הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי סמנים ביולוגיים מולקולריים הקשורים למערכת החיסון בהפרעת הספקטרום האוטיסטי באמצעות פרוטאומיקה בלתי תלויה בנתונים ולמידת מכונה

565 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68949

⸱

26 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Hunan Normal University, 2Changsha Maternal and Child Health Hospital, Affiliated to Hunan Normal University, 3Changsha Central Hospital, Affiliated to University of South China, 4Shanghai Bioprofile Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש בספקטרומטריית מסה בלתי תלויה בנתונים ולמידת מכונה שזיהה שמונה חלבונים הקשורים למערכת החיסון כסמנים ביולוגיים מדויקים לאבחון מוקדם של הפרעת הספקטרום האוטיסטי, שאומתו על ידי בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים.

תקציר

מחקר זה מציג פרוטוקול הניתן לשחזור לזיהוי סמנים ביולוגיים של חלבון בסרום הקשורים להפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) באמצעות ספקטרומטריית מסה של רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA) בשילוב עם למידת מכונה (ML). DIA מאפשר פרופיל בלתי מוטה ברזולוציה גבוהה של פרוטאום הסרום, כולל חלבונים בשפע נמוך, תוך הבטחת שחזור על פני דגימות. גישות ML יושמו לבחירת לוחות חלבון אינפורמטיביים אבחנתיים ושיפור חוסן המודל. הניתוח כלל סרום מ-99 ילדים עם ASD ו-70 בקרות תואמות גיל. חלבונים בשפע גבוה התרוקנו, פפטידים הוכנו באמצעות הליכי עיכול ופיצול סטנדרטיים, ו-DIA בוצע על ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה. עיבוד וכימות הנתונים זיהו חלבונים בעלי ביטוי דיפרנציאלי, שעברו ניתוח העשרה פונקציונלית. שמונה חלבונים הקשורים למערכת החיסון התגלו כמועמדים חזקים לפיתוח סמנים ביולוגיים. מודל רגרסיה לוגיסטית שהוכשר על חלבונים אלה השיג דיוק של 95.27%, ערך קאפה של 0.9025 ו-AUC של 1.000 באימות צולב. ממצאים אלה מדגימים את הפוטנציאל של פרוטאומיקה מבוססת DIA, בשילוב עם למידת מכונה, כמסגרת חזקה לגילוי סמנים ביולוגיים ב-ASD ולהסתגלות במחקר קליני רחב יותר.

מבוא

הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) היא קבוצה של הפרעות נוירו-התפתחותיות מוקדמות המאופיינות בהטרוגניות באטיולוגיה ובהצגה קלינית. מאפייני הליבה כוללים ליקויים מתמשכים בתקשורת חברתית ובאינטראקציה, כמו גם התנהגויות, תחומי עניין או פעילויות מוגבלים וחוזרים על עצמם. בארצות הברית, השכיחות היא כ-2.3% בקרב ילדים בני 8 וכ-2.2% בקרב מבוגרים, מה שמדגיש את השפעתה על בריאות הציבור 1,2,3,4. גורמי הסיכון מגוונים, כולל נטיות גנטיות, חוסר ויסות חיסוני וחשיפות סביבתיות טרום לידתיות 5,6,7. אבחון והתערבות מוקדמים יכולים לשפר משמעותית את התוצאות ההתפתחותיות, מה שהופך את זיהוי הסמנים הביולוגיים האובייקטיביים והאמינים למוקד עיקרי של מחקר ASD 8,9,10. פרוטוקול זה מתבסס על עבודתנו שפורסמה בעבר ביישום פרוטאומיקה ולמידת מכונה של רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA) כדי לזהות חלבונים הקשורים למערכת החיסון כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים לאבחון מוקדם של ASD11.

למרות מאמצים נרחבים, לא קיימים כיום סמנים ביולוגיים ספציפיים ומאומתים באופן אוניברסלי לאבחון קליני של ASD12. המועמדים המוצעים - כגון שינויים במיקרוביום המעי13, אינטרלוקין-6 מוגבר (IL-6)14, שינויים בגורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF)15 וסמני עקה חמצונית כמו גלוטתיון16 - נותרו ראשוניים וחסרי יכולת שחזור לשימוש קליני. פרוטאומיקה התגלתה כגישה מבטיחה לזיהוי חתימות מולקולריות ספציפיות למחלה, ומספר מחקרים חקרו דגימות ביולוגיות שונות (דם, רוק, שתן, PBMCs) עבור חלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי 8,17,18,19,20,21,22 . לדוגמה, Bao et al. הראו כי חלבונים דלקתיים שזוהו על ידי פרוטאומיקה של Olink עשויים לסייע באבחון מוקדם של ASD (17), בעוד שמחקרים אחרים מצביעים על כך שמסלולים פרוטאומיים ומטבוליים משותפים עשויים להניב סמנים ביולוגיים חזקים למרות ההטרוגניות הגנטית של ASD23.

ספקטרומטריית מסה DIA זכתה לתשומת לב הולכת וגוברת בזכות פרופיל החלבון המקיף והניתן לשחזור שלה. בניגוד לרכישה תלוית נתונים מסורתית (DDA), המפצלת באופן סלקטיבי את היונים האינטנסיביים ביותר, DIA מפצלת את כל היונים הקודמים על פני חלונות m/z מוגדרים מראש. זה מספק כיסוי פרוטאום עמוק יותר ויכולת שחזור משופרת על פני קבוצות גדולות, יתרון מרכזי להשוואות קליניות14. מחקרי השוואה מראים ש-DIA מזהה יותר פפטידים הניתנים לכימות מאשר DDA, במיוחד עבור חלבונים בשפע נמוך, עם שונות נמוכה יותר בין ריצות14.

