דינמיקה תלוית גיל של תנועה ב- Caenorhabditis elegans: ניתוח מעריך ליאפונוב

סיכום

מחקר זה בוחן את השפעת הגיל על התנועה ב-C. elegans על ידי מדידת מעריך ליאפונוב הגדול ביותר (LLE). ככל שהם מתבגרים, C. elegans מראים עלייה וירידה בשליטה המוטורית. התוצאות מראות שיא LLE לאחר חמישה ימים, ואחריו ירידה ככל שהתולעים מזדקנות.

תקציר

מחקר זה חוקר את השפעת הגיל על הניידות של Caenorhabditis elegans (C. elegans) על ידי שימוש בעקיפה אופטית דינמית (DOD) כדי להעריך את מעריך ליאפונוב הגדול ביותר (LLE). ה-LLE, מדד מפתח במערכות דינמיות, מכמת את קצב הסטייה או ההתכנסות של מסלולים במרחב הפאזה, ומצביע על יכולת החיזוי והכאוס בדינמיקה של המערכת, במקרה זה, התנהגויות הקטר של התולעת. אור לייזר 632 ננומטר מתעקם את תולעת השחייה בעמוד מים, ויוצר דפוס עקיפה. פוטו-דיודה מזהה את האור בנקודה אחת בתוך תבנית העקיפה, ולוכדת סדרת זמן חד-ממדית כאשר התולעת מתנדנדת. סדרת זמן זו משמשת כייצוג מורכב של תנועת התולעת כולה, ומכילה את דינמיקת התנועה שלה מכיוון שנקודה אחת בתבנית העקיפה היא סופרפוזיציה של כל הנקודות על התולעת. לאחר מכן, סדרת הזמן מוטמעת במרחב פאזה בעל מימד גבוה יותר כדי לחשב את ה-LLE. C. elegans חיים בדרך כלל כ-14 יום, בעקבות דפוס של עלייה וירידה בשליטה המוטורית עם הגיל. כדי לבודד השפעות ספציפיות לגיל, תולעים הועברו לצלחות אגר טריות המכילות E. coli כל יומיים, כדי להבטיח שהן יתיישנו כראוי (3 עד 12 ימים). ניתוח של עוקבה של 13 C. elegans גילה כי ה-LLE הגיע לשיא חמישה ימים לאחר הבקיעה, בקצב של 1.34 ±-0.03 1/s. שיא זה מסמל נקודה קריטית בהתפתחות שבה תנועת התולעים מציגה את המורכבות וההתנהגות הכאוטית הגבוהה ביותר. ערכי ה-LLE שנצפו עולים בקנה אחד עם משוואת מור, מודל מבוסס היטב המתאר שינויים הקשורים לגיל בפעילות רצונית, ומקשר בין ירידה בשליטה מוטורית ורמות פעילות עם עלייה בגיל ב-C. elegans.

מבוא

התנועה של Caenorhabditis elegans (C. elegans), תולעת מיקרוסקופית, נחקרה כדי לקדם את ההבנה של החיווט של נוירונים מוטוריים מכיוון שהנמטודה הזו פשוטה מבחינה נוירולוגית, עם 302 נוירונים בלבד¹. C. elegans הוא אורגניזם מודל שמתוחזק בקלות עם תוחלת חיים של 14 ימים בלבד². רק כ-72 נוירונים של 302 ב-C. elegans משמשים לתנועה וממוקמים בכל הגוף הבוגר של הנמטודה¹. התנועה בממדים נמוכים (כלומר, מצד לצד, קדימה ואחורה)³ של C. elegans הופכת אותם לדגימה קלה למעקב אחר טווחים ב-LLE. מערכות העצבים של נמטודות מובנות במידה מדהימה⁴.

ניתוח וידאו עזר לכמת את תנועת C. elegans על ידי מדידת כמויות כגון רדיוס עקמומיות, תדרי גליות ואורך גל⁵. מדידות אלו קבעו משתני בקרה המאפשרים השוואה של תכונות תנועה בסביבות שונות ובתנאים שונים ^6,7. מידע זה יוצר מודל מתפתח של המעגלים המניעים את התנועה של C. elegans⁸ ואף מאפשר יצירת סימולציות דינמיות וירטואליות כמו גם פיזיות של תולעים⁹.

עקיפה אופטית דינמית (DOD)¹⁰ שימשה גם לכימות התנועה של C. elegans. במהלך DOD, אור לייזר בעוצמה נמוכה מתכופף סביב התולעת החיה, ויוצר דפוס עקיפה בשדה רחוק המכונה דפוס עקיפה של Fraunhofer. התפלגות העוצמה בתבנית החיה משתנה ככל שהנמטודה נעה. נקודה אחת בעקיפה היא סופרפוזיציה של כל הנקודות על התולעת, כך שהעוצמה התלויה בזמן בתבנית העקיפה יוצרת סדרת זמן חד-ממדית המכילה מידע על הדינמיקה התנועתית¹¹. אנו מתמקדים במעריך ליאפונוב הגדול ביותר (LLE) התלוי בגיל של תנועה שאנו מחשבים מסדרת הזמן החד-ממדית הניסיונית. ה-LLE בשלבי התפתחות שונים דומה למחקרים אחרים הקשורים לגיל, ומראה כי המעגלים העצביים מתבטאים בדפוסי תנועה הניתנים למדידה באמצעות כלים שונים, כגון ניתוח וידאו או DOD⁵.

