קווי תאים עמידים לתרופות מאפשרים הבנה של מנגנוני עמידות לטיפול והערכה לא קלינית של תרכובות חדשות, תרופות ייעודיות וטיפולים משולבים. מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת קווי תאים עמידים על ידי חשיפת קווי תאי האב לעלייה הדרגתית בריכוז תרופת המטרה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פיתוח קווי תאים עמידים לתרופות להליכים ניסיוניים
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיתוח קווי תאים עמידים לתרופות חיוני להבנת מנגנוני העמידות לתרופות וזיהוי אסטרטגיות להתגברות על כישלון הטיפול בטיפול בסרטן. מודלים של עמידות מאפשרים הערכה פרה-קלינית של תרכובות חדשות, תרופות ייעודיות וטיפולים משולבים. כדי ליצור תאים עמידים, קווי תאי סרטן ההורים נחשפים שוב ושוב לריכוזים הולכים וגדלים של תרופת המטרה במשך מספר שבועות. תאים ששורדים ומתרבים בכל שלב נבחרים, מורחבים ונחשפים למינונים גבוהים יותר של תרופות. התפתחות העמידות מאושרת על ידי כימות והשוואה של ערכי ריכוז מעכב חצי מקסימלי (IC50) בין תאים הוריים לתאים עמידים באמצעות מבחני כדאיות תאים וניתוח רגרסיה לא ליניארית. ערכי IC50 מוגברים משמעותית מצביעים על הסתגלות מוצלחת ללחץ תרופתי והתפתחות עמידות. קווי תאים עמידים לתרופות אלה זמינים לניתוח מקיף, כגון מיקרו-מערך וריצוף תאים בודדים, כמו גם ניסויים שונים במבחנה או in vivo . מודלים אלה מספקים כלים רבי ערך לחקירת אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות להתגברות על עמידות לתרופות.
מבוא
כימותרפיה היא אפשרות הטיפול הנפוצה ביותר לסרטן מקומי שאינו מתאים לניתוח או הקרנות או סרטן גרורתי. תרופות ממוקדות מולקולרית וכימותרפיה משמשות כטיפולי קו ראשון לממאירות רבות, ויעילותן מוכרת באופן נרחב. חלק מסוגי הסרטן מראים עמידות לתרופות מסוימות מתחילת הטיפול, מה שהופך את הטיפול ללא יעיל. עם זאת, במקרים נפוצים יותר, טיפול שהיה יעיל בתחילה הופך ללא יעיל עקב התפתחות עמידות לתרופות, מה שמוביל להתקדמות הסרטן.
עמידות לתרופות נגרמת הן על ידי מוטציות גנטיות והן על ידי תגובה אפיגנטית בתאי סרטן הגורמים לביטוי של תוצרי גנים המתחמקים מתרופות או מסייעים לצמיחת תאים 1,2
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. מבחני תרבית תאים וכדאיות תאים
הערה: פקליטקסל היא תרופה אנטי סרטנית והיא ציטוטוקסית. בעת הטיפול בו, יש ללבוש חלוק, משקפי מגן וכפפות, ולעבוד בתוך ארון בטיחות כדי למנוע שאיפה לגוף. DMSO אינו ציטוטוקסי במיוחד, אך כאשר הוא בא במגע עם עור או ריריות, החדירות של תרופות מומסות עולה, לכן יש ללבוש חלוק, משקפי מגן וכפפות בעת הטיפול בו.
- תרבית תאי DU-145 בצלחת תרבית תאים בגודל 10 ס"מ באמצעות מדיום שלם (RPMI-1640 + 1% פניצילין-סטרפטומיצין [pen-strep] + 10% סרום בקר עוברי [FBS]) באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 עד 80% קונפלונט.
- שאפו את מדיום התרבות, שטפו עם DPBS, ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות שיטה זו, בילינו בעבר 9 חודשים בהקמה מוצלחת של תאי DU145 עמידים לפקליטקסל (DU145-TxR). תוצאות בדיקת כדאיות התא הראו שערך ה-IC50 של פקליטקסל עבור קו תאי האב DU145 היה 1.1 ננומטר, בעוד שערך ה-IC50 עבור DU145-TxR היה גבוה פי 149.6 מזה של קו תאי האב (IC50: 164.6 ננומטר) (טבלה 1 ואיור 2). תוצאה זו מצביעה על כך ש-DU145-TxR רכש עמידות גבוהה מאוד לתרופות.
מורפולוגיה של התא נצפתה באמצעות מיקרוסקופיה הפוכה דיגיטלית מי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פיתוח קווי תאים סרטניים עמידים לתרופות הוא שיטה מבוססת לחקר מנגנוני רעילות ועמידות לתרופות, אך האתגר הראשון העומד בפני החוקרים הוא בחירת מודל מתאים לביטוי עמידות. שיטה נפוצה ליצירת קווי תאים עמידים לתרופות במבחנה היא חשיפת קו התאים לתרופת המטרה, אך יש לשקול כיצד להגדיר את ריכוז החשיפה (בשלבים או בבת אחת) והאם לקבוע תקופה ללא תרופות (פועמת או רציפה).
שיטת הדופק, עם התקופה נטולת התרופות שלה, דומה לחולה סרטן שעובר מספר מחזורי כימותרפיה, שכן יש תקופה קצרה של חשיפה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים פוטנציאליים.
תודות
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק P01 CA093900 של המכונים הלאומיים לבריאות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 10 מ"ל פיפטה סרולוגית חד פעמית | פישר מדעי | 13-678-11E | |
| צלחת 100 מ"מ צלחת | קורנינג | 353003 | |
| 15 מ"ל צינור חרוטי | 352097 | ||
| 2.0 מ"ל בקבוקונים קריוגניים | קורנינג | 431386 | |
| 96 באר צלחת | תרבית תאיםקורנינג | 353072 | |
| תא ספירת תאים שקופית | Invitrogen | C10228 | |
| מגיב התפשטות תאים WST-1 | סיגמא | 5015944001 | |
| צנטריפוגה 5702 R | eppendorf | ||
| אינספור II | Invitrogen | תאי | |
| דלפק דימתיל סולפוקסיד | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | D4W2J | |
| DU145 | ATCC | HTB-81 | קו תאי סרטן הערמונית |
| EVOS FLc | תרמו פישר סיינטיפיק | דיגיטלי הפוך מיקרוסקופ | |
| FBS | Gibco | A5670701 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| פניצילין– סטרפטומיצין | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Synergy H1 | BioTek | Microplate | |
| Reader תמיסת Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | 15250061 |
מקורות
- Zahreddine, H., Borden, K. L. Mechanisms and insights into drug resistance in cancer. Fron Pharmacol. 4, 28(2013).
- Emran, T. B., et al. Multidrug resistance in cancer: understanding molecular mechanisms, immunoprevention and therapeutic ap....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