בהתבסס על התקדמות זו, יישמנו ניתוח פרוטאומי מבוסס DIA על דגימות סרום מ-99 ילדים עם ASD ו-70 בקרות, לאחר דלדול חלבונים בשפע גבוה. הממצאים שלנו מדגישים את הפוטנציאל של חלבונים הקשורים למערכת החיסון כסמנים מולקולריים לאבחון מוקדם של ASD ומדגימים את הערך של פרוטאומיקה מבוססת DIA בגילוי סמנים ביולוגיים בשילוב עם מתודולוגיה קפדנית11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול נערך בהתאם להצהרת הלסינקי והפרוטוקול אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית בבית החולים לבריאות האם והילד בצ'אנגשה; התקבלה הסכמה מדעת מהנבדקים.

1. זיהוי ילדים עם אוטיזם עם DSM-5

  1. איסוף היסטוריה רפואית ומידע רקע
    1. היסטוריה התפתחותית
      1. לאסוף מידע על ההתפתחות המוקדמת של המטופל, כולל התקדמות שפה, מיומנויות חברתיות ומוטוריות.
      2. שימו לב לכל עיכוב התפתחותי או חריגות (למשל, עיכוב שפה, קשיים באינטראקציה חברתית).
    2. היסטוריה משפחתית
      1. שאל על כל היסטוריה משפחתית של אוטיזם או הפרעות נוירו-התפתחותיות אחרות.
    3. רמה פונקציונלית נוכחית
      1. להעריך את ביצועי המטופל בחיי היומיום, כולל למידה, עבודה, אינטראקציות חברתיות וכישורי חיים עצמאיים.
  2. שימוש בקריטריוני אבחון DSM-5
    1. ליקויים מתמשכים בתקשורת חברתית ובאינטראקציה חברתית
      1. ודא שלפחות שניים משלושת הקריטריונים הבאים מתקיימים:
        1. ליקויים בהדדיות חברתית-רגשית - חפשו היעדר קשר עין נורמלי, הבעות פנים או שפת גוף וקושי ביצירת חברויות או מערכות יחסים תואמות גיל.
        2. ליקויים בהתנהגויות תקשורתיות לא מילוליות - חפש אתגרים בשימוש במחוות, הבעות פנים או טון דיבור כדי להעביר רגשות והבנה מוגבלת של רמזים לא מילוליים מאחרים.
        3. ליקויים בפיתוח, שימור והבנה של מערכות יחסים - חפשו קושי להסתגל להקשרים חברתיים שונים וחוסר עניין בבני גילם או חוסר יכולת לעסוק במשחק דמיון.
    2. דפוסי התנהגות, תחומי עניין או פעילויות מוגבלים וחוזרים על עצמם
      1. ודא שלפחות שניים מארבעת הקריטריונים הבאים מתקיימים:
        1. תנועות מוטוריות סטריאוטיפיות או חוזרות על עצמן (למשל, נפנוף ידיים, נדנוד גוף או שימוש חוזר בחפץ).
        2. התעקשות על זהות או דפוסי התנהגות טקסיים - חפשו מצוקה קיצונית בגלל שינויים קלים בשגרה.
        3. תחומי עניין מוגבלים ומקובעים מאוד - חפשו התמקדות אינטנסיבית באופן חריג בנושאים או פעילויות ספציפיות.
        4. תגובתיות יתר או היפו-תגובתיות לקלט חושי - חפש תגובות לא טיפוסיות לגירויים חושיים כגון צלילים, אורות או מגע.
  3. הערכת הופעת התסמינים וחומרתם
    1. תזמון התסמינים - מאשר שהתסמינים היו קיימים בילדות המוקדמת (בדרך כלל לפני גיל 3), גם אם הם הופכים לגלויים יותר מאוחר יותר.
    2. השפעת התסמינים - אשר שהתסמינים גורמים לפגיעה משמעותית בתחומי תפקוד חברתיים, תעסוקתיים או חשובים אחרים.
    3. דרגות חומרה
      הערה: על פי DSM-5, חומרת ASD מסווגת לשלוש רמות (טבלה משלימה S1).
      1. סווג כרמה 1 אם המטופל זקוק לתמיכה קלה בלבד.
      2. סווג כרמה 2 אם המטופל זקוק לתמיכה משמעותית (בינונית).
      3. סווג כדרגה 3 אם המטופל זקוק לתמיכה משמעותית מאוד (חמורה).
  4. אי הכללה של סיבות פוטנציאליות אחרות
    1. בדיקה רפואית ערכו הערכות רפואיות נחוצות (למשל, בדיקות גנטיות, הדמיית מוח) כדי לשלול מצבים אחרים שעלולים לגרום לתסמינים דומים (למשל, תסמונות גנטיות, ליקויי שמיעה, מוגבלות שכלית).
    2. הערכת תחלואה נלווית: העריכו את נוכחותם של מצבים נלווים (למשל, הפרעת קשב וריכוז, הפרעות חרדה, דיכאון, אפילפסיה וכו').

2. הכנת מדגם לניתוח ספקטרומטריית מסה DIA

  1. ציות אתי ואיסוף דגימות
    1. קבל הסכמה מדעת מההורים או האפוטרופוסים החוקיים של ילדים בגילאי 3-7 שנים המאובחנים עם הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD).
    2. לסווג את המטופלים לדרגות חומרה 1 עד 3 על פי קריטריוני האבחון המפורטים ב-DSM-5 האמריקאי לאוטיזם (שלב 1.3.3).
    3. אסוף דגימות סרום מהמשתתפים. ודא שכל הדגימות מעובדות תוך ארבע שעות מאיסוף הדם כדי למנוע פירוק חלבון. שמור דגימות על קרח במהלך העיבוד.
  2. הסרת חלבונים בשפע גבוה
    1. השתמש בערכה מסחרית כדי לרוקן חלבונים בשפע גבוה מ-60 מיקרוליטר סרום לדגימה, בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, אזנו את עמודת הדלדול עם מאגר קשירה, טענו את דגימת הסרום ואפשרו לה לעבור דרך העמודה בזרימת כוח הכבידה. אסוף את הזרימה, המכילה את חלק החלבון בשפע נמוך.
    2. מדוד את ריכוז החלבון הכולל באמצעות בדיקת BCA. לנרמל את כל הדגימות לריכוז סופי של 0.5-1.0 מיקרוגרם/מיקרוליטר לפני העיכול בתמיסה. ודא שכל דגימה מכילה לפחות 100 מיקרוגרם חלבון לניתוח שלאחר מכן.
  3. עיכול חלבונים
    הערה: עיכול החלבון בוצע באמצעות שיטת FASP שתוארה על ידי Wisniewski et al.24.
    1. הוסף את חומר הניקוי, דיתיותרייטול (DTT) ויודואצטמיד (IAA) במאגר UA (מאגר אוריאה) כדי לחסום ציסטאין מופחת.
    2. עכל את תרחיף החלבון עם טריפסין ביחס של 50:1 למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
  4. התפלת פפטידים, ניקוי ופיצול פאזה הפוכה ב-pH גבוה
    1. צנטריפוגה את תערובות הפפטידים ב-16,000 × גרם למשך 15 דקות במעלות-צלזיוס כדי להסיר פסולת בלתי מסיסה.
    2. העבירו את הסופרנטנט (המכיל פפטידים מעוכלים) לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בעל קשירה נמוכה כדי למזער את הפסדי הספיגה.
    3. . הכן מיקרו-עמודים C18 (ארוזים בבית עם שרף C18) על ידי מיזוג מוקדם עם 100% מתנול (20 מיקרוליטר) ואיזון עם 0.1% (v/v) חומצה טריפלואורואצטית (TFA) במים (מאגר A; 20 מיקרוליטר).
    4. טען את דגימת הפפטיד על המיקרו-עמוד. שטפו את העמוד עם 20 מיקרוליטר של מאגר A כדי להסיר מלחים, חומרי ניקוי ומזהמים לא פפטידיים.
    5. מסירים פפטידים מטוהרים עם 20 מיקרוליטר של 80% אצטוניטריל המכילים 0.1% TFA.
    6. יבש את הפפטידים המנופחים בוואקום באמצעות רכז ואקום צנטריפוגלי. אחסן פפטידים מיובשים בטמפרטורה של -8 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
    7. יש להרכיב מחדש פפטידים מיובשים ב-0.1% חומצה פורמית לפני ניתוח LC-MS/MS.
    8. 2.4.8. לכמת את ריכוז הפפטידים על ידי מדידת ספיגה ב-280 ננומטר (OD280) באמצעות ספקטרופוטומטר, תוך התחשבות בתרומות משאריות טריפטופן וטירוזין לכימות מדויק.
      כדי לפצל תערובות פפטידים באמצעות HPLC פאזה הפוכה עם pH גבוה, השתמש בעמודת C18 (3.5 מיקרומטר, 2.1 x 150 מ"מ) במערכת HPLC עם קצב זרימה של 0.3 מ"ל לדקה, שלב נייד A: 10 מ"מ פורמט אמוניום במים, pH 10 (מותאם עם אמוניום הידרוקסיד), שלב נייד B: 10 מ"מ פורמט אמוניום ב-90% אצטוניטריל, pH 10. בצע שיפוע כדי לאסוף 60 שברים לדגימה במשך ~60 דקות.
    9. שלב כל שבר שלישי כדי להפחית את היתירות, וכתוצאה מכך 20 שברים מאוגדים לכל דגימה. יבש כל שבר מאוגד תחת ואקום לניתוח במורד הזרם.
      הערה: שברי הפפטיד המתקבלים מוכנים כעת לניתוח ננו-LC-MS/MS.

3. הגשה לניתוח ספקטרומטריית מסה DIA

  1. ניתוח ספקטרומטריית מסה DIA
    1. העלה את פפטיד הרכישה תלוית הנתונים (DDA) משבר ה-HPRP עם פפטידים סטנדרטיים של iRT והפרד אותם באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (RP-HPLC) בשלב הפוך על מערכת ננו-HPLC עם עמודה (75 מיקרומטר x 150 מ"מ; 2 מיקרומטר חרוזי C18, 120 Å) בקצב זרימה של 300 ננוטר/דקה עם שלב נייד A: 0.1% חומצה פורמית במים, שלב B נייד: 0.1% חומצה פורמית ב-95% אצטוניטריל.
    2. מסלק את הפפטידים במשך 60 דקות עם שיפוע ליניארי של מאגר B מוגדר כדלקמן: 0 - 2 דקות, שיפוע ליניארי מ-2% עד 5% מאגר B; 2 - 42 דקות, שיפוע ליניארי בין 5% ל -20% מאגר B; 42 - 50 דקות, שיפוע ליניארי בין 20% ל -35% מאגר B; 50 - 52 דקות, שיפוע ליניארי מ-35% ל-90% מאגר B; 52 - 60 דקות, מאגר B נשמר על 90%.
    3. נתח את הפפטידים המנופחים בספקטרומטר המסה המוזכר. רכוש נתוני MS באמצעות שיטת top20 תלוית נתונים ובחירה דינמית של יוני המבשר הנפוצים ביותר מסריקת הסקר (350 - 1500 m/z) עבור פיצול HCD.
    4. הפעל את המכשיר כאשר מצב זיהוי פפטידים מופעל. השתמש במסת נעילה של 445.120025 Da כתקן הפנימי לכיול מסה. רכוש את סריקות MS המלאות ברזולוציה של 70,000 ב-m/z 200, ו-17,500 ב-m/z 200 עבור סריקת MS/MS. הגדר את זמן ההזרקה המרבי ל-50 אלפיות השנייה עבור MS ו-30 אלפיות השנייה עבור MS/MS, אנרגיית התנגשות מנורמלת ל-28, חלון הבידוד ל-1.6 Th, ומשך ההחרגה הדינמי ל-30 שניות.
  2. ניתוח LC-MS/MS עבור רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA)
    1. העלו את הפפטידים מכל דגימה עם iRT באופן שווה ובנפרד.
    2. בצע LC-MS/MS על ספקטרומטר מסה מרובע בשילוב עם מערכת ננו-HPLC. הגדר את תנאי LC באותו אופן כמו עבור שיטת DDA לעיל. בצע סריקת סקר מ-400 עד 1,200 m/z ברזולוציה של 60,000 עם יעד AGC של 3E6 וזמן הזרקה של 30 אלפיות השנייה. רכוש את סריקות DIA MS/MS ברזולוציה של 15,000 עם חלון בידוד של 20 m/z ועם יעד AGC של זמן הזרקה של 1E6 ו- 50 ms. הגדר את אנרגיית ההתנגשות המנורמלת ל-30.
    3. רשום את הספקטרום של סריקות MS ו-DIA מלאות בסוגי פרופיל וצנטרואידים, בהתאמה.
  3. חיפוש מסד נתונים ברצף
    1. נתח את נתוני DDA MS באמצעות תוכנת DIA2.
    2. חפש את נתוני הטרשת הנפוצה מול מסד הנתונים האנושי של UniProtKB (186,532 ערכים בסך הכל, הורד ב-10/2019), עם חלבונים המורכבים מ-11 רצפי פפטידים iRT.
    3. בחר טריפסין כאנזים העיכול. הגדר את שני אתרי המחשוף המקסימליים שהוחמצו ואת סובלנות המסה של 4.5 ppm עבור יונים קודמים ו-20 ppm עבור יוני שברים לחיפוש במסד נתונים. הגדר קרבמידומתילציה של ציסטאין כשינוי קבוע ואצטילציה של חלבון N-terminal וחמצון של מתיונין כשינויים משתנים לחיפוש במאגרי נתונים.
    4. סנן את תוצאות החיפוש של מסד הנתונים וייצא אותן עם שיעור גילוי שגוי של <1% (FDR) ברמות מותאמות לספקטרום פפטידים ורמות חלבון, בהתאמה.
  4. ביצוע עיבוד נתונים גולמיים
    1. ניתוח נתוני DIA MS נותחו באמצעות תוכנת DIA [34, 35] ליצירת ספרייה ספקטרלית מתוצאות החיפוש. השתמש בהגדרות ברירת המחדל עבור החיפוש וב- iRT הדינאמי לחיזוי זמן שמירה. ודא שתיקון ההפרעות עבור סריקת MS/MS מופעל.
    2. ייצא את התוצאות עם <1% FDR ברמת הפפטיד.

4. אנליזה דיפרנציאלית של חלבונים

  1. בצע בדיקת השערות באמצעות מבחן t של סטודנט בשילוב עם שינוי קיפול (FC) ב-http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=70.
    1. היכנס לפלטפורמת הענן ונווט לכלי ניתוח בדיקת השערות . העלה את קובץ נתוני כימות החלבון המעובד מראש (למשל, פורמט CSV או TXT).
    2. בהגדרות הפרמטרים, בחר מבחן t של סטודנט כשיטה הסטטיסטית וסף המובהקות בערך p < 0.05. הגדר את סף שינוי הקיפול כ-FC > 1.5 או FC < 1/1.5. לחץ על הפעל ניתוח והמתן ליצירת התוצאות.
    3. הורד את קובץ הפלט המכיל ערכי p, log2(FC) ומצב מובהקות עבור כל חלבון.
      הערה: גישה כפולה זו מאזנת בין מובהקות סטטיסטית לרלוונטיות ביולוגית, ומבטיחה זיהוי חזק של חלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEPs).

5. ניתוח נתיב אותות

  1. הדמיה של עלילת הר געש
    1. נווט אל הכלי ב-http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=63 ולאחר מכן, אל דף הכלי של עלילת הר הגעש .
      1. העלה את קובץ התוצאות של ניתוח DEP מסעיף 4.
      2. הגדר פרמטר הדמיה: ציר X: log2 (שינוי קיפול) - מציין את כיוון השינוי; ציר Y: -log10(p-value) - משקף מובהקות סטטיסטית; קידוד צבע: אדום : חלבונים מווסתים משמעותית (p < 0.05 ו- FC > 1.5); כחול : חלבונים מווסתים באופן משמעותי (p < 0.05 ו- FC < 0.667); אפור : חלבונים לא משמעותיים (p ≥ 0.05 או 1/1.5 ≤ FC ≤ 1.5).
      3. לחץ על צור תמונה והורד את התמונה ברזולוציה גבוהה (פורמט PDF/SVG) לפרסום.
  2. מפת חום היררכית של אשכולות
    1. נווט אל הכלי בכתובת http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=17
      1. גש לכלי מפת החום של האשכולות .
      2. העלה את מטריצת ביטוי ה- DEP המסוננת.
      3. הגדר את הפרמטרים הבאים: שיטת נורמליזציה: ציון Z בשורה כדי למנוע הבדלי קנה מידה; מדד מרחק: מרחק אוקלידי; שיטת אשכולות: אשכולות היררכיים מלאים של הצמדה; אופציונלי: אפשר אשכולות של עמודות ו/או שורות בהתאם לקיבוץ לדוגמה.
      4. נקישה הפעל כדי ליצור את מפת החום.
      5. הורד ושמור את מפת החום כתמונה מוכנה לפרסום.
        הערה: מפת החום מייצגת חזותית את הדמיון והסטייה של דפוסי ביטוי החלבון על פני דגימות.
  3. ניתוח הערות פונקציונליות והעשרה של GO
    1. התקן וטען חבילות R נדרשות:
      library(clusterProfiler)
      library(org. Hs.eg.db)
      ספריה(ggplot2)
    2. המרת מזהי חלבונים (למשל, Uniprot או סמלי גנים) למזהי Entrez:
      entrez_ids <- bitr(diff_proteins, fromType = "UNIPROT", toType = "ENTREZID", OrgDb = org. Hs.eg.db)
    3. ביצוע ניתוח העשרה GO:
      go_enrich <- enrichGO(gene = entrez_ids$ENTREZID, OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = "ENTREZID", ont = "BP")
    4. דמיין את התוצאות באמצעות תרשימי נקודות:
      1. dotplot(go_enrich, showCategory = 20)
        נוסחה:
        גורם עשיר = (a/b) / (c/d)
        איפה:
        a = מספר DEPs עם הערות למונח;
        b = המספר הכולל של DEPs;
        c = מספר חלבוני הרקע המבוארים למונח;
        d = המספר הכולל של חלבוני רקע.
  4. ניתוח הערות והעשרה של מסלול KEGG
    1. ביצוע ניתוח העשרה של KEGG:
      kegg_enrich <- enrichKEGG(גן = entrez_ids$ENTREZID, אורגניזם = "יש")
    2. דמיין את תוצאות מסלול KEGG:
      barplot(kegg_enrich, showCategory = 20)
    3. התאם אישית עלילות באמצעות ggplot2 לעיצוב פרסום.

6. סינון ראשוני של חלבונים באמצעות ניתוח עקומת ROC

  1. הכנת נתונים: טען את מערך הנתונים של הפרוטאומיקה המכיל את כל החלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEPs) שזוהו מהפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) וקבוצות הביקורת. ודא שמערך הנתונים כולל ערכי ביטוי חלבון עבור שתי הקבוצות, עם תוויות ברורות המציינות דגימות ASD ובקרה.
  2. בצע ניתוח עקומת ROC.
    1. השתמש בחבילת pROC ב-R כדי לבצע ניתוח עקומת מאפיין הפעלה של מקלט (ROC) עבור כל חלבון.
    2. העריכו את היכולת של כל חלבון להבחין בין קבוצת ASD לקבוצת הביקורת על ידי חישוב השטח מתחת לעקומה (AUC).
      AUC = 0.5: אין אפליה (שווה ערך למקרה אקראי).
      0.7 ≤ AUC < 0.8: אפליה מקובלת.
      0.8 ≤ AUC < 0.9: אפליה מצוינת.
      AUC ≥ 0.9: אפליה יוצאת דופן.
      הערה: ה-AUC מייצג את ההסתברות שלפרט שנבחר באקראי מקבוצת ASD יש רמת חלבון גבוהה יותר מאשר לפרט שנבחר באקראי מקבוצת הביקורת. AUC גבוה יותר מצביע על ביצועי אבחון טובים יותר, כאשר ערכים מעל 0.8 נחשבים בדרך כלל בעלי משמעות קלינית במחקרי סמנים ביולוגיים.
    3. רשום את ערכי ה-AUC עבור כל החלבונים.
  3. בחר סמנים ביולוגיים מועמדים.
    1. זהה חלבונים עם AUC גדול מ-0.7 כסמנים ביולוגיים מועמדים.
    2. ייצא את רשימת הסמנים הביולוגיים המועמדים לניתוח נוסף.
  4. הציגו את התוצאות באופן חזותי.
    1. השתמש בחבילת ggplot2 ב-R כדי ליצור הדמיות של עקומות ה-ROC עבור החלבונים בעלי הביצועים הטובים ביותר.
    2. כלול את ערכי AUC במקרא העלילה לצורך הבהרה.

7. סינון משני באמצעות יער אקראי

  1. הכן נתוני קלט.
    1. השתמש ברשימת הסמנים הביולוגיים המועמדים שהתקבלו מניתוח ROC כקלט לניתוח יער אקראי.
    2. ודא שמערך הנתונים מעוצב כראוי, עם שורות המייצגות דגימות ועמודות המייצגות ערכי ביטוי חלבון.
  2. תרגול מודל היער האקראי.
    1. החל את אלגוריתם היער האקראי באמצעות חבילת randomForest ב- R.
    2. הגדר את מספר העצים (ntree) ל-500 ואת מספר המשתנים שנדגמו באופן אקראי בכל פיצול (mtry) לשורש הריבועי של המספר הכולל של התכונות.
    3. הערך את חשיבות התכונה באמצעות מדד MeanDecreasePrecision, המודד את הירידה ברמת הדיוק של המודל בעת הסרת תכונה ספציפית.
    4. תרגול מודל יער אקראי באמצעות חבילת randomForest ב-R:
      R. library(randomForest)
      # דוגמה: חיזוי קבוצה (למשל, ASD לעומת ביקורת) באמצעות רמות חלבון
      rf_model <- randomForest(x = protein_data,
      y = as.factor(קבוצה),
      importance = TRUE, # נדרש לחישוב חשיבות תכונה
      ntree = 500) # מספר עצים
    5. חלץ מדדי חשיבות תכונה באמצעות הפונקציה significance():
      ר. importance_scores <- חשיבות(rf_model)
    6. אחזר את ערכי MeanDecreaseAccuracy ומיין אותם בסדר יורד:
      R. mean_dec_acc <- importance_scores[ , "MeanDecreaseAccuracy"]
      importance_rank <- מיון (mean_dec_acc, יורד = TRUE)
    7. דמיין את חשיבות התכונה באמצעות הפונקציה המובנית varImpPlot():
      R. varImpPlot(rf_model, main = "חשיבות תכונה (ירידה ממוצעת ברמת הדיוק)")
      הערה: המדד MeanDecreaseAccuracy משקף עד כמה כל תכונה חיונית לביצועי החיזוי של המודל. ירידה גדולה ברמת הדיוק בעת ההסרה מעידה על חשיבות גבוהה. גישה זו שימושית במיוחד לגילוי סמנים ביולוגיים, מכיוון שהיא עוזרת לתעדף חלבונים או גנים בעלי כוח ההבחנה החזק ביותר בין קבוצות.
    8. ייצא את ציוני החשיבות לדיווח או לניתוח במורד הזרם:
      R. importance_table <- data.frame(
      תכונה = שמות(importance_rank),
      MeanReductionAccuracy = importance_rank
      )
      write.csv(importance_table, "feature_importance.csv", row.names = FALSE)
    9. דרג את החלבונים על סמך ציוני MeanDecreaseAccuracy שלהם.
    10. בחר את 15 החלבונים המובילים עם ציוני MeanDecreaseAccuracy הגבוהים ביותר כתכונות המשמעותיות ביותר למידול הבא.
    11. ייצא את רשימת החלבונים הללו לאימות נוסף.
      הערה: לחלבונים עם ערכי MeanDecreaseAccuracy נמוכים עשויה להיות השפעה מינימלית על ביצועי המודל אם יוסרו.
    12. הדגישו את הרלוונטיות הביולוגית של החלבונים שנבחרו, במיוחד אלה הקשורים לתפקודי מערכת החיסון או למסלולים המעורבים ב-ASD.

8. שלב תוצאות לבחירת הסמן הביולוגי הסופי.

הערה: ודא ש-R מותקן עם החבילות הבאות: pROC, randomForest ו-ggplot2. ודא שמערך הנתונים של הפרוטאומיקה מעובד מראש ומנורמל לפני הניתוח. שמור את רשימות הסמנים הביולוגיים המועמדים ותרשימי ההדמיה כקבצים נפרדים לעיון.

  1. שלב ממצאים.
    1. הצליב את התוצאות מניתוח ROC ובדיקת יער אקראית כדי לזהות חלבונים חופפים.
    2. תעדוף חלבונים המופיעים בשני הניתוחים כסמנים ביולוגיים מועמדים אמינים ביותר.
    3. בצע שלבי אימות נוספים, כגון אימות צולב (LOOCV), כדי לאשר את החוסן של הסמנים הביולוגיים שנבחרו.
    4. השתמש במודלים של רגרסיה לוגיסטית כדי להעריך את דיוק החיזוי של מערך הסמנים הביולוגיים המשולב.
    5. צור עקומות ROC ועלילות אחזור מדויקות עבור הקבוצה הסופית של סמנים ביולוגיים באמצעות חבילת ggplot2.
    6. כלול מדדים כגון AUC וערכי זיכרון מדויקים כדי להדגים את פוטנציאל האבחון של הסמנים הביולוגיים שנבחרו.

9. בחירת תכונה דו-כיוונית

  1. הכן נתונים והגדר את המודל.
    1. טען את מערך הנתונים המכיל ערכי ביטוי חלבון ותוויות מתאימות (למשל, ASD לעומת בקרה). ודא שמערך הנתונים מעובד מראש ומנורמל.
    2. הגדר את המודל הראשוני: השתמש במודל ליניארי כללי (GLM) עם משפחה בינומית לסיווג.
    3. השתמש ב-AIC כמדד הערכה להשוואת מודלים במהלך בחירת התכונה.
  2. בצע בחירת תכונה קדימה.
    1. התחל עם מודל ריק המכיל רק את מונח היירוט.
    2. הוסף תכונה אחת בכל פעם בהתבסס על ההפחתה הגדולה ביותר ב- AIC.
    3. רשום את ערך ה- AIC לאחר כל הוספה. עצור כאשר לא נצפתה ירידה נוספת ב-AIC.
  3. ביצוע בחירת תכונה לאחור.
    1. תרגול מודל באמצעות כל התכונות הזמינות.
    2. הסר תכונה אחת בכל פעם בהתבסס על הגידול הקטן ביותר ב- AIC.
    3. רשום את ערך ה- AIC לאחר כל הסרה. עצור כאשר לא נצפתה ירידה נוספת ב-AIC.
    4. שלב צעדים קדימה ואחורה.
  4. לסירוגין בין בחירה קדימה ואחורה.
    1. בצע סבב אחד של בחירת תכונה קדימה, ומיד אחריו סבב אחד של בחירת תכונה אחורה. חזור על תהליך זה עד שלא נצפו שיפורים נוספים ב-AIC.
    2. גישה חלופית: התחל בבחירת תכונה לאחור ולאחר מכן בצע בחירת תכונה קדימה. הערך את ההשפעה של הוספת תכונות שהוסרו בעבר בחזרה למודל.
  5. סיים את התכונות שנבחרו.
    1. ייצא את הרשימה הסופית של התכונות שנבחרו ואת המקדמים המתאימים להן (איור משלים S1).

10. אימות צולב של בחירת תכונה דו-כיוונית באמצעות רגרסיה לוגיסטית בשיטת השארת אחד החוצה

הערה: ודא ש-R מותקן עם החבילות הבאות: caret, pROC ו-ggplot2. יש לעבד מראש את מערך הנתונים של הפרוטאומיקה ולנרמל אותו לפני הניתוח. שמור את מטריצת הבלבול, עקומת ה-ROC וסיכום המודל כקבצים נפרדים לעיון.

  1. הכן את הנתונים והגדר את המודל.
    1. טען את מערך הנתונים המכיל ערכי ביטוי חלבון ותוויות מתאימות (למשל, ASD לעומת בקרה) מקובץ GLMSTEP/bothFitModel.txt. ודא שמערך הנתונים מעובד מראש ומנורמל.
    2. הגדר את המודל הראשוני באמצעות מודל ליניארי מוכלל (GLM) עם משפחה בינומית לסיווג.
    3. השתמש בדיוק ובמקדם Kappa כמדדי הערכה כדי להעריך את ביצועי המודל במהלך אימות צולב.
  2. בצע אימות צולב של השארת אחד החוצה.
    1. אתחול אימות צולב באמצעות חבילת הסמן ב-R כדי ליישם אימות צולב להשאיר אחד החוצה (LOOCV).
    2. התאם את מודל הרגרסיה הלוגיסטית באמצעות שמונה התכונות שנבחרו.
    3. רשום את הדיוק ומקדם הקאפה עבור כל איטרציה של אימות צולב.
  3. נתח את תוצאות האימות המוצלב.
    1. סכם את התוצאות.
      הערה: תוצאות תהליך ה-LOOCV ייראו כך (כמו במחקר זה): מודל ליניארי כללי, 169 דגימות, 8 מנבאים, 2 מחלקות: 'A', 'B', דגימה מחדש: אימות צולב להשאיר אחד, סיכום גדלי המדגם: 168, 168, 168, 168, 168, 168, 168, ... , תוצאות דגימה מחדש: דיוק קאפה 0.9526627 0.9024531.
    2. פרש את המדדים.
      הערה: כאן, המודל השיג דיוק של 0.9527 ומקדם קאפה של 0.9025 , מה שמצביע על התאמה מצוינת בין התוצאות החזויות והנצפות.
      1. הסתכלו על מקדם קאפה כדי לאמוד את כוח החיזוי של המודל. מקדם קאפה נע בין -1 ל-1, כאשר 0 מציין חיזוי אקראי ו-1 מציין הסכמה מושלמת.
        הערה: במחקר זה, ערך הקאפה של 0.9025 משקף את כוח החיזוי החזק של המודל.
  4. הערך את מקדמי המודל.
    1. לבחון את המקדמים של מודל הרגרסיה הלוגיסטית כדי להבין את התרומה של כל תכונה. הערך את הסטייה האפסית, הסטייה השיורית וה-AIC כדי לאשר את התאמת המודל.
      הערה: לדוגמה, במחקר זה, קיבלנו סטייה אפסית: 2.2928e+02 על 168 דרגות חופש, סטייה שיורית: 2.2378e-07 על 160 דרגות חופש, AIC: 18, מספר איטרציות ניקוד פישר: 25.
  5. דמיין את התוצאות.
    1. צור מטריצת בלבול כדי להציג באופן חזותי את הביצועים החיזויים של המודל.
    2. שרטט את עקומת מאפיין ההפעלה של המקלט (ROC) כדי להעריך את ביצועי הסיווג של המודל.
    3. פרש את התוצאות s. חשב את השטח מתחת לעקומה (AUC) כדי לקבל את מדד ביצועי הסיווג של המודל.
      הערה: עקומת ה-ROC מדגימה את הפשרה בין שיעור חיובי אמיתי לשיעור חיובי כוזב. השטח שמתחת לעקומה (AUC) צריך להיות קרוב ל-1, מה שמעיד על ביצועי סיווג מצוינים. עקומת ה-ROC משקפת את השינויים בשיעור החיובי האמיתי ובשיעור החיובי השגוי של המודל בספים שונים. ככל שערך ה-AUC גדול יותר, כך ביצועי הדגם טובים יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המחקר כלל 99 ילדים עם ASD ו-70 בקרות תואמות גיל (3-7 שנים), עם התפלגות מין מאוזנת (טבלה משלימה S2). הסרום נאסף לאחר צום לילה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים: דם נשאב לתוך צינורות מפרידים בסרום, הותר להיקרש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ואז צנטריפוגה ב-1,500 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט אוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד להמשך עיבוד. חלבונים בשפע גבוה (למשל, אלבומין, IgG, הפטוגלובין) התרוקנו כדי לשפר את רגישות הזיהוי. ריכוז החלבון נקבע על ידי בד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מתאר גישה מקיפה לזיהוי סמנים ביולוגיים מולקולריים הקשורים למערכת החיסון בהפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) באמצעות ספקטרומטריית מסה של רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA) וטכניקות למידת מכונה. השלבים החשובים בפרוטוקול מבטיחים תוצאות אמינות וניתנות לשחזור, תוך הדגשת תחומים שבהם עשויים להיות נחוצים שינויים או פתרון בעיות (טבלה 2).

אחד השלבים המרכזיים בפרוטוקול הוא איסוף וטיפול בדגימות סרום. ניתן לאסוף סרום באמצעות צנטריפוגה או...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

תודה לכל חברי המעבדה המרכזית ולאלה שעזרו בפרויקט זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים וכימיקליםאצטוניטריל (דרגת HPLC)פישר סיינטיפיקA18-50
<חזק>ריאגנטים וכימיקליםאמוניום ביקרבונט (NH? HCO?)סיגמא-אולדריץ'38939
<חזק>ריאגנטים וכימיקליםפורמט אמוניוםסיגמא-אולדריץ'90265
<חזק>ריאגנטים וכימיקליםאלבומין סרום בקר (BSA)תרמו פישר סיינטיפיק23212
<חזק>ריאגנטים וכימיקליםדיתיותרייטול (DTT)סיגמא-אולדריץ'43815
<חזק>ריאגנטים וכימיקליםחומצה פורמית (0.1%)תרמו פישר סיינטיפיק28905
<חזק>ריאגנטים וכימיקליםיודואצטמיד (IAA)סיגמא-אולדריץ'I1149
<חזק>ריאגנטים וכימיקליםמתנול (דרגת HPLC)פישר סיינטיפיקA452-4
<חזק>ריאגנטים וכימיקליםחומצה טריפלואורואצטית (TFA)סיגמא-אולדריץ'T6508
<חזק>ריאגנטים וכימיקליםאוריאהסיגמא-אולדריץ'U5378
<ערכות חזקות>וריאגנטים מיוחדיםערכת בדיקת חלבון BCAתרמו פישר סיינטיפיק23227
<ערכות חזקות>וריאגנטים מיוחדיםמחסניות C18 Sep-PakווטרסWAT023590
<ערכות חזקות>וריאגנטים מיוחדיםC18 StageTips (תוצרת בית)3M Empore&Trade;
<ערכות חזקות>וריאגנטים מיוחדיםערכת דלדול חלבון בשפע גבוהמיליפור סיגמא122642
<ערכות חזקות>וריאגנטים מיוחדיםפפטידים סטנדרטיים של iRTביוגנוסיס AG
<ערכות חזקות>וריאגנטים מיוחדיםערכת Lysozyme ELISAווהאן פיין ביוטק ושות' בע"מ
<ערכות חזקות>וריאגנטים מיוחדיםתערובת אנזימים טריפסין/LysCפרומגהV5071
<חזק>ציודצנטריפוגהאפנדורףברקוד 5430R
<חזק>ציודמערכת Easy-nLC 1200תרמו פישר סיינטיפיק
<חזק>ציודספקטרופוטומטר אחד של Nanodropתרמו פישר סיינטיפיקND-אחד-W
<חזק>ציודQ ספקטרומטר מסה HF-X אקטיביתרמו פישר סיינטיפיק
<חזק>ציודרכז SpeedVacתרמו פישר סיינטיפיקSPD131DDA
<חזק>ציודצנטריפוגת רוטור Swinning-Bucketמגוון
<חזק>ציודטור ווטרס XBridge BEH130ווטרסC18, 3.5 ו-mu; m, 2.1 ופעמים; 150 מ"מ
<חזק>ציודמערכת Agilent 1260 HPLCזריז1260 אינפיניטי II
<חזק>תוכנה וכלים מקווניםמוליכים ביולוגיים (חבילות R)bioconductor.org
<חזק>תוכנה וכלים מקווניםcaret (חבילת R)קראןcaret_6.0-93
<חזק>תוכנה וכלים מקווניםclusterProfiler (חבילת R)מוליכים ביולוגיים4.0.5
<חזק>תוכנה וכלים מקווניםדיא-נתוכנת DIA-NNגרסה 1.8
<חזק>תוכנה וכלים מקווניםggplot2 (חבילת R)קראן3.4.0
<חזק>תוכנה וכלים מקווניםמקסימום קוואנטמכון מקס פלאנק1.6.17
<חזק>תוכנה וכלים מקווניםomickits.comפלטפורמת הענן של OmiKitshttp://www.omickits.com
<חזק>תוכנה וכלים מקווניםpROC (חבילת R)קראן1.18.0
<חזק>תוכנה וכלים מקווניםrandomForest (חבילת R)קראן4.7-1.1
<חזק>תוכנה וכלים מקווניםספקטרונאוט פולסר Xביוגנוסיס AG17
<חזק>תוכנה וכלים מקווניםמסד נתונים אנושי של UniProtKBuniprot.orgמהדורה: 2019_10
<חזק>חומרים אחריםצינורות מיקרוצנטריפוגה בעלי כריכה נמוכהאפנדורף30120094
<חזק>חומרים אחריםשפופרות מפריד סרום (SST)BD Biosciences367988
<חזק>חומרים אחרים3M Empore&Trade; דיסקי C183 דקות

מקורות

  1. Ophir, Y., Rosenberg, H., Tikochinski, R., Dalyot, S., Lipshits-Braziler, Y. Screen time and autism spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. JAMA Netw Open. 6 (12), e2346775(2023).
  2. He, S., Zhou, F., Tian, G., Cui, Y., Yan, Y. Effect of anesthesia during pregnancy, delivery, and childhood on autism spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. J Autism Dev Disord. 54 (12), 4540-4554 (2024).
  3. Alkhonezan, S. M., Alkhonezan, M. M., Alshayea, Y., Bukhari, H., Almhizai, R. Factors influencing the lives of parents of children with autism spectrum disorder in saudi arabia: A comprehensive review. Cureus. 15 (11), e48325(2023).
  4. Larson, C., Thomas, H. R., Crutcher, J., Stevens, M. C., Eigsti, I. M. Language networks in autism spectrum disorder: A systematic review of connectivity-based fmri studies. Rev J Autism Dev Disord. 12 (1), 110-137 (2025).
  5. Kodak, T., Bergmann, S. Autism spectrum disorder: Characteristics, associated behaviors, and early intervention. Pediatr Clin North Am. 67 (3), 525-535 (2020).
  6. Zwaigenbaum, L., et al. Early intervention for children with autism spectrum disorder under 3 years of age: Recommendations for practice and research. Pediatrics. 136 (Suppl 1), S60-S81 (2015).
  7. Whitehouse, A. J. O., et al. Effect of preemptive intervention on developmental outcomes among infants showing early signs of autism: A randomized clinical trial of outcomes to diagnosis. JAMA Pediatr. 175 (11), e213298(2021).
  8. Ngounou Wetie, A. G., et al. A pilot proteomic analysis of salivary biomarkers in autism spectrum disorder. Autism Res. 8 (3), 338-350 (2015).
  9. Mota, F. S. B., et al. Potential protein markers in children with autistic spectrum disorder (asd) revealed by salivary proteomics. Int J Biol Macromol. 199, 243-251 (2022).
  10. Corbett, B. A., et al. A proteomic study of serum from children with autism showing differential expression of apolipoproteins and complement proteins. Mol Psychiatry. 12 (3), 292-306 (2007).
  11. Hu, E., et al. Data independent acquisition proteomics and machine learning reveals that proteins associated with immunity are potential molecular markers for early diagnosis of autism. Clin Chim Acta. 573, 120238(2025).
  12. Shen, L., et al. Biomarkers in autism spectrum disorders: Current progress. Clin Chim Acta. 502, 41-54 (2020).
  13. Yap, C. X., et al. Autism-related dietary preferences mediate autism-gut microbiome associations. Cell. 184 (24), 5916-5931.e17 (2021).
  14. Zhang, H., et al. The use of data independent acquisition based proteomic analysis and machine learning to reveal potential biomarkers for autism spectrum disorder. J Proteomics. 278, 104872(2023).
  15. Francis, K., et al. Brain-derived neurotrophic factor (bdnf) in children with asd and their parents: A 3-year follow-up. Acta Psychiatr Scand. 137 (5), 433-441 (2018).
  16. Bjorklund, G., et al. The impact of glutathione metabolism in autism spectrum disorder. Pharmacol Res. 166, 105437(2021).
  17. Bao, X. H., et al. Olink proteomics profiling platform reveals non-invasive inflammatory related protein biomarkers in autism spectrum disorder. Front Mol Neurosci. 16, 1185021(2023).
  18. Ngounou Wetie, A. G., et al. Comparative two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of the salivary proteome of children with autism spectrum disorder. J Cell Mol Med. 19 (11), 2664-2678 (2015).
  19. Suganya, V., Geetha, A., Sujatha, S. Urine proteome analysis to evaluate protein biomarkers in children with autism. Clin Chim Acta. 450, 210-219 (2015).
  20. Shen, L., et al. Itraq-based proteomic analysis reveals protein profile in plasma from children with autism. Proteomics Clin Appl. 12 (3), e1700085(2018).
  21. Shen, L., et al. Proteomics study of peripheral blood mononuclear cells (pbmcs) in autistic children. Front Cell Neurosci. 13, 105(2019).
  22. Mesleh, A., et al. Blood proteomics analysis reveals potential biomarkers and convergent dysregulated pathways in autism spectrum disorder: A pilot study. Int J Mol Sci. 24 (8), 7443(2023).
  23. Yang, J., et al. Association between plasma proteome and childhood neurodevelopmental disorders: A two-sample mendelian randomization analysis. EBioMedicine. 78, 103948(2022).
  24. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  25. Wu, Y., et al. Quantitative proteomics analysis of serum and urine with dia mass spectrometry reveals biomarkers for pediatric obstructive sleep apnea. Arch Bronconeumol. 61 (2), 67-75 (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.