בדיקת פליטת פוספוליפידים ספציפית לליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

Edward  B. Neufeld; Masaki Sato; Alan T. Remaley

doi:10.3791/68947

מאמר שיטה

בדיקת פליטת פוספוליפידים ספציפית לליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

DOI:

10.3791/68947

⸱

30 בספטמבר 2025

Edward B. Neufeld^*¹ , Masaki Sato^*¹ , Alan T. Remaley¹

¹Lipoprotein Metabolism Laboratory, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים למדידת כמות הפוספוליפיד הפלואורסצנטי שהוסר במיוחד מחלקיקי תורם שומנים על ידי ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) הקיים בפלזמה או בסרום אנושי שלם. הראינו שמדד זה של פונקציונליות HDL מנבא מחלות לב וכלי דם אירועיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רמות פלזמה של כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL-C) הן כיום מדד מפתח להערכה קלינית של הסיכון למחלות לב וכלי דם (CVD). הסרה בתיווך HDL של שומני פלאק מהתאים ומשקעים חוץ-תאיים בדופן העורקים היא אחת מכמה פונקציות אנטי-אטרוגניות של HDL שעשויות להסביר את הקשר ההפוך שלו לסיכון למחלות לב וכלי דם. הסרת כולסטרול תאי במבחנה בתיווך HDL הוכחה לאחרונה כמנבא טוב עוד יותר לסיכון למחלות לב וכלי דם מאשר HDL-C.

HDL מורכב מאוכלוסייה הטרוגנית של חלקיקים, המבצעים פונקציות שונות. חלקיקי HDL המעורבים בהסרת שומני רובד טרשת עורקים מכילים אפוליפופרוטאינים הניתנים להחלפה, בעיקר אפוליפופרוטאין A-I, המתנתקים מהחלקיק ולאחר מכן מסירים שומני פלאק. HDL מתהווה נוצר על ידי מסיסות והסרה של פוספוליפידים וכולסטרול מתחומי קרום הפלזמה התאיים שנוצרו על ידי ABCA1 על ידי אפוליפופרוטאינים הניתנים להחלפה שמקורם ב-HDL. תהליך זה ממלא תפקיד קריטי הן במניעה והן ברגרסיה של רובד טרשת עורקים.

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לבדיקת פליטת פוספוליפידים נטולת תאים וספציפית ל-HDL (HDL-SPE), שהראינו בעבר שיכולה לחזות סיכון למחלות לב וכלי דם. בדיקה זו מודדת באופן ספציפי הסרה בתיווך אפוליפופרוטאין HDL של פוספוליפיד פלואורסצנטי שאינו ניתן להחלפה מחלקיק תורם שומנים. המחקרים הקליניים שלנו קבעו כי בדיקת HDL-SPE מתפקדת טוב ואולי אפילו טוב יותר מבדיקת יכולת פליטת הכולסטרול מבוססת התאים "תקן הזהב", בדיקה מייגעת ומורכבת מבחינה טכנית המשתמשת לעתים קרובות בכולסטרול רדיואקטיבי.

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר לחוקרים בסיסיים וקליניים כאחד להעריך את הפונקציונליות של HDL בגיוס שומנים, באמצעות בדיקה פשוטה, סטנדרטית, נטולת תאים ותפוקה גבוהה. בדיקה זו יכולה לשמש חוקרים בסיסיים כדי לקבל תובנות לגבי המנגנונים העומדים בבסיס פליטת שומנים בתיווך HDL ולסינון חומרים טיפוליים חדשים המשפרים את פונקציונליות ה-HDL. HDL-SPE יכול לשמש גם כבדיקת אבחון מעבדה קלינית להערכת סיכון למחלות לב וכלי דם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת פליטת פוספוליפידים ספציפית לליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL-SPE) מודדת את פונקציונליות ה-HDL ומיועדת לשימוש במחקר ביו-רפואי ובמעבדות אבחון קליניות כדי (i) לקבל תובנות נוספות לגבי המנגנונים העומדים בבסיס הסרת שומנים בתיווך HDL מנגעים טרשת עורקים, (ii) לשמש פלטפורמה חדשה לשיפור הערכת הסיכון הקלינית למחלות לב וכלי דם ו-(iii) לפתח טיפולים חדשים לטיפול במחלות לב וכלי דם.

כולסטרול HDL (HDL-C) הוא גורם חשוב לסיכון למחלות לב וכלי דם¹, אך התועלת שלו נפגעת ככל שרמות גבוהות של HDL-C (>80 מ"ג/ד"ל) קשורות לסיכון גבוה יותר למחלות לב וכלי דם 2,3,4,5. רמות גבוהות של HDL-C עשויות לייצג הצטברות של HDL לא מתפקד בעל יכולת מופחתת להסיר שומנים בפלאק עורקי⁶.

בדיקת קיבולת פליטת הכולסטרול התאית (CEC) הייתה הראשונה שפותחה למדידת פונקציונליות HDL. בבדיקה זו, מקרופאגים מתורבתים (עכבר או אדם), המסומנים בדרך כלל עם ³H- או כולסטרול בודיופי פלואורסצנטי, מודגרים עם פלזמה או סרום מדולל apoB. אחוז פליטת הכולסטרול מחושב על סמך כמות הקרינה/רדיואקטיביות הקשורה לתאים ובינוניים ^7,8,9. בדיקת CEC הוכחה כמנבא טוב יותר לאירוע CVD מאשר HDL-C⁷. בדיקת CEC אינה ניתנת להמרה לבדיקה אבחנתית קלינית שגרתית בעיקר בשל דרישותיה לתרבית תאים ומשך זמן ארוך (למשל, ימים). יתר על כן, בדיקת ה-CEC מוגבלת על ידי השונות המובנית שלה (למשל, סוגים שונים של תאים, טכניקות תיוג ודלדול PEG של β-ליפופרוטאינים, מה שמשנה את הרכב ה-HDL¹⁰).

מספר קבוצות מחקר פיתחו מבחני פליטת כולסטרול HDL ללא תאים לשימוש ככלים להשגת תובנות חדשות על תפקוד HDL ולתרגום פוטנציאלי לבדיקת אבחון קלינית כדי להעריך טוב יותר את הסיכון למחלות לב וכלי דם^11,12. מבחני פליטה אלה כוללים בדרך כלל מספר שלבים ומשתמשים בחלקיק תורם שומנים המסומן בכולסטרול פלואורסצנטי, וכמו בדיקת CEC, הם דורשים דלדול של β-ליפופרוטאינים או, לחילופין, לכידת חלקיקים המכילים apoA-I באמצעות נוגדנים נגד apoA-I, כדי למדוד את פליטת הכולסטרול HDL בפלזמה. למרות שבדיקות חלופיות אלה אומתו כקשורות בדרגות שונות לסיכון CVD, עד כה, רק¹³ אחד, המעריך את שער החליפין apoA-I, הוכח כמנבא סיכון CVD¹⁴. מעניין לציין כי הקינטיקה של חילופי apoA-I על ומחוץ לפלזמה HDL הוכחה כקשורה באופן עצמאי ל-CEC¹⁵ ומופחתת באופן ניכר בחולים עם תסמונת כלילית חריפה¹⁶. בנוסף, הוכח כי מספר אפוליפופרוטאינים הניתנים להחלפה HDL מתווכים הן כולסטרול והן פוספוליפיד מתאים המבטאים ABCA1 במבחנה¹⁷.

פיתחנו גישה חלופית להערכת פונקציונליות HDL¹⁸. הבדיקה הפשוטה, המהירה והאמינה המתוארת כאן דורשת רק שני מרכיבים, כלומר דגימות פלזמה או סרום שלמות של בני אדם (או בעלי חיים) (טריות או מופשרות בהקפאה), וחלקיק תורם מצופה שומן פלואורסצנטי. הבדיקה מודדת את היכולת של apoA-I ואפוליפופרוטאינים אחרים הניתנים להחלפה הקשורים ל-HDL בפלזמה/סרום שלם להסיר פוספטידיל-אתנולמין פלואורסצנטי (PE) שאינו ניתן להחלפה ומתויג על ידי קבוצת ראש מחלקיק תורם^{מצופה שומן 18} (איור 1).

החלקיקים התורמים בבדיקה זו מורכבים מגבישי הידרט סידן סיליקט (CSH) המצופים בכולסטרול, פוספוליפיד פוספטידילכולין (PC) ו-PE פלואורסצנטי. אפוליפופרוטאינים הקשורים ל-HDL הניתנים להחלפה, בעיקר apoA-I, המשתחררים מחלקיקי HDL נקשרים לחלקיקי התורם ולאחר מכן מתנתקים מהם יחד עם שומני חלקיקים תורמים, כולל PE פלואורסצנטי. באופן זה, HDL, אך לא הליפופרוטאינים האחרים הקיימים בפלזמה/סרום שלם, רוכש באופן ספציפי PE פלואורסצנטי מהחלקיקים התורמים^18,19. פלזמה/סרום שלם מודגר עם חלקיקי תורם סידן סיליקט הידרט מצופה שומן פלואורסצנטי (LC-CSH) ותמיסת מלח ב-37 מעלות צלזיוס, עם ניעור למשך שעה. מכיוון שצפיפות ה-LC-CSH היא בערך פי שניים מצפיפות המים, חלקיקי התורם מופרדים בקלות מהפלזמה על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה.

אחוז פליטת ה-PE הנמדדת במחקרים קליניים מנורמל בדרך כלל על ידי חלוקה בערך הקרינה PE הנרכשת על ידי HDL בסופרנטנט של תערובת התגובה של דגימה קלינית בערך המתקבל על ידי HDL בפלזמה אנושית בקרת ייחוס. נורמליזציה לפלזמת ייחוס מתבצעת כדי לתקן שינויים בהכנת ריאגנטים. עבור יישומי מחקר, ניתן לקבוע את % פליטת PE על ידי חישוב הקרינה הסופרנטנטית PE חלקי הקרינה הכוללת (פלואורסצנציה PE סופרנטנטית + פלואורסצנציה LC-CSH). ערכי מדידה פלואורסצנטיים של Supernatant מודבקים בתבנית בקבצי גיליונות אלקטרוניים כדי לחשב %PE Efflux (טבלה משלימה 1 למדידות משולשות וטבלה משלימה 2 למדידות כפולות). ההוראות לביצוע חישובים אלה בגיליון האלקטרוני מסופקות כקבצים משלימים (תיק משלים 1, תיק משלים 2, תיק משלים 3, תיק משלים 4, תיק משלים 5, תיק משלים 6, תיק משלים 7 וקובץ משלים 8), וחישוב לדוגמה מסופק כטבלה משלימה 3.

figure-introduction-1
איור 1: בדיקת HDL-SPE. פליטת פוספוליפידים ספציפית ל-HDL נבדקת בצלחות של 96 בארות. גבישי הידרט מלוחים, סידן סיליקט (אפור) מצופים בשומנים (LC-CSH), כולל פוספטידיל-אתנולמין (LRh-PE; שכבות ממברנה אדומות) שאינן ניתנות להחלפה, ועד 30 דגימות פלזמה/סרום שלמות (צהובות; במשולש) נטענות על צלחות של 96 בארות. לאחר ערבוב של שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמו-מיקסר, צנטריפוגה קצרה של הצלחות כדי לגלול את חלקיקי התורם LC-CSH. עליונות של הסופרנטנטים, המכילים HDL המסומן במיוחד ב-LRh-PE, מועברים לצלחת שחורה המכילה חומר ניקוי (להמסת Lh-Rh-PE) ותמיסת מלח. לאחר מכן נמדדת פלואורסצנטיות PE באמצעות פלואורמטר. מי מלח (שליטה שלילית; NC), לתיקון רקע, ופלזמה אנושית בריאה מאוגדת (בקרה חיובית; PC) לנורמליזציה של צלחות, נטענים במקום פלזמה/סרום דגימה בקבוצת הבארות האחרונה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איסוף הדם מתבצע בהתאם לכללי הצהרת הלסינקי משנת 1975 (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/), שתוקנה בשנת 2013, וצריכה להתאים להנחיות המוסדיות בנוגע להסכמה מדעת.

1. הכנת חלקיקי שומנים תורמים המסומנים בפוספוליפידים פלואורסצנטיים

היווצרות סרט שומנים
זהירות: הכן והחלק תמיסות מלאי במכסה מנוע כימי. ללבוש מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. השלך תמיסות כלורופורם בפסולת כימית אורגנית, תמיסות טריטון X-100 (ללא פלזמה) בפסולת כימית, ותמיסות המכילות פלזמה בפסולת ביולוגית/רפואית.
1. רכשו תמיסות מלאי שומנים בכלורופורם מספק או הכינו אותם במעבדה:
  25 מ"ג/מ"ל: 1,2-דימיריסטויל-sn-גליצרו-3-פוספוכולין (DMPC):
  10 מ"ג/מ"ל: כולסטרול
  1 מ"ג/מ"ל: 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissaminerhodamine B sulfonyl) [LRh-PE]
  הערה: השתמש בצינורות זכוכית אטומים לאוויר עם בורג. מכסה אטום עם סרט טפלון.
  יש לאחסן בטמפרטורה של -20^{מעלות צלזיוס}.
2. קבע את כמות ה-LC-CSH שתידרש והכין את המספר המתאים של צינורות זכוכית.
  במכסה אדים כימי, הוסף את הדברים הבאים לכל צינור זכוכית בורוסיליקט 10 מ"מ 150 מ"מ: 472 מיקרוליטר של תמיסת מלאי DMPC (17.7 מיקרומול, 11.8 מ"ג), 339 מיקרוליטר של תמיסת מלאי כולסטרול (8.8 מיקרומול, 3.39 מ"ג) ו-305 מיקרוליטר של LRh-PE (200 ננומול, 0.305 מ"ג). מערבולת קצרה לערבב.
3. במכסה אדים כימי, יבש את תערובת השומנים בצינור זכוכית מתחת לזרם עדין של N₂ למשך שעה, ליצירת סרט שומנים יבש בתחתית הצינור.
  הערה: הזרימה של N₂אמורה רק לגרום לאדוות קלות על פני הנוזל.
4. עבור בדיקות הדורשות מספר צלחות של 96 בארות לאורך ימים או שבועות, הכינו אצווה גדולה של LC-CSH שניתן להכניס לתוך צינורות, או להשתמש בה לייצור לוחות LC-CSH מוכנים לשימוש, המאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס. ראה שלבים 2.2.1-2.2.2 להלן.
ציפוי סידן סיליקט הידרט עם סרט שומנים פלואורסצנטי
זהירות: יש ללבוש מעיל מעבדה, כפפות, מסכת פנים ומשקפי מגן בזמן הטיפול בסידן סיליקט הידרט.
1. הכנס חרוט נייר שקילה לתוך צינור הזכוכית המכיל את השומנים המיובשים. הוסף 80 מ"ג של אבקת סידן סיליקט הידרט (CSH) (מגיב להסרת שומנים) לצינור הזכוכית באמצעות קונוס נייר השקילה כדי לכוון את האבקה לבסיס הצינור. הוסף מיד 2 מ"ל של מי מלח רגילים לצינור הזכוכית המכיל את השומנים המיובשים ו-CSH. מכסים את החלק העליון של הצינור בפרפילם.
2. מערבולת ביד כדי לעקור את עיקר השומן מתחתית צינור הזכוכית. הכנס את צינור הזכוכית לחור העשוי בפלטפורמת קלקר המחוברת לחלק העליון של מערבולת. אבטח את הצינור לפלטפורמת המערבולת באמצעות סרט מחוזק.
  הערה: התאם מראש את מהירות המערבולת כדי לאפשר לתערובת לעלות בערך באמצע צינור הזכוכית.
3. מערבולת למשך 10 דקות. לאחר המערבולת, ודא שלא נשאר שומן על דופן הצינור. במידת הצורך, מערבולת ידנית לפי הצורך עד שלא נשאר שומנים. העבירו את הנפח הכולל בצינור הזכוכית לצינור פלסטיק חרוטי של 15 מ"ל, באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. שוטפים את קירות צינור הזכוכית עם 3 מ"ל מלח נוסף ומעבירים לאותו צינור פלסטיק חרוטי של 15 מ"ל.
שטיפת LC-CSH
1. צנטריפוגה של צינור הפלסטיק בנפח 15 מ"ל המכיל את ה-CSH המצופה בשומן (LC-CSH) למשך 2 דקות ב-935 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את חלקיקי התורם. הסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי שאיבת ואקום באמצעות קצה פיפטה ארוך ודק מאוד.
2. התחל בחלק העליון של הסופרנטנט ותוך כדי החלקה איטית של קצה הפיפטה לאורך צד הצינור, הטה את הצינור בזמן הסרת הסופרנטנט. השאירו כמות קטנה (≈ 200 מיקרוליטר) של מי מלח כדי למנוע שאיפה מקרית של ה-LC-CSH מהגלולה. הוסף מספיק מי מלח כדי להביא את הנפח הכולל ל -5 מ"ל.
3. חזור על שלבים 1.3.1-1.3.2 ארבע פעמים. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף מספיק מי מלח כדי להביא את הנפח הסופי ל -2.5 מ"ל.
  הערה: יש לאחסן בתכשירי LC-CSH בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים או בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
הכנת אצווה גדולה עבור לוחות LC-CSH מוכנים לשימוש
הערה: גישה זו מאפשרת הכנת לוחות מדידה עם הרכב ריאגנטים אחיד מאותה אצווה LC-CSCH, ובכך ממזערת את שונות המדידה בין הלוחות.
1. הכן 12 צינורות LC-CSH (2.5 מ"ל x 12 צינורות) כמתואר בשלבים 1.1.1-1.3.2 לעיל. שלב את כל התוכן של כל 12 הצינורות לצינור פלסטיק חרוטי של 50 מ"ל (נפח כולל של 30 מ"ל). מערבולת בזהירות כדי לקבל פיזור הומוגני של חלקיקי LC-CSH, ולהוציא 6 מ"ל לתוך צינור חרוטי מפלסטיק של 15 מ"ל. חזור על הפעולה ארבע פעמים כדי להניב בסך הכל 5 צינורות חרוטיים מפלסטיק, כל אחד מכיל 6 מ"ל של LC-CSH.
2. כל צינור יספק מספיק LC-CSH כדי ליצור 5 לוחות LC-CSH מוכנים לשימוש (המכילים 50 מיקרוליטר לבאר עבור כל 96 הבארות בצלחת אחת). ראה שלבים 2.2.1-2.2.2 להלן.

2. דגירה של דגימות פלזמה/סרום עם חלקיקי שומנים תורמים עם תווית פוספוליפידים פלואורסצנטיים (LC-CSH)

צלחות אישיות לשימוש מיידי.
1. פיפטה 75 מיקרוליטר של מי מלח לכל באר של צלחת של 0.3 מ"ל 96 בארות תוך שימוש בכמה בארות שצריך לבדיקת ערכת הדגימה. פיפטה של 100 μL של מי מלח לתוך בארות בקרה שלילית משולשת (NC), ו-75 μL של מי מלח לתוך בארות בקרה חיובית (PC) כפולות (איור 2). השתמש בפיפטה מרובת בארות כדי לחלק.
2. לפני חלוקת LC-CSH, מערבב את צינור מלאי הפלסטיק בנפח 15 מ"ל 3 פעמים, 10 שניות כל אחת. בעזרת פיפטת באר אחת, הוציא 50 מיקרוליטר של LC-CSH לאורך הצד הימני של הבארות המכילות מלח. יש להוציא במהירות 50 מיקרוליטר כל אחד ל-3 בארות בלבד. חזור על פרוטוקול המערבולת לפני הוצאת LC-CSH ל-3 הבארות הבאות.
  הערה: הליך זה הוא קריטי כדי להבטיח שה-LC-CSH הכבד, המשקע באופן ספונטני, מושעה באופן הומוגני, ובכך מאפשר חלוקת כמויות שוות לכל באר.
3. סובב את לוח 96 הבארות ב-180 מעלות כך שהצד השמאלי של הבארות יהיה כעת ימינה. פיפטה 25 מיקרוליטר של דגימות פלזמה/סרום לאורך הצד הימני של הבאר (איור 2). עבור בארות ה-PC, הוסף 25 מיקרוליטר של פלזמה/סרום נורמוליפידמי אנושי סטנדרטי. הנפח הכולל לבאר עבור הבדיקה הוא 150 מיקרוליטר.
  הערה: הליך זה מונע זיהום צולב של פלזמה/סרום עם LC-CSH, מכיוון שהם מופצים לאורך צדדים מנוגדים של הבארות.
4. אטום היטב את הצלחת עם סרט דבק. דגרו את הצלחת האטומה של 96 בארות בחושך למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס ב-1200 סל"ד בתרמו-מיקסר. לאחר השלמת הדגירה, הוציאו את הצלחת מהתרמו-מערבל והניחו אותה על קרח. צנטריפוגה של הצלחת למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס (כדי לעצור את תגובת ההעברה) ב-935 גרם כדי לגלול את חלקיקי התורם.
לוחות LC-CSH מוכנים לשימוש
1. לשימוש, הפשירו צלחות מוכנות לשימוש קפואות (ראה שלבים 1.4.1-1.4.2 להכנת צלחת) בקור (4 מעלות צלזיוס עד 10 מעלות צלזיוס) למשך שעתיים (או לילה במידת הצורך). צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ב-935 × גרם לאיסוף כל החומר (125 מיקרוליטר) יחד. הסר בזהירות את סרט הדבק כדי לא להתיז את תכולת הבארות.
2. להוציא 25 מיקרוליטר של דגימות פלזמה/סרום, מי מלח ופלזמה אנושית ייחוס, בשלוש עותקים, לבארות המתאימות (איור 1) של הצלחת המוכנה לשימוש, על קרח, ולאטום עם סרט דבק. דגרו את 96 הבארות האטומות בחושך למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס ב-1200 סל"ד בתרמו-מיקסר. מוציאים את הצלחת מהתרמו-מערבל ומניחים אותה על קרח. צנטריפוגה של הצלחת למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס (כדי לעצור את תגובת ההעברה) ב-935 × גרם (כדי לגלול את חלקיקי התורם).

figure-protocol-1
איור 2: הוצאת ריאגנטים לבארות ללא זיהום צולב. יש לחלק פלזמה/סרום ו-LC-CSH על קירות מנוגדים של הבארות. זיהום צולב ממוזער אם הצלחת מסובבת ב-180 מעלות לאחר הוצאת LC-CSH הראשונה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. מדידת פליטת פוספוליפידים פלואורסצנטית לפלזמה/סרום HDL

העברה ללוח שחור ומדידת פלואורסצנטיות
1. הסר בזהירות את סרט הדבק כדי לא להפריע לכדור LC-CSH.
  הערה: אם מתרחשת הפרעה בגלולה, צנטריפוגה שוב.
2. העבר 50 מיקרוליטר של סופרנטנט מלוח התגובה של 96 בארות לבארות של צלחת פוליסטירן שחורה שטוחה עם 96 בארות למדידות פלואורסצנטיות. השתמש בפיפטה מרובת בארות.
  הערה: אין לשאוב שום LC-CSH. אם זה יקרה, הזרקו שוב לבאר ולצנטריפוגה.
3. מלאו מאגר במי מלח רגילים. הוסף 50 מיקרוליטר מלח לכל באר באמצעות פיפטה מרובת בארות.
4. הכן 1% TX-100 על ידי הוספת 90 מ"ל מים מזוקקים ל-10 מ"ל של תמיסת מלאי 10% Triton X-100 בבקבוק פלסטיק של 125 מ"ל Erlenmeyer. מלאו מאגר ב-1% Triton-X 100.
5. הוסף 100 מיקרוליטר של 1% טריטון X-100 בטמפרטורת החדר לכל באר וערבב על ידי פיפטה עדינה למעלה ולמטה 2-3 פעמים באמצעות פיפטה מרובת בארות. הימנע מהיווצרות בועות. פוצץ כל בועות עם אוויר מפיפטה העברה של 3 מ"ל.
6. מדוד פלואורסצנציה של Lissaminerhodamine עם פלואורמטר (עירור 540 ננומטר / פליטה של 600 ננומטר).
חישוב פליטת %PE
1. חישוב פליטת PE
  1. % פליטת PE = ([סה"כ שפעת סופרנטנט פלזמה או סרום - שפעת סופרנטנט NC]/שפעת כוללת)) × 100
    שפעת = יחידות פלואורסצנטיות; NC = שליטה שלילית. מכיוון שרק 50 מיקרוליטר מתוך 150 מיקרוליטר של תערובת התגובה הסופרנטנטית משמשים למדידת הקרינה לבאר, יש צורך לתקן באופן הבא:
  2. סה"כ שפעת/באר סופרנטנט = שפעת נמדדת של 50 מיקרוליטר (צלחת שחורה) × 3
  3. סה"כ שפעת לכל 150 מיקרוליטר תערובת/באר תגובה = סה"כ שפעת הנפלטת על ידי 50 מיקרוליטר של LC-CSH.
    הערה: הקרינה LC-CSH מחושבת כמתואר להלן (שלב 4.2.5).
2. חישוב פליטת %PE מנורמל
  1. השתמש בפליטת %PE מנורמלת כדי לתקן שונות בין בדיקות שבוצעו בתנאים שונים (כלומר, ניסוי שבוצע בימים שונים, הבדלי אצווה).
  2. השתמש בנוסחה זו כדי לחשב פליטת % PE מנורמלת:
    %PE Efflux מנורמל = ערך פליטה של %PE (FLU) / ערך פליטת ייחוס חיובי %PE efflux FLU.
  3. השתמש בפלזמה אנושית זהה מתורמים בריאים עם פרופיל שומנים תקין כבקרת ייחוס. אין צורך לחשב את סך כל ה-FLU/באר הסופרנטנט מכיוון שערך זה זהה הן עבור הדגימה והן עבור ההפניה.
  4. עבור דגימות משולשות, הדבק את הנתונים הגולמיים שהתקבלו בשלב 3.1.6 בגיליון האלקטרוני (טבלה משלימה 1). עבור דוגמאות כפולות, הדבק את הנתונים הגולמיים שהתקבלו בשלב 3.1.6 בגיליון האלקטרוני (טבלה משלימה 2).

