הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיית סידן in vivo ו-ex-vivo של נוירון במעגל הריח בזחל Drosophila melanogaster בכוכב השלישי

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68956

⸱

31 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Nevada, Reno, 2Integrative Neuroscience Program, University of Nevada, Reno, 3Molecular Biosciences Program, University of Nevada, Reno, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקולי הדמיית סידן עבור נוירון ריח של זחל דרוזופילה, באמצעות דבק רקמות מקומי לקיבוע. שיטה זו משפרת את היציבות, ומאפשרת ניסויים אמינים in vivo ו-ex-vivo. סקריפטים מותאמים אישית של R מנתחים אותות סידן, ומספקים פלטפורמה יעילה למחקר נוירופיזיולוגי מפורט.

תקציר

הדמיית סידן חיונית לחקר הדינמיקה העצבית ותפקוד המוח. עם זאת, השיטות הנוכחיות להדמיית סידן בזחלי דרוזופילה מאתגרות בשל חפצי תנועה וצרכי ציוד מיוחדים. כאן, אנו מציגים שיטה מעשית בעלות נמוכה לביצוע הדמיית סידן הן in vivo והן ex vivo בזחלי דרוזופילה כוכב שלישי, תוך שימוש בדבק רקמות מקומי לקיבוע דגימות. אנו מספקים גם סקריפטים מותאמים אישית של R ומסגרת לניתוח נתונים, המאפשרים מדידות של שינויים בסידן בתנאי ניסוי שונים. באמצעות גישה זו, רשמנו בהצלחה מעברי סידן בזוג נוירונים של מערכת העצבים המרכזית של הזחל עם חפצי תנועה מינימליים, והדגמנו יכולת שחזור על פני התכשירים. השיטה תואמת למערכות קונפוקליות סטנדרטיות של דיסק מסתובב וניתן להתאים אותה להגדרות עשה זאת בעצמך או מסחריות של שני פוטונים, מה שהופך אותה לנגישה למעבדות עם משאבים שונים. גישה זו עשויה להגביר את הנגישות למחקרי הדמיית סידן של זחלים וניתן להתאים אותה לבחינת ההשפעות של גירויים חיצוניים, כגון ריחות, וגירויים פנימיים, כגון נוירומודולטורים.

מבוא

הבנת דינמיקת הסידן בתאי עצב היא חיונית לחשיפת המנגנונים המורכבים העומדים בבסיס איתות עצבי ותפקוד המוח, שכן יוני סידן ממלאים תפקיד מרכזי בוויסות הפעילות העצבית והנעת תגובות תאיות לגירויים. ניתן לנטר את דינמיקת הסידן העצבית באמצעות הדמיית סידן, המספקת תובנות בזמן אמת לגבי איתות בתיווך סידן על פני מגוון רחב של אורגניזמים, כולל זחל הדרוזופילה. זחל הדרוזופילה מתגלה כמערכת מודל רבת עוצמה לחקר תפקוד המעגל העומד בבסיס ההתנהגות. זהו אחד משלושת האורגניזמים היחידים שעבורם נוצר קונקטום מוחי שלם ברזולוציה סינפטית1. הזחל מתאים למגוון כלים מתוחכמים המאפשרים הדמיה ומניפולציה של נוירונים הן ברמת המוח השלם והן ברמת הנוירון הבודד 2,3.

היכולת למדוד דינמיקת סידן בתאי עצב של זחלי דרוזופילה באמצעות הדמיית סידן הייתה חיונית לקידום המחקר במדעי המוח4. ההתקדמות האחרונה בהדמיית סידן אפשרה למדוד דינמיקת סידן ברמה של סינפסות בודדות בזחל5 לרישומים רב-עצביים בזחלים הנעים בחופשיות6. הדמיית סידן יכולה להתבצע in vivo, כאשר אירועי סידן נלכדים בהקשרים פיזיולוגיים טבעיים של הזחל השלם 4,7,8,9, או ex vivo, כאשר אירועי סידן נרשמים ברקמות זחל מנותחות שנשמרו בתנאים פיזיולוגיים מדומים10. בסך הכל, חוקרים השתמשו באיטרציות שונות של שיטת הדמיית הסידן בזחלי דרוזופילה כדי לחשוף מנגנונים בסיסיים של מעגלים עצביים, תחושות, למידה וזיכרון והתנהגות 8,11,12,13,14,15,16,17 . עם זאת, מחקרי הדמיית סידן של זחלים מוגבלים בשל הצורך בציוד מיוחד ובעיות בפירוש נתונים עקב חפצי תנועה.

כאן, אנו מציגים מתודולוגיה חסכונית וניתנת ליישום בקלות עבור הדמיית סידן in vivo ו-ex vivo בזחלי Drosophila melanogaster בכוכב שלישי. אנו מדמים דינמיקת סידן ב- Keystone-LN, נוירון מעגל ריח מעכב18,19, בתוך תכשירי זחל שלמים להצגת הדמיית סידן in vivo, ובמוחות זחלים מנותחים כדי להציג הדמיית סידן ex vivo. זחלים שלמים ומוחות מנותחים נשארים ברי קיימא ומגיבים במשך כ-10-15 דקות בתנאי ההדמיה שלנו, מה שמאפשר רכישת ניסויי גירוי מרובים לכל דגימה. כדי להתמודד עם האתגר של קיבוע זחלים שלמים או דגימות רקמה תוך שמירה על כדאיות הרקמה והפחתת השונות הניסיונית, ייעלנו את השימוש ב-GLUture, דבק רקמות מקומי ציאנואקרילט תואם ביולוגית.

בהשוואה לשיטות קיבוע זחלים מסורתיות, כגון הטמעה או הצמדה של אגרוז, גישה מבוססת דבק זו מפחיתה את חפצי התנועה תוך שמירה על כדאיות הרקמות20,21; יחסית למערכות הדמיה דו-פוטוניות, מערך הדיסק המסתובב מוריד את עלויות המכשור ומשפר את הנגישות למעבדות מוגבלות במשאבים. לבסוף, אנו מתארים גישות הדמיה פשוטות, יחד עם סקריפטים R שפותחו בהתאמה אישית לניתוח נתונים. הגישה שלנו עשויה להגביר את הנגישות למחקרי הדמיית סידן של זחלים וניתן להתאים אותה לבחינת ההשפעות של גירויים חיצוניים, כגון ריחות, וגירויים פנימיים, כגון נוירומודולטורים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת זחלי דרוזופילה כוכב שלישי להדמיית סידן

  1. שמור על זבובים על מזון זבובים סטנדרטי (ראה טבלת חומרים) ב-25 מעלות צלזיוס, עם לחות יחסית של 50-60% (לחות יחסית) ומחזור אור/חושך של 12 שעות.
  2. כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) לזיהוי נוירונים ו-GCaMP6f (אינדיקטור סידן) בתאי העצב המעניינים ('X'), הכלאה של נקבות בתולות מקו X-Gal4 עם זכרים הנושאים UAS-GCaMP6f ו-UAS-tdTomato22.
    הערה: במחקר זה, נעשה שימוש בקו Keystone-Gal4 כדי להניע ביטוי של tdTomato ו-GCaMP6f בזוג יחיד של נוירונים מקומיים מעכבים (Keystone-LNs) במוח הזחל18,19.
  3. לאחר שאפשרו לזכרים ולנקבות להזדווג ולהטיל ביצים במשך 48 שעות, העבירו את הבוגרים לבקבוקון טרי.
  4. חלץ זחלי כוכב שלישי (כ-120 שעות לאחר הטלת הביצים) על ידי הצפתם על תמיסת סוכרוז של 15%. השתמש במיקרופיפטה P1000 כדי להעביר את הזחלים הצפים לכוס זכוכית של 1,000 מ"ל.
  5. שטפו את הזחלים פי 3-4 על ידי החלפת המים בכוס ב-800 מ"ל מים מזוקקים טריים בכל פעם. אפשר לזחלים לנוח במשך 10 דקות לפני שתמשיך בשאר הפרוטוקול.

2. פרוטוקול רעב לזחלי דרוזופילה כוכב שלישי (אם בודקים תנאים מורעבים לעומת תנאים שאינם מורעבים)

  1. הכן שני תאי האכלה על ידי הנחת ריבוע קטן של מגבון מעבדה בכלי פטרי בגודל 6 ס"מ. לתנאים שאינם מורעבים, הוסף 350 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז 0.2 M; לתנאי רעב, הוסף 350 מיקרוליטר מים מזוקקים.
  2. העבירו מספר שווה של זחלים שטופים לכל תא האכלה. אפשר לזחלים לאכול מסוכרוז (לא מורעב) או מים מזוקקים (מורעבים) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.

3. הדמיית סידן in vivo

הערה: כל הניסויים הכוללים את דבק הרקמות צריכים להתבצע תוך שימוש בנוהלי בטיחות מעבדה סטנדרטיים. נדרש ציוד מגן אישי (PPE), כולל כפפות ניטריל, מעיל מעבדה ומשקפי מגן או מגן פנים; יש להימנע מכפפות כותנה עקב תגובות אקסותרמיות עם ציאנואקרילט. יש להימנע ממגע של הדבק עם העור, העיניים או הריריות. במקרה של הדבקת העור, יש להשרות את האזור במים חמים וסבון ולהפריד בעדינות; במקרה של חשיפה לעיניים, יש לשטוף במים פושרים למשך ≥5 דקות ולפנות לטיפול רפואי מיידי. יש להרחיק את הדבק מלהבות פתוחות וחום גבוה, מכיוון שדבק מרפא עלול לשחרר אדים מגרים אם הוא נשרף. יש לאחסן את הדבק בטמפרטורה של ≤30 מעלות צלזיוס, הרחק מלחות ומאור שמש ישיר, בכלי אטום היטב כאשר אינו בשימוש.

  1. הכן את מאגר הדמיית הסידן עם ההרכב הבא: NaCl 110 מ"מ, KCl 5.4 מ"מ, CaCl2 1.2 מ"מ, MgCl2 0.8 מ"מ, D-גלוקוז 10 מ"מ ו-HEPES 10 מ"מ. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש.
    הערה: תמיסת המלח המותאמת המכילה 110 מ"מ NaCl היא נוסחה מקובלת לדיסקציה והדמיה של מערכת העצבים המרכזית של הזחלים ונמצאת בטווח האופייני המשמש במחקרי אלקטרופיזיולוגיה והדמיה (≈108-128 מ"מ NaCl)23,24,25,26.
  2. על זכוכית כיסוי מיקרוסקופ בגודל 24X50 מ"מ (עובי 1.5 מ"מ), צור באר באמצעות ג'לי נפט המופץ ממזרק.
  3. יש להניח טיפה קטנה של דבק רקמות מקומי (60% 2-אוקטיל ו-40% n-בוטיל ציאנואקרילט) במרכז זכוכית הכיסוי. מורחים את הדבק באופן שווה לשכבה דקה ואחידה בעזרת מוט זכוכית.
  4. העבירו בזהירות זחל בודד על הדבק בעזרת מברשת או חוט דק. לחץ בעדינות את הצד הגחוני של הזחל על הדבק. הניחו לדבק להתייבש, וודאו שהזחל משותק לחלוטין.
  5. ברגע שהזחל משותק, הניחו את זכוכית הכיסוי על שלב המיקרוסקופ ההפוך (איור 1A).

4. הדמיית סידן Ex-vivo

  1. הכן את מאגר דיסקציה של הזחלים עם ההרכב הבא: NaCl 110 מ"מ, KCl 5.4 מ"מ, CaCl2 0.3 מ"מ, MgCl2 0.8 מ"מ, D-גלוקוז 10 מ"מ ו-HEPES 10 מ"מ. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש.
  2. נתח את נתיחות המוח כפי שתוארו על ידי אישימוטו וסנו10. בקצרה, בעזרת מברשת או חוט דק, מעבירים זחל בודד לצלחת פטרי בגודל 3.5 ס"מ עם שכבות סיליקון אלסטומר בתחתית.
  3. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מקם את הזחל כשהצד הגחוני שלו פונה כלפי מעלה ואתר את המוח. בעזרת מספריים לדיסקציה, חתכו כשליש מהדרך במורד הקצה הקדמי של הזחל. בצע חתך נוסף בווי הפה. שימור המוח תוך הסרת ווי הגוף והפה (מותאם מפרוטוקול27 של Janelia Flylight).
  4. זהה את אשכול העצבים המכילים נוירונים מוטוריים מחוט הגחון. בעזרת מלקחיים, משכו בעדינות את המוח הרחק משאר הזחלים המנותחים. חתוך את כל הרקמות העודפות מהמוח.
    הערה: טיפול עדין בכוח מוגזם עלול לגרום לנזק לרקמות מכיוון שהמוח שברירי.
  5. הכן זכוכית כיסוי מיקרוסקופ עם דבק הרקמות להדמיית סידן כמתואר בשלבים 3.2 עד 3.3.
  6. בעזרת מיקרופיפטה P10, שאפו בזהירות את המוח המנותח עם 5 מיקרוליטר של תמיסת דיסקציה מצלחת הפטרי. הוציאו לאט את המוח אל הדבק. לפני שהדבק מתייבש, כוונו את המוח למצב גבי כלפי מעלה (כאשר שתי אונות המוח פונות כלפי מטה וחוט הגחון הגבי כלפי מעלה).
  7. באמצעות מיקרופיפטה P200, העבירו 100 מיקרוליטר של מאגר הדמיית הסידן מעל מוח הזחל המשותק על זכוכית הכיסוי.
  8. הניחו את זכוכית הכיסוי עם המוח על המיקרוסקופ ההפוך, שמחובר למודול סורק קונפוקלי של דיסק מסתובב ולמצלמת CCD עבור דימות סידן (איור 1B).
    הערה: עבור תכשירים ex-vivo , הקפידו לכוון את המוח בצורה נכונה כשהדבק עדיין רטוב. לאיכות תמונה אופטימלית, מקם את המוח כך שה-ROI יהיה הקרוב ביותר למטרת המיקרוסקופ והימנע ממריחת דבק עודף ליד ה-ROI.

5. פרוטוקול הדמיה

  1. פתח את התוכנה להדמיית סידן באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי. צלם תמונות באמצעות אובייקט NA 10x/1.4 עם החלפת מסנן בין לייזר GFP (עירור 488 ננומטר, עוצמה 70%, פליטה 525 ננומטר/50 מ', OD8) ולייזר RFP (עירור 561 ננומטר, עוצמה 50%, פליטה 610 ננומטר/75 מ', OD8). הגדר את החשיפה בין 100 אלפיות השנייה ל-1,000 אלפיות השנייה, את הרווח ב-50% מערך החשיפה המתאים, ומקדם שילוב של 2 במהלך לכידת תמונה.
  2. כוונן את המיקרוסקופ להגדלה של פי 10 ואתר את המוח תחת תאורת שדה בהיר.
  3. זהה את הנוירון המעניין על ידי חיפוש האות tdTomato עם לייזר RFP (עירור מוגדר ל-561 ננומטר).
    הערה: בחר רוויה והפחת גאמה כדי להגדיר את ערך החשיפה הנכון.
  4. לאחר זיהוי אזור העניין (ROI), עבור ללייזר GFP (עירור מוגדר ל-488 ננומטר) כדי ללכוד אותות GCaMP6f. ודא שגם אותות tdTomato וגם GCaMP מתמקמים לפני צילום תמונות מחסנית של שני הערוצים.
    הערה: התאם את הגדרות התמונה עבור הקלטות מחסנית tdTomato ו-GCaMP6f כדי למקסם את הקרינה.
  5. צלם שתי הקלטות נפרדות של סדרות זמן של אותות tdTomato ו-GCaMP6f בו-זמנית בקצב של 0.5 פריימים לשנייה (בסך הכל 2 דקות).
    הערה: מוח הזחל המנותח נשאר בר-קיימא במשך כ-10 דקות בתנאי חציצה אלה; לאחר זמן זה, האותות יתדרדרו.
  6. לאחר שהדגימה מוכנה לתמונה, צלם שתי הקלטות נפרדות של סדרות זמן של אותות tdTomato ו-GCaMP6f בו-זמנית בקצב של 0.5 פריימים לשנייה (בסך הכל 2 דקות).
    הערה: מוח הזחל המנותח נשאר בר-קיימא במשך כ-10 דקות בתנאי חציצה אלה; לאחר זמן זה, האותות יתדרדרו.
    הערה: בעת ביצוע ניתוח כמותי, אנו ממליצים להגדיל את עוצמת הלייזר ולהתאים את רווח החשיפה לגלאי לפי הצורך תוך שמירה על קנה מידה של עוצמה ליניארית.

6. עיבוד וניתוח נתונים

  1. פתח וייבא את ערימות האותות tdTomato ו-GCaMP6f ל-ImageJ (NIH)28.
  2. כדי לזהות את אזור העניין הנכון (ROI), מזג את האותות tdTomato ו- GCaMP6f כדי לאשר קולקליזציה. לאחר האימות, פצל את ערוצי tdTomato ו-GCaMP6f.
  3. בתפריט העליון, בחר תוספים | חדש, ולחץ על פקודות מאקרו כדי ליזום מאקרו חדש. לאחר מכן, ייבא את פקודות המאקרו המותאמות אישית המבוססות על החזר ROI ל-ImageJ. בחר את מחסנית GCaMP6f ולחץ על הפעל לניתוח סידן.
  4. עבד את אותות הקרינה באמצעות מאקרו ImageJ מותאם אישית (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). המאקרו מייצר תחילה הקרנות בעוצמה מקסימלית, מבצע תיקון תנועה באמצעות התוסף StackReg (מצב רישום קשיח )29, ומחיל תיקון אקונומיקה.
  5. חלון קופץ "נדרשת פעולה" יופיע המבקש בחירת החזר ROI ידנית, המאפשרת למשתמשים לצייר באופן ידני החזר ROI רחב. לחץ על אישור כדי להמשיך בניתוח. כדי לבצע תיקון תנועה, ודא שהתיבה המלבנית מכסה את כל ההחזר על ההשקעה בכל המסגרות לתיקון תנועה מדויק תוך שמירה על צורה מרחבית מקומית והחזר ROI על פני מסגרות.
    הערה: ההקלטות נרשמו ב-ImageJ באמצעות StackReg. כאשר התנועה במישור הייתה גדולה (תזוזה מצטברת של XY > 1 מיקרומטר) או סחיפה צירית Z הובילה לאובדן מיקוד, הרישום הפך לא אמין, או שהדגימה אבדה לחלוטין מחלון ההדמיה. לפיכך, דגימות המציגות סחיפה קיצונית או ירידה באותות סידן (>30%) תויגו אוטומטית ולא נכללו בניתוח במורד הזרם כדי להבטיח מדידות מדויקות של פעילות עצבית. ספים אלה עולים בקנה אחד עם שיטות בקרת איכות נפוצות במחקרי הדמיית סידן 30,31,32,33. ההדרה גם הבטיחה שרק הקלטות יציבות עם מעברי סידן אמינים הקשורים לגירוי שימשו לניתוחים.
  6. לצורך הניתוח, חלץ עקבות פלואורסצנטיות מהחזר ROI מעגלי מוגדר ידנית, מונחה על ידי מתאם אוטומטי של פיקסלים; החזר ROI זה יקיף את כל תחום הנוירונים של Keystone.
    1. חלץ את נתוני עוצמת הקרינה הגולמיים עבור שני פלואורופורים: GCaMP6f/GFP ו-tdTomato/RFP, באמצעות פקודות מאקרו מותאמות אישית ב-ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, ראה טבלת חומרים).
    2. החל חלון הזזה עם החזר השקעה של 20 x 20 פיקסלים וגודל צעד של 10 פיקסלים על פני שדה הראייה. עבור כל החזר ROI, המאקרו יחשב: (1) את העוצמה בכל המסגרות, (2) את הפרש התנודות הבסיסי (כלומר, ההפרש בין ערכי העוצמה המקסימלית והמינימלית במהלך 10 הפריימים הראשונים), ו-(3) את שינוי העוצמה המקסימלי ממסגרת למסגרת (ΔF). החזר ROI המציגים תנודות עוצמה של פחות מ-10 יחידות יבוטלו, ורק ערכי ה-ΔF החדים ביותר ייבחרו לניתוח נוסף.
    3. נרמל את עקבות הקרינה בשיטות הבאות:
      1. נורמליזציה של Fmax ו-Fmin: חשב Δ מנורמל באמצעות הנוסחה:
        figure-protocol-1
        כאשר F היא הקרינה הגולמית בכל נקודת זמן, Fmin היא הקרינה המינימלית (קו הבסיס), ו-Fmax היא הקרינה המקסימלית במהלך ההקלטה.
      2. נורמליזציה של ΔF/F 0: בנוסף, בצע נורמליזציה של ΔF/Fo, כאשר Fo (קו בסיס) נקבע על ידי 10 הפריימים הראשונים של כל הקלטה, באמצעות הנוסחה:
        figure-protocol-2
        כאשר Ft הוא הקרינה בזמן t, ו-F0 הוא ערך הבסיס המחושב מ-10 הפריימים הראשונים.
  7. לאחר חילוץ אותות GCaMP6f, לחץ לחיצה ימנית ובחר הכל, גזור והדבק כדי להעביר את כל הערכים לגיליון אלקטרוני חדש של Excel. בשורת התפריטים העליונה, בוחרים באפשרות נתונים | טקסט לעמודות. יופיע חלון קופץ של אשף "טקסט לעמודה". בשלב 1, בחר מופרד ולאחר מכן לחץ על הבא. בשלב 2, תחת מפרידים, בחר טאב ופסיק ולאחר מכן לחץ על הבא. בשלב 3, בחר סיום.
    אופציונלי: כדי להתוות את אותות הסידן המנורמלים, סמן Fnorm_FminFmax ובחר Scatterplot.
  8. חפש קובץ .csv שנוצר המכיל: (1) ערכי פלואורסצנציה גולמיים F, (2) ΔF/Fo ו- (3) Fnorm (עוצמת פלואורסצנטיות מנורמלת). ארגן את מערך הנתונים הסופי לארבע עמודות: (1) זמן (מסגרות), (2) מצב דגימה (מורעב או מוזן), (3) מזהה שכפול (מדגם בודד), ו-(4) עוצמה מנורמלת (ערכי Fnorm בקנה מידה מ-0 ל-1).
  9. לבסוף, בצע ניתוח נתונים והדמיה ב-R באמצעות סקריפטים מותאמים אישית של R (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. ראה טבלת חומרים).
    1. ייבא את קובץ ה- Script המותאם אישית של R לפרוייקט R חדש. ודא שחבילות R הנדרשות, כולל ggplot2, dplyr ו-readr, מותקנות ומתעדכנות לפני הפעלת הניתוח.
    2. החל משורה 1 של סקריפט R המותאם אישית, לחץ על הפעל ברציפות כדי לבצע את ניתוח הסידן. כמו כן, ודא שהפלט כולל מפות חום הממחישות את עוצמת הסידן המנורמלת עבור 30 הפריימים הראשונים, 60 הפריימים וכל הפריימים של הקלטת סדרת הזמן, ותרשימים כדי להציג את החציון של העוצמות המנורמלות.
    3. העריכו את המשמעות של עוצמת סידן מנורמלת באמצעות מבחן Mann-Whitney U .

7. פינוי פסולת וטיהור

  1. לאחר ניסויים, הסר פסולת גסה מכלים ומשטחים מתחת למים זורמים, ולאחר מכן חיטוי עם 70% אתנול או 10% אקונומיקה ואחריו מים סטריליים. לעבוד על משטח מחוטא, ולשטוף ידיים לאחר הסרת הכפפות; אין לאכול או לשתות במעבדה.
  2. יש להניח רקמת זחל וכלים חד פעמיים מזוהמים בשקיות ביולוגיות ובחיטוי לפני השלכתם.
  3. השלך פסולת דבק שנרפאה במלואה באשפה כללית; יש לאסוף דבק לא מרפא וכלים חד פעמיים מזוהמים במיכל פסולת כימית מסוכנת אטום ומסומן.
  4. מניחים את כל החדים (להבים, מחטים, זכוכית שבורה) במיכל חד עמיד בפני פנצ'ר.
  5. אסוף ממיסים דליקים (אתנול, אצטון) במיכלי פסולת דליקים מסומנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להדגים את גישת הדמיית הסידן של הזחלים שלנו, יישמנו אותה בהצלחה על תכשירים in-vivo ו-ex-vivo של זחלי דרוזופילה (איור 2 ואיור 3, וידאו 1, וידאו 2, וידאו 3 ווידאו 4). מדדנו דינמיקת סידן בזחלי דרוזופילה מדרגה שלישית המבטאים GCaMP6f ו-Td-Tomato בזוג יחיד של Keystone-LNs במוח הזחל 18,19. כדי להציג מדידות השוואתיות, השוו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מתארים גישה להדמיית סידן in vivo ו-ex-vivo בזחלי Drosophila melanogaster כוכב שלישי. צילמנו דינמיקת סידן ב-Keystone-LN, נוירון מקומי מעכב בזחל הדרוזופילה . מדדנו את דינמיקת הסידן של Keystone-LN בתכשירים של זחלים שלמים (in vivo) ובתכשירים מנותחים של מוח הזחל (ex vivo) (איור 1).

בעבר ביצענו השוואות איכותיות בין GCaMP5, GCaMP6s ו-GCaMP6f עבור מספר קטן של זחלים. הסתפקנו ב-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

אנו אסירי תודה לד"ר ג'פרי הרפר, שהעמיד לרשותנו את המיקרוסקופ הקונפוקלי של הדיסק המסתובב של המעבדה שלו עבור הניסויים האלה. אנו אסירי תודה על המתנה של קו הזבובים: w; UAS-GCaMP6f/CyO, בכי; UAS-tdעגבנייה מד"ר ג'ונג הוואן קים. עבודה זו נתמכה על ידי כספים מהקרן הלאומית למדע תחת מספרי פרסים 2341202 ו-2129234. איור 1 נוצר באמצעות Biorender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Fly Stocks & אחזקה
מזון זבובי נוטריפלייםג'נסי סיינטיפיק66-112
UAS-GCaMP6f, tdTomatoמתנה מד"ר ג'יי.ה. קים  
w;; קיסטון-גאל4 (GMR27F08-GAL4)BDSC49232
פרוטוקול חומרים לרעב
צלחת פטרי באורך 6 ס"מג'נסי סיינטיפיק32-106G
סוקרוזהמיליפור סיגמאS0389-500G
מגיבים להדמיה ולחיתוך בופר
כלוריד סידןג'יי.טי. בייקר, אוונטור סיינסJT1311-1CAS: 1311-01, 500 גרם
D-(+)-גלוקוזתרמו פישר סיינטיפיקA16828.36CAS: 50-99-7, 500 גרם
HEPES-2-[4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיניל]-אתאנסולפוניק חומצהג'יי.טי. בייקר, אוונטור סיינסJT4018-1CAS: 4018-01, 100 גרם
כלוריד מגנזיוםVWR97064-150CAS: 7786-30-3, 100 גרם
כלוריד אשלגןתרמו פישר סיינטיפיקJ64189.36CAS: 7447-40-7, 500 גרם
כלוריד נתרןEMD מיליפור סיגמאEMD-SX0420-1CAS: 7647-14-5, 500 גרם
כלים ותגובות לניתוח
בופר דיסקציההחיבור מסופק בטקסט
צלחות פטרי של אולימפוס, 60 x 15 מ"מ מאווררג'נסי סיינטיפיק32-105
בסיס אלסטומר סילגארד 184מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים24236-10A
סוכן ריפוי בסיס סילגארד 184 אלסטומרמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים24236-10B
פינצטה בסגנון 5, EMSמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים78320-5
מספריים קפיץ של ואנאס - קצה חיתוך 3 מ"מכלי המדע המדויק15000-00
ציוד/חומרים להדמיה והרכבה
מודול סורק קונפוקלייוקוגאווהCSU-W1מחובר למיקרוסקופ
בופר הדמיההחיבור מסופק בטקסט
מיקרוסקופ הפוךלייקה מיקרוסיסטמסDMi8 מחובר למודול סורק קונפוקלי דיסק מסתובב ומצלמת CCD
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ, 24 מ"מ על 50 מ"מ, #1.5 עוביגלוב סיינטיפיק בע"מ.1415-15
דבק טופיקלי של MWI Veterinary GLUTUREפישר סיינטיפיקNC0632797
ג'לי פטרוליום טהורוולגרינס912556
קישורים למשאבים זמינים לציבור
BioRenderhttps://www.biorender.com/
ImageJNIH912556https://imagej.net/ij/
סרטון פרוטוקול ג'נליה פליילייטhttps://www.janelia.org/https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o
מתיו לאב בגיטהאבhttps://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging

מקורות

  1. Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379 (6636), eadd9330(2023).
  2. Eschbach, C., Zlatic, M. Useful road maps: studying Drosophila larva's central nervous system with the help of connectomics. Curr Opin Neurobiol. 65, 129-137 (2020).
  3. Aimon, S., Grunwald Kadow, I. C. Studying complex brain dynamics using Drosophila. J Neurogenet. 34 (1), 171-177 (2020).
  4. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  5. Fukumasu, K., Nose, A., Kohsaka, H. Extraction of bouton-like structures from neuropil calcium imaging data. Neural Netw. 156, 218-238 (2022).
  6. Yamaguchi, A., et al. Multi-neuronal recording in unrestrained animals with all acousto-optic random-access line-scanning two-photon microscopy. Front Neurosci. 17, 1135457(2023).
  7. Marescotti, M., Lagogiannis, K., Webb, B., Davies, R. W., Armstrong, J. D. Monitoring brain activity and behaviour in freely moving Drosophila larvae using bioluminescence. Sci Rep. 8 (1), 9246(2018).
  8. Si, G., et al. Structured odorant response patterns across a complete olfactory receptor neuron population. Neuron. 101 (5), 950-962.e7 (2019).
  9. Ji, H., Han, C. Larvaspa, a method for mounting Drosophila larva for long-term time-lapse imaging. J Vis Exp. (156), e60792(2020).
  10. Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in Drosophila. J Vis Exp. (136), e57701(2018).
  11. Maier, G. L., Komarov, N., Meyenhofer, F., Kwon, J. Y., Sprecher, S. G. Taste sensing and sugar detection mechanisms in Drosophila larval primary taste center. Elife. 10, (2021).
  12. Carreira-Rosario, A., York, R. A., Choi, M., Doe, C. Q., Clandinin, T. R. Mechanosensory input during circuit formation shapes Drosophila motor behavior through patterned spontaneous network activity. Curr Biol. 31 (23), 5341-5349.e4 (2021).
  13. Yoon, Y., et al. System level analysis of motor-related neural activities in larval Drosophila. J Neurogenet. 33 (3), 179-189 (2019).
  14. Vaadia, R. D., et al. Characterization of proprioceptive system dynamics in behaving Drosophila larvae using high-speed volumetric microscopy. Curr Biol. 29 (6), 935-944.e4 (2019).
  15. Utashiro, N., Williams, C. R., Parrish, J. Z., Emoto, K. Prior activity of olfactory receptor neurons is required for proper sensory processing and behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 8 (1), 8580(2018).
  16. Gillespie, J. M., Hodge, J. J. CASK regulates CaMKII autophosphorylation in neuronal growth, calcium signaling, and learning. Front Mol Neurosci. 6, 27(2013).
  17. Francis, J., et al. Inhibitory circuit motifs in Drosophila larvae generate motor program diversity and variability. PLoS Biol. 23 (4), e3003094(2025).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. Elife. 5, (2016).
  19. Odell, S. R., et al. Internal state affects local neuron function in an early sensory processing center to shape olfactory behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 12 (1), 15767(2022).
  20. Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J Neurophysiol. 100 (2), 868-878 (2008).
  21. Marley, R., Baines, R. A. Dissection of third-instar Drosophila larvae for electrophysiological recording from neurons. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (9), (2011).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Held, M., et al. Aminergic and peptidergic modulation of insulin-producing cells in Drosophila. Elife. 13, (2025).
  24. Kim, S. M., Wang, J. W. Calcium imaging of pheromone responses in the insect antennal lobe. Methods Mol Biol. 1068, 179-187 (2013).
  25. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol [A]. 175 (2), 179-191 (1994).
  26. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).
  27. Larval Dissection. , Howard Hughes Medical Institute. https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o (2019).
  28. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: an open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  29. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  30. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  31. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  32. De Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nat Neurosci. 23 (1), 138-151 (2020).
  33. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with a positively tuned voltage indicator. Nat Commun. 16 (1), 6396(2025).
  34. Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145 (1), 133-144 (2011).
  35. Slankster, E., et al. Mechanism underlying starvation-dependent modulation of olfactory behavior in Drosophila larva. Sci Rep. 10 (1), 3119(2020).
  36. Lehnert, B. P., Baker, A. E., Gaudry, Q., Chiang, A. S., Wilson, R. I. Distinct roles of TRP channels in auditory transduction and amplification in Drosophila. Neuron. 77 (1), 115-128 (2013).
  37. Murthy, M., Turner, G. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 140-148 (2013).
  38. Giovannucci, A., et al. CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
  39. Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
  40. Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

לרבה של הברושקה (Drosophila)דימוי In Vivoדימוי Ex Vivoמיקרוסקופ קונפוקאלי בעל דיסק מסתובבתיקון תנועהפלואורסצנציית GCaMP6fקיבוע רקמהניתוח ROI
הדמיית סידן in vivo ו-ex-vivo של נוירון במעגל הריח בזחל Drosophila melanogaster בכוכב השלישי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.