DOD מספק סדרת זמן רגישה בקני מידה מרובים מכיוון שתבנית ההתאבכות יכולה לפתור את התנועה לשבריר מאורך הגל המשמש תוך התחשבות בשינויים בקנה מידה גדול בפלסטיות (צורה) של המין. תכונה זו שימושית במיוחד כאשר מערכת רגישה לתנאים התחלתיים, כמו במערכות כאוטיות שבהן שינויים קטנים מובילים לשינויים אקספוננציאלים במסלול, הידוע גם בשם אפקט הפרפר¹². מסיבה זו, חיוני ללכוד את סדרות הזמן בקצב המאפשר רישום של שינויים קטנים, שכן שינויים אלו יכולים לגרום לשינויים משמעותיים ככל שהמערכת מתפתחת. פוטו-דיודה (PD) יכולה ללכוד את סדרות הזמן מהר יותר ממצלמות מהירות יקרות רבות. השילוב של הרגישות המרחבית בדפוס העקיפה וקצב צבירת נתונים גבוה יכול ללכוד את המהות של מערכת כאוטית^13,14.

ה-LLE מתאר את הסטייה המעריכית של מסלולי מרחב פאזה. מרחב הפאזה מכיל את כל המצבים האפשריים של מערכת, המתוארים על ידי משתני המצב (או הקואורדינטות) שלהם והנגזרות הקשורות אליהם (או מומנטה)¹⁵. מסלולים שונים מתארים את התפתחות המערכת בתנאים התחלתיים שונים. במערכת כאוטית, שני מסלולים סמוכים יתפצלו באופן אקספוננציאלי לאורך זמן, והסטייה הזו מכומתת על ידי LLE חיובי. במערכות פיזיקליות, סטייה זו מתבטאת בהתפשטות אי הוודאות בתנאים ההתחלתיים של המערכת, וגם כחוסר יכולת לחזות באופן אמין את מצב המערכת לאחר זמן מה, כפי שניתן על ידי LLE¹⁴.

במערכות ניסיוניות, משתני המצב לרוב אינם ידועים; עם זאת, ניתן לשחזר את הטופולוגיה של מרחב הפאזה ממשתנה נמדד אחד בלבד באמצעות משפט הטמעת טאקס¹⁶ על ידי בניית הגרסאות המושהות בזמן שלו (שווה ערך לנגזרות זמן). כל גרסה מושהית בזמן מיוצגת על ציר; יחד, עיכובי הזמן יוצרים תרשים פיגור, הזהה מבחינה טופולוגית לתרשים פאזה אם סדרת הזמן ארוכה עד אינסוף. סדרות זמן ניסיוניות מוגבלות באורכן, ולכן יכולות להציג רק LLEs משוערים המוגבלים על ידי אי ודאות ניסויית.

התנועה של C. elegans נושאת LLE¹⁰ חיובי, אינדיקטור לכאוס. אורגניזם צעיר עובר שינויים תנועתיים בגיל¹⁷. LLE גדול יותר מצביע על יכולת חיזוי נמוכה יותר בהשוואה ל-LLE קטן יותר. ה-LLE מספק שיטה אמינה לכימות דפוסי התנועה של אורגניזם 10,13,14. מאפייני התנועה של הנמטודות קשורים לנוירונים בתוך הנמטודות¹⁸. על פי כהן ^{ואחרים.19}, תנועת הנמטודות תלויה בנוירונים מוטוריים, מה שמרמז על כך שחקר המורכבות בתנועת הנמטודה קשור גם למעגלים העצביים שלה.

אנו מכיילים את ה-LLE על סמך גיל כדי למזער את אי הוודאות למחקרים עתידיים. מחקרים קודמים העריכו את ממוצע ה-LLE בנמטודות בנות שלושה עד שישה ימים¹³. מחקר זה עקב בקפידה אחר גילאי הנמטודות כדי להקל על ניתוח קפדני של ירידות הקשורות להזדקנות. בנוסף, שינויים בתנועה נחקרו כדי לזהות שינויים ביולוגיים אחרים ב- C. elegans¹⁸. המשוואה של מור עוקבת אחר פרמטרי גיל הקשורים לתנועה²⁰. כאן, אנו משתמשים בגרסה שונה של משוואת מור המאפשרת גמישות כאשר המנגנון התנועתי נמצא במקום כדי להיות מוערך, המוצג כסמן זמני T:

, (1)

כאשר P(t) מייצג ביצועים, t הוא זמן, a ו-c מייצגים פרמטרים של קנה מידה, בעוד b ו-d הם הזמנים האופייניים לצמיחה וירידה מעריכית, בהתאמה. המשוואה של מור הוכחה כמנבאת את המסלולים של כמויות שאינן קשורות לכאורה, כגון מהירות ופעילות רצונית, ככל שאורגניזמים מזדקנים. ניתן לאפיין מינים על ידי צורת העקומה כפי שצוינה במשוואת מור; כלומר, מינים מסוימים עשויים להגיע לשיא מוקדם יותר מאחרים²¹.