4. עקומה סטנדרטית LC-CSH

הערה: העקומה הסטנדרטית LC-CSH משמשת לחישוב כמות האות הפלואורסצנטי PE הקיים בכמות של LC-CSH לבאר. בדרך כלל, נעשה שימוש ב-50 מיקרוליטר של LC-CSH/באר. ניתן להשתמש בערך זה כדי לחשב את הפליטה %PE ל-HDL בדגימה מנורמלת ל-Total FLU (ראה שלב 3.2.1) הקיימת בתערובת התגובה.

%PE efflux = ((יחידות פלואורסצנטיות של דגימה סופרנטנטית [FLU] - שפעת מי מלח סופרנטנטית)/(סה"כ LC-CSH FLU)) x 100.

דילול סדרתי של LC-CSH
1. הכן דילולים פי 10 ופי 100 של LC-CSH במלאי (כפי שהוכן בשלבים 1.1.1-1.3.3):
  דילול פי 10: 100 μL של LC-CSH + 900 μL של 1% Triton X-100
  דילול פי 100: 100 μL של LC-CSH מדולל פי 10 + 900 μL של 1% Triton X-100
2. הוצא דגימות משולשות של LC-CSH מדולל פי 10 ו-100 לתוך צלחת דגירה של 96 בארות עבור העקומה הסטנדרטית (ראה איור 3).
3. הוסף נפח מספיק של 1% טריטון X-100 לבארות המכילות LC-CSH כדי להביא לנפח סופי של 200 מיקרוליטר (ראה טבלה 1).
המסה של LC-CSH למדידת פלואורסצנטיות
1. אוטמים את הצלחת בניילון דבק ודוגרים למשך שעה ב-24 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-1200 סל"ד. צלחת צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ב-935 × גרם. הסר בזהירות את סרט הדבק.
2. בעזרת פיפטה מרובת בארות, מערבבים דגימות על ידי פיפטה למעלה ולמטה פי 2-3. העבירו 100 מיקרוליטר של LC-CSH לבאר לצלחת פוליסטירן שחורה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות למדידות פלואורסצנטיות, באמצעות פיפטה מרובת בארות.
3. הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של 1% טריטון-X בטמפרטורת החדר לכל באר, באמצעות פיפטה מרובת בארות. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פי 2-3.
4. מדוד פלואורסצנטיות עם פלואורמטר (עירור 540 ננומטר/פליטה של 600 ננומטר).
5. הדבק את ערכי הקרינה הנמדדים באמצעות הפלואוריומטר בתבנית ניתוח רגרסיה ליניארית בטבלה משלימה 1 כפי שמתואר בקובץ המשלים 3. הריכוזים הסופיים של LC-CSH בלוחית מדידת העקומה הסטנדרטית מוצגים בטבלה 2.

figure-protocol-2
איור 3: לוח עבור עקומה סטנדרטית LC-CSCH. LRh-PE-מסומן בדילול סדרתי LC-CSH מחולק לצלחת של 96 בארות, כפי שמוצג. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ריכוז סופי	מדולל פי 10	מדולל פי 100	1% טריטון X-100	סך
LC-CSH	LC-CSH	LC-CSH	מחטא	נפח
(מיקרוליטר / באר)	(מיקרוליטר)	(מיקרוליטר)	(מיקרוליטר)	(מיקרוליטר)
10	100	0	100	200
5	50	0	150	200
2.5	25	0	175	200
1	0	100	100	200
0.5	0	50	150	200
0.25	0	25	175	200

טבלה 1: נפחי ריאגנטים שנוספו לבארות של צלחת דגירה עבור עקומה סטנדרטית LC-CSH.

מסיס	מלוחים	סך	נוסף	נמדד
LC-CSH	נפח	נפח	LC-CSH	LC-CSH
(מיקרוליטר)	(מיקרוליטר)	(מיקרוליטר)	(מיקרוליטר / באר)	(מיקרוליטר / באר)
100	100	200	10	5
100	100	200	5	2.5
100	100	200	2.5	1
100	100	200	1	0.5
100	100	200	0.5	0.25
100	100	200	0.25	0.125

טבלה 2: נפחי ריאגנטים שנוספו לבארות של לוחית המדידה עבור העקומה הסטנדרטית LC-CSH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות אנליטיות

כפי שצוין לעיל, ניתן לשנות ניתוחי דגימות HDL-SPE עבור יישומים שונים, כפי שמודגם להלן. לפני ביצוע מחקרים עם דגימות מחקר, מבוצעות תחילה בדיקות אימות עקומה סטנדרטית LC-CSH, שחזור וריכוז פלזמה על מנת לשלוט בטכניקות הנדרשות. ראשית, בצע את ניתוח העקומה הסטנדרטית LC-CSH כדי להעריך את איכות תכשירי LC-CSH. לאחר מכן, בצע את בדיקת השחזור. לבסוף, יש לבצע את בדיקת מינון הפלזמה כדי לאשר ליניאריות. לאחר שנקבע CV% ≤ 5 במבחני שחזור, ניתן לבצע מח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDL-C הוא גורם מפתח המשמש להערכה קלינית של הסיכון למחלות לב וכלי דם (CVD) ולכן הצורך בהורדת שומנים או טיפולים מונעים פוטנציאליים אחרים¹. הוכח כי תפקודו של HDL בפליטת כולסטרול תאי במבחנה הוא מנבא טוב עוד יותר למחלות לב וכלי דם מאשר HDL-C⁷. למרבה הצער, בדיקה תאית זו אינה ניתנת להמרה לבדיקת מעבדה קלינית בעלת תפוקה גבוהה לבדיקות אבחון שגרתיות בשל דרישת הזמן הרב לביצוע הבדיקה והצורך בתרבית תאים. עם זאת, בדיקת CEC מבוססת תאים עדיין שימוש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פטנטים: US20220178953A1; WO2020185598A1 (א.ב.נ., מ.ס., א.ט.ר.)

