מאמר שיטה

בדיקת שחבור מקבילה מסיבית לבחינת שגיאות שחבור הנגרמות על ידי גרסאות אינטרוניות הקשורות למחלה

DOI:

10.3791/68984

⸱

9 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 2Genome and Systems Biology Degree Program, Academia Sinica and National Taiwan University, 3Institute of Statistical Science, Academia Sinica

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע מבחני שחבור מקבילים מסיביים (MaPSy), המשתמשים במבנים מיני-גנים כדי להעריך באופן שיטתי וריאנטים אינטרוניים בתפזורת. גישה זו מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של שינויי שחבור המושרים על ידי וריאנטים בתאים באמצעות ריצוף אמפליקון, ומספקת הערכות פונקציונליות של השפעתם על שחבור קדם-mRNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שגיאות שחבור מייצגות 10-30% מהמוטציות הפתוגניות האחראיות להפרעות גנטיות נדירות. שחבור RNA מבטיח ביטוי גנים תקין על ידי חיבור סלקטיבי של אקסונים והסרת אינטרונים, כאשר רצפי רגולציה מרכזיים ממוקמים בתוך האינטרונים. אתר החיבור 5' ואתר ההסתעפות מקיימים אינטראקציה עם RNA גרעיני קטן כדי ליצור את קומפלקס הזיהוי של הספלייסאוזום, בעוד שאלמנטים כמו מערכת הפוליפירימידין ומשפרי שחבור/משתיקי קול מגייסים חלבונים כדי לווסת את הרכבת הספלייסוזום. חיזוי שיבושי שחבור מגרסאות אינטרוניות הוא מאתגר בשל המורכבות של אינטראקציות אלו.

וריאנטים אינטרוניים, המהווים 90% מהווריאציות הטבעיות של הגנים האנושיים, עלולים לשבש את השחבור הקנוני ולגרום למחלות. כדי לחקור אפשרות זו, פיתחנו בדיקת שחבור מקבילה מסיבית (MaPSy) כדי להעריך וריאנטים אינטרוניים שזוהו על ידי המטופל. אוליגונוקלאוטידים מסונתזים עם רצפי ייחוס או וריאנטים נקשרו למיני-גנים שחבור המכילים אותות מקדם ופוליאדנילציה. כל מבנה כלל שני אקסונים קבועים משני צדי אקסון אמצעי שהכיל את רצף צומת האינטרון-אקסון המשתנה. יעילות השחבור הסלולרי של רצפי הווריאנטים הושוותה לעמיתיהם הייחוס, מה שמאפשר לנו לזהות שיבושים משמעותיים כגרסאות שחבור.

ניתן לאמת את תוצאות ה-MaPSy באמצעות גישות נוספות, כגון מבחני מיני-גנים או עריכת גנום בתיווך CRISPR in vivo. יתר על כן, ניתוח מצטבר של הצמתים המשובשים יכול לספק תובנות עמוקות יותר לגבי מנגנוני שחבור והבסיס המולקולרי של מחלות הקשורות לשגיאות שחבור.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שחבור RNA הוא תהליך מכריע המחבר אקסונים לתרגום ומסיר אינטרונים, מקל על ייצוא RNA ושומר על הומאוסטזיס של חומצות גרעין. מנגנון מווסת היטב זה פועל בצורה זמנית ומרחבית, ותורם לגיוון ומורכבות הטרנסקריפטום1. השחבור מונחה על ידי אותות מפתח, כולל אתר החיבור 5' (5'ss), אתר ההסתעפות ואתר החיבור 3' (3'ss), יחד עם אלמנטים רגולטוריים נוספים כגון מערכת הפוליפירימידין במורד הזרם של אתר הסניף ואזור אי הכללת ה-AG dinucleotide, המסייעים בזיהוי 3's2. מבחינה מכנית, U1 RNA גרעיני קטן (snRNA) מתחבר עם ה-5ss, בעוד שאתר ההסתעפות מקיים אינטראקציה עם U2 snRNA3. הפעילות המתואמת של אתר הענף, מערכת הפוליפירימידין ו-3 מקלה על קשירת נוקלאופרוטאינים קטנים U2 (snRNPs) וגורמי עזר U2, מייצבת את הספליסאוזום וממקמת את נקודת ההסתעפות להתקפה נוקלאופילית על ה-5, ובכך יוזמת שחבור.

עם ההתקדמות המהירה של טכנולוגיות הריצוף, העלות של ריצוף גנום שלם ממשיכה לרדת, מה שמוביל לקטלוג הולך ומתרחב של וריאנטים גנטיים אנושיים. ההערכה היא כי 10-30% מהמוטציות הקשורות למחלה בהפרעות גנטיות נדירות משפיעות על שחבור RNA 4,5,6, ולעתים קרובות מייצרות תוצרי גנים חריגים שעשויים לשמש כמטרות טיפוליות. עם זאת, הערכת ההשפעה התפקודית של וריאנטים אינטרוניים נותרה מאתגרת בשל המורכבות של אותות שחבור, שלעתים קרובות מיותרים ומנוונים. בעוד שאתרי החיבור 5' ו-3' מאופיינים היטב יחסית, אתרי הסתעפות, דרכי פוליפירימידין ואלמנטים רגולטוריים אחרים של שחבור מציגים שונות רצף ומיקום ניכרת באיקריוטים גבוהים יותר. מחקרי מיפוי בקנה מידה גדול הוכיחו עוד כי אתרי ענפים מרובים יכולים להתקיים בתוך אינטרון יחיד 7,8,9,10, מה שמסבך את הפרשנות של וריאציות גבול אינטרון-אקסון.

למידה עמוקה שימשה כדי להעריך כיצד רצפים ראשוניים תורמים לזיהוי אתרי חיבור 4,11,12, וחושפת כי גרסאות שחבור מתקבצות באתרי חיבור קנוניים תוך התפשטות בדלילות לתוך האקסון ואזור 3' של האינטרונים. דפוס זה מתיישב עם ההבנה המבוססת שבחירת אתר חיבור 5' מוכתבת בעיקר על ידי רצפי קונצנזוס, בעוד שזיהוי אתר חיבור 3' תלוי באלמנטים אינטרוניים נוספים, כגון אתרי הסתעפות ומסלולי פוליפירימידין. עם זאת, מודלים קיימים אומנו להבחין בין אתרי חיבור מכוננים לבין אתרים חלופיים או מלאכותיים במקום להתמקד בגרסאות אינטרוניות באופן ספציפי. כתוצאה מכך, כלים חישוביים אלה מראים דיוק חיזוי בינוני בלבד, בעיקר זיהוי אתרי חיבור וגרסאות שחבור אקסוניות 13,14,15,16. בנוסף למודלים חיזויים, מערכת ניסיונית המסוגלת לאמת גרסאות שחבור בכמויות גדולות תשפר משמעותית את הזיהוי והאפיון של פגמי שחבור.

נתוני ריצוף RNA מקיפים המקשרים בין וריאנטים אינטרוניים הקשורים למחלה לפנוטיפים של שחבור נותרו נדירים בשל תדירותם הנמוכה והקושי לחזות תוצאות שחבור ממערכי נתונים קיימים. כדי להתמודד עם פער זה, פותחו מבחני שחבור בתפוקה גבוהה ומודלים חישוביים לניתוח שיטתי של גרסאות שחבור. מבחני דיווח שחבור מקבילים מסיביים (MaPSy) תוכננו להעריך את ההשפעה של רצפים משתנים על בחירת אתר החיבור. על ידי שילוב וריאציות רצף ליד אתרי החיבור 5' ו-3' או על פני אזורי אינטרון-אקסון שלמים בתוך עמודי שדרה מיניגנים קבועים, MaPSy מאפשר הערכה פונקציונלית של שינויים בשחבור. עם זאת, בשל המגבלות של סינתזת אוליגונוקלאוטידים בתפזורת, וריאנטים אינטרוניים עמוקים והפעלת פסאודו-אקסון אינם נלכדים בגישה זו.

החוסן של MaPSy אומת באמצעות 70 מיניגנים שחבור עצמאיים, מה שהניב מתאם פירסון של 0.8917. יש לציין כי כ-90% מגרסאות תורם השחבור (+1 ו-+2) הראו פגמי שחבור, מה שמדגיש את דיוק הבדיקה. בנוסף, MaPSy עם רצפי אתרי ענף אקראיים חשף את האופי המנוון של זיהוי אתר ענף ואת הסתמכותו על חלבוני ליבה U218. יתר על כן, נעשה שימוש בעיצוב MaPSy מפוצל GFP בשילוב עם מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי לחקור אירועי דילוג על אקסונים הנגרמים על ידי וריאציות גנטיות. גישה זו גילתה כי 54% מהגרסאות המשבשות שחבור שוכנות באזורים אינטרוניים, כולל אתרי חיבור קנוניים13, מה שמדגיש את התפקיד המשמעותי של אלמנטים אינטרוניים בוויסות שחבור. באופן קולקטיבי, ממצאים אלה מחזקים את החשיבות של רצפים אינטרוניים בבקרת שחבור ומדגימים את התועלת של MaPSy בזיהוי פגמי שחבור הקשורים למחלה (איור 1).

figure-introduction-1
איור 1: תכנון ניסיוני של בדיקת שחבור מקבילה מסיבית (MaPSy) של מוטציות אינטרוניות כמעט אקסוניות. וריאנטים שתועדו במאגרי מידע של מחלות אנושיות נאספו וסונתזו כ-5,307 זוגות אוליגוס. כל זוג אוליגו מכיל ייחוס ואלל וריאנט על פני האזורים האינטרוניים של 78 נוקלאוטידים (nt) ו-35-nt. האוליגוס מוקפים באתרי תחול נפוצים להגברה וקשירה למיני-גנים שחבור 3-אקסונים. בהתאם, האזור המסונתז כולל את ה-3 של האקסון השני של המיניגן. לאחר הרכבת מיניגנים, המיניגנים המאוגדים חוברו לתאי כליה עובריים אנושיים (HEK293T). האיזופורמים השחבורים שהתקבלו נקטפו ונפתרו על ידי ריצוף אמפליקון. נתון זה הותאם באישור צ'יאנג ואחרים.17. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סינתזה של ספריית האוליגונוקלאוטידים (אוליגו) MaPSy

  1. מבנה אוליגו בסיסי: תכנן כל אוליגו במאגר 155-nuncleotide (nt) כך שיכלול רצף אקסוני של 35-nt ורצף אינטרוני של 80-nt, היוצרים אזור ספציפי לגן 115-nt המוקף ברצפי תחול נפוצים של 20-nt בכל קצה (איור 2A).
  2. אוסף גרסאות: כדי לשמור על שלמות המוטיב ולהתמקד באזורים רגולטוריים המשפיעים על שחבור, אסוף את הגרסאות האינטרוניות שהן:
    -78 עד +10 nt מה-3
    -3 עד +30 nt מה-5
    הערה: ניתן להשיג גרסאות קליניות מ-ClinVar19, ערכים בתדירות נמוכה ב-dbSNP20, פרסומים רלוונטיים ומאגרי מידע קליניים נוספים. ניתן להשתמש בקואורדינטות גנום כדי לחתוך וריאנטים עם האזורים הגנומיים הרצויים (למשל, באמצעות BEDTools21). יש לבחור רק פולימורפיזמים חד-נוקלאוטידים (SNPs) והוספות/מחיקות קטנות (indels) מתחת ל-15 nt כדי למזער את שונות הגודל בתוך מאגר האוליגו לסינתזה בתפזורת.
  3. מבנה מיניגן בסיסי: כדי לשמר את מבנה צומת השחבור, כל עמוד שדרה מיני-גן מכיל שלושה אקסונים: שני אקסונים חיצוניים קבועים המקודדים שברים של EGFP (מ-pGint, Addgene Plasmid #24217) ואקסון אמצעי שמקורו באקסון 15 של CAMTA2 אנושי (איור 2B). עכל גם את מקטע CAMTA2 וגם את pGint עם אנזימי הגבלה BamHI ו-SalI וקשר את מקטע CAMTA2 ל-pGint בין אקסוני EGFP, וצור מיני-גנים של pGint-CAMTA2 שלושה אקסונים (קובץ משלים 1).
    הערה: האקסון האמצעי, כלומר, CAMTA2 אקסון 15, אמור להפגין יעילות שחבור ביניים כאשר הוא מתבטא בתאי מטרה. מאפיין זה חיוני מכיוון שהוא מספק קו בסיס מאוזן, המאפשר זיהוי של עליות וירידות ביעילות השחבור עקב השפעות שונות.
  4. עיצוב אתר תחול: צרף את רצף אתר ההחדרה לשני קצוות הספרייה כך שכל אוליגו יכיל רצפי אגף ~20-nt החופפים לאתר ההחדרה המיועד בתוך האקסון/אינטרון האמצעי (איור 2A).
    הערה: אם מאגר האוליגו מיועד למספר מבני מיני-גנים, ניתן לשלב אתרי תחול מרובים.
  5. עיצוב ברקוד: עבור גרסאות אינטרוניות, ברקודים אקסוניים חיוניים כדי להבחין בין גנוטיפים למוצרים שחבור, מכיוון שרצפים אינטרוניים הולכים לאיבוד לאחר שחבור. כדי למנוע שינויים בשחבור עקב רצפי ברקוד (כלומר, אפקט הברקוד), מקם את הברקודים באופן דיסטלי בתוך האקסונים, הרחק מאתרי החיבור (כלומר, ממש ליד אתר ההתחלה האקסוני).
    הערה: מומלץ להשתמש במספר ברקודים לכל וריאנט במידת האפשר. אורך הברקוד הנדרש תלוי במורכבות הספרייה. לדוגמה:
    ברקוד של 1-nt מספיק אם אלל ייחוס מתחבר לגרסה אחת בלבד.
    ברקוד 2-nt עדיף אם אלל ייחוס מתחבר עם שש גרסאות שונות.
    ספריות עם מספר גרסאות הקשורות קשר הדוק לאלל ייחוס יחיד (למשל, שונות בנוקלאוטיד אחד בלבד) עשויות להגדיל את מורכבות הניתוח.
  6. הזמנת אוליגוס: סדר אוליגוס בפורמט קובץ FASTA, כאשר כל צומת וריאנט משויך לצד אלל הייחוס שלו.
    הערה: עבור צמתים עם מספר גרסאות, יש צורך רק באלל ייחוס אחד לכל צומת. שירותי סינתזת רצפים משותפים זמינים מחברות כמו GeneScript (https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html), Twist Bioscience (https://www.twistbioscience.com/products/oligopools), IDT (https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools) ו-Agilent (https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis). אורך הסינתזה, קיבולת הספרייה והעלויות עשויים להשתנות בהתאם לספק ולאזור.

figure-protocol-1
איור 2: תכן מיני-גנים של Oligo ושחבור עבור MaPSy. (A) תכנון לסינתזה של אוליגו מאוגדת של קצה 3' או 5' של אינטרונים. התרשימים ממחישים את המבנה הבסיסי של האוליגו של 155 nt. הקיבולת בפועל של סינתזת אוליגו תלויה בחברה שנבחרה לייצור. (B) עיצוב המיניגנים של MaPsy. מיניגן של שלושה אקסונים (ii) שונה מפלסמיד pGint (i), ואתרי החיבור הוחלפו על ידי האוליגו המאוגד כדי להציג וריאציות אות שחבור (iii). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. בניית תבניות DNA של ספריית MaPSy

  1. הגברה ראשונית עם קבלת מאגר האוליגו
    1. עם קבלת מאגר האוליגו, הגבירו 10-50 ננוגרם מספריית האוליגו עם אתרי ההתחלה המתוכננים על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) של 100 מיקרוליטר באמצעות DNA פולימראז בנאמנות גבוהה כדי להמיר את האוליגו לגדילים כפולים (פריימרים LibF ו-LibR בטבלה 1, הגדרות תרמו-ציקלר בטבלה 2).
    2. נקה את מוצרי ה-PCR באמצעות עמודות טיהור. בפירוט, קשרו את מוצר ה-PCR לקרום העמודה, ולאחר מכן שטפו עם מאגרים המכילים 70% אתנול כדי להסיר שאריות פריימרים, מלחים ופולימראז. לבסוף, יש להוציא את מוצר ה-PCR המטוהר באמצעות בופר דל מלח או מים נטולי נוקלאז.
    3. ודא את גודל האוליגו המוגבר על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. טען 5 מיקרוליטר של מוצר ה-PCR המטוהר על ג'ל אגרוז 1.5% שהוכן במאגר 1× TAE (בסיס טריס 40 מ"מ, חומצה אצטית 20 מ"מ, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0).
      הערה: הגבל את ה-PCR ampמחזורי ההגברה ל-15 כדי למנוע amplation יתר והטיית PCR. פס מטושטש משני, בדרך כלל גדול יותר מתוצר היעד, עשוי להצביע על הגברת יתר וחישול לא שלם בתוך מאגר האוליגו. שמור חלק ממוצרי ה-PCR ורצף את מאגר האוליגו כדי להעריך את האיכות ושיעורי השגיאות לפני שתמשיך (נקודת עצירה).
  2. בניית מיניגנים שחבור MaPSy - PCR ראשוני.
    1. שברי עמוד שדרה: השתמש ב-0.5 ננוגרם של עמוד השדרה של הפלסמיד pGint-CAMTA2 כמקור לשני שברי ה-PCR העיקריים
      1. מוצר PCR 1: הגביר את מקדם ה-CMV, האקסון הראשון (N-terminal EGFP), וחלק מהאינטרון הראשון (טבלה 1 וטבלה 2).
      2. מוצר PCR 3: הגברת חלק מהאקסון האמצעי (CAMTA2 exon 15), האינטרון השני, האקסון השלישי (C-terminal EGFP) ואות הפוליאדנילציה SV40 (איור 3, טבלה 1 וטבלה 2).
    2. מגבר ספרייה: מוצר PCR 2: עבור ספריית ה-3ss, הגבר את מגברי הספרייה עם רצפים חופפים בכל קצה כדי להתאים לקצוות הפנימיים של מוצר PCR 1 ומוצר PCR 3, מה שמאפשר אינטגרציה יעילה ב-3 של אקסון CAMTA2 15 (איור 3, טבלה 1 וטבלה 2).
      הערה: עבור ספריית ה-5ss, החלף את קצה ה-5' של צומת האקסון האמצעי ברצף הספרייה.
  3. לאחר PCR, נקה את כל המוצרים באמצעות עמודות טיהור כשלב 2.1.2. כדי למנוע זיהום מווקטור התבנית, יש לטהר את המוצרים הרצויים מ-PCR1 ו-PCR3 על ידי מיצוי ג'ל אגרוז. באופן ספציפי, לאחר אלקטרופורזה, יש להוציא ~ 100 מ"ג ג'ל אגרוז המכיל את מוצר ה-PCR המטרה ולהמיס אותו במאגר הקשירה. קושרים את תמיסת הג'ל המומסת לקרום העמוד, ולאחר מכן המשך בפרוטוקול טיהור ה-PCR הסטנדרטי.
  4. בניית מיניגנים שחבור MaPSy - הרחבת חפיפה PCR: בצע סיבוב אחד או עוקב של PCR חופף כדי לחבר את שלושת המקטעים העיקריים (מוצר PCR 1, מגבר הספרייה ומוצר PCR 3; השתמש ב-~ 20 ננוגרם כל אחד כתבנית) למיני-גן שחבור באורך מלא (השתמש בפריימרים החיצוניים ביותר CAMGFPF ו-CMVGFPR בטבלה 1, והגדרות תרמו-ציקלר בטבלה 2).
    הערה: המוצר הסופי מכיל את מקדם ה-CMV ושלושה אקסונים עם 3 הראשונים שמקורם בספריית האוליגונוקלאוטיד, והוא מוכן לטרנספקציה לניסויים מבוססי תאים.
  5. לאחר ההרכבה, נקה את תבניות ה-DNA באורך מלא באמצעות עמודות טיהור PCR. אם נצפות רצועות לא ספציפיות בג'ל, בצע מיצוי ג'ל כדי לבודד במדויק את המוצר הרצוי באורך מלא כשלב 2.3.
    הערה: רצפים דומים מאוד בספרייה עלולים להוביל להרכבה לא שלמה. אם הרכבה מלאה בתגובת PCR אחת קשה, ניתן לנסות לבצע PCR חופפים ברצף (החל משני מקטעים, ואז הוספת שלישי). כדי לשפר את הספציפיות של PCR, שקול להתאים את טמפרטורת החישול או ליישם PCR מגע כדי לשפר את ספציפיות הכריכה עבור תבניות מורכבות. הכן מספיק מבני MaPSy לביצוע לפחות ארבעה ניסויים עצמאיים. שמור כמות קטנה של כל מבנה לריצוף הדור הבא כדי לאמת את שלמות הרצף, מכיוון שחלק מהאוליגונוקלאוטידים עשויים שלא להגביר ביעילות ולגרום להרכבות לא שלמות (נקודת עצירה).

figure-protocol-2
איור 3: זרימת העבודה של בניית ספרייה. (A) פריימרים המשמשים ב-PCR החופף (ראה גם טבלה 1). (ב) הנוהל לחפיפה של PCR. בקצרה, בריכות אוליגו ושאר החלקים של מיני-השחבור הוגברו על ידי 25 מחזורי PCR. השבר המכיל את המקדם ואת האקסון הראשון (מוצר PCR 1) נתפר למאגר האוליגו (מוצר PCR 2) על ידי חפיפה של PCR באמצעות 20 מחזורי הגברה. לאחר מכן, המוצר התפור (מוצר PCR 1+2) נתפר עוד יותר לשבר המכיל את האקסוןהשלישי ואות הפוליאדנילציה (מוצר PCR 3) באמצעות 20 מחזורי הגברה כדי להשיג את המבנה הסופי (מוצר PCR 1+2+3). נתון זה הותאם באישור צ'יאנג ואחרים.17. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

בניית פריימר ספריית MaPSyהערה
CMVGFPFCCGCCATGCATTAGTTATTAATAGמוצר PCR 1
ליבR2CAGGTCTTCAGGCCCCAGCCמוצר PCR 1
ליבףGGCTGGGGCCTGAAGACCTGמוצר PCR 2
ליבRAAGGCGCACATGACCCCGGGמוצר PCR 2
LibF2CCCGGGGTCATGTGCGCCTTמוצר PCR 3
CMVGFPRGGACAAACCACAACTAGAATGCמוצר PCR 3
פריימר PCR של ספריית MaPSy לריצוף אמפליקונים
P7-LIB0FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGAGAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-LIB1FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGAGNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-LIB2FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGAGNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib3FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGAGNNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P5-Lib0RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACGAAGGCTCCTCTCTCTGTAGT
P5-Lib1RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGAGNCGAAGGCTCCTCTCTCTCTGTAGT
P5-Lib2RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGAGNNCGAAGGCTCCTCTCTCTCTGTAGT
P5-Lib3RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGAGNNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
פריימר אימות
Lib0F (אימות ספרייה)AAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
Lib0R (אימות ספרייה)CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

טבלה 1: פריימרים המשמשים בפרוטוקול זה.

תערובת תגובות PCR
רכיביםנפח
ddH2O13.4 מיקרוליטר
מאגר HF 5x4 מיקרוליטר
dNTPs של 10 מילימטר0.4 מיקרוליטר
פריימר קדימה 10 מיקרומטר0.5 מיקרוליטר
פריימר הפוך 10 מיקרומטר0.5 מיקרוליטר
cDNA1 מיקרוליטר
DNA פולימראז בנאמנות גבוהה0.2 מיקרוליטר
הפעל את תוכנית ה-PCR (תגובת 20 מיקרוליטר)
טמפ'זמןמחזורים
דנטורציה ראשונית98 מעלות צלזיוס1 דק'1
דנטורציה98 מעלות צלזיוס30 שניות10–20
חישול65 מעלות צלזיוס30 שניות
סיומת72 מעלות צלזיוס30 שניותחזרה לדנטורציה
הארכה סופית72 מעלות צלזיוס5 דק'1
אחז4 מעלות צלזיוסאחזאחז

טבלה 2: הגדרות תרמו-ציקלר

3. ביטוי ושחזור של מיני-גנים שחבור מתאי יונקים

  1. תרבית תאים: שמרו על HEK293T תאים במדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 יחידות/מ"ל פניצילין וסטרפטומיצין, ו-2 מ"מ L-גלוטמין ב-5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.
  2. טרנספקציה של מיניגנים שחבור:
    1. לוח 5 × 105 HEK293T תאים ב -2 מ"ל של מדיום בצלחות 6 בארות 24 שעות לפני הטרנספקציה.
    2. תאי טרנספקט עם 1-2 מיקרוגרם של מבני MaPsy, מודגרים מראש למשך 5 דקות עם ריאגנט טרנספקציה של 3.75 מיקרוליטר, בהתאם לפרוטוקול היצרן. טרנספקציה מוצלחת מסומנת על ידי נוכחותם של אותות EGFP מהספרייה השחבורה.
    3. ליז את התאים באמצעות 250 מיקרוליטר טריזול (או שווה ערך) 24 שעות לאחר הטרנספקציה.
  3. מיצוי RNA: חלץ את סך ה-RNA באמצעות ערכת מיני-הכנת RNA, בהתאם לפרוטוקול היצרן. באופן ספציפי, יש לקשור את ה-RNA בטריזול לקרומי העמודים, לשטוף עם מאגרים המכילים 70% אתנול כדי להסיר מלחים, חלבונים וזיהומים אחרים, ולסלק את ה-RNA המטוהר באמצעות מאגר דל מלח או מים נטולי נוקלאז.
    זהירות: טריזול (או שווה ערך) הוא מאכל ורעיל. חשיפה עלולה להוביל לכוויות כימיות חמורות, צלקות קבועות ואי ספיקת כליות.
    הערה: ניתן לאחסן RNA בטריזול (או מגיב שווה ערך מבוסס טריזול, כגון מחלץ RNA TOOLSmart על ידי TOOLS) בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך עד שנה (נקודת עצירה). ניתן לאחסן RNA מטוהר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שנתיים אם מחזורי ההקפאה-הפשרה ממוזערים (נקודת עצירה).
  4. שעתוק הפוך: הכן cDNA מ-2 מיקרוגרם RNA כולל באמצעות טרנסקריפטאז הפוך עם הקסמרים אקראיים, בהתאם לפרוטוקול היצרן. באופן ספציפי, דגרו את ה-RNA עם הקסמרים אקראיים של 50 מיקרומטר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר חישול, ולאחר מכן בצעו שעתוק הפוך ב-55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: ניתן לאחסן cDNA בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שנה (נקודת עצירה).
  5. הגברה של המיניגנים המחוברים לשחבור: בצע PCR באמצעות רצפי ההתחלה הספציפיים עבור המיניגנים המחוברים (טבלה 2). השתמש במספר המחזורים המינימלי הדרוש כדי לדמיין את המוצר על ג'ל אגרוז.
    הערה: רצועות מעורבות של מוצרים לא מחוברים ומחוברים צריכות להיות גלויות על הג'ל. רצועות עשויות להיראות מפוזרות עקב האוכלוסייה המעורבת של מיני דנ"א (איור 4A).
  6. נקה את מוצר ה-PCR באמצעות עמודות טיהור כשלב 2.1.2.
  7. חיבור מתאמי רצף: בצע סיבוב אחרון של PCR כדי לחבר רצפי מתאמי רצף לקצוות המגבר. כלול 0-3 נוקלאוטידים אקראיים בקצה המגמפליקונים כדי להבטיח זיהוי פלואורסצנטי מאוזן בפלטפורמת NextSeq (טבלה 1).
  8. נקה את מוצר ה-PCR באמצעות עמודות טיהור כשלב 2.1.2.

4. ריצוף וניתוח אמפליקון

  1. ריצוף קריאה קצרה: הכפיף את מגברי ה-PCR ל-150 ריצוף קצה מזווג באמצעות Illumina Miseq, Novaseq או שווה ערך, באמצעות מתקן ליבה או שירות מסחרי.
  2. יישור:
    1. צור גנום ייחוס: צור "גנום ייחוס" סינתטי על ידי תיוג כל גנוטיפ ייחודי ככרומוזום נפרד. גנום הייחוס כולל את האקסונים והאינטרונים הסינתטיים הכלולים במגברים.
    2. יישר את קריאות הרצף: יישר את קריאות הקצה המזווג לגנום הייחוס באמצעות HISAT222,23, והתאם את הפרמטרים לבקרה עבור אלמנטים ספציפיים לשחבור (ראה קובץ משלים 2 לפרטי שורת הפקודה).
    3. בחר קריאות באיכות גבוהה: המר SAM לתבנית BAM, סנן קריאות באיכות גבוהה (איכות מיפוי ≥60) ולאחר מכן מיין ואינדקס את קבצי ה- BAM24 (ראה קובץ משלים 2 לקבלת פרטי שורת הפקודה).
    4. זהה צמתים של חיבור וחשב את קריאות הצומת: כמת את השימוש בצומת החיבור על ידי חילוץ אירועי דילוג אקסון ממחרוזות CIGAR בקובץ ה-BAM המיושר . זהה את קריאות הצומת המתפרשות על סמך פעולות "N", וספירת קריאה מצטברת לכל קואורדינטת צומת וגדיל כדי להעריך דפוסי שחבור (ראה קובץ משלים 2 לפרטי שורת הפקודה).
    5. סיווג אתרי החיבור הקנוניים: סווג אתרי אחוי כקנוניים אם הם תואמים לצמתים המבוארים של GT-AG.
      הערה: במקרים נדירים, אללי ייחוס ב-MaPSy עשויים להשתמש באתרי חיבור לא קנוניים. קריאות חסרות צמתים המשתרעים על מיקום אתר החיבור המיועד נשמרות כקריאות לא מחוברות.
  3. ניתוח סטטיסטי לזיהוי וריאנטים של שחבור: סווג את הקריאות לשלוש קבוצות:
    (1) קריאות מחוברות לעומת לא מחוברות;
    (2) קנוני לעומת לא קנוני בין כל הקריאות המחוברות;
    (3) קריאות קנוניות לעומת לא קנוניות בתוספת קריאות לא מחוברות.
    בצע בדיקה מדויקת דו-צדדית של פישר, ואחריה תיקון שיעור גילוי שווא (FDR) (טבלה 3), כדי להעריך את ההשפעה של וריאנטים על יעילות ודיוק השחבור.
  4. סינון עבור גרסאות שחבור בביטחון גבוה: סווג את שני זוגות ההתייחסות/וריאנטים העולים על 100 ספירות קריאה עם ערך q של פחות מ-0.05 על פני ארבע חזרות כמשמעותיות. לאחר מכן, שקול מועמדים עם שינוי יחס סיכויים פי 2 כאשר לאלל הייחוס או למשתנה יש >5% קריאות לא מחוברות ולא קנוניות, גרסאות שחבור בביטחון גבוה (איור 4B).
קוראשחבורלא מחוברים ו/או לא קאנונים
הפניהab
משתנהcd

טבלה 3: טבלה של שניים על שניים למבחן המדויק של פישר.

5. אימות

  1. שחבור מיניגנים לאימות:
    1. סינתזה והגברה של אוליגו: לסנתז את אוליגוס ה-DNA של רצפי מועמדים נבחרים ל-MaPSy בנפרד (למשל, על ידי טכנולוגיות DNA משולבות). לאחר מכן, הגבירו את האוליגו באמצעות רצפי האגפים המעוצבים לגדילים כפולים על ידי PCR באמצעות DNA פולימראז בנאמנות גבוהה (טבלה 2).
    2. שיבוט מיניגנים: לעכל גם את תוצרי ה-PCR המתקבלים וגם את ה-pGint-CAMTA2 על ידי BbsI ו-SmaI ולקשר את התוצר המעוכל על ידי ליגאזות DNA.
    3. טרנספקציה: העבר את המבנים המתקבלים לתאי HEK293T באמצעות מגיב טרנספקציה כשלב 3.2.2.
    4. מיצוי RNA: חלץ RNA מהתאים שעברו טרנספטציה, כמתואר בשלב 3.3.
    5. שעתוק הפוך: בצע תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך (RT-PCR) באמצעות הקסמרים אקראיים.
    6. הגברת איזופורמים של שחבור: הגבירו את האיזופורמים של השחבור עם פריימרים המכוונים לשני האקסונים הראשונים של המיניגן (Lib0F ו-Lib0Rl, טבלה 1, הגדרות תרמו-ציקלר בטבלה 2). פתור את המוצרים המוגברים על ידי אלקטרופורזה ודמיין באמצעות מערכת Gel Doc.
    7. כמות: כמת את עוצמת האות של כל איזופורם שחבור באמצעות ImageJ (המכונים הלאומיים לבריאות, ארה"ב)25,26. לחלופין, השתמש בערכת סינון ה-DNA באמצעות מנתח חומצות הגרעין בעל הביצועים הגבוהים eGENE HDA-GT12 כדי לכמת את העוצמה והמשקל המולקולרי של מוצרי ה-PCR.
    8. מיצוי איזופורמים ואישור: בודד כל איזופורם על ידי מיצוי ג'ל אגרוז כשלב 2.3, ואשר את תוצאת השחבור על ידי ריצוף סנגר של מוצרי ה-PCR באמצעות מתקן ליבה או שירות מסחרי, הערכת שחבור רגיל, הכללת אינטרונים ודילוג אקסון.
  2. מיניגנים לשחבור מרובה אקסונים:
    1. לאחר אימות תוצאות ה-MaPsy, בחר את הגרסה המעניינת ושכפל שלושה עד חמישה אקסונים מ-DNA גנומי (gDNA) כדי לספק הקשר גנומי יותר לפגם השחבור שנצפה.
    2. בצע מוטגנזה מכוונת אתר באמצעות פריימרים למוטגניזציה ו-PCR חופף כדי להרכיב מבני מיני-גנים המכילים את שינוי הרצף הרצוי באתר היעד.
      הערה: אם האינטרונים המאגפים ארוכים מדי לשיבוט, שמור כ-300 nt מהרצף האינטרוני עבור כל אתר חיבור כדי להבטיח הקשר שחבור תקין.
    3. בצע את בדיקת השחבור מבוססת התאים כמתואר לעיל ב-5.1.
  3. אימות סלולרי: כדי לאמת את אפקט השחבור בתאים, השתמש בעריכת CRISPR מבוססת תבנית כדי לשנות את רצף הגרסאות שנבחרו במודל סלולרי מתאים.
    הערה: במידת האפשר, השתמש בדגימות אנושיות הנושאות את הגרסה הספציפית כדי להעריך את דפוס השחבור ישירות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות שחבור תאי של מבני MaPSy, קיימים גם מוצרים מחוברים וגם לא מחוברים כתערובת. בשל מגוון הגודל של הספרייה והפוטנציאל לשחבור לא קנוני, שני סוגי המוצרים עשויים להיראות מפוזרים במקצת על ג'ל. במבנים המכוונים לקצה 3', האינטרון השני, המכיל רצפים אדנו-ויראליים חלקיים, נוטה להתחבר בצורה חזקה מאוד (איור 4A).

בניסויי MaPSy, כ-10-30% מהגרסאות הרלוונטיות למחלה מציגות שחבור שונה, כאשר רוב המקרים המשמעותיים מראים יעילות שחבור קנונית מופחתת (איור 4B

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אות ה-EGFP הפנימי במבנה ה-MaPSy מאפשר זיהוי מבוסס פלואורסצנטי של דילוג אקסון. אם הרצף באקסון האמצעי או באינטרונים מקדם דילוג על אקסונים, קשירה של האקסון הראשון והשלישי מייצרת אות EGFP הניתן לזיהוי על ידי FACS, מה שהופך אותה לשיטה רבת ערך לזיהוי וריאנטים המשפיעים על דילוג אקסונים ומאפשרת הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה של גרסאות שחבור13. עם זאת, גישת ריצוף האמפליקון המתוארת כאן אינה לוכדת מוצרים מדלגים על אקסון, מכיוון שהם חסרים מידע על הספרייה ולכן הם אינם רצפים. כתוצאה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמיכה במימון לעבודה זו ניתנה על ידי פרס פיתוח הקריירה, תוכנית המחקר הרב-תחומית של ענן הבריאות, מענק האתגר הגדול של האקדמיה סיניקה (AS-CDA-108-M03, AS-PH-109-01-3 ו-AS-GCS-113-L03), פרס פיתוח הקריירה של המכונים הלאומיים לחקר הבריאות, טייוואן (NHRI-EX112-10908BC), ומענקי מחקר מצטיינים לחוקרים צעירים ופרס הזיכרון של המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה. טייוואן (MOST 112-2628-B-001-009-MY3 ו-108-2118-M-001-013-MY5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת Direct-zol RNA MiniPrep Plusזימו מחקר₪2072
דולבקו s Modified Eagle' s בינוני (DMEM)תרמו פישר סיינטיפיק11965084
סרום בקר עוברי (FBS)תרמו פישר סיינטיפיק26140079
ל-גלוטמיןתרמו פישר סיינטיפיקA2916801 
ליפופקטמין 3000 תרמו פישר סיינטיפיקL3000015
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק15140122
פלסמיד pGintאדג'ן24217
פולימראז DNA בנאמנות גבוהה של Phusionתרמו פישר סיינטיפיקF530L
ערכת מיצוי ג'ל QIAquickקיגן28706
ערכת טיהור PCR מהירה קיגן28106
ערכת סינון DNA QIAxcel (2400)קיגן929004
SuperScript IV טרנסקריפטאז הפוךתרמו פישר סיינטיפיק18090010

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baralle, F. E., Giudice, J. Alternative splicing as a regulator of development and tissue identity. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (7), 437-451 (2017).
  2. Gooding, C., et al. A class of human exons with predicted distant branch points revealed by analysis of AG dinucleotide exclusion zones. Genome Biol. 7 (1), R1(2006).
  3. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annu Rev Biochem. 89, 359-388 (2020).
  4. Jaganathan, K., et al. Predicting splicing from primary sequence with deep learning. Cell. 176 (3), 535-548.e24 (2019).
  5. Lim, K. H., Ferraris, L., Filloux, M. E., Raphael, B. J., Fairbrother, W. G. Using positional distribution to identify splicing elements and predict pre-mRNA processing defects in human genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11093-11098 (2011).
  6. Calabrese, C., et al. Genomic basis for RNA alterations in cancer. Nature. 578 (7793), 129-136 (2020).
  7. Mercer, T. R., et al. Genome-wide discovery of human splicing branchpoints. Genome Res. 25 (2), 290-303 (2015).
  8. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Res. 27 (4), 639-649 (2017).
  9. Pineda, J. M. B., Bradley, R. K. Most human introns are recognized via multiple and tissue-specific branchpoints. Genes Dev. 32 (7-8), 577-591 (2018).
  10. Zeng, Y., et al. Profiling lariat intermediates reveals genetic determinants of early and late co-transcriptional splicing. Mol Cell. 82 (24), 4681-4699 (2022).
  11. Xiong, H. Y., et al. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347 (6218), 1254806(2015).
  12. Cheng, J., et al. MMSplice: modular modeling improves the predictions of genetic variant effects on splicing. Genome Biol. 20 (1), 48(2019).
  13. Chong, R., et al. A multiplexed assay for exon recognition reveals that an unappreciated fraction of rare genetic variants cause large-effect splicing disruptions. Mol Cell. 73 (1), 183-194.e8 (2019).
  14. Rosenberg, A. B., Patwardhan, R. P., Shendure, J., Seelig, G. Learning the sequence determinants of alternative splicing from millions of random sequences. Cell. 163 (3), 698-711 (2015).
  15. Jian, X. Q., Boerwinkle, E., Liu, X. M. In silico tools for splicing defect prediction: a survey from the viewpoint of end users. Genet Med. 16 (7), 497-503 (2014).
  16. Riepe, T. V., Khan, M., Roosing, S., Cremers, F. P. M., 't Hoen, P. A. C. Benchmarking deep learning splice prediction tools using functional splice assays. Hum Mutat. 42 (7), 799-810 (2021).
  17. Chiang, H. L., et al. Mechanism and modeling of human disease-associated near-exon intronic variants that perturb RNA splicing. Nat Struct Mol Biol. 29 (11), 1043-1055 (2022).
  18. Gupta, A. K., et al. Degenerate minigene library analysis enables identification of altered branch point utilization by mutant splicing factor 3B1 (SF3B1). Nucleic Acids Res. 47 (2), 970-980 (2019).
  19. Landrum, M. J., et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D862-D868 (2016).
  20. Sherry, S. T., Ward, M. H., Sirotkin, K. dbSNP-database for single nucleotide polymorphisms and other classes of minor genetic variation. Genome Res. 9 (8), 677-679 (1999).
  21. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  22. Kim, D., Landmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  23. Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nat Biotechnol. 37 (8), 907-915 (2019).
  24. Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), giab008(2021).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  26. Lind, R. Open Source Software for Image Processing and Analysis: Picture this with ImageJ. Open Source Software in Life Science Research. , Woodhead Publishing. Cambridge. (2012).
  27. Huang, A. C., et al. SpliceAPP: an interactive web server to predict splicing errors arising from human mutations. BMC Genomics. 25 (1), 600(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Splicing ErrorsIntronic VariantsRNA SplicingMassively Parallel AssaySplicing MinigenesExon JunctionSpliceosome AssemblyGenome EditingSplicing EfficiencyDisease Mutations

מאמרים קשורים