מאמר שיטה

הכנת מדגם למחקרי מטבולומיקה של ספקטרומטריית מסה של תא בודד: שטיפת תאים משולבת, מרווה, ייבוש ואחסון

DOI:

10.3791/68995

⸱

16 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, 2Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה נועד לשמר מטבוליטים של תאים עבור ספקטרומטריית מסה של תא בודד (SCMS) על ידי שילוב של שטיפת תמיסת מלח נדיפה, מרווה חנקן נוזלי מהיר, ייבוש בהקפאה ואחסון של -8 מעלות צלזיוס. הוא מדגים כי כיבוי חנקן נוזלי חיוני לשמירה על פרופילי מטבוליטים, בעוד שיש למזער אחסון קר ממושך כדי למנוע שינויים מטבוליים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספקטרומטריית מסה של תא בודד (SCMS) הפכה לכלי הכרחי לחקר חילוף החומרים התאי. בשל ההתקדמות בטכניקות ספקטרומטריית מסה מודרניות (MS) והביקוש במחקרים על הטרוגניות תאים במדעי הביולוגיה הבסיסיים ומחלות אנושיות, מגוון טכניקות SCMS שונות פותחו ויושמו במחקר מעבדה. מכיוון שמטבוליטים יכולים לשקף במדויק את מצב התא, ניתוח מטבולומי SCMS של תאים חיים נחשב לכלי רב עוצמה לספק מידע מולקולרי על תאים. עם זאת, אתגר מרכזי בניתוח SCMS של תאים חיים הוא שימור פרופילי המטבוליטים האנדוגניים במהלך הכנת הדגימה, הובלה ומדידה. מטבוליטים תאיים עוברים תחלופה מהירה ורגישים מאוד לשינויים סביבתיים, מה שהופך אותם לרגישים לפירוק או טרנספורמציה לפני הניתוח. כדי להתמודד עם מגבלה זו, אנו מציגים פרוטוקול הכנת תאים חזק וניתן לשחזור שנועד לשמר את שלמות המטבוליטים התאיים עבור SCMS. הפרוטוקול משלב שטיפת תאים עם תמיסת אמוניום נדיפה (AF), מרווה מהירה עם חנקן נוזלי (LN2), ייבוש בהקפאה בוואקום ואחסון ב-80 מעלות צלזיוס. גישה זו ממזערת את הנזק לקרום התא תוך עצירה יעילה של הפעילות המטבולית. התוצאות מצביעות על כך שכיבוי תאים מהיר הוא חיוני; עם זאת, הגבלת זמן האחסון ב-80 מעלות צלזיוס נחוצה לשימור מטבוליטים בתאים. הפרוטוקול המוצע יכול לשמש לטכניקות SCMS קיימות אחרות ליישומים רחבים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטרוגניות מתא לתא התגלתה כעיקרון בסיסי של מערכות ביולוגיות, במיוחד בהקשרים של התקדמות מחלות, עמידות לתרופות והתמיינות תאית 1,2. באורגניזמים רב-תאיים, אפילו תאים זהים גנטית באותה מיקרו-סביבה יכולים להציג פנוטיפים מובחנים, הנובעים מהבדלים ברמות הטרנסקריפטומיות3, פרוטאומיות4, ובאופן מכריע, מטבולומיות5. בעוד שגנומיקה וטרנסקריפטומיקה של תא בודד צברו אחיזה משמעותית בעשור האחרון, מטבולומיקה של תא בודד נותרה לא מפותחת יחסית בשל המורכבות האינהרנטית והדינמיקה המהירה של מטבוליטים6. מטבוליטים רגישים מאוד לרמזים סביבתיים, יש להם מבנים כימיים וקוטבים מגוונים7, וקיימים בריכוזים נמוכים בנפחי תאים קטנים8. תכונות אלה הופכות את המדידה האמינה שלהם מתאים בודדים לאתגר אנליטי. מכיוון שהמטבולומיקה מציעה את תמונת המצב הקרובה ביותר של המצב התפקודי של התא בזמן אמת, שיטות מתקדמות לחקר המטבולום ברזולוציה של תא בודד חיונית להבנה מעמיקה יותר של הפיזיולוגיה והפתולוגיה של התא7.

טכניקות מטבולומיקה מסורתיות בתפזורת ממוצעות אותות על פני אוכלוסיות תאים גדולות, מסוות הטרוגניות תאית ועלולות לטשטש חתימות מטבוליות נדירות אך משמעותיות. לעומת זאת, מטבולומיקה של תא בודד חושפת פרופילים ביוכימיים ייחודיים ברמת התא הבודד, מה שהופך אותה לבעלת ערך רב לחקר תהליכים כמו התמיינות תאי גזע, תגובות לתרופות ומנגנוני מחלה 6,9,10,11,12,13. שיטות מבוססות ספקטרומטריית מסה (MS), כגון ספיגה-יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) MS ויונים משניים (SI) MS, קידמו את התחום אך מתמודדים עם אתגרים כמו הכנה מורכבת, דרישות ואקום ויינון הרסני המגבילים את ניתוח התאים החיים 9,14. במיוחד, ההתפתחויות האחרונות במכשור הביאו לטכניקות מתקדמות, כולל MALDI במצב שידור יחד עם פוסטיוניזציה המושרה על ידי לייזר (t-MALDI-215) וספקטרומטריית מסה של יונים משנית של Orbitrap (OrbiSIMS)16,17, אפשרו הדמיה מטבולית תלת מימדית ללא תוויות ברזולוציה גבוהה ברמת התא הבודד והתת-תאי, והציעו דיוק מסה ורזולוציה מרחבית יוצאי דופן.

יינון סביבתי MS מטפל בבעיות אלה. טכניקות ה-SCMS הסביבתיות המייצגות כוללות ספקטרומטריית מסה של וידאו חד-תא חי (Video-MS)18, DESI19 וננו-DESI20. ביניהם, ה-SCMS היחיד הוא אחת הטכניקות הבולטות ביכולתו לדגום וליינן ישירות תאים חיים בזמן אמת באמצעות מערכת נימית כפולה 21,22,23,24. טכניקה זו ממזערת את הפרעות הדגימה תוך שהיא מאפשרת פרופיל מטבולי ברזולוציה גבוהה באתרה ויושמה בהצלחה במחקרים של ספיגת תרופות והשפעה על חילוף החומרים של התאים 22,25,26,27,28,29,30, תגובות סביבתיות 31,32 והטרוגניות מטבולית33, 34,35,36 בין תאים בודדים.

בעוד ששיטות SCMS סביבתיות רבות מאפשרות ניתוח תאים חיים, הן בדרך כלל סובלות מתפוקה נמוכה עקב הטיפול הידני הנדרש לבחירת תאים בודדים 23,37,38. מכיוון שחילוף החומרים בתא הוא דינמי ביותר, הכנת דגימה מורחבת יכולה לשנות את פרופילי המטבוליטים. כדי לטפל בכך, החוקרים מיישמים טכניקות מרווה מיד לאחר בידוד תאים39,40. מרווה עוצר את הפעילות המטבולית על ידי קירור מהיר 41,42,43,44 או דנטורציה של אנזים 43,45,46,47, ומשמר את המצב הביוכימי של התאים ברגע מסוים. שלב זה חיוני להבטחת נתונים מטבולומיים מדויקים ורלוונטיים מבחינה זמנית. פרוטוקול מרווה יעיל חייב לעצור במהירות וביסודיות את הפעילות המטבולית התוך תאית. הוערכו שיטות שונות, כולל תמיסת מלח איזוטונית קרה48, אצטוניטריל צונן46, מתנול קר 44,47,48,49, תמיסת חיץ פוספט קר כקרח (PBS) 43,50, LN2 43,44,51, ואפילו טיפולים באוויר חם 52. בעוד שרבים מהם פותחו במקור עבור מטבולומיקה של תאים בתפזורת, חלקם, כמו מתנול קר ואצטוניטריל, הותאמו לטכניקות של תא בודד כגון Pico-ESI-MS39 ו-MALDI-MS46. למרות יעילותם, לכל שיטה יש חסרונות: ממיסים אורגניים עלולים לגרום לדליפת מטבוליט ולפגיעה בקרומי התאים48,53, ותמיסות מלח לא נדיפות עלולות להפריע לטרשת נפוצה על ידי גרימת דיכוי יונים54, הפחתת רגישות ופגיעה בדיוק הנתונים47,55.

הקפאת LN2 משמשת בדרך כלל במחקר ביולוגי56 מכיוון שהיא עוצרת במהירות את חילוף החומרים התאי מבלי להשאיר אחריה מלחים לא נדיפים, מה שהופך אותה למתאימה ל-SCMS. עם זאת, זה יכול לפגוע בקרומי התאים, וזה בעייתי עבור SCMS57,58. כדי להפחית את הנזק הזה, חלק מהמחקרים השתמשו בשיטה הכוללת סינון מהיר, שטיפת NaCl קרה והקפאת LN2, המסייעת בשמירה על מטבוליטים עם תחלופה מהירה53,59. ובכל זאת, שיטה זו אינה אידיאלית עבור SCMS בשל קשיים בבידוד תאים בודדים והשפעות מטריצה פוטנציאליות משאריות מלח. אחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס היא שיטת שימור נפוצה נוספת, אך השפעותיה על פרופילי מטבוליט של תא בודד נותרו לא ברורות. דיווחנו בעבר על מחקרים לטיפול במגבלות אלה על ידי שילוב של מספר שלבים מרכזיים: תאים נשטפים תחילה עם תמיסת AF נדיפה ותואמת MS, לאחר מכן מרווה אותם עם LN2, מיובשים בהקפאה בוואקום ומאוחסנים בטמפרטורה נמוכה (-80 מעלות צלזיוס)60. הגישה הנוכחית ממזערת נזק לתאים ופירוק מטבוליטים, ומאפשרת מדידות SCMS מדויקות יותר. עבודה זו מתמקדת בפרטים ניסיוניים, במטרה לקדם את אימוץ שיטת הכנת התאים הזו לטכניקות SCMS חזקות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בצע כל שלב בתוך מעבדת בטיחות ביולוגית מוסמכת Class II ותנאים סטריליים. במחקר זה, קו התאים HCT-116 שימש כמערכת מודל, ותאים תורבבו במדיום תרבית שלם. העוצרים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. תרבית תאים

  1. הכן מדיום שלם. תוסף מדיום 5A של מקוי עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. מחממים אותו ל-37 מעלות צלזיוס.
  2. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה עם 5% CO2. עקוב אחר מפגש מדי יום ומעבר כאשר תרביות מגיעות ל~80% מפגש.
  3. מעבר התאים (כל ~ יומיים).
    1. שאפו את המדיום ושטפו פעם אחת עם 5 מ"ל של 1x PBS.
    2. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לצלחת התרבית ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות כדי להקל על ניתוק התאים.
    3. נטרל טריפסין על ידי הוספת 8 מ"ל של מדיום שלם שחומם מראש ופיפטינג עדין לפיזור תאים.
    4. העבירו 1 מ"ל מהמתלה ל-9 מ"ל של מדיום שלם טרי.
    5. ספור את התאים.
      הערה: התאים נספרו באמצעות מונה תאים אוטומטי TC20 בהתאם להוראות היצרן. לא נעשה שימוש בכחול טריפן או בחומרי צביעה אחרים.
  4. תאי זרעים על הכיסויים.
    1. לדלל את התאים לריכוז סופי של ~1 × 106 תאים/מ"ל.
    2. הנח את כיסויי הזכוכית האישיים בגודל 18 מ"מ לבארות של צלחת 12 בארות.
      הערה: יש לבצע חיטוי של כיסויי זכוכית לפני השימוש בהם לתרבית תאים.
    3. הוסף 2 מ"ל מהמדיום השלם ו -200 מיקרוליטר של תרחיף התא (~ 2 × 105 תאים / באר).
    4. דגרו על התאים למשך הלילה כדי לאפשר חיבור לתאים.
      הערה: כדי להבטיח שהתאים נמצאים במצב גידול תקין, בדוק באופן שגרתי את המורפולוגיה של התאים ואת מצב הגידול שלהם (באמצעות מיקרוסקופ) וכן בחן זיהום מיקופלזמה פוטנציאלי (באמצעות ערכת זיהוי מיקופלזמה).

2. שטיפת תאים עם תמיסת אמוניום פורמט (AF).

הערה: הכן תמיסת AF טרייה בכל פעם.

  1. הכן את מאגר שטיפת ה-AF. שוקלים 0.45 גרם של פורמט אמוניום ומתמוססים ב-50 מ"ל מים בדרגת LC/MS. הריכוז הסופי של פורמט אמוניום הוא 0.14 M (0.9% w/w).
    הערה: שמור את התמיסה קרה כקרח (0-4 מעלות צלזיוס) עד לשימוש.
  2. הוסף 2 מ"ל של תמיסת AF קרה לכל באר של צלחת 12 הבארות.
  3. שוטפים את הכיסויים. השתמש בזוג מלקחיים סטריליים כדי להרים בעדינות כל כיסוי המכיל תאים דבקים מהבאר שלו ולאחר מכן לזמן קצר (למשך 2-3 שניות) הנח אותו בבאר נפרדת מלאה מראש ב-2 מ"ל של תמיסת אמוניום פורמטיבית (AF) קרה של 0.9%. חזור על תהליך השטיפה.
    הערה: כדי למנוע הפרעה לתאים במהלך שלב הכביסה, בצע שטיפת תאים בעדינות רבה.

3. מרווה תאים על ידי חנקן נוזלי (LN2)

  1. הנח כל כיסוי שטוף AF (תאים הפונים כלפי מעלה) לתוך צלחת הפטרי בתוך מיכל נייר האלומיניום.
    הערה: ללבוש כפפות בדירוג קריוגני, משקפי מגן ומעיל מעבדה. בצע את כל הטיפול ב-LN2 באזור מאוורר היטב. ניתן להשתמש בנייר אלומיניום לקיפול מיכל למרווה LN2 .
  2. יוצקים לאט 10-20 מ"ל חנקן נוזלי על החלקות הכיסוי, ומבטיחים כיסוי מלא.
  3. הטה מיד את צלחת הפטרי בפינצטה כדי לשפוך את כל החנקן הנוזלי שנותר.
    הערה: השלם פעולה זו תוך מספר שניות כדי למנוע היווצרות גבישי קרח גדולים משאריות לחות הכביסה.

4. ייבוש בהקפאת תאים בוואקום

  1. יש לייבש בהקפאה מיד לאחר מרווה LN2 כדי למנוע הפשרה.
    הערה: הסר את הרוטור של ה-SpeedVac כדי ליצור פלטפורמה שטוחה המתאימה לצלחת פטרי 100 מ"מ.
  2. בעזרת כפפות קריוגניות ופינצטה מבודדת, הנח את צלחת הפטרי המכילה את הכיסויים המצוננים LN2 על תא ריכוז הוואקום.
  3. עבד באמצעות הגדרות הוואקום הסטנדרטיות שלו והמשך במשך 5-7 דקות עד ש-LN2 הנראה לעין התאדה והחלקות הכיסוי נראות יבשות. כיסויים מיובשים לא צריכים להכיל שאריות LN2 וגבישי קרח.

5. אחסון תאים במקפיא -80 מעלות צלזיוס

  1. עוטפים את המיכל במגבת נייר ומעבירים למקפיא של 80 מעלות למשך 48 שעות.
  2. לאחר האחסון, העבירו מיד את הכיסויים המכילים את צלחת הפטרי למייבש בטמפרטורת החדר למשך ~10 דקות. ודא שכפור מרוכז או מים על החלקות הכיסוי נעלמים לחלוטין לפני הוצאתם מחומר הייבוש.
    הערה: העברה מהירה של החלקות הכיסוי למייבש ממזערת את העיבוי; אפילו הרטבה קלה על פני השטח עלולה להמיס מטבוליטים מיובשים.
  3. לאחר שטיפת AF, חלקו את הדגימות לשתי קבוצות (קבוצה 1 וקבוצה 2). החל את פרוטוקולי העיבוד הבאים.
    קבוצה 1: מרווה LN2 → ייבוש בהקפאה → ניתוח SCMS (ללא אחסון).
    קבוצה 2: מרווה LN2 → ייבוש בהקפאה → -80 מעלות צלזיוס אחסון 48 שעות → ניתוח SCMS.
  4. המשך בניתוח SCMS כמתואר להלן.
    הערה: ניתן להכין קבוצות תאים נוספות בתנאים שונים. קבוצה 1 וקבוצה 2 משמשות להמחשת הפרוטוקולים הכלליים.

6. ייצור בדיקה אחת והגדרת SCMS

הערה: הגשושית היחידה מיוצרת בהתאם לנהלים שנקבעו 21,24,60,61, ורק פרוטוקולים קצרים מסופקים כאן.

  1. משוך את מחט הקוורץ בעלת הקדח הכפול באמצעות מושך לייזר וצור קצה של ~10 מיקרומטר. הרכיבו בדיקה יחידה על ידי הכנסת נימי הסיליקה המותכים ופולט הננו-ESI לתוך מחט הקוורץ בעלת הקדח הכפול. אבטח את כל הרכיבים למגלשת זכוכית עם אפוקסי להגדרה מהירה.
  2. הרכיב את הגשושית היחידה על שלב XYZ. הצמד את הגשושית היחידה למניפולטור XYZ ממונע הממוקם מתחת למיקרוסקופ דיגיטלי.
  3. חבר את ההתקנה לספקטרומטר מסה לניתוח SCMS.
  4. השתמש באצטוניטריל (≥99.9%) המכיל 0.1% חומצה פורמית כממס מיצוי בקצב זרימה של 150 נ"ל/דקה המועבר על ידי משאבת מזרק.
  5. הגדר את הפרמטרים של MS.
    מצב יונים חיובי: m/z 200-1500, +2.9 קילו וולט, רזולוציית מסה 120 k (ב-m/z 200).
    מצב יונים שלילי: m/z 70-900, -2.1 קילו וולט, רזולוציית מסה 120 k (ב-m/z 200).
    הערה: מכיוון שיונים שליליים מזוהים בדרך כלל בטווח m/z נמוך מזה של יונים חיוביים, ניתן להשתמש בטווחי m/z שונים עבור שני מצבי יונים אלה. הגדרות MS נוספות כוללות זמן הזרקה מקסימלי של 100 אלפיות השנייה, מיקרו-סריקה אחת, בקרת רווח אוטומטית סטנדרטית (AGC), אופן סריקה מלאה (עבור ניתוח MS), דיסוציאציה התנגשות באנרגיה גבוהה יותר (HCD) (עבור ניתוח MS/MS) עם 10-35 אנרגיית התנגשות מנורמלת (NCE), ו-320 מעלות צלזיוס עבור טמפרטורת צינור העברת היונים. כרומטוגרמה כוללת של יונים (TIC) נוצרה בכל סריקה/נקודת זמן כדי לנטר את יציבות האות וזיהוי תא בודד.

7. ניסויי SCMS עם בדיקה אחת

  1. הנח את שני הכיסויים (קבוצה 1 וקבוצה 2) יחד על ה-XYZ הממונע stage של מערך SCMS יחיד 21,24,61.
  2. כדי למזער את השפעות האצווה, בחר את התאים באופן אקראי תחת המיקרוסקופ.
  3. רכוש ספקטרום מסה של מצב יונים חיובי ושלילי. נתח מספר תאים (למשל, ~30) לכל קבוצה עם אותו בדיקה יחידה, קצב זרימת ממס ומתח יינון.
    הערה: השתמש באותו מתח בדיקה יחיד, קצב זרימת ממס ומיינון עבור כל ניסוי כדי להבטיח השוואת נתונים. כייל את ה-Orbitrap מדי יום לפני הרכישה. ניתן לבצע ניתוחי טרשת נפוצה ו-MS/MS ברמת התא הבודד. אסוף נתוני MS כדי לקבל ערכי m/z מדויקים למחקרים של פרופילי מטבוליט ותוויות טנטטיביות בניתוח לא ממוקד. ביצוע ניתוח MS/MS של יונים נבחרים לזיהוי מולקולרי בניתוח ממוקד. הנתונים הושגו באמצעות תוכנת איסוף ופרשנות נתונים תואמת.

8. ניתוח נתונים

  1. עבד מראש את נתוני ה-SCMS הגולמיים באמצעות סקריפט R מותאם אישית. שלבי העיבוד המקדים כוללים הסרת רקע ורעש ונורמליזציה של עוצמת היונים ל-TIC 11,12,23.
  2. דה-איזוטופ של נתוני SCMS באמצעות חבילת Python ms_deisotope.
  3. בצע יישור שיא באמצעות סקריפט Pythonפנימי 60. השתמש ברוחב סל של 0.01 m/z עבור binning. השתמש בסובלנות מסה של 0.01 m/z או 5 ppm ליישור שיא.
  4. בצע ניתוח נתונים סטטיסטיים באמצעות MetaboAnalyst 6.062. ערכו בדיקת t וצרו מפת חום (לרמות מטבוליט יחסיות). בחר השתמש ב-100 המובילים ב-T-test/ANOVA כדי ליצור את 100 המטבוליטים המובילים, המדורגים לפי ערכי p מנמוך לגבוה, עם הבדל משמעותי (p <-0.05) מההשוואה. שרטטו מפת חום באמצעות 100 המטבוליטים המובילים הללו.
  5. חפש ערכי m/z מדויקים וספקטרום MS/MS מול מסד הנתונים של מטבולום אנושי (HMDB63). השתמש בסובלנות מסה של 10 עמודים לדקה בחיפוש במסד נתונים של MS.
    הערה: ניתן להשתמש במסדי נתונים אחרים, כגון LipidMaps64, לחיפוש במסדי נתונים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוח זה מתאר מתודולוגיה המשלבת שטיפת תאים, כיבוי תאים מהיר, ייבוש ואקום ואחסון ב-80°C- (איור 1). באופן ספציפי, גישה זו נועדה לשמר את המצב המטבולומי של התאים לפני ניתוח SCMS. יעילותו של פרוטוקול זה נבדקה על ידי הכנת תאים בשני תנאים שונים: תאים טריים ומיובשים (קבוצה 1, המשמשת כביקורת), ותאים מרווים, מיובשים ומאוחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס (קבוצה 2). כל קבוצה נותחה בשיטת SCMS של בדיקה אחת במצבי יונים חיוביים ושליליים כאחד. ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) והדמיית מפת חום שימשו להערכת ההבדלים בפרופילים מטבולומיים בין קבוצות.

תוצאות PCA במצב היונים החיובי (איור 2A) חשפו כי לקבוצות 1 וקבוצה 2 היו פרופילי מטבוליטים כלליים דומים. הפרופילים הכמעט זהים של קבוצה 1 וקבוצה 2 מדגימים שאחסון של -80 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות אינו משנה באופן משמעותי את המטבולום אם התאים מרווים כראוי לפני הייבוש. במצב היונים השליליים (איור 2B), נצפה דפוס דומה, אם כי קבוצה 2 נראית מעט יותר מובחנת בפוטנציאל עקב הבדלי יינון בין מחלקות מטבוליטים ספציפיות, למשל, פוספטידילכולינים מזוהים טוב יותר במצב חיובי, בעוד שחומצות שומן מייננות ביעילות רבה יותר במצב שלילי60. למרות שונות זו, האשכולות העקביים בין קבוצות 1 ו-2 בשני המצבים תומכים במסקנה כי פרוטוקול המרווה-ייבוש-אחסון המשולב שומר על שלמות מטבולית.

ניתוח מפת החום אימת עוד יותר את ממצאי ה-PCA על ידי תיאור השפע היחסי של 100 המטבוליטים המובילים בשתי קבוצות. כפי שמוצג באיור 3, 100 המטבוליטים המובילים מציגים דפוסי שפע עקביים ביותר בין קבוצה 1 לקבוצה 2 בשני מצבי היונים. לא נצפו תזוזות גדולות או אשכולות ספציפיים לקבוצה, אם כי שינויים קלים בכמה צבירי מטבוליטים עשויים לשקף הבדלים ביעילות היינון או ביציבות המטבוליטים. תוצאות אלו מדגימות ביחד כי זרימת העבודה של מרווה-ייבוש-אחסון שומרת על פרופילים מטבולומיים תאיים בנאמנות גבוהה, מה שהופך אותה למתאימה היטב עבור יישומי SCMS סביבתיים.

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה כללית עבור ניתוח ספקטרומטריית מסה של תא יחיד (SCMS) החוקר כיצד מרווה LN2 ואחסון של 48 שעות ב-80 מעלות צלזיוס משפיעים על פרופילי מטבוליט בתאים בודדים. (A) תאים נזרעו, הודגרו ונשטפו באמצעות תמיסת פורמט אמוניום (AF). (B) הוכנו שתי קבוצות תאים - קבוצה 1: תאים נשטפו, רוו ויובשו בהקפאה לניסויי SCMS מיידיים ללא אחסון; קבוצה 2: תאים נשטפו, מרווים, יובשו בהקפאה ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) של נתוני SCMS מתאי HCT-116 בקבוצות ניסוי במצב יונים חיוביים (A) ו-(B) מצב יונים שליליים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מפות חום המציגות את הרמות היחסיות של 100 המטבוליטים המובילים שזוהו בתאי HCT-116 בודדים שהוכנו בתנאים שונים, המוצגים עבור (A) אופן יונים חיוביים ו-(B) אופן יונים שליליים. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא כיבוי מיידי של תאים חיים באמצעות LN2 לאחר שטיפה עם AF, מה שמפחית באופן משמעותי את הפעילות האנזימטית ועוצר תהליכים מטבוליים מתמשכים. בנוסף, שטיפת תאים עם AF לפני כיבוי עוצמת יונים מוגברת והשפעות מטריצה מופחתות, תומכת בהכללתו כשלב הכנה לשיפור רגישות SCMS. במחקרים הנוכחיים, תאים בקבוצות שונות (כלומר, קבוצה 1 וקבוצה 2) תורבבו באמצעות אותה אצווה ראשונית כדי למזער את השונות הביולוגית שלהם. זמן אחסון של 48 שעות נבחר מכיוון שתאים עם זמן גדילה נוסף (קבוצה 1) עדיין יכולים לשמור על צפיפות תאים מתאימה (למשל, כדי למנוע אגרגטים של תאים) לניתוח SCMS השוואתי עם תאים מאוחסנים (קבוצה 2). עם זאת, יש לנקוט משנה זהירות כאשר מסתמכים על אחסון בקירור, אפילו למשך 48 שעות, מכיוון שעדיין נצפו שינויים מטבוליים משמעותיים בהשוואה בין דגימות מיובשות ומאוחסנות (קבוצה 1 לעומת 1. קבוצה 2). למרות שבמחקרים בפועל, דגימות תאים ורקמות מאוחסנות בדרך כלל לתקופות ארוכות יותר (למשל, שבועות וחודשים) במקפיא של -80 מעלות צלזיוס, מומלץ לקצר את זמן האחסון כדי למזער שינויים במטבוליטים.

לכן פתרון בעיות צריך להתמקד במזעור הזמן בין הייבוש לניתוח SCMS, ולהבטיח שתנאי ההפשרה ימנעו עיבוי או התייבשות חלקית. תכולת מים שיורית ועיבוי מים במהלך מעברי דגימה יכולים להחזיר חלקית את התאים ולאפשר תגובות אנזימטיות וכימיות כגון הידרוליזה, חמצון ופרוטאוליזה המפרקות מטבוליטים65, מה שמוביל לשינויים מלאכותיים בהרכב המטבוליטים. דגימות מיובשות היטב עוצרות ביעילות תהליכים אלה ושומרות על שלמות מולקולרית66. הבטחת סביבת ייבוש נטולת לחות ומעבר מהיר ל-SCMS היא המפתח להימנעות ממלכודות אלו.

למרות הצלחתה של שיטה זו בשימור פרופילי מטבוליטים, נותרו מגבלות. השיטה דורשת גישה למערכת ייבוש ואקום ומקפיא 80 מעלות צלזיוס, והיא אינה יעילה לחלוטין לאחסון לטווח ארוך. יתר על כן, בעוד שייבוש מהיר בטמפרטורת החדר משמר מטבוליטים באופן זמני, הוא אינו מהווה תחליף למרווה LN2 . שינויים הקשורים לאחסון עדיין עשויים להתרחש עקב פינוי מים לא מלא והסיכון להתייבשות במהלך הטיפול בדגימה. מגבלות אלו מדגישות את הצורך בחידוד השיטה אם רוצים אחסון ארוך יותר או תפוקה גבוהה יותר.

הפרוטוקולים המדווחים בעבודה זו מציעים גישה פשוטה ויעילה לשימור המטבולום של תא בודד עבור SCMS סביבתי. בניגוד לשיטות הדורשות חומרי הקפאה משוכללים או הקפאה באתר, זרימת העבודה שלנו תואמת בקלות לטכניקות יינון הסביבה הקיימות ומאפשרת לוחות זמנים גמישים של דגימה וניתוח. השילוב של שטיפת תאים, מרווה, ייבוש ואחסון לטווח קצר ללא אובדן משמעותי של נאמנות מטבולומית מציע פתרון מעשי למעבדות חסרות גישה לפי דרישה לספקטרומטרי מסה. גישה זו טומנת בחובה פוטנציאל חזק לקידום המחקר בביולוגיה של מערכות תאים בודדים, מטבוליזם של סרטן, הטרוגניות של תגובה לתרופות ופנוטיפ מטבולי של אוכלוסיות תאים נדירים. הישימות הרחבה של פרוטוקולים אלה, במיוחד עבור פלטפורמות SCMS מבוססות יינון סביבתי, הופכת אותם לתרומה חשובה לתחום הטכניקות האנליטיות של תא בודד. במחקרים עתידיים, ניתן להתאים ולחדד את הפרוטוקולים הללו כך שיתאימו למגוון רחב יותר של סוגי תאים. עם שלבי הכנת דגימה נוספים (למשל, יישום מטריצה), ניתן לנתח את התאים המעובדים על ידי טכניקות SCMS אחרות (למשל, MALDI ו-SIMS), המציעות רזולוציה מרחבית ותפוקה גבוהות יותר לניתוח של מספר גדול יותר של תאים (למשל, תאים מתכנסים מאוד). התוצאות מצביעות גם על כך שניתן להשתמש בפרוטוקולי מרווה-ייבוש-אחסון אלה להכנת תאים למשלוח (למשל, במיכלי קרח יבש), מה שמאפשר מחקרי SCMS משותפים במקומות שונים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (2305182), המכונים הלאומיים לבריאות (1R01AI177469) ויוזמת צ'אן צוקרברג. איור 1 נוצר ב-BioRender (https://BioRender.com/yqn5isk).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
-80 מעלות; מקפיא Cאפנדורף, ניו ברונסוויקU700הכנת מדגם
אצטונטרילתרמו-פישר סיינטיפיק240744הגדרת ניסוי SCMS
פורמט אמוניום תרמו-פישר סיינטיפיק401152500הכנת מדגם
כיסוי 18 מ"מזכוכית כיסוי מיקרו VMR48380046תרבית תאים
סטריאומיקרוסקופ דיגיטלישנזן D& F Co.סופראייז T004ניתוח
צינורות קוורץ כפולים, 1.120 אינץ' x0.005 אינץ' x12 אינץ'פרידריך & דימוק בע"מMBT-005-020-2Qייצור בדיקה אחת
שרף אפוקסידבקוןחלק מס' 20945ייצור בדיקה אחת
חומצה פורמיתהמדע של וורד 470301-120 500 מ"להגדרת ניסוי SCMS
נימי סיליקה התמזגו, ID: 40 ומיקרו; מ', OD: 100 ומיקרו; mטכנולוגיות פולימיקרוTSP040105ייצור בדיקה אחת
נימי סיליקה התמזגו, ID: 50 ומיקרו; מ', OD: 150 ומיקרו; mטכנולוגיות פולימיקרו1068150015הגדרת ניסוי SCMS
כיסויי זכוכית, 18 מ"מVWR 48380046תרבית תאים
סרום סינתטי HyClone (FBS)שיקלוןSH3006603תרבית תאים
אינקובטור HeraCell (Heraeus)תרבית תאים
מושך לייזרסאטר אינסטרומנט ושות'דגם P-2000ייצור בדיקה אחת
מנורת LED UVפושאן ליאנג יה ציוד שינייםLY-C240ייצור בדיקה אחת
ה-5A של מקוי ג'יבקו 2537128תרבית תאים
מיקרו-איחודIDEX בריאות & מדע בע"מM-539הגדרת ניסוי SCMS
ממשק FAIMS pro שונה תרמו פישר 98100-20046ניתוח
ערכת זיהוי מיקופלזמה MycoAlert PLUSלונזהLT07-703תרבית תאים
לוח אופטי חוות דעת על Thorlabs Inc. , ניוטוןניתוח
מים בדרגת אופטימה LC/MS (פישר כימיקלים, ארה"ב)תרמו-פישר סיינטיפיקW6500הכנת מדגם
ספקטרומטר מסה Orbitrap Exploris 240 תרמו-פישר סיינטיפיקהגדרת ניסוי SCMS
פניצילין/סטרפטומיציןג'יבקו15140-122תרבית תאים
מי מלח חומציים פוספט (PBS)VWR0780-50 ליטרתרבית תאים
רכז SpeedVac (Savant)תרמו-פישר סיינטיפיק SPD111 וולטהכנת מדגם
משאבת מזרק (SKE10)Chemyx בע"מ80561הגדרת ניסוי SCMS
מזרק, 250 ומיקרו; Lהמילטון1725LTN250ULהגדרת ניסוי SCMS
מונה תאים אוטומטי TC20מעבדות ביו-ראד ברקוד 1450102EDUספירת תאים
צלחת תרבית רקמות, 100 מ"מפישר סיינטיפיק FB012924תרבית תאים
טריפסין-EDTAתרמו-פישר סיינטיפיק25200-072תרבית תאים
מיקרוסקופ דיגיטלי USB ("עקרב" 500 זום)Chinavasion, סיטונאי בע"מניתוח
שרף ריפוי UVפריים דנטלפריט מספר.006.030ייצור בדיקה אחת
תוכנת Xcaliburתרמו-פישר סיינטיפיק
שלב XYZ (CONEX- MFACC)ניופורט קורפניתוח

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology (Basel). 12 (3), 393(2023).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat Methods. 8 (4 Suppl), S20-S29 (2011).
  3. Kanter, I., Kalisky, T. Single cell transcriptomics: Methods and applications. Front Oncol. 5, 53(2015).
  4. Newman, J. R., et al. Single-cell proteomic analysis of s. Cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).
  5. Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
  6. Yang, Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  7. Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. Challenges and opportunities of metabolomics. J Cell Physiol. 227 (8), 2975-2981 (2012).
  8. By B Alberts, D. B., Lewis, J., Raft, M., Roberts, K., Watson, J. D. Molecular biology of cell. 1361, Garland Publishing. (1994).
  9. Zhang, L., Vertes, A. Single-cell mass spectrometry approaches to explore cellular heterogeneity. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  10. Duncan, K. D., Fyrestam, J., Lanekoff, I. Advances in mass spectrometry-based single-cell metabolomics. Analyst. 144 (3), 782-793 (2019).
  11. Lan, Y., Zou, Z., Yang, Z. Single cell mass spectrometry: Towards quantification of small molecules in individual cells. TrAC Trends Anal Chem. 174, 117657(2024).
  12. Renmeng Liu, Z. Y. Single cell metabolomics using mass spectrometry- techniques and data analysis. Analytica Chimica Acta. 1143, 11(2021).
  13. Chen, Z. Y., et al. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single-cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13, 6687-6695 (2022).
  14. Ibanez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  15. Niehaus, M., Soltwisch, J., Belov, M. E., Dreisewerd, K. Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution. Nat Methods. 16 (9), 925-931 (2019).
  16. Passarelli, M. K., et al. The 3D orbisims-label-free metabolic imaging with subcellular lateral resolution and high mass-resolving power. Nat Methods. 14 (12), 1175-1183 (2017).
  17. Suvannapruk, W., et al. Single-cell metabolic profiling of macrophages using 3D orbisims: Correlations with phenotype. Anal Chem. 94 (26), 9389-9398 (2022).
  18. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live single-cell molecular analysis by video-mass spectrometry. Anal Sci. 24 (5), 559-561 (2008).
  19. Zhang, H., Shi, X., Lu, H., Li, L. Delineation of subcellular molecular heterogeneity in single cells via ultralow-flow-rate desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 97 (18), 9985-9991 (2025).
  20. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  21. Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: Single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chem Commun (Camb). 55 (5), 616-619 (2019).
  23. Bhusal, D., Wije Munige, S., Peng, Z., Yang, Z. Exploring single-probe single-cell mass spectrometry: Current trends and future directions. Anal Chem. 97 (9), 4750-4762 (2025).
  24. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the single-probe: Mass spectrometry imaging and single cell analysis under ambient conditions. J Vis Exp. (112), e53911(2016).
  25. Pan, N., et al. Quantification of drug molecules in live single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 91 (14), 9018-9024 (2019).
  26. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic studies of live single cancer stem cells using mass spectrometry. Anal Chem. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  27. Lan, Y., Chen, X., Yang, Z. Quantification of nitric oxide in single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 95 (51), 18871-18879 (2023).
  28. Chen, X., Sun, M., Yang, Z. Single cell mass spectrometry analysis of drug-resistant cancer cells: Metabolomics studies of synergetic effect of combinational treatment. Anal Chim Acta. 1201, 339621(2022).
  29. Sun, M., Chen, X., Yang, Z. Single cell mass spectrometry studies reveal metabolomic features and potential mechanisms of drug-resistant cancer cell lines. Anal Chim Acta. 1206, 339761(2022).
  30. Bensen, R. C., et al. Single-cell mass spectrometry quantification of anticancer drugs: Proof of concept in cancer patients. ACS Pharmacol Transl Sci. 4 (1), 96-100 (2021).
  31. Liu, R., Zhang, G., Sun, M., Pan, X., Yang, Z. Integrating a generalized data analysis workflow with the single-probe mass spectrometry experiment for single cell metabolomics. Anal Chim Acta. 1064, 71-79 (2019).
  32. Nguyen, T. D., et al. Single-cell mass spectrometry enables insight into heterogeneity in infectious disease. Anal Chem. 94 (30), 10567-10572 (2022).
  33. Liu, R., et al. Quantifying cell heterogeneity and subpopulations using single cell metabolomics. Anal Chem. 95 (18), 7127-7133 (2023).
  34. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using dicationic ion-pairing compounds to enhance the single cell mass spectrometry analysis using the single-probe: A microscale sampling and ionization device. Anal Chem. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  35. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass spectrometry measurement of single suspended cells using a combined cell manipulation system and a single-probe device. Anal Chem. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  36. Chen, X., Peng, Z., Yang, Z. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13 (22), 6687-6695 (2022).
  37. Bergman, H. M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  38. Portero, E. P., Nemes, P. Dual cationic-anionic profiling of metabolites in a single identified cell in a live Xenopus laevis embryo by microprobe CE-ESI-MS. Analyst. 144 (3), 892-900 (2019).
  39. Zhang, X. C., et al. Combination of droplet extraction and pico-ESI-MS allows the identification of metabolites from single cancer cells. Anal Chem. 90 (16), 9897-9903 (2018).
  40. Guo, S., Zhang, C., Le, A. The limitless applications of single-cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 71, 115-122 (2021).
  41. Buziol, S., et al. New bioreactor-coupled rapid stopped-flow sampling technique for measurements of metabolite dynamics on a subsecond time scale. Biotechnol Bioeng. 80 (6), 632-636 (2002).
  42. Sake, C. L., Newman, D. M., Boyle, N. R. Evaluation of quenching methods for metabolite recovery in photoautotrophic Synechococcus sp. Pcc 7002. Biotechnol Prog. 36 (5), e3015(2020).
  43. Wang, T. X. Y. G., Zhuang, Y., Wang, G. A systematic evaluation of quenching and extraction procedures for quantitative metabolome profiling of HeLa carcinoma cell under 2D and 3D cell culture conditions. Biotechnol J. 18 (5), e2200444(2023).
  44. Hernandez Bort, J. A., et al. Reduced quenching and extraction time for mammalian cells using filtration and syringe extraction. J Biotechnol. 182 - 183 (100), 97-103 (2014).
  45. House, R. R. J., et al. A diverse proteome is present and enzymatically active in metabolite extracts. Nat Commun. 15 (1), 5796(2024).
  46. Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. Single-cell MALDI-MS as an analytical tool for studying intrapopulation metabolic heterogeneity of unicellular organisms. Anal. Chem. 82, 6(2010).
  47. Sellick, C. A., et al. Effective quenching processes for physiologically valid metabolite profiling of suspension cultured mammalian cells. Anal Chem. 81 (1), 174-183 (2008).
  48. Dietmair, S., Timmins, N. E., Gray, P. P., Nielsen, L. K., Kromer, J. O. Towards quantitative metabolomics of mammalian cells: Development of a metabolite extraction protocol. Anal Biochem. 404 (2), 155-164 (2010).
  49. Faijes, M., Mars, A. E., Smid, E. J. Comparison of quenching and extraction methodologies for metabolome analysis of Lactobacillus plantarum. Microb Cell Fact. 6, 27(2007).
  50. Pabst, M. G. J., et al. Nucleotide and nucleotide sugar analysis by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry on surface-conditioned porous graphitic carbon. Anal. Chem. 82 (23), 6(2010).
  51. Lorenz, M. A., Burant, C. F., Kennedy, R. T. Reducing time and increasing sensitivity in sample preparation for adherent mammalian cell metabolomics. Anal Chem. 83 (9), 3406-3414 (2011).
  52. Wahrheit, J., Heinzle, E. Quenching methods for the analysis of intracellular metabolites. Methods Mol Biol. 1104, 211-221 (2014).
  53. Volmer, M., Gettmann, J., Scholz, S., Buntemeyer, H., Noll, T. A method for metabolomic sampling of suspended animal cells using fast filtration. BMC Proc. 5 (Suppl 8), P93(2011).
  54. Richard King, R. B., Fernandez-Metzler, C., Cynthia Miller-Stein, A. T. O. Mechanistic investigation of ionization suppression in electrospray ionization. J Am Soc Mass Spectrom. 11, 8(2000).
  55. Dunn, W. B. Current trends and future requirements for the mass spectrometric investigation of microbial, mammalian and plant metabolomes. Phys Biol. 5 (1), 011001(2008).
  56. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: Quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), 53(2017).
  57. Krismer, J., et al. Screening of Chlamydomonas reinhardtii populations with single-cell resolution by using a high-throughput microscale sample preparation for matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Appl Environ Microbiol. 81 (16), 5546-5551 (2015).
  58. Ye, D., et al. Improved sample preparation for untargeted metabolomics profiling of Escherichia coli. Microbiol Spectr. 9 (2), e0062521(2021).
  59. Volmer, M., et al. Fast filtration for metabolome sampling of suspended animal cells. Biotechnol Lett. 33 (3), 495-502 (2011).
  60. Wije Munige, S., Bhusal, D., Peng, Z., Chen, D., Yang, Z. Developing a cell quenching method to facilitate single cell mass spectrometry metabolomics studies. JACS Au. 5 (5), 2379-2387 (2025).
  61. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells. J Vis Exp. (148), e59875(2019).
  62. Pang, Z., et al. Metaboanalyst 6.0: Towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation. Nucleic Acids Res. 52 (W1), W398-W406 (2024).
  63. Wishart, D. S., et al. Hmdb 5.0: The human metabolome database for 2022. Nucleic Acids Research. 50 (D1), D622-D631 (2022).
  64. Conroy, M. J., et al. Lipid maps: Update to databases and tools for the lipidomics community. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1677-D1682 (2024).
  65. Pinu, F., Villas-Boas, S. Extracellular microbial metabolomics: The state of the art. Metabolites. 7 (3), 43(2017).
  66. Rockinger, U., Funk, M., Winter, G. Current approaches of preservation of cells during (freeze-) drying. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (8), 2873-2893 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים