום מסך של בלוק הקוד השני ששימש להתקנת חבילת ConPhar ב-Google Colab. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-3
איור 3: צילום מסך המציג קבצי JSON של פרמקופור שהועלו בהצלחה לתיקייה הייעודית ב-Google Colab. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-4
איור 4: צילום מסך המציג את הקוד המשמש לחילוץ תכונות פרמקופוריות מקבצי JSON ואיחודם למסגרת נתונים יחידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-5
איור 5: ויזואליזציה של אשכולות של מאפיינים פרמקופוריים שנוצרו במהלך בניית מודל הפרמקופור הקונצנזוס. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-6
איור 6: צילום מסך המציג את היצירה המוצלחת של קבצי פרמקופור קונצנזוס בפורמטים תואמי PyMOL ו-Pharmit. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-7
איור 7: צילום מסך המציג את היצירה של קבצי פרמקופור קונצנזוס מקובצים באשכולות לפי סוג תכונה, כולל יציאות עבור ויזואליזציות PyMOL, Pharmit ודנדרוגרמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-8
איור 8: צילום מסך המציג את הייצוא המוצלח של נתוני פרמקופור הקונצנזוס לקובץ consensus_result.csv. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

מאה קומפלקסים של Mpro שהתגבשו יחד עם מעכבים לא קוולנטיים שונים היו מיושרים, כפי שמודגם באיור 9A. לאחר מכן כל ליגנד חולץ כקובץ בודד (איור 9B) ולאחר מכן הועלה לשרת פארמית. ההפעלה נשמרה כדי ליצור קובץ JSON מתאים (ראה איור 9C).

figure-results-1
איור 9: הכנת ליגנד למודלים פרמקופוריים קונצנזוס. (A) יישור מבני של שלושה קומפלקסים מייצגים של Mpro שהתגבשו יחד עם מעכבים לא קוולנטיים. (B) סופרפוזיציה של 100 הליגנדים שנכללו במחקר זה. (ג) העלאה של כל ליגנד לשרת פארמיט באמצעות האפשרות "טען תכונות", ואחריה יצירת קבצי JSON באמצעות האפשרות "שמור הפעלה". שתי האפשרויות מסומנות בחצים אדומים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הסט השלם של קבצי JSON שימש ליצירת מודל פרמקופור קונצנזוס, שכלל 1450 מאפיינים פרמקופוריים מקובצים ל-110 אשכולות: 23 ארומטיים (Aro), 30 מקבלים קשרי מימן (HBA), 16 תורמי קשרי מימן (HBD), 36 הידרופוביים (Hyd) ו-5 אשכולות טעונים שלילית (אניון) (איור 10A, טבלה משלימה 1). זיהינו את האשכולות הגדולים יותר עבור כל תכונה לשילובם במודל הקונצנזוס. מבין אשכולות Aro, בחרנו כאלה עם יותר מ-20 אלמנטים. מקבוצות HBA, HBD ו-Hyd, שמרנו על אשכולות עם לפחות 50 אלמנטים. לאף אחד מאשכולות האניונים לא היו יותר מ-4 חברים, ולכן הם לא נכללו במודל הקונצנזוס (איור 10B). ערכי הסף המספריים הללו (>20 חברים ל-Aro; ≥50 ל-HBA, HBD ו-Hyd) הוגדרו אמפירית על סמך התפלגות גדלי האשכולות כדי לתעדף את דפוסי האינטראקציה השמורים והצפופים ביותר.

figure-results-2
איור 10: אשכול של מאפיינים פרמקופוריים מ-100 קומפלקסים של מפרו-ליגנד. (A) התפלגות של 1450 מאפיינים פרמקופוריים: ארומטי (Aro) בסגול, מקבל קשרי מימן (HBA) בכתום, תורם קשר מימן (HBD) בלבן, הידרופובי (Hyd) בירוק וטעון שלילי (אניון) באדום. (ב) אשכולות המכילים ≥10 חברים מוצגים עבור Aro, HBA, HBD ו-Hyd; כל אשכולות האניונים מוצגים. האשכולות הגדולים ביותר - המוגדרים כאלו עם ≥20 חברים ל-Aro, ו-≥50 חברים ל-HBA, HBD ו-Hyd, ו-≥4 חברים לאניון - מודגשים בכדורים מנוקדים. מספר החברים בכל אחד מהאשכולות הגדולים ביותר מצוין במפורש. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לפיכך, מודל הפרמקופור הקונצנזוס שלנו כלל 11 תכונות: 3 תכונות ארומטיות (Aro), Aro 1, 2 ו-3, שמקורן באשכולות עם 20, 24 ו-45 איברים, בהתאמה; 4 מקבלי קשרי מימן (HBA), HBA 1, 2, 3 ו-4, מאשכולות עם 51, 55, 77 ו-81 חברים, בהתאמה; 2 תורמי קשרי מימן (HBD) מאשכולות עם 51 ו-71 חברים, בהתאמה; ו-2 מאפיינים הידרופוביים (Hyd) מצבירים עם 50 ו-52 חברים, בהתאמה (ראה איור 11A).

מודל הפרמקופור שימש לחיפוש במסד הנתונים של PubChem באמצעות האסטרטגיה שדווחהבעבר 10, אך לא נמצאו התאמות. כדי להגביר את גמישות החיפוש, התכונה הארומטית Aro 1 - שמקורה באשכול הקטן והפחות מייצג - הוסרה. התאמה זו הובילה לזיהוי של שתי פגיעות, כולל קונפורמציה של התרכובת עם PubChem CIDs 101267741 ו-10285538 (ראה איור 11B). המבנה הכימי הדו-ממדי של תרכובת 101267741 מוצג באיור 11C. מעניין שהתרכובת המזוהה הזו משתלבת היטב בכיס הקישור של Mpro. ניתוח השוואתי עם הליגנד המשותף 38a15 (מזהה PDB: 9HAJ) מראה כי הקונפורמור התואם לפרמקופור של 101267741 קבור אפילו עמוק יותר מ-38a בתוך כיסי המשנה S1 ו-S2 של Mpro. עם זאת, 38a תופס אזור רחב יותר של הכיס, בעיקר בשל שרשרת הצד אתיל קרבוקסמיד שלו, המשתרעת לכיוון כיס S1'. עם זאת, האינטראקציות הבין-מולקולריות העיקריות של 38a מערבות חלקים אחרים ולא שרשרת צד זו. לעומת זאת, תרכובת 101267741 יוצרת 11 אינטראקציות בין-מולקולריות, כולל שבעה קשרי מימן וארבעה מגעים הידרופוביים. בהשוואה לשלושת קשרי המימן ושתי האינטראקציות ההידרופוביות שנוצרו על ידי 38a, מצב הקישור של תרכובת 101 נראה חזק יותר (איור 11D).

figure-results-3
איור 11: חיפוש פרמקופור במסד הנתונים של PubChem. (A) מודל הפרמקופור המלא של הקונצנזוס מכיל 11 תכונות: 3 ארומטי (סגול), 4 מקבלי קשרי מימן (כתום), 2 תורמי קשרי מימן (לבן) ו-2 הידרופוביים (ירוק). (B) הקונפורמור של התרכובת PubChem 101267741 מיושר עם מודל הפרמקופור המופחת לאחר הסרת תכונת Aro 1, ו-(C) המבנה הכימי הדו-ממדי של התרכובת שזוהה. (D) ניתוח השוואתי של מצבי הקישור של תרכובת 38a (מג'נטה; ממזהה PDB: 9HAJ) ותרכובת PubChem CID 101267741 (ירוק) לכיס קטליטי SARS-CoV-2 Mpro. האינטראקציות הבין-מולקולריות המתאימות לכל תרכובת מוצגות מימין. קשרי מימן ואינטראקציות הידרופוביות מוצגים כקווים מקווקווים בכחול ואפור, בהתאמה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ תומך 1: סקריפט זרימת עבודה של Pharmacophore. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה תומכת 1: סיכום אשכולות של תכונות פרמקופוריות. מספר אשכולות, חברים לאשכול, קואורדינטות צנטרואידיות ורדיוסי אשכול אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

מודלים פרמקופוריים מסייעים לגילוי תרופות רציונלי16. הפרוטוקול המתואר כאן בפירוט שימש ליצירת פרמקופורה קונצנזואלית עבור הפרוטאז הראשי של SARS-CoV-2 (Mpro) החל מעשרות מעכבים לא קוולנטיים, אך ניתן ליישם אותו על כל מטרה ביולוגית עם קונפורמציות ידועות הקשורות לליגנד, במיוחד אלה עם מערכי נתונים נרחבים של ליגנד. בהשוואה למודלים פרמקופוריים בודדים או מבוססי ליגנד בלבד, גישת קונצנזוס זו משפרת את החוסן ומפחיתה הטיה על ידי שילוב קונפורמציות ליגנד מרובות. ניתן ליישם את מודל הפרמקופור הקונצנזוס שנוצר על ידי פרוטוקול זה על ספריות מולקולריות מגוונות, כולל מאגרי מידע ציבוריים כגון ChEMBL17ו-ZINC14, אוספים מסחריים וספריות מורכבות קנייניות. רבגוניות זו מאפשרת לחקור מרחבים כימיים רחבים ומגוונים בקמפיינים וירטואליים של סינון, ובכך להגדיל את הסבירות לזיהוי תרכובות ביו-אקטיביות חדשות. לפיכך, זרימת עבודה זו תומכת בזיהוי תרכובות ביו-אקטיביות חדשות עם פרופילי האינטראקציה הרצויים.

שלב קריטי אחד בפרוטוקול זה כולל הכנה והתאמה מדויקת של קומפלקסים של ליגנד-מטרה. יישור מוקדם מדויק של ליגנדים בקונפורמציות הביו-אקטיביות שלהם חיוני כדי להבטיח אינטגרציה משמעותית ואמינה של תכונות, שכן חוסר יישור יכול להחליש את כוח החיזוי של המודל10. כדי להשיג יישור אופטימלי, אנו ממליצים לבצע סופרפוזיציה מבנית באמצעות שאריות אתר קשירת חלבון משומר או אטומי עמוד שדרה. עבור מערכי נתונים עם ליגנדים מגוונים, יישור נקודות אינטראקציה מרכזיות או תכונות פרמקופוריות משפר את העקביות על פני הקבוצה. בנוסף, מומלץ לבצע בדיקה ידנית קפדנית ותיקון של קונפורמציות ליגנד חריגות כדי למנוע חפצים שעלולים להפחית את דיוק המודל. בנוסף, אופי הקוד הפתוח של ConPhar מאפשר אינטגרציה בתהליכי עבודה חישוביים אחרים כמו גם התאמות מתקדמות בפרמטרי האשכולות. משתמשים מנוסים עשויים לשנות את פרמטרי האשכולות של תכונות פרמקופוריות כדי לקבל איזון בין כלליות המודל לספציפיות. שינויים אלה יכולים להיות מכוונים על ידי גודל מערך נתונים של ליגנד, מגוון כימי או מורכבות מטרה. לדוגמה, כאשר עוסקים בליגנדים מגוונים מאוד, אשכולות צעדיים או ניתוח תת-קבוצות יכולים ללכוד טוב יותר תכונות רלוונטיות18.

הכלי ConPhar נמצא כעת בפיתוח פעיל. זה מציע גמישות משמעותית למשתמשים המעוניינים להתאים את הכלי לצרכי מחקר ספציפיים, כולל אינטגרציה עם צינורות תוכנה משלימים. עם זאת, מכיוון שהתוכנה עדיין עשויה לעבור שינויים, מומלץ למשתמשים לעקוב אחר עדכונים רשמיים ולעיין בתיעוד ספציפי לגרסה. דיווח על בעיות שנתקלו בהן יתרום להמשך שיפורו ולתיקוף קהילתי רחב יותר. הפרוטוקול שלנו יבנה מודלים עם דפוסי אינטראקציה מקיפים, וכך ניתן להשתמש בהם בסינון וירטואלי של ספריות גדולות. בתוצאות המייצגות שלנו, השתמשנו בפרמקופור שהתקבל בזיהוי שני ליגנדים פוטנציאליים חדשים לאזור הקטליטי של Mpro. בסופו של דבר, שיטת פרמקופור קונצנזוס זו מייעלת את זיהוי הלהיטים ומאיצה אופטימיזציה של לידים.

עם זאת, אנו מזהים את המגבלות הבאות של הפרוטוקול: i) תלות במבנים הקשורים לליגנד באיכות גבוהה, מכיוון שנתונים ברזולוציה נמוכה יכולים להפחית את דיוק המודל; ii) הסיכון להתעלם מאינטראקציות ייחודיות וחשובות החיוניות לליגנדים ספציפיים, מכיוון שפרמקופור הקונצנזוס מדגיש תכונות משותפות; ו-3) יכולת השחזור יכולה להיות מושפעת מהגדרת תכונות שונה על פני כלי תוכנה שונים19. עם זאת, ניתן להתגבר על מגבלות אלו על ידי חידוד המבנה של מערכת חלבון-ליגנד על ידי סימולציות דינמיקה מולקולרית20, שימור אשכולות המבוסס על ידע המשתמש ושימוש עקבי בתוכנה לזיהוי תכונות פרמקופוריות.

למרות שמודל הפרמקופור הקונצנזוס בפרוטוקול זה לא אומת באמצעות מדדים בינאריים קלאסיים, יכולת החיזוי שלו הוכחה במחקר קודם10. בעבודה זו, נעשה שימוש בערכת בדיקה עצמאית של 78 ליגנדים מגוונים כימית כדי לאמת פרמקופור קונצנזוס שנוצר באותה מתודולוגיה. ערכת האימות כללה ליגנדים עם דמיון של ≤0.5 טנימוטו, מסות מולקולריות בין 200 ל-700 גרם/מול, ≤17 קשרים מסתובבים ולפחות שלושה מאפיינים פרמקופוריים. המודל זיהה בהצלחה חומרים פעילים ידועים, ותמך בישימות שלו בתהליכי עבודה של סינון וירטואלי ובחוסנו על פני מועמדים מגוונים מבחינה כימית.

הפרוטוקול המדווח כאן מאפשר בניית מודלים פרמקופוריים הלוכדים דפוסי אינטראקציה מקיפים האופייניים למטרה. זה חשוב במיוחד עבור מטרות עם נתוני ליגנד נרחבים, כגון פרוטאזות ויראליות, קינאזות וקולטנים גרעיניים21. המודלים שנוצרו מתאימים לסינון וירטואלי של ספריות תרכובות גדולות, מה שמקל על זיהוי מועמדים ביו-אקטיביים חדשים. על ידי הדגשת תכונות שמורות ורלוונטיות מבחינה פונקציונלית, גישת הפרמקופור הקונצנזוס תומכת הן בגילוי להיטים בשלב מוקדם והן באופטימיזציה של לידים לאחר מכן.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

המחקר הנוכחי מומן בחלקו על ידי PAPIIT UNAM IV200121 (M.A.V-V.), SECIHTI project Cátedras CONACYT 639 (L.C-B. ו-M.A.V-V.), LANCAD-UNAM-DGTIC-386 (L.C-B.) והיחידה למחקר ופיתוח בביו-תרפיוטיקה (UDIBI).

המחברים מודים לאדוארדו אורוזקו על תמיכתו רבת הערך ותרומתו רבת התובנות לאורך פיתוח כתב היד הזה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
גוגל קולאבגוגל בע"מhttps://colab.googleפלטפורמה מבוססת אינטרנט להפעלת מחברות Python; משמש כאן לביצוע סקריפטים של ConPhar ו-PyMOL למידול פרמקופור קונצנזוס.
פארמיתמעבדת קוס באוניברסיטת פיטסבורגhttps://pharmit.csb.pitt.edu/search.htmlפלטפורמת אינטרנט לסינון וירטואלי אינטראקטיבי של פרמקופור וחקר חלל כימי, המאפשרת העלאת קבצי ליגנד ויצירת תכונות פרמקופור
פימולSchrö דינגר בע"מhttps://www.pymol.orgתוכנת הדמיה מולקולרית ויישור מבני המשמשת לחלבון; סופרפוזיציה ואנליזה מרוכבת ליגנד
תמיכה בסקריפט זרימת עבודה של Pharmacophore File 1גוגל בע"מhttps://colab.research.google.com/drive/1Zj8DjazV6mJM-we9iOpoGTZt8JfW4I7D?usp=sharingסקריפט הפעלה מלא להתקנת Conda, PyMOL והפעלת זרימת העבודה של Pharmacophore ב-Google Colab. מסופק גם כקובץ תומך 1.

מקורות

  1. Leach, A. R., Gillet, V. J., Lewis, R. A., Taylor, R. Three-dimensional pharmacophore methods in drug discovery. J Med Chem. 53 (2), 539-558 (2010).
  2. Giordano, D., Biancaniello, C., Argenio, M. A., Facchiano, A. Drug design by pharmacophore and virtual screening approach. Pharmaceuticals (Basel). 15 (5), 646(2022).
  3. Schaller, D., et al. Next generation 3D pharmacophore modeling. WIREs Comput Mol Sci. 10 (4), e1468(2020).
  4. Wolber, G., Langer, T. LigandScout: 3-D pharmacophores derived from protein-bound ligands and their use as virtual screening filters. J Chem Inf Model. 45 (1), 160-169 (2005).
  5. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. Br J Pharmacol. 152 (1), 9-20 (2007).
  6. Wolber, G., Dornhofer, A. A., Langer, T. Efficient overlay of small organic molecules using 3D pharmacophores. J Comput Aided Mol. 20 (12), 773-788 (2006).
  7. Schuster, D. 3D pharmacophores as tools for activity profiling. Drug Discov Today Technol. 7 (4), e205-e211 (2010).
  8. Qing, X., et al. Pharmacophore modeling: advances, limitations, and current utility in drug discovery. J Recept Ligand Channel Res. 7, 81-92 (2014).
  9. Ullrich, S., Nitsche, C. The SARS-CoV-2 main protease as drug target. Bioorg Med Chem Lett. 30 (17), 127377(2020).
  10. Ruiz-Moreno, A. J., et al. Consensus pharmacophore strategy for identifying novel SARS-CoV-2 Mpro inhibitors from large chemical libraries. J Chem Inf Model. 64 (6), 1984-1995 (2024).
  11. Schrödinger, L., DeLano, W. PyMOL, 2020. , http://www.pymol.org/pymol (2020).
  12. Sunseri, J., Koes, D. R. Pharmit: Interactive exploration of chemical space. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W442-W448 (2016).
  13. Kim, S., et al. PubChem 2025 update. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D1516-D1525 (2025).
  14. Tingle, B. I., et al. ZINC-22: A free multi-billion-scale database of tangible compounds for ligand discovery. J Chem Inf Model. 63 (4), 1166-1176 (2023).
  15. Hazemann, J., et al. Accelerating the hit-to-lead optimization of a SARS-CoV-2 Mpro inhibitor series by combining high-throughput medicinal chemistry and computational simulations. J Med Chem. 68 (8), 8269-8294 (2025).
  16. Momin, Y., Beloshe, V. Pharmacophore modeling in drug design. Adv Pharmacol. 103, 313-324 (2025).
  17. Zdrazil, B., et al. The ChEMBL database in 2023: A drug discovery platform spanning multiple bioactivity data types and time periods. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1180-D1192 (2024).
  18. Zhou, L., Griffith, R., Gaeta, B. Combining spatial and chemical information for clustering pharmacophores. BMC Bioinformatics. 15 (Suppl 16), S5(2014).
  19. Guner, O. History and evolution of the pharmacophore concept in computer-aided drug design. Curr Top Med Chem. 2 (12), 1321-1332 (2002).
  20. Wieder, M., Perricone, U., Seidel, T., Boresch, S., Langer, T. Comparing pharmacophore models derived from crystal structures and from molecular dynamics simulations. Monatsh Chem. 147 (3), 553-563 (2016).
  21. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 19-34 (2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים