הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פיתוח קווי תאים עמידים לתרופות להליכים ניסיוניים

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68957

⸱

12 באוגוסט 2025

 ,  ,  , 
1Department of Urology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Urology, Kanazawa University, 3Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor, 4Single Cell Spatial Analysis Program, University of Michigan, Ann Arbor

במאמר זה

סיכום

קווי תאים עמידים לתרופות מאפשרים הבנה של מנגנוני עמידות לטיפול והערכה לא קלינית של תרכובות חדשות, תרופות ייעודיות וטיפולים משולבים. מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת קווי תאים עמידים על ידי חשיפת קווי תאי האב לעלייה הדרגתית בריכוז תרופת המטרה.

תקציר

פיתוח קווי תאים עמידים לתרופות חיוני להבנת מנגנוני העמידות לתרופות וזיהוי אסטרטגיות להתגברות על כישלון הטיפול בטיפול בסרטן. מודלים של עמידות מאפשרים הערכה פרה-קלינית של תרכובות חדשות, תרופות ייעודיות וטיפולים משולבים. כדי ליצור תאים עמידים, קווי תאי סרטן ההורים נחשפים שוב ושוב לריכוזים הולכים וגדלים של תרופת המטרה במשך מספר שבועות. תאים ששורדים ומתרבים בכל שלב נבחרים, מורחבים ונחשפים למינונים גבוהים יותר של תרופות. התפתחות העמידות מאושרת על ידי כימות והשוואה של ערכי ריכוז מעכב חצי מקסימלי (IC50) בין תאים הוריים לתאים עמידים באמצעות מבחני כדאיות תאים וניתוח רגרסיה לא ליניארית. ערכי IC50 מוגברים משמעותית מצביעים על הסתגלות מוצלחת ללחץ תרופתי והתפתחות עמידות. קווי תאים עמידים לתרופות אלה זמינים לניתוח מקיף, כגון מיקרו-מערך וריצוף תאים בודדים, כמו גם ניסויים שונים במבחנה או in vivo . מודלים אלה מספקים כלים רבי ערך לחקירת אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות להתגברות על עמידות לתרופות.

מבוא

כימותרפיה היא אפשרות הטיפול הנפוצה ביותר לסרטן מקומי שאינו מתאים לניתוח או הקרנות או סרטן גרורתי. תרופות ממוקדות מולקולרית וכימותרפיה משמשות כטיפולי קו ראשון לממאירות רבות, ויעילותן מוכרת באופן נרחב. חלק מסוגי הסרטן מראים עמידות לתרופות מסוימות מתחילת הטיפול, מה שהופך את הטיפול ללא יעיל. עם זאת, במקרים נפוצים יותר, טיפול שהיה יעיל בתחילה הופך ללא יעיל עקב התפתחות עמידות לתרופות, מה שמוביל להתקדמות הסרטן.

עמידות לתרופות נגרמת הן על ידי מוטציות גנטיות והן על ידי תגובה אפיגנטית בתאי סרטן הגורמים לביטוי של תוצרי גנים המתחמקים מתרופות או מסייעים לצמיחת תאים 1,2. יתר על כן, במקרים רבים, עמידות זו מתפתחת לעמידות מרובת תרופות, כאשר התא הסרטני הופך עמיד למספר תרופות 3,4. לכן, זיהוי מנגנוני העמידות לתרופות ופיתוח אסטרטגיות להתגברות עליה חשובים ביותר לקידום הטיפול בסרטן.

קווי תאים עמידים לתרופות משמשים לעתים קרובות מודלים לחקר מנגנוני העמידות הטיפולית וממלאים תפקיד חשוב הן בניסויים במבחנה והן בניסויים in vivo 5. מודלים אלה הם כלים חיוניים להשגת הבנה מעמיקה יותר של מסלולי הפעולה של תרופות, זיהוי סמנים ביולוגיים המשפיעים על היעילות הטיפולית ומציאת אסטרטגיות טיפוליות לעיכוב היווצרות עמידות לתרופות. התהליך הבסיסי של יצירת קו תאים עמיד לתרופות הוא לגרום לעמידות על ידי חשיפת קו תאים לרמות הולכות וגדלות של תרופת המטרה 3,6.

הריכוז בו נעשה שימוש ומשך החשיפה לתרופה הם מרכיבים קריטיים בתהליך זה. בכל רמת ריכוז, תת-קבוצת התאים ששורדים מוגברת ואז נחשפת לריכוז הבא של התרופה באופן חוזר. בסופו של דבר, נגזר קו תאים עמיד לתרופות בעל ריכוז מעכב חצי מקסימלי מוגבר (IC50) לתרופה בהשוואה לקו התאים ההורי. דוח זה מפרט את ההליך ליצירת קו תאים עמיד לפקליטקסל (DU145-TxR) מקו תאי סרטן הערמונית האנושי DU145, תוך שימוש בשיטה מדורגת עם חשיפה לתרופות לסירוגין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מבחני תרבית תאים וכדאיות תאים

הערה: פקליטקסל היא תרופה אנטי סרטנית והיא ציטוטוקסית. בעת הטיפול בו, יש ללבוש חלוק, משקפי מגן וכפפות, ולעבוד בתוך ארון בטיחות כדי למנוע שאיפה לגוף. DMSO אינו ציטוטוקסי במיוחד, אך כאשר הוא בא במגע עם עור או ריריות, החדירות של תרופות מומסות עולה, לכן יש ללבוש חלוק, משקפי מגן וכפפות בעת הטיפול בו.

  1. תרבית תאי DU-145 בצלחת תרבית תאים בגודל 10 ס"מ באמצעות מדיום שלם (RPMI-1640 + 1% פניצילין-סטרפטומיצין [pen-strep] + 10% סרום בקר עוברי [FBS]) באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 עד 80% קונפלונט.
  2. שאפו את מדיום התרבות, שטפו עם DPBS, הוסיפו 0.05% טריפסין והשאירו בחממה למשך 5 דקות.
  3. לאחר הקשה ואישור במיקרוסקופיה שהתאים מנותקים מהצלחת וצפים, הוסף 1 מ"ל של מדיום שלם כדי לעצור את פעולת הטריפסין.
  4. ספרו את מספר התאים וזרעו אותם בצפיפות של 1.0 × 104/99 מיקרוליטר לבאר במדיום שלם בכל באר של צלחת של 96 בארות. דגירה למשך שעתיים כדי לאפשר לתאים להיצמד לתחתית הצלחת. יש לצבוע תאים בשלוש או ארבע עבור כל קבוצת בדיקה.
  5. התאם את הפקליטקסל וה-DMSO שיתווספו לכל באר. ודא שכמות ה-DMSO שנוספה לכל באר זהה, ושהריכוז הסופי של DMSO אינו עולה על 1%.
    1. כדי לבצע זאת ולעקוב אחר הפרוטוקול שלנו, התחל עם 10 מ"מ פקליטקסל ב-DMSO והוסף 87.2 מיקרוליטר של DMSO ל-12.8 מיקרוליטר של תרופה זו בשפופרת כדי להשיג 100 מיקרוליטר פקליטקסל ב-1,280 מיקרומטר.
    2. מעבירים 50 מיקרוליטר מתמיסה זו לצינור אחר ומדללים אותה לחצי חוזק עם 50 מיקרוליטר DMSO (640 מיקרומטר).
    3. חזור על הליך זה כדי לבצע דילול סדרתי ולהכין תמיסות של פקליטקסל בריכוזים של 0 (DMSO בלבד), 0.1, 0.5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 ו-1,280 מיקרומטר.
      הערה: יש לאחסן פקליטקסל מדולל ב-DMSO קפוא לשימוש חוזר בניסויים הבאים (כדי למזער מחזורי הקפאה-הפשרה, יש לאחסן במכסות).
  6. יש לדלל 1 מיקרוליטר מתמיסת הפקליטקסל שהוכנה קודם לכן עם 9 מיקרוליטר של מדיום שלם בצינור נפרד, ולהוסיף 1 מיקרוליטר מזה לכל באר שעתיים לאחר זריעת התאים. ריכוזי הפקליטקסל בכל באר יהיו 0, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 ו-1,280 ננומטר, כאשר כל באר מכילה 100 מיקרוליטר של תווך.
    הערה: בעת קביעת ריכוז התרופות המשמשות במבחני כדאיות התאים, בדוק את ערכי ה-IC50 שפורסמו במאמרים קודמים וודא שהריכוז נופל בטווח3. ריכוז ה-DMSO בכל באר היה 0.1% לאורך כל הדרך (פחות מ-1% רצוי).
  7. דגירה למשך 48 שעות. הוסף 10 מיקרוליטר של מגיב התפשטות תאים WST-1 לכל באר (100 מיקרוליטר של מדיום תרבית) ודגר למשך 0.5 עד 4.0 שעות נוספות.
    הערה: זמן הדגירה האופטימלי תלוי בקו התאים ובצפיפות התאים. במחקר הזה תרבינו תאים במשך כשעה וחצי. אם זמן הדגירה קצר מדי או ארוך מדי, הספיגה של כל באר תהיה נמוכה מדי או גבוהה מדי בשלב הבא. כתוצאה מכך, לא ניתן יהיה לאשר את ההבדל בכדאיות התאים. לפיכך, לבדיקה הראשונית, יש לבדוק מספר זמני דגירה כדי לאשר את זמן הדגירה המתאים.
  8. מדוד את ספיגת WST-1 באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
    הערה: ספיגת היעד היא 450 ננומטר (מומלץ 420-480 ננומטר), וספיגת הרקע היא 650 ננומטר (מומלץ 600 ננומטר ומעלה).

2. חישוב כדאיות התא וערך ריכוז מעכב חצי מקסימלי (IC50)

  1. חשב את כדאיות התא מספיגה. הספיגה היא (A450nm-A650nm).
    כדאיות התא (%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100
    כמו: ספיגת דגימה (תאים שטופלו בתרופות)
    בט: ספיגה ריקה (בינונית בלבד, ללא תאים)
    AC: בקרת ספיגה (תאים לא מטופלים בתרופה)
  2. סכם את כדאיות התא שחושבה בסעיף הקודם בתוכנת גיליון אלקטרוני.
  3. חשב ורשום את ה-IC50 עבור תאי ההורה על ידי ניתוח רגרסיה לא ליניארית.
    הערה: המודל הלוגיסטי של ארבעת הפרמטרים (4PL) הוא לרוב שיטת חישוב מתאימה. כלי חישוב מקוונים של IC50 זמינים7. עם זאת, אין להשתמש במודל 4PL כאשר יעילות התרכובת נמצאת מחוץ לטווח הריכוז, והנתונים אינם יכולים לייצג באופן מלא את האסימפטוטות התחתונות והעליונות של עקומת הסיגמואיד.
    1. כדי למנוע עלייה כזו, מדוד את כדאיות התאים בכמה שיותר נקודות ריכוז. אם לא ניתן להשיג עקומת סיגמואיד, השתמש במצב של שניים או שלושה פרמטרים עם ערכי מינימום ומקסימום קבועים7.
    2. אם אינך משתמש בתוכנת חישוב או בתוכנה סטטיסטית, כולל אלה הזמינות באינטרנט, השתמש בנוסחה הבאה:
      IC50=((50-C)(B-A) + A(D-C))/(D-C)
      ת: הערך הנמוך ביותר מבין ריכוזי התרופה שנמדדו עם כדאיות תאים של ≤50%
      B: הערך הגבוה ביותר מבין ריכוזי התרופה שנמדדו עם כדאיות תאים של >50%
      C: כדאיות התא ב-B
      D: כדאיות התא ב-A
      הערה: נוסחה זו מניחה שהגרף בין שתי הנקודות המרכיבות את ערך IC50 הוא קו ישר.

3. חשיפה לסמים

הערה: סקירה כללית של ההליכים המתוארים בסעיף זה מוצגת באיור 1.

  1. תאי הורה של זרעים על צלחות תרבית תאים (2.0 × 106 תאים לצלחת של 100 מ"מ).
  2. הוסף פקליטקסל בריכוז מעכב כדאיות תא של ~10-20% (IC10-20, ~0.5 ננומטר במקרה זה) למדיום ותרבית בחממה למשך יומיים.
  3. מחליפים במדיום נטול פקליטקסל ודוגרים למשך מספר ימים.
  4. לאחר שהתאים גדלו והפכו ל-80% מתלכדים, העבירו אותם לצלחת תרבית תאים חדשה. שימור הקפאה של התאים הנותרים.
  5. הוסף פקליטקסל לתאים המועברים בריכוז של ~1.5-2.0 פעמים מהריכוז ההתחלתי (0.75-1 ננומטר). דגירה בחממה למשך יומיים.
  6. מחליפים במדיום נטול פקליטקסל ודוגרים למשך מספר ימים.
  7. אם התאים גדלים באופן דומה, חזור על שלבים 3.4-3.6, והגדל את ריכוז החשיפה לפקליטקסל צעד אחר צעד.
    הערה: העלייה בריכוז התרופה (פי 1.5-2.0) יכולה להיות מוגדרת באופן חופשי על ידי הנסיין, ויש לחזור על הניסוי בריכוז זה. אנו ממליצים להקפיא ולאחסן את התאים בכל פעם שריכוז התרופה עולה. אם ריכוז הפקליטקסל ממשיך לעלות עוד יותר, התפשטות התאים עלולה שלא להתאושש, והתאים עלולים למות. במקרים כאלה, יש להפשיר את התאים שהתרבו בריכוז לפני המוות, להפחית את עליית הפקליטקסל פי 1.1-1.5 (מומלץ פי 1.2), ולחזור על התרבית.
  8. הגדל בהדרגה את ההתנגדות של קו התאים לתרופה ולאחר מכן, חשב ורשום את ה-IC50 באמצעות WST-1 ותוכנה כמתואר בסעיף 2.
    הערה: אם נצפתה עלייה ב-IC50 של לפחות פי 3-5, ניתן לקבוע שהזן הוא קו תאים עמיד לתרופות.

4. שמירה על עמידות לתרופות

  1. כדי לשמור על הפנוטיפ העמיד של קו התאים העמיד לתרופות, דגרו עם ריכוז תרופה של IC10-20.
    הערה: מומלץ למדוד את ה-IC50 בבדיקת הישרדות תאים מעת לעת, מכיוון שעמידות לתרופות עשויה להשתנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות שיטה זו, בילינו בעבר 9 חודשים בהקמה מוצלחת של תאי DU145 עמידים לפקליטקסל (DU145-TxR). תוצאות בדיקת כדאיות התא הראו שערך ה-IC50 של פקליטקסל עבור קו תאי האב DU145 היה 1.1 ננומטר, בעוד שערך ה-IC50 עבור DU145-TxR היה גבוה פי 149.6 מזה של קו תאי האב (IC50: 164.6 ננומטר) (טבלה 1 ואיור 2). תוצאה זו מצביעה על כך ש-DU145-TxR רכש עמידות גבוהה מאוד לתרופות.

מורפולוגיה של התא נצפתה באמצעות מיקרוסקופיה הפוכה דיגיטלית מי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פיתוח קווי תאים סרטניים עמידים לתרופות הוא שיטה מבוססת לחקר מנגנוני רעילות ועמידות לתרופות, אך האתגר הראשון העומד בפני החוקרים הוא בחירת מודל מתאים לביטוי עמידות. שיטה נפוצה ליצירת קווי תאים עמידים לתרופות במבחנה היא חשיפת קו התאים לתרופת המטרה, אך יש לשקול כיצד להגדיר את ריכוז החשיפה (בשלבים או בבת אחת) והאם לקבוע תקופה ללא תרופות (פועמת או רציפה).

שיטת הדופק, עם התקופה נטולת התרופות שלה, דומה לחולה סרטן שעובר מספר מחזורי כימותרפיה, שכן יש תקופה קצרה של חשיפה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים פוטנציאליים.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק P01 CA093900 של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% Trypsin-EDTAGibco25300-054
10 מ"ל פיפטה סרולוגית חד פעמיתפישר מדעי13-678-11E
צלחת 100 מ"מ צלחתקורנינג353003
15 מ"ל צינור חרוטי352097
2.0 מ"ל בקבוקונים קריוגנייםקורנינג431386
96 באר צלחתתרבית תאיםקורנינג353072
תא ספירת תאים שקופיתInvitrogenC10228
מגיב התפשטות תאים WST-1סיגמא5015944001
צנטריפוגה 5702 Reppendorf
אינספור IIInvitrogenתאי
דלפק דימתיל סולפוקסיד SigmaD2650
DPBSGibcoD4W2J
DU145ATCCHTB-81קו תאי סרטן הערמונית
EVOS FLcתרמו פישר סיינטיפיקדיגיטלי הפוך מיקרוסקופ
FBSGibcoA5670701
PaclitaxelSelleckS1150
פניצילין– סטרפטומיציןInvitrogen15140-122
RPMI 1640Gibco11875-093
Synergy H1BioTekMicroplate
Reader תמיסת Trypan Blue 0.4%Invitrogen15250061

מקורות

  1. Zahreddine, H., Borden, K. L. Mechanisms and insights into drug resistance in cancer. Fron Pharmacol. 4, 28(2013).
  2. Emran, T. B., et al. Multidrug resistance in cancer: understanding molecular mechanisms, immunoprevention and therapeutic approaches. Fron Oncol. 12, 891652(2022).
  3. Takeda, M. The establishment of two paclitaxel-resistant prostate cancer cell lines and the mechanisms of paclitaxel resistance with two cell lines. Prostate. 67 (9), 955-967 (2007).
  4. Abelman, R. O., et al. TOP1 mutations and cross-resistance to antibody-drug conjugates in patients with metastatic breast cancer. Cli Cancer Res. 31 (10), 1966-1974 (2025).
  5. McDermott, M. In vitro development of chemotherapy and targeted therapy drug-resistant cancer cell lines: a practical guide with case studies. Fron Oncol. 4, 40(2014).
  6. Breen, L., Murphy, L., Keenan, J., Clynes, M. Development of taxane resistance in a panel of human lung cancer cell lines. Toxico In Vitro. 22 (5), 1234-1241 (2008).
  7. Bioquest, A. A. IC50 calculator. , AA Bioquest. https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator (2025).
  8. Kawai, H. Characterization of non small-cell lung cancer cell lines established before and after chemotherapy. Lun Cancer. 35 (3), 305-314 (2002).
  9. Berendsen, H. H., et al. Characterization of three small cell lung cancer cell lines established from one patient during longitudinal follow-up. Cance Res. 48 (23), 6891-6899 (1988).
  10. Sakai, W. Functional restoration of BRCA2 protein by secondary BRCA2 mutations in BRCA2-mutated ovarian carcinoma. Cance Res. 69 (16), 6381-6386 (2009).
  11. Schnepp, P. M., et al. Single-cell transcriptomics analysis identifies nuclear protein 1 as a regulator of docetaxel resistance in prostate cancer cells. Mo Cancer Res. 18 (9), 1290-1301 (2020).
  12. Grigoreva, T., Sagaidak, A., Novikova, D., Tribulovich, V. New insights into chemoresistance mediated by Mdm2 inhibitors: the benefits of targeted therapy over common cytostatics. Biomedicines. 12 (3), 547(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

IC50Microarray
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.