פרוטוקול

1. הכנת C. elegans לרכישת נתונים

1. שים 0.5 מ"ל של E. coli עם OD600 בכל צלחת אגר של מדיום גידול נמטודות (NGM) כדי שהנמטודות יוכלו לאכול. המתן עד שהאי קולי יתייבש על כל צלחת אגר.
2. רכוש לוחית בקרה של C. elegans מכל ספק חומרים ביולוגיים על מנת לייצר לוחות חדשים של C. elegans לצורך בקרת גיל.
3. עקר פיק פלטינה באמצעות להבה ממבער בונסן או שווה ערך. השתמש במיקרוסקופ מנתח כדי לבחור 5-10 C . elegans בוגרים מסוג בר להכניס לכל צלחת.
4. הניחו לנמטודות להטיל ביצים במשך 4-5 שעות לפני שקוטפים את הבוגרים מהצלחת. דגרו על הנמטודות הנותרות ואפשרו להן לקטוף אותן ביום הרצוי.
5. ביום איסוף הנתונים, מלאו קובטה קוורץ בדרגה אופטית של 4.5 מ"ל במידות 10 מ"מ x 10 מ"מ x 45 מ"מ במים מזוקקים בטמפרטורת החדר ממש מתחת לחלק העליון של הקובט כדי למנוע שפיכה בעת הוספת חלק עליון מפלסטיק. בחרו 2-3 נמטודות והניחו אותן בעדינות בקובטה. ברגע שהנמטודות נמצאות בקובטה, הניחו אותה על צדה כדי ליישר בקלות את התולעת בקרן הלייזר. C. elegans עשוי לצוף לכיוון הקרקעית אך ימשיך עם גלי שחייה כל עוד הוא שקוע לחלוטין במים⁵.

2. איסוף נתונים

הערה: יש ליישם את הנוהל שלהלן לרישום סדרות הזמן בערך באותה שעה בכל יום כדי למזער את אי הוודאות בגיל.

1. הגדר את הניסוי המתואר במאמר הקודם²². בצע שינוי קטן של בניית פריסקופ עם שתי מראות והנחת הקובט על צדו בין שתי המראות כדי להקל על מרכז התולעת בקרן הלייזר מאוחר יותר. במקום המצלמה, מקמו PD בתבנית העקיפה (איור 1).
   1. יישר את המראות אנכית כדי לבנות את הפריסקופ הנ"ל.
      הערה: זוהי עבודת יישור הלייזר היחידה שיש להשלים.
2. הפעל את לייזר HeNe (הליום ניאון) ותן לו להתחמם כדי להגיע לשיווי משקל תרמי (~15 דקות).
3. הפעל את האוסילוסקופ הדיגיטלי כדי להתחיל באיסוף נתונים. הגדר את הפרמטרים של מרווח הזמן ומאגר הזיכרון באוסילוסקופ הדיגיטלי. הגדר את מרווח הזמן ל-100 שניות ויישם מאגר זיכרון של לפחות 100 קילו-דגימות לשנייה (kS).
4. הגדר את הרזולוציה ל-1 קילו-הרץ עבור קצב רכישת הנתונים ו-12 סיביות כדי לפתור את המשרעות, מה שעוזר להבחין במורכבות בקנה מידה קטן²³.
5. הגדר את האוסילוסקופ למרכז את תנודות העוצמה על ידי שימוש בהיסט AC אוטומטי כדי למרכז את סדרת הזמן באפס וולט.
6. בחרו 2-3 נמטודות והניחו בעדינות בקובטה מלאה במים מזוקקים כך שיהיה קל יותר למצוא ולרכז לפחות תולעת אחת בקרן הלייזר. אין לנער את הקובטה.
7. הנח את הקובט המכיל 2-3 נמטודות בפריסקופ ומרכז נמטודה 1 בקרן הלייזר.
   1. כאשר C. elegans מרוכז בקרן הלייזר, תיווצר תבנית עקיפה של שדה רחוק כ-50 ס"מ מהפריסקופ.
8. מקם את הפוטודיודה בתבנית עקיפה של שדה רחוק כאשר C. elegans חוצה את קרן הלייזר. ודא שה-PD ממוקם מחוץ למרכז בתבנית העקיפה כדי ללכוד אור עקיפה ולא את המקסימום המרכזי (קרן לייזר משודרת).
9. אסוף לפחות 10 שניות של נתונים כדי לחשב את ה-LLE בצורה מהימנה; כלומר, נדרשות לפחות 10,000 נקודות נתונים כדי לחשב LE יציב.
   הערה: פחות נקודות נתונים גורמות ל-LLE שמשתנה באופן מלאכותי.
10. חזור על איסוף הנתונים לעיל עבור כל יום 9-15 פעמים. אסוף נתונים לגילאי 3-12 ימים באותה שעה ביום.

3. ניתוח נתונים

הערה: עבור ניתוח הנתונים, סדרת הזמן מוטמעת במרחב הפאזה באמצעות תרשים פיגור¹⁶ ולאחר מכן מעריך את ה-LLE על ידי חישוב הסטייה של המסלולים.

1. בחר קטעים בסדרת הזמן שבהם הנמטודה שוחה בחופשיות בתוך קרן הלייזר על ידי בחינה מדוקדקת של סדרת הזמן. איור 2A מציג סדרת זמן בת קיימא עם אות רציף של לפחות 20 שניות.
2. סינון סדרת הזמן עבור יחס אות לרעש נמוך (איור 2B). קבע את רמת הרעש על ידי הקלטת סדרת זמן ללא התולעת בקובטה. התכונות בסדרת הזמן, לא רק המשרעת, חייבות להיות יותר מפי שניים מרמת הרעש.
3. אל תכלול נתונים רוויים מסדרת הזמן הרלוונטית (איור 2C). אם יותר מדי נתונים רוויים כדי לחלץ מידע שימושי, חזור לסעיף איסוף נתונים לעיל, חזור על שלבים 2.7.1 עד 2.9 והתאם את רמת העוצמה על ידי הזזת הפוטו-דיודה הרחק מהמקסימום המרכזי.
4. קבע את התדירות הממוצעת הניתנת על ידי
   (2)
   כאשר f הוא התדר ו - P הוא ספקטרום ההספק (איור 3). ניתן לעשות זאת באופן חישובי באמצעות התמרת פורייה מהירה (FFT) ולאחר מכן חישוב ממוצע התדרים. לתוכניות חישוביות רבות יש פונקציה מובנית לחישוב התדירות הממוצעת של מערך נתונים.
5. שחזר את הטופולוגיה של מרחב הפאזה בשיטת עיכוב זמן. בחר סדרת זמן X ודחה את סדרת הזמן בהשהיית זמן τ כדי לפתור את המסלולים (איור 4). עיכוב הזמן האופטימלי נקבע על ידי זיהוי המינימום המקומי הראשון במידע ההדדי (MI)²⁴:
   (3)
   כאשר N הוא מספר הנקודות, X_i היא נקודה בסדרת הזמן X, בעוד _{X i+τ} היא נקודה מושהית בזמן באותה סדרת זמן. p(X_i) היא ההסתברות להתרחשות נקודה X_i, ו-p(X_i+τ) היא ההסתברות להתרחשות X_i+τ. p(X_i, X_i+τ) היא ההסתברות המשותפת²⁵ הן של סדרת הזמן X_i והן של סדרת הזמן בפיגור X_i+τ החופפות.
6. זהה את המינימום הראשון בגרף MI בין 0.140 ל-0.240 שניות (140 ו-240 נקודות נתונים), כפי שמוצג באיור 5. אין מספר מדויק לפיגור; המטרה העיקרית היא לפתור את מסלולי הפאזה מספיק כדי לקבוע את הסטייה.
7. השתמש בסדרת הזמן X_i ובגרסאות המפגרות שלה ב-τ, כפי שנקבע על ידי מזעור ה-MI בשלב הקודם.
8. קבע את ממד ההטבעה. ממד ההטבעה המתאים ביותר הוא הממד הנמוך ביותר שעבורו השכנים הקרובים ביותר (FNN) מתייצבים במינימום (איור 6)²⁶. השתמש בשיטה שפותחה על ידי אברבנאל ואחרים ^27,28.
9. השתמש באלגוריתם רוזנשטיין²⁹ כדי לשחזר את המערכת הדינמית במרחב פאזה ולעקוב אחר הסטייה של מסלולים סמוכים לאורך זמן. בפרט, השתמש בשגרת MATLAB של מרווה קיזילקיה, כפי שפורסמה בפורום MATLAB³⁰, כדי לחשב את ה-LLE. שגרה זו דורשת את הקלט הבא: סדרת הזמן, התדירות הממוצעת של המושך, פער הזמן τ, קצב רכישת הנתונים עבור סדרת הזמן והמרווח שיתאים לסטייה.
10. חזור על ההליך לעיל עבור 9-15 מערכי נתונים כדי להפחית את אי הוודאות של הערכות LLE. ממוצע של ה-LEs עבור כל יום ולאחר מכן התאם את עקומת מור (איור 7).

תוצאות

תוך כדי מדידת ה-LLE לעומת הגיל, מדדנו גם כמויות אחרות הקשורות לעתים קרובות למערכות דינמיות מורכבות, כגון תדירות המושך, MI ו-FNN. אספנו נתוני מחקר גיל מימים 3 עד 12. התולעים קטנות מדי ולא בשלות לפני שהן בנות 3 ימים מכדי לטפל בהן ידנית. בגיל 12 יום, התולעים מזדקנות ובקושי זזות מכיוון שהמעגלים העצביים שלהן מתדרדרים ומערכת העצבים^שלהן מתדרדרת.

האלגוריתם של רוזנשטיין בוחר נקודה שכנה במרווח של לפחות נקודה ממוצעת אחת לכל נקודה במסלול המשובץ. החל מווקטור ההפרדה בין שתי הנקודות בשני המסלולים השכנים (איור 8), האלגוריתם עוקב אחר התפתחות הסטייה. הפרדת המסלולים גדלה בתחילה באופן אקספוננציאלי עקב האופי הכאוטי של מערכת³², ואז היא מתייצבת מכיוון שהמסלול מוגבל. שרטוט הלוגריתם של הסטייה הממוצעת לאורך זמן עוקב אחר הפרדת המסלולים (איור 8 ואיור 9). השיפוע של הריבועים הפחותים הליניאריים מתאים לחלק הראשון של העקומה לפני שהוא משתטח מביא להערכה אמינה עבור LLE³³ של המערכת. שים לב שאי ודאות מעורבת בבחירת הטווח עבור ההתאמה הריבועית הנמוכה ביותר וההתאמה עצמה. הרגישות לתנאים התחלתיים גורמת לאזור ההתאמה הליניארית להציג התנהגות תנודתית כאשר הסטייה עוקבת אחר המושך. השונות הביולוגית בין תולעים, שהייתה ממוצעת עבור כל קבוצת גיל, עולה על השונות בהתאמה הליניארית של LLE לניסוי בודד, כפי שהוצג בפרסום קודם¹⁰.

סדרת הזמן (איור 2A) מראה ששיאים ושפלים חופפים להיבטים של תנועת התולעת, כמו למשל שינויים בתדירות השחייה, בצורה ובכיוון. סדרת הזמן היא א-מחזורית; התנודות בסדרות הזמן לעולם לא חוזרות על עצמן, אך נשארות מוגבלות בעוצמתן. התדר יציב תוך תנודות קלות, מה שמעיד על מורכבות וגבולות בתדירות. איור 10 מראה מגמת ירידה בתדירות השחייה ככל שהתולעת מזדקנת, אשר מתפרקת ביום ה-12. השכיחות הממוצעת קופצת לאחר היום ה-12 עבור רוב התולעים. סביר להניח שזו אינדיקציה להתמוטטות המעגל העצבי. לעומת זאת, הפיגור הממוצע τ, כפי שנקבע על ידי המינימום הראשון של ה-MI, גדל ככל שהאוכלוסייה מזדקנת, מכיוון שהמחזור מתארך (איור 11).

במקרה שלנו, ה-MI מייצג את החפיפה הסטטיסטית בין שתי סדרות זמן בפיגור. אם ה-MI הוא מינימלי, אז יש חפיפה מינימלית בין מסלולים. תיאורטית, מסלולים כאוטיים לעולם אינם חופפים; עם זאת, בפועל, עם ספרות משמעותיות מוגבלות ורעש ניסיוני מסוים, נקודות מסוימות יחפפו בתוך סובלנות מסוימת²⁴. אנו שואפים למזער את האפשרות לחפיפה על ידי מזעור ה-MI. ההבדל בין MI ממוזער ל-MI גדול משמעותית מודגם באיור 4.

ממד ההטבעה נקבע על-ידי השכנים הקרובים ביותר (FNNs) השגויים. מספר ה-FNNs משתטח עם 5% או פחות FNNs סביב מידות ההטבעה 3 או 4. באיור 6, גיל הנמטודות אינו משפיע על ממד ההטמעה, למעט ביום ה-12, כאשר התולעת כמעט בסוף תוחלת החיים שלה.

המסלול של ה-LLE עוקב אחר עקומת מור (איור 7) עם שיא של 5 ימים, מה שמצביע על כך שהתנועה הבלתי צפויה ביותר (ואולי המורכבת) מתרחשת כאשר C. elegans בוגרים זה עתה. באיור 7, גרף של LLEs מימים 3 עד 12 מראה עלייה ליניארית עם שיא ב-5 ימים, ואחריה ירידה לאחר יום 5. פסי השגיאה באיור 10 מייצגים את סטיית התקן של הממוצע ^4,34 ומשקפים מספר גורמים, כולל המגוון בתוך מינים ביולוגיים והערכת LLE. השונות בין התולעים נוטה לגבור על אי הוודאות בשגרת התאמת ה-LLE. השונות בין ימים, כמו ימים 5 ו-7, אינה חופפת, כך שניתן להבחין בבירור בנתונים. המגמה של LLEs עם הגיל תואמת מאוד את משוואת מור ממחקר קודם¹⁸, המתארת את השפעות הגיל על זיכרון ותנועה באורגניזמים חיים אחרים.

ה-LEs בטבלה 1 עקביים, ומראים מגמת עלייה איטית ואז ירידה עם הגיל. הערכים תואמים לתוצאות שפורסמו בעבר באמצעות DOD¹⁰ וניתוח וידאו^34,35.

איור 1: מערך עקיפה ניסיוני של שדה רחוק (לא מצויר בקנה מידה). מראות ההיגוי יוצרות פריסקופ. הקובט המכיל את ה-C. elegans ממוקם בין מראות ההיגוי. קרן הלייזר מתעקפת על ידי התולעת ונעה לעבר ה-PD דרך מראת ההיגוי השנייה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: סדרות זמן אינטנסיביות. סדרת הזמן של DOD מציגה תנודות בעוצמה כאשר הנמטודה נעה בקרן הלייזר עם (A) סדרת זמן בת קיימא לניתוח נתונים. (ב) סדרת זמן זו מצביעה על כך שהמרווח שבין 11 ל-30 שניות אינו מציג אות; הוא רק מציג את רמת הרעש של המערכת, שכן המשרעות היציבות הקצרות יותר מקורן בעיקר באור מפוזר. (C) בסדרת הזמן הזו יש כמה מקרים של נתונים רוויים. כל נקודת נתונים מייצגת עלייה משמעותית בגרף שנחתך ומשוטח בפסגות ובשפל. בדוגמה זו, הקוצים משתטחים כאשר העוצמה נעה בין -100 ל-100 יחידות אסטרונומיות בין 45 ל-50 שניות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ספקטרום הספק. ספקטרום ההספק מראה מקסימום בסביבות 0.95 הרץ. התדרים מפוזרים מכיוון שהתדר במסלולים על המושך משתנה ולעולם לא בדיוק חוזר על עצמו. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: נתונים ניסיוניים המוטמעים בתרשים פיגור תלת-ממדי עם שני פיגורים שונים של אותה סדרת זמן של תולעת בת 9 ימים. סדרת זמן זו מראה כי תנועה היא מושך מוגבל התואם את תיאוריית הכאוס. (A) המסלול נפתר באמצעות המינימום המקומי הראשון (MI ≈ 2.11), מה שנותן פיגור של כ-0.183 שניות (183 נקודות נתונים). מעברי המסלול הנראים לעין הם תוצאה של הקרנה על מרחב דו-ממדי. (B) תרשים ההשהיה הזה נותר לא פתור על ידי פיגור לא מתאים של 0.002 שניות (2 נקודות נתונים, (MI > 7)) מכיוון שהנקודות קרובות מדי זו לזו מכדי שניתן יהיה להבחין בהן ואינן מראות סטייה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הירידה האקספוננציאלית של המידע ההדדי. המינימום הראשון ב-MI קובע את הפיגור של מערך הנתונים ב-0.161 שניות (161 נקודות נתונים) במקרה הספציפי הזה כדי לפתור את מסלול הפאזה. פיגור זה מעביר את ערך סדרת הזמן כדי לשחזר את המושך במרחב הפאזה. הפיגור צריך להיות רק קרוב למינימום הראשון, מספיק כדי לפתור את המסלולים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: מידות ההטבעה הממוצעות בימים 3, 5, 9 ו-12, בהתאמה. תצוגה מוגדלת של ממד ההטבעה משמשת כדי להציג את ההבדל הספציפי בין מידות ההטבעה של כל יום. רק היום ה-12 מציג הבדל ניכר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: ממוצע ה-LEs המשוערים בין הימים 3 ל-12. ה-LLE מגיע לשיא ב-5 ימים. במשך עד 5 ימים, נמטודות מציגות מסלול גדילה התואם את המעבר מחוסר בשלות לבגרות. לאחר 5 הימים הללו, נמטודות חוות ירידה בסטייה. אי-הוודאות היא מדד של סטיית התקן של הממוצע, שנשלט על ידי וריאציות בין תולעים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: תיאור הסטייה הקיימת בתיאוריית הכאוס. LLE חיובי יגרום למסלולים קרובים בהתחלה להתפצל עם הזמן. t הוא מרווח זמן, d הוא הסטייה, ו-x(t) היא נקודה במרחב פאזה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: סטיית מסלול פאזה בקנה מידה לוגריתמי. ה-LLE המשוער הוא שיפוע ההתאמה הליניארית (1.08 1/s) באזור העולה לפני שהוא משתטח עקב הגבול של המושך בין 0.96 ל-1.01 שניות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: התדירות הממוצעת לכל יום. ממוצע יום 12 מציין שינוי משמעותי באותות הנוירולוגיים המניעים תנועה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11: הפיגור הממוצע לכל יום. ה-MI מוביל בממוצע לפיגורים נמוכים יותר בין ימים 3 ל-6, בעוד שפיגור ממוצע גבוה יותר מופיע בין ימים 7 ל-12. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

גיל (ימים)	מספר מערכי נתונים	LLE (1/s)	סטיית תקן של הממוצע (1/s)
3	11	1.14	0.02
4	15	1.20	0.03
5	13	1.34	0.03
6	11	1.23	0.02
7	10	1.16	0.03
8	12	1.13	0.02
9	12	1.07	0.02
10	9	1.00	0.03
11	9	0.96	0.03
12	9	0.92	0.02

טבלה 1: מספר מערכי הנתונים וממוצע ה-LLE עבור כל יום במחקר הגיל. ה-LEs עקביים עם נתונים קודמים שנאספו באמצעות DOD ומראים את המסלול העולה ואז היורד של עקומת מור מאיור 7. 9-15 מערכי נתונים נאספו עבור כל יום של נתונים. מערכי הנתונים ירדו ככל שהתולעים הזדקנו עקב אופי הידרדרות השרירים והירידה העצבית שלהן, מה שגרם לירידה בתנועה.

דיון

סיווגנו את תנועת C. elegans על ידי הערכת ה-LLE על פני גילאים שונים, הנתמכים על ידי פרמטרים כמו תדירות שחייה, מידע הדדי (MI) ושכנים קרובים כוזבים (FNN) - שכל אחד מהם מציע תובנה נוספת לגבי התכונות הדינמיות של המערכת. המאפיינים הדטרמיניסטיים והלא ליניאריים של מערכת זו נחקרים באמצעות שיטות נתונים חלופיות ועלילות הישנות³⁶.

שימוש ב-DOD כדי לכמת את השפעות ההזדקנות על התנועה הוא טכניקה משלימה למיקרוסקופיה המסורתית. זה לא תחליף לבדיקה ויזואלית של המינים המיקרוסקופיים; הוא מספק דרך עקבית ויעילה לכמת תנועה מעבר לטכניקות מסורתיות. מכיוון ש-DOD עוקף ניתוח וידאו, חלק מעומס העבודה החישובי מנוהל מטבעו על ידי הטכניקה האופטית, שכן עקיפה ממפה ישירות את התפלגות העוצמה למרחב פורייה. הסופרפוזיציה של השדה האופטי במהלך עקיפה עוקבת אחר כל המינים המיקרוסקופיים. באופן אידיאלי, הרזולוציה נשלטת על ידי אורך הגל λ של האור המשמש, במקרה זה, 632 ננומטר. אפילו תזוזה של שבריר מאורך הגל תגרום לשינוי בעוצמה. מסיבה זו, הרזולוציה נשלטת על ידי הטווח והרזולוציה של גלאי הצילום כמו גם על ידי עוצמת הלייזר. לדוגמה, אם הגלאי חש אות סדרת זמן המשתנה בין שני מתחים, Vmin ו-Vmax, והרזולוציה היא n סיביות (ראה שלב פרוטוקול 2.4), אז הרזולוציה המקסימלית היא λ/n, או במקרה שלנו, 632 nm/12. בתיאוריה, ניתן ליישם שיטה זו על כל גוף שמשנה את צורתו; עם זאת, DOD מתאים במיוחד למינים מיקרוסקופיים, שכן לייזרים זולים עם אורכי הגל המתאימים זמינים וחסכוניים.

כדי להבטיח דפוס עקיפה ברור ועקבי, יש לעקוב בקפידה אחר התולעת ולשמור אותה מרוכזת בתוך קרן הלייזר בזמן שהיא שוחה. אם התולעת נסחפת מחוץ ליישור, האות עלול להתדרדר או ללכת לאיבוד לחלוטין. כדי להפחית בעיות של רוויית פוטו-דיודה ולהפחית רעש סטוכסטי, נעשה שימוש במסנן צפיפות ניטרלית כדי להחליש את עוצמת הלייזר. סינון זה מסייע בשמירה על התחום הדינמי של הפוטו-דיודה ומונע רוויית יתר בסדרות הזמן המוקלטות. עם זאת, כל קטעי הנתונים המציגים רוויה מוגזמת או יחסי אות לרעש נמוכים אינם נכללים בניתוח הסופי כדי לשמור על איכות הנתונים.

סחיפה בתדירות השחייה מייצרת ספקטרום תדרים רציף, סמן מוקדם מבוסס של כאוס¹³. הקשר ההפוך בין התדר הממוצע ל-MI מצביע על כך שכ-1/8 ממחזור פותר את המסלול בדיוק מספיק כדי להעריך את ה-LLE, בדומה לרזולוציה הנדרשת לניתוח צורת גל סינוסואידית.

האחוז הנמוך של FNNs סביב מידות ההטמעה 3 ו-4 באיור 6 מרמז על רמות רעש נמוכות הן בתנועה של C. elegans והן במערכת האופטית. עם זאת, בתולעים בנות 12 יום, אחוז ה-FNNs עולה מעט אך נשאר הרבה מתחת ל-5%, לאו דווקא בגלל עלייה בממד ההטבעה האמיתי, אלא ככל הנראה בגלל רעש מוגבר באות התנועה, המיוחס להשפלה עצבית באורגניזמים מזדקנים^34,37.

שינויים ב-LLE לאורך ההתפתחות מראים כי מידת הכאוס בתנועה משתנה עם הגיל, בהתאמה רבה לתחזיות ממשוואת מור. שיא ב-LLE בשלב מוקדם בחיים עולה בקנה אחד עם מאפיינים של מינים שנבחרו על ידי R, כגון C. elegans, שחייבים לפתח תפקוד עצבי-שרירי במהירות בהיעדר טיפול הורי. יש לציין כי 70% מהקשרים העצביים ארוכי הטווח נוצרים כאשר התולעת היא רק 20% מגודלה הבוגר^37,38. לעומת זאת, מינים שנבחרו על ידי K, כמו בני אדם, מציגים התפתחות נוירולוגית איטית יותר, הנתמכת על ידי השקעה הורית, וכתוצאה מכך דפוסים מוטוריים מאוחרים אך מורכבים יותר. הבדלים אלה באים לידי ביטוי בתזמון שיא ה-LLE בין המינים.

מחזור החיים הקצר של C. elegans, כ-14 יום, עם התפתחות מהירה במהלך היומיים הראשונים על פני ארבעה שלבי זחל², הופך אותו למתאים במיוחד לחקר מורכבות שיא בתנועה. בעוד שמחקרים קודמים התמקדו בירידה במבנה העצבי כדי להסביר שינויים הקשורים לגיל בתנועה^34,39, העבודה שלנו מקשרת את השינויים הפיזיים הללו לדינמיקה הכאוטית הבסיסית של המערכת. השילוב של DOD עם דינמיקה לא ליניארית מאפשר אפיון כמותי מדויק על פני סולמות אורך מרובים, ומציע תובנות חדשות לגבי המניעים העצביים של ההתנהגות. ה-LLE החיובי באופן עקבי לאורך שלבי ההתפתחות תומך מאוד בנוכחות התנהגות כאוטית במערכת התנועה.

מחקר זה מציע מסגרת מתודולוגית חדשה לבחינת שינויים התנהגותיים הקשורים לגיל ב-C. elegans, ובכך מרחיב את ההבנה הנוכחית של המתאמים הביולוגיים והדינמיים של ירידה מוטורית. הוא מאמת עוד יותר את השימוש ב-LLE כסמן ביולוגי רגיש לשינויים נוירולוגיים הקשורים לגיל ומדגים כי ה-LLE הוא מדד כמותי אמין של דינמיקה תנועתית המושפעת מהזדקנות.

DOD היא שיטה רבת עוצמה ולא פולשנית לכימות תנועה וכאוס באורגניזמים מיקרוסקופיים, שעדיף לראות אותה כמשלימה לניתוח וידאו ולא כתחליף. ביישום הנוכחי שלו, הניסוי דורש שהנמטודות יהיו בנות שלושה ימים לפחות, מכיוון שתולעים צעירות יותר קטנות מכדי לייצר אותות עקיפה אמינים. סדרת הזמן החד-ממדית המופקת מנקודה אחת בתבנית העקיפה דוחסת בהכרח מידע מרחבי, שיכול לטשטש דינמיקה מקומית לאורך גוף האורגניזם. גישות רב-ערוציות עוזרות לטפל במגבלה זו על ידי אימות עקביות הפרמטרים על פני שדה העקיפה, אם כי עדיין ניתן להתעלם מהטרוגניות מרחבית עדינה. הערכה מדויקת של ה-LLE תלויה עוד יותר בהשגת סדרות זמן ארוכות מספיק ונטולות רעש; אתגרים מעשיים כגון תנועת תולעת מחוץ לקרן או תנודות סביבתיות יכולים לפגוע באיכות הנתונים ולהפחית את הביטחון בערכי LLE. כמו בכל שיטות הניסוי, רעש מדידה והחלטות סובייקטיביות במהלך התאמת LLE מציגים אי ודאות נוספת, אשר עבור מדידות בודדות נשארת בדרך כלל בטווח של כ-15%.

העבודה העתידית תתמקד במדידת ה-LLE בתנאי ניסוי שונים, מה שיאפשר השוואות בין LLEs מודלים ונמדדים. זה יקל על פיתוח מודלים נוירולוגיים מנבאים שיכולים להעמיק את ההבנה שלנו כיצד שליטה מוטורית מורכבת מופיעה ומתדרדרת עם הזמן. אנו גם נמשיך לחקור את העקביות של הממצאים שלנו על ידי חקירת שיטות חישוביות אחרות, כגון חישוב מישור האנטרופיה-סיבוכיות כדי לאמת שוב את האופי הדטרמיניסטי של מערכת ביולוגית זו⁴⁰.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2 מראות אלומיניום קדמיות	Thorlabs	PF10-03-F01
לייזר HeNe 632 ננומטר	ניופורט	LGX1	כל לייזר אור אדום
צלחת פטרי ריקה	קרוליינה	971632	צלחות פטרי מפלסטיק שבהן אנו שופכים את אגר הצמיחה של הנמטודות
Escherichia coli K12, חי, מארח בקטריופאג'	קרוליינה	124500	שימש כמקור מזון ל-C. elegans; OD600
מיקרוסקופ לייקה S9i	לייקה מיקרוסיסטמס	LED2500	מיקרוסקופ ניתוח
מצית	ביק לייטרס		כל כלי חיטוי המשמש לעקר הפיק לפני ואחרי איסוף כל תולעת
MATLAB	MathWorks		אלגוריתם-שגרת רוזנשטיין בפורום MATLAB שנוצרה על ידי מרב קיזילקאיה
אגר גדילה של נמטודות	קרוליינה	173520	בקבוק מדיה מוכן, 135 מ"ל
פוטודיאודה	Thorlabs	DET36A	גלאי Si מוטה 350-1100 ננומטר
Picoscope5204	טכנולוגיית פיקו	עמ' 376	אוסצילוסקופ PC www.picotech.com
בחירת פלטינה			שימש לאיסוף C. elegans; זהו פיק קטן בעבודת יד עם חתיכת זכוכית ידנית וכף פלטינה;
קוורץ-קובט	תאי סטארנה	21/G/5	ממולאת במים מזוקקים כדי לשים את C. elegans בפנים