מסאקי סאטו מועסק על ידי Eiken Chemical Co., Ltd.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך [בחלקו] על ידי תוכנית המחקר התוך-כיתתי של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). תרומותיהם של מחברי ה-NIH נחשבות ליצירות של ממשלת ארצות הברית. הממצאים והמסקנות המוצגים במאמר זה הם של המחבר/ים ואינם משקפים בהכרח את העמדות של ה-NIH או של משרד הבריאות ושירותי האנוש של ארה"ב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1,2-דימיריסטויל-sn-גליצרו-3-פוספוכולין	אוונטי ריסרץ'	850345	14:0 PC (DMPC) כלורופורם סולויטון
1,2-דיולואיל-sn-גליצרו-3-פוספואתנולאמין-N- (ליסאמין רודמין B סולפוניל) (מלח אמוניום)	אוונטי ריסרץ'	810150-C	תמיסת כלורופורם LRh-PE
סרט דביק	Applied Biosystems	4306311	סרט דבק שקוף MicroAmp
סרט טפלון בצפיפות גבוהה של Bay Corporation 1/2 אינץ' x 520	פתרונות בדיקות רפואיות	86732
צינורות זכוכית בורוסיליקט בגודל 20 מ"מ וחד; 150 מ"מ	פישר סיינטיפיק	14-961-33
צנטריפוגה	תרמו-סיינטיפיק	סדרת סורוול X Pro
כלורופורם	סיגמא-אלדריץ'	366927	מתאים ל-HPLC, ≥ 99.8%
אבקת כולסטרול	סיגמא-אלדריץ'	C8667	3β-הידרוקסית-5-כולסטן, 5-כולסטן-3&בטא;-אול
נייר שקילה מזכוכית	קול-פאלמר	UX-01338-02	לטיפול ב-LC-CSH
לוח דגירה	USA Scientific	1402-9700	TempPlate 96 Semi Farm Semi skirt 0.2mL לוחות PCR
חומר הסרת שומנים (LRA)	סופלקו	13358-U	LC-CSH
לוח מדידה	גריינר ביו-וואן	655076	מיקרופלטה, PS, 96-באר, F-BOTTOM (באר הארובה), שחור; פלוטראק, קישור תרופתית
מיקרוסופט אקסל	Microsoft 365 MSO	גרסה 2507
קצות פיפט MultiFlex	פישר סיינטיפיק	50-550-206	ל-aspiraitng supernatant במהלך שטיפות LC-CSH
קורא לוחות רב-תוויות	פרקין אלמר	1420-050	מונה רב-תוויות Victor3 Wallac1420
סליין רגיל	איכות ביולוגית	114-055-101	לשימושים מרובים
פאראפילם	קול-פאלמר	HS23452	לכסות את החלק העליון של צינור הזכוכית במהלך מערבולת
בקבוקי ארלןמאייר פוליקבונט	פישר סיינטיפיק	10-041-8	עבור תמיסה של 10% טריטון-X
פלזמה אנושית מאוגדת (נגזר בדם) לי הפארין)	Innovative Research Inc	IPLAWBLIH	פלזמה ייחוס, בקרה חיובית (PC)
מגברי סרפקט X 100	תרמו-סיינטיפיק	28314	10% טריטון X-100, מדלל פי 10 עם מים מזוקקים
תרמומיקסר	אפנדורף	5382000023	תרמומיקסר C עם תרמובלוק 96 בארות
תרמומיקסר סמארטבלוק	אפנדורף	5306000006	SmartBlock עם 96 בארות
פיפטות העברה (3 מ"ל, פלקון)	פישר סיינטיפיק	13-711-9CM	להסרת בועות מהחלק העליון של הבאר
מערבל מערבולת	דייגר	3030A	מחזיק סיכום לצינור זכוכית למעלה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grundy, S. M., et al. 2018 AHA/ACC/AACVPR/AAPA/ABC/ACPM/ADA/AGS/APHA/ASPC/NLA/PCNA guideline on the management of blood cholesterol: A report of the american college of cardiology/american heart association task force on clinical practice guidelines. Circulation. 139 (25), e1082-e1143 (2019).
Zhong, S., et al. Increased coronary heart disease in Japanese-American men with mutation in the cholesteryl ester transfer protein gene despite increased HDL levels. J Clin Invest. 97 (12), 2917-2923 (1996).
Madsen, C. M., Varbo, A., Nordestgaard, B. G. Extreme high high-density lipoprotein cholesterol is paradoxically associated with high mortality in men and women: Two prospective cohort studies. Eur Heart J. 38 (32), 2478-2486 (2017).
Ko, D. T., et al. High-density lipoprotein cholesterol and cause-specific mortality in individuals without previous cardiovascular conditions: The CANHEART study. J Am Coll Cardiol. 68 (19), 2073-2083 (2016).
Liu, C., et al. Cholesterol efflux capacity is an independent predictor of all-cause and cardiovascular mortality in patients with coronary artery disease: A prospective cohort study. Atherosclerosis. 249, 116-124 (2016).
Rosenson, R. S., et al. Dysfunctional HDL and atherosclerotic cardiovascular disease. Nat Rev Cardiol. 13 (1), 48-60 (2016).
Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
Rohatgi, A., et al. HDL cholesterol efflux capacity and incident cardiovascular events. N Engl J Med. 371 (25), 2383-2393 (2014).
Sankaranarayanan, S., et al. A sensitive assay for ABCA1-mediated cholesterol efflux using bodipy-cholesterol. Journal of Lipid Research. 52 (12), 2332-2340 (2011).
Schachtl-Riess, J. F., et al. Lysis reagents, cell numbers, and calculation method influence high-throughput measurement of HDL-mediated cholesterol efflux capacity. J Lipid Res. 62, 100125(2021).
Harada, A., et al. Cholesterol uptake capacity: A new measure of HDL functionality for coronary risk assessment. J Appl Lab Med. 2 (2), 186-200 (2017).
Horiuchi, Y., et al. Validation and application of a novel cholesterol efflux assay using immobilized liposomes as a substitute for cultured cells. Biosci Rep. 38 (2), BSR20180144(2018).
Lorkowski, S. W., et al. A novel cell-free fluorescent assay for HDL function: Low apolipoprotein a1 exchange rate associated with increased incident cardiovascular events. J Appl Lab Med. 5 (3), 544-557 (2020).
Denimal, D. Rethinking 'good cholesterol' for cardiovascular risk stratification. QJM: An Int J Med. 117 (4), 243-245 (2023).
Borja, M. S., et al. HDL-apolipoprotein A-I exchange is independently associated with cholesterol efflux capacity. J Lipid Res. 56 (10), 2002-2009 (2015).
Borja, M. S., et al. HDL-apoa-I exchange: Rapid detection and association with atherosclerosis. PLoS One. 8 (8), e71541(2013).
Remaley, A. T., et al. Apolipoprotein specificity for lipid efflux by the human ABCAI transporter. Biochem Biophys Res Commun. 280 (3), 818-823 (2001).
Sato, M., et al. Cell-free, high-density lipoprotein-specific phospholipid efflux assay predicts incident cardiovascular disease. J Clin Invest. 133 (18), e165370(2023).
Neufeld, E. B., et al. ApoA-I-mediated lipoprotein remodeling monitored with a fluorescent phospholipid. Biology (Basel). 8 (3), 53(2019).
Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. J Lipid Res. 57 (4), 674-686 (2016).
Phillips, M. C. Molecular mechanisms of cellular cholesterol efflux. J Biol Chem. 289 (35), 24020-24029 (2014).
Oram, J. F., Yokoyama, S. Apolipoprotein-mediated removal of cellular cholesterol and phospholipids. J Lipid Res. 37 (12), 2473-2491 (1996).
Phillips, M. C. Is ABCA1 a lipid transfer protein. Journal of Lipid Research. 59 (5), 749-763 (2018).
Smith, J. D., et al. Abca1 mediates concurrent cholesterol and phospholipid efflux to apolipoprotein A-I. J Lipid Res. 45 (4), 635-644 (2004).
Ossoli, A., et al. Lipoprotein X causes renal disease in LCAT deficiency. PLoS One. 11 (2), e0150083(2016).
Martínez-Beamonte, R., et al. Effect of extra virgin olive oil high in bioactive compounds on atherosclerosis in apoe-deficient mice. Mol Nutr Food Res. , (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HDL A I

בדיקת פליטת פוספוליפידים ספציפית לליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים