הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנה והערכה של מודל אי ספיקת שחלות מוקדמת בעכבר

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69000

⸱

19 בספטמבר 2025

 , 
1The First Hospital of Anhui University of Science and Technology'

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבניית מודל עכבר של אי ספיקת שחלות מוקדמת באמצעות הזרקת ציקלופוספאמיד. המודל משכפל ביעילות, בקלות ובהתאמה את ההתקדמות הפתולוגית של אי ספיקה שחלתית מוקדמת אנושית, ומפגין אמינות גבוהה וחסכוניות.

תקציר

אי ספיקת שחלות מוקדמת (POI) היא מצב קריטי המוביל לאי פוריות נשית, המחייב מודלים אמינים של בעלי חיים למחקר מכניסטי וטיפולי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי להקמה והערכה של מודל עכבר POI המושרה על ידי ציקלופוספאמיד (CTX). עכברים נקבות בנות שישה עד שמונה שבועות עם מחזורי ייחום סדירים נבחרו ועברו זריקות CTX תוך צפקיות: מינון ראשוני של 100 מ"ג/ק"ג ביום הראשון, ואחריו מינון יומי של 20 מ"ג/ק"ג במשך 14 הימים הבאים. שינויים דינמיים במחזורי הייחום נוטרו באמצעות ציטולוגיה של מריחת הנרתיק עם צביעת רייט. רמות הסרום של אסטרדיול (E2), הורמון מגרה זקיק (FSH) והורמון אנטי-מולרי (AMH) כומתו באמצעות ELISA כדי להעריך שינויים אנדוקריניים. היסטופתולוגיה של השחלות הוערכה באמצעות צביעת המטוקסילין-אאוזין (H&E) של קטעים משובצים בפרפין כדי לכמת אטרזיה זקיקית, בעוד שניתוח אימונוהיסטוכימי של קספאז-3 שסוע בוצע לאיתור אפופטוזיס של תאי גרנולוזה. התוצאות הראו שיבוש במחזוריות הייחום, ירידה משמעותית ברמות E2 ו-AMH, ריכוזי FSH גבוהים, אטרזיה זקיקית מוגברת ואפופטוזיס מוגבר של תאי גרנולוזה בעכברים שטופלו ב-CTX, מה שאישר מודלים מוצלחים של POI. שיטת בניית מודל זו יכולה לחקות מאוד את המנגנון של נזק לשחלות הנגרם על ידי כימותרפיה, ולהציג מאפיינים פתולוגיים אופייניים כגון דלדול עתודות זקיקים והפרעות בהורמוני המין. הוא מספק פלטפורמה ניסויית אמינה לחשיפת מנגנון רעילות הרבייה של כימותרפיה, בדיקת תרופות להגנה על השחלות ואופטימיזציה של אסטרטגיות שימור פוריות. יתר על כן, דגם זה פשוט יחסית לתפעול, בעלות נמוכה ובעל מחזור ייצור קצר, מה שמקל על הביצוע והפופולריות. המתודולוגיה תואמת את הדרישות של JoVE להדגמות ניסיוניות הניתנות להמחשה צעד אחר צעד.

מבוא

אי ספיקת שחלות מוקדמת (POI), הצורה הנפוצה ביותר של הפרעת הזדקנות הרבייה הנשית, לא רק פוגעת קשות בבריאות הפיזית והנפשית של המטופלות באמצעות תסמיני מחסור באסטרוגן ותפקוד לקוי של מערכת הרבייה, אלא גם מעלה את הסיכונים לפתח מחלות נלוות, כולל שברים, הפרעות אוטואימוניות, מחלות לב וכלי דם, סוכרת וכו'.1. פיתוח אסטרטגיות טיפוליות יעילות ובטוחות הפך אפוא לעדיפות דחופה ביותר ברפואה המודרנית. בהתחשב בזמינות המוגבלת של דגימות קליניות, אטיולוגיה רב-גורמית וסיכונים אתיים גבוהים הקשורים למחקר POI, הקמת מודלים אמינים של בעלי חיים המאפשרים חקירה מכניסטית שיטתית ואימות בטיחות הפכה להכרחית.

נכון לעכשיו, מודלים של נזק לשחלות הנגרמים על ידי כימותרפיה נמצאים בשימוש נרחב למחקרי POI. ציקלופוספאמיד (CTX), חומר אלקילציה בעל תכונות מדכאות חיסון, זוהה כתרכובת גונדוטוקסית חזקה. המנגנון שלו כרוך בנזק צולב DNA כדי לדכא התפשטות תאית2, מה שמוביל לאפופטוזיס של תאי רזרבה בשחלות 3,4. מודלים מבוססי CTX מסכמים ביעילות את סימני ההיכר הקליניים של POI, כולל דלדול זקיקים קדמוניים, היפואסטרוגנמיה ורמות גבוהות של הורמון מגרה זקיק (FSH). הזרקת CTX תוך-צפקית בעכברים מציעה יתרונות ברורים: זמינות ביולוגית גבוהה באמצעות ספיגה צפקית מהירה, יכולת תפעול סטנדרטית עם שונות טכנית מינימלית וחסכוניות למחקרים בקנה מידה גדול. יש לציין כי המבנה השחלתי של עכברים דומה מאוד לזה של בני אדם, מה שמקל על התבוננות דינמית בדלדול זקיקים ושינויים הורמונליים. יתר על כן, עכברים הם בעלות נמוכה ובעלי קצב רבייה מהיר, העומדים בדרישות למחקרי מדגם בקנה מידה גדול.

למרות יתרונות אלה, הטרוגניות במשטרי מינון CTX (למשל, זריקות בולוס בודדות לעומת זריקות מקוטעות) וחלונות מתן זמניים הובילו לתוצאות מודלים לא עקביות בין מחקרים. כדי להתמודד עם פער זה, אנו מציגים פרוטוקול שיטתי המייעל את מינון ה-CTX ותדירות המתן לאינדוקציה של POI בעכברים. מחקר זה נועד לבסס מודל הניתן לשחזור באמצעות הערכה כמותית של דלדול רזרבה בשחלות, חוסר ויסות הורמונלי ומתאמים היסטופתולוגיים, ובכך לספק פלטפורמה חזקה לחקירה מכניסטית ובדיקות טיפוליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd. (מספר אתיקה: SDLL202502281). מחקר זה עומד בהנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לגבי טיפול ושימוש במכרסמי מעבדה בכל הליכי הניסויים בבעלי חיים. נקבות העכברים C57BL/6 ששימשו בניסוי זה היו בנות 6-8 שבועות ונשמרו בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים (SPF). כזן מולד ותת-זן של שושלת C57, עכברי C57BL/6 מאופיינים בפרווה השחורה שלהם. לפני הניסויים, העכברים התאקלמו במשך שבוע במעבדת בעלי חיים בתנאי טמפרטורה ולחות מבוקרים, עם מחזור אור/חושך של 12 שעות כדי לחקות את השעון הביולוגי הטבעי. במהלך תקופת ההתאקלמות ניתנה לעכברים גישה חופשית למזון ולמים.

1. הכנת בעלי חיים

הערה: בחר 24 עכברים נקבות C57BL/6 בדרגת SPF בגילאי 6-8 שבועות עם מחזורי ייחום תקינים. אספו נוזל שטיפת נרתיק מהעכברים בשעה 9:00 בבוקר במשך 10 ימים רצופים כדי להכין מריחות של תאי נרתיק מקולפים. התבונן במחזורי הייחום ובחר את העכברים שיש להם לפחות מחזור רציף ושלם אחד.

  1. אפשרו לעכברים להתאקלם בסביבה במשך שבוע לפני הניסויים. סמן עכברים באמצעות אגרוף אוזניים לאחר תקופת ההסתגלות. יש לרשום את מדידות משקל הגוף מיד לאחר הסימון.
  2. אחזו היטב בעכברים עד שמתרחשת השתנה טבעית הנגרמת על ידי מתח. משתק על ידי צביטה של עור הצוואר הגבי בין האגודל לאצבע המורה של יד שמאל. מקם את ראש העכבר כלפי מטה כדי לחשוף את אזור הבטן במלואו.
  3. טען קצה פיפטה סטרילי על מיקרו-פיפטה. שאפו 10 מיקרוליטר של תמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית. בצע שלושה מחזורי שטיפה רצופים דרך תעלת הנרתיק. יש לשמור על נוזל השטיפה בתוך קצה הפיפטה.
  4. פזרו באופן שווה את נוזל השטיפה על פני שקופית מיקרוסקופ הזכוכית. מגלשות יבשות לחלוטין בטמפרטורת החדר. תקן תאים על ידי טבילתם באתנול 95% לשימור. תייג שקופיות באופן מקיף עם פרמטרים ניסיוניים, ושמור על אחסון מוגן בקופסאות שקופיות אטומות לאור ב-4 מעלות צלזיוס כאשר אינן מעובדות.
  5. פרוטוקול הצביעה של רייט
    1. טבלו שקופיות באתנול 95% (למשך 3-10 דקות). שוטפים היטב מתחת לזרם המים המזוקקים.
    2. העברה מגלשה דרך אמבט אתנול 95% (משך דקה אחת).
    3. מגרדים סרט מחומצן ממשטח תמיסת ההמטוקסילין באמצעות נייר סינון נקי. טבלו את השקופיות בהמטוקסילין מסונן (למשך 5 דקות).
    4. שוטפים את השקופיות במים מזוקקים. טבלו לזמן קצר (<1 שניות) בתמיסת HCl 1%. השלימו עם שטיפת מים מזוקקים מורחבת.
    5. הכן כתם מעורב באמצעות תמיסות Orange G ו- EA50. כתם מחליק בתערובת (למשך 3 דקות).
    6. העבירו את המגלשות דרך שלוש אמבטיות אתנול 95% ברצף (מרווחים של 5 שניות).
    7. טפל בקסילן בשני שלבים (2 דקות כל אחד).
      הערה: פעל בתוך מכסה אדים כדי למנוע שאיפת אדי קסילן. סגור את המכולות מיד לאחר השימוש.
    8. שימור לצמיתות של דגימות באמצעות מדיום הרכבה של שרף ניטרלי
  6. בעת קריאת השקופית מתחת למיקרוסקופ, זהה את התאים עם ציטופלזמה ורודה בהירה וגרעינים סגולים כהים כתאי אפיתל גרעינים, תאים ורודים חיוורים קשקשים לא סדירים כתאי אפיתל קרטיניים, ותאים כחולים עגולים קטנים כתאי דם לבנים.
    הערה: קבע את שלב מחזור הייחום על סמך המאפיינים הציטולוגיים הבאים: (1) שלב פרואסטרוס: תאי אפיתל גרעיניים דומיננטיים. מופיעים גם כתאים בודדים וגם כגיליונות מקובצים באשכולות. נוכחות לויקוציטים דלילה (<5% שדה ראייה); (2) שלב אסטרוס: שפע של תאי אפיתל קרטיניים ללא גרעין. מאפיינים: מורפולוגיה שטוחה גדולה עם גבולות לא רגולריים. כמעט היעדר לויקוציטים ותאים גרעיניים (<2% משולבים); (3) שלב מטסטרוס: הפחתת אוכלוסיית התאים הקרטינים. חדירת לויקוציטים מתעוררת. תאי אפיתל גרעיניים המופיעים מחדש (הרכב 20%-40%); (4) שלב דיסטרוס: לויקוציטים דומיננטיים ותאים גרעיניים (>80%). היעדר וירטואלי של תאים קרטיניים (<1%)5. עיין באטלס הציטולוגי הסטנדרטי באיור 1 לאימות דפוסים.
  7. ארגן ונתח את הנתונים, ובחר 24 עכברים עם מחזורי ייחום רגילים.

2. הכנת הזרקת ציקלופוספאמיד

הערה: ציקלופוספאמיד אינו יציב לאור ויש לטפל בו בחושך לאורך כל התהליך. ציקלופוספאמיד רעיל, ולכן יש ללבוש ביגוד מגן, כפפות ניטריל דו-שכבתיות ומסכות במהלך הפעולה.

  1. הוסף 200 מ"ג של אבקת ציקלופוספאמיד סטרילית באיכות פרמצבטית ל-10 מ"ל של מי מלח סטריליים. מערבבים היטב לקבלת תמיסת ציקלופוספאמיד של 20 מ"ג/מ"ל. שמור מנה אחת לשימוש מיידי; הכן ריכוזים נוספים עם השאר.
  2. מעבירים 200 מיקרוליטר של מלאי 20 מ"ג/מ"ל לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל עטוף בנייר אלומיניום. הוסף 800 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים כדי להגיע לנפח כולל של 1 מ"ל. מערבולת מערבלת למשך 30 שניות לקבלת תמיסה של 4 מ"ג/מ"ל. הכן 14 מנות זהות (1 מ"ל כל אחת). אחסן את כל המינונים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס במדף אנכי.

3. הזרקת תמיסת ציקלופוספאמיד

הערה: חלק באופן אקראי 24 עכברים לשלוש קבוצות באמצעות מערכת ממוחשבת: (1) ריק: ללא טיפול (n = 8); (2) NS: בקרות מי מלח (n = 8); (3) נקודת עניין: קבוצת ציקלופוספאמיד (n = 8). יש להזריק לעכברים כל בוקר בשעה 9:00. עבור קבוצת POI, יש להזריק תוך צפקית 100 מ"ג/ק"ג של תמיסת ציקלופוספאמיד ביום הראשון, ולאחר מכן להזריק ברציפות 20 מ"ג/ק"ג של תמיסת ציקלופוספאמיד במשך 14 הימים הבאים. הזריק תוך צפקית נפח שווה של מי מלח רגילים לקבוצת NS, והשאיר את קבוצת BALNK ללא טיפול. שקלו את כל העכברים לפני כל זריקה, כל יום, ואספו תאים פילינג נרתיקיים למריחה לאחר ההזרקה.

  1. מניחים כדור צמר גפן ספוג איזופלורן עם מלקחיים לכלי הניתן לאיטום. מקם את העכבר בתוך המיכל להרדמה בשאיפה של 10 שניות.
    הערה: איזופלורן הוא חומר הרדמה נדיף עם רעילות וגירוי מסוימים. הפעולות צריכות להתבצע בסביבה מאווררת היטב בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד.
  2. חישוב נפח ההזרקה: משקל גוף (גרם) × 5 = μL. חיטוי הרביע התחתון הימני עם ספוגית אתנול של 75%. הכנס מחט של 26 גרם בזווית של 30-45 מעלות (כיוון שיפוע כלפי מעלה). יש להתקדם 5 מ"מ דרך דופן הבטן עד לתחושת "פופ". ספק פתרון בקצב של 50 μL/s.
  3. הנח שאריות נוזלים וציוד מזוהם למיכלי פסולת חסיני אור שכותרתם "פסולת רגישה לאור". השליכו כדורי צמר גפן ספוגים באיזופלורן במיכלים אטומים ייעודיים המודבקים בתוויות שקופות של פסולת מסוכנת.
  4. יש להפשיר כמויות קפואות של 4 מ"ג/מ"ל באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (3 דקות). חישוב מחדש של המינון היומי: משקל גוף (גרם) × 5 = מיקרוליטר. יש לוודא את ניקיון התמיסה לפני טעינת המזרק.

4. איסוף סרום

הערה: לאחר 15 יום של הזרקת תמיסת ציקלופוספאמיד, אסוף דם מקודקוד הלב של כל העכברים. צנטריפוגה להשגת הסרום. יש לדגום עכברים בקבוצת הביקורת ובקבוצת ה-NS בשלב הדיסטרוס. עכברי קבוצת POI עברו דגימה מותאמת זמן בשילוב עם עכברי קבוצת ביקורת/NS, שאושרו כנמצאים בדיסטרוס.

  1. הרדמת העכבר
    1. הנח את העכבר בתא שקוף ואטום המכיל כדור צמר גפן רווי איזופלורן.
    2. שימו לב להתנהגות העכבר. אובדן רפלקס יישור (אי תיקון יציבה עצמי כאשר הוא שוכב בעדינות) מעיד על השראת הרדמה מספקת. תהליך זה דורש בדרך כלל 2-3 דקות.
    3. הסר את העכבר מהמיכל. קבע את ראשו ביד שמאל, ולחץ בעדינות על העפעף העליון עם האצבע המורה. החזיקו צמר גפן סטרילי ביד ימין, טבלו אותו במשחת עיניים אריתרומיצין כדי לאסוף כמות בקוטר 1-2 מ"מ.
      1. יש למרוח את המשחה באופן שווה על פני גלגל העין והעפעף הפנימי. סגור את העפעף ולאחר מכן עסה בעדינות עם קצה האצבע למשך 10 שניות כדי לפזר את המשחה בצורה אחידה. נגב עודפי משחה סביב העין באמצעות צמר גפן יבש.
  2. מקם את העכבר במצב שכיבה על לוח קצף. חתוך את שיער החזה בעזרת מספריים כירורגיים. יש לחטא את אזורי בית החזה והבטן עם 75% אתנול.
    1. חותכים את העור והרקמה התת עורית לאורך קו האמצע. חותכים את השרירים הבין-צלעיים לאורך הצד השמאלי של עצם החזה. חשוף את הלב.
  3. הכנס מזרק (כששיפוע המחט פונה כלפי מעלה) לקודקוד הלב בזווית של כ-30°. מקדמים את המחט לאט ובעדינות. הזריק את הדם שהתקבל לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  4. הכניסו את הדם שהושג לצנטריפוגה. הגדר את הצנטריפוגה על 850 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השתמש בפיפטה כדי להוציא את הסרום בשכבה העליונה ולהניח אותו בצינור צנטריפוגה של 0.5 מ"ל. אחסן אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

5. איתור אסטרוגן בסרום, FSH ו-AMH

  1. הכניסו את הסרום הקפוא למקרר בטמפרטורה של 4 מעלות למשך הלילה כדי להפשיר אותו לאט.
  2. הוצא את ערכת ELISA מהמקרר 30 דקות מראש כדי לאפשר לריאגנטים בה לחזור לטמפרטורת החדר.
  3. על פי הוראות הערכה, בצע דילולים סדרתיים של התקן באמצעות המדלל הסטנדרטי. בדרך כלל, הגדר שיפועי ריכוז מרובים, כגון 0, 10, 20, 40, 80, 160 pg/mL וכו'.
  4. הוסף את התקן המדולל ואת דגימות הסרום לבדיקה לבארות המתאימות של צלחת ELISA, 100 מיקרוליטר לבאר. במקביל, הגדר בארות בקרה ריקות והוסף 100 מיקרוליטר של מדלל הדגימה.
  5. הכניסו את צלחת ה-ELISA לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות כדי לאפשר לאנטיגן ולנוגדן להיקשר במלואם.
  6. לאחר סיום הדגירה, שאפו בזהירות את הנוזל בבארות. שטפו את צלחת ELISA עם תמיסת הכביסה 3-5 פעמים. לאחר כל כביסה, יש לייבש בעדינות את צלחת ה-ELISA כדי להסיר את שאריות תמיסת הכביסה.
  7. הוסף את תמיסת הנוגדן המסומנת באנזים, 100 מיקרוליטר לבאר. המשיכו לדגור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  8. חזור על שלבי הכביסה שלמעלה, שטוף 3-5 פעמים וייבש את צלחת ה-ELISA.
  9. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת מצע לכל באר. יש לערבב בעדינות על ידי ניעור. דוגרים בחושך בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות עד שמתפתח צבע כחול בהיר.
  10. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת סיום לכל באר כדי לעצור את התגובה. שימו לב לשינוי הצבע מכחול לצהוב.
  11. השתמש בקורא מיקרו-פלטות כדי לקרוא את ערכי הספיגה (ערכי A) של כל באר באורך גל של 450 ננומטר ולתעד את הנתונים.
  12. קח את ריכוז התקן כ-abscissa ואת ערך הספיגה המתאים כאורדינטה כדי לצייר עקומה סטנדרטית. בדרך כלל, השתמש בהתאמה פולינומית כדי להבטיח שמקדם המתאם r² של העקומה הסטנדרטית גדול מ-0.99.
    1. על פי העקומה הסטנדרטית, החלף את ערך הספיגה של דגימת הסרום שתיבדק במשוואת העקומה הסטנדרטית כדי לחשב את ריכוז ההורמונים בדגימה.

6. אוסף רקמת שחלה

  1. המתת חסד של העכבר שעדיין מורדם על ידי פריקת צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד), ולאחר מכן השתמש במספריים כירורגיים כדי לפתוח את בטן העכבר.
  2. השחלות ממוקמות מתחת לכליות ועטופות ברפידות שומן לבנות. הרם בעדינות את רפידות השומן בעזרת מלקחיים כדי לחשוף את השחלות והחצוצרות. השתמש במספריים כדי להפריד את השחלות מרקמות החיבור שמסביב.
  3. הנח את רקמות השחלה שהוסרו לתוך 4% פרפורמלדהיד לקיבוע למשך 24 שעות.

7. הכנת קטעי פרפין

  1. התייבשות: הוציאו את השחלות והעבירו אותן דרך תמיסות אתנול בריכוזים שונים (75%, 85%, 95%, 100%) ברצף, כאשר כל שלב נמשך שעה.
  2. טיפול בשקיפות: ראשית, יש לטפל בשחלות בתערובת של קסילן ואתנול למשך 15 דקות. לאחר מכן, טבלו אותם בקסילן I וקסילן II למשך 15 דקות כל אחד.
  3. הספגת שעווה: טבלו את השחלות בתערובת של קסילן ופרפין. לאחר מכן, העבירו אותם לפרפין I, פרפין II ופרפין III למשך 0.5 שעות כל אחד.
  4. הטבעה: מניחים את השחלות הספוגות בשעווה בתבנית הטבעה. התאם את כיוון הרקמות (כשהמשטח החתוך פונה כלפי מטה). יוצקים פרפין מומס לתבנית ונותנים לו להתקרר ולהתמצק.
  5. חתך: חותכים את גוש הפרפין לחלקים בעובי 5 מיקרומטר בעזרת מיקרוטום. בצע חיתוך סדרתי והעביר בעדינות את הסרט בעזרת מברשת, וודא שהוא יוצר רצועה אחידה ושקופה השוכבת שטוחה ללא עיוות כאשר היא צפה על אמבט מים

8. צביעת H&E

  1. הסרת שעווה: טבלו את החלקים המוטבעים בפרפין בקסילן I למשך 10 דקות. לאחר מכן מעבירים את החלקים לקסילן II ומשרים עוד 10 דקות.
  2. התייבשות: העבירו את החלקים דרך סדרה של תמיסות אתנול בריכוזים שונים ברצף: 100% אתנול, 95% אתנול, 85% אתנול ו-75% אתנול, עם זמן טבילה של 5 דקות לכל אחד. לבסוף, יש לשטוף את החלקים במים מזוקקים למשך דקה.
  3. צביעת המטוקסילין: טבלו את החלקים בתמיסת צביעה המטוקסילין למשך 5 דקות. שוטפים את החלקים תחת מים זורמים למשך 30 שניות.
  4. בידול: טבלו את החלקים בתמיסת חומצה הידרוכלורית 1% אתנול למשך 1-3 שניות. שוטפים את החלקים תחת מים זורמים למשך 1-2 דקות.
  5. צביעה ציטופלזמית: טבלו בתמיסת אאוזין Y (דקה אחת). כתם כתם עודף בנייר פילטר.
  6. התייבשות: העבירו את החלקים דרך סדרה של תמיסות אתנול: 85% אתנול, 95% אתנול ו-100% אתנול (פעמיים), עם זמן טבילה של 5 שניות לכל אחד.
  7. ניקוי: טבלו את החלקים בקסילן I למשך 5 דקות. לאחר מכן מעבירים את החלקים לקסילן II ומשרים עוד 5 דקות.
  8. הרכבה: זרוק שרף ניטרלי על החלק המוכתם. הנח בזהירות כיסוי מעל הקטע.
  9. ספירת זקיקים: התבונן בחלקים המוכתמים במיקרוסקופ. ספרו ורשמו את מספר הזקיקים בשלבי התפתחות שונים.

9. אימונוהיסטוכימיה של Caspase-3 ברקמת השחלה

  1. אחזור אנטיגן: הנח את החלקים נטולי השעווה וההתייבשות לתוך מאגר נתרן ציטראט (pH 6.0). מחממים את החלקים במיקרוגל בעוצמה גבוהה למשך 5 דקות. ואז מוציאים אותם ונותנים להם להתקרר.
    1. חזור על תהליך החימום פעמיים נוספות, בסך הכל 3 מחזורי חימום. לאחר קירור טבעי יש לשטוף את החלקים עם PBS 3 פעמים, בכל פעם למשך 5 דקות.
  2. סילוק פרוקסידאז אנדוגני: יש להוסיף 3% H₂O₂ טיפה על החלקים. דגרו את החלקים בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 דקות. שטפו את החלקים עם PBS 3 פעמים, בכל פעם למשך 3 דקות.
  3. חסימת סרום ודגירת נוגדנים: הוסף נוגדן ראשוני ארנב אנטי-קספאז-3 טיפה על החלקים. דגרו את החלקים בקופסה רטובה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, אפשר לחלקים לחזור לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שוטפים את החלקים עם PBS 3 פעמים, בכל פעם למשך 5 דקות.
  4. פיתוח צבע, צביעה נגדית והרכבה: השתמש ב-DAB לפיתוח צבע, שבדרך כלל לוקח בערך 1-5 דקות. מכתים את החלקים עם המטוקסילין למשך 2 דקות. לאחר צביעה נגדית, שטפו את החלקים למשך 5 דקות.
    1. לאחר מכן הניחו את החלקים במי אמוניה למשך דקה אחת כדי להפוך אותם לכחולים. לבסוף, בצע התייבשות באמצעות שיפוע של אתנול, נקה את החלקים והרכיב אותם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תהליך הקמת מודל עכבר ה-POI מתואר באיור 2. משקל הגוף ומחזור הייחום של העכברים תועדו החל מהיום הראשון של הזרקת הסם. לאחר 15 ימים של הזרקת CTX, שיעור הירידה הממוצע במשקל הגוף של העכברים בקבוצת ה-POI (3.717% ±-1.463%) היה גבוה משמעותית מזה של קבוצת BLANK (0.2526% ±-0.1469%) וקבוצת NS (0.4305% ±-0.2494%) (p <-0.0001). לא היה הבדל מובהק סטטיסטית במשקל הגוף בין קבוצת NS לקבוצת BLANK (עמ ' > 0.05). (איור 3A).

מחזור היי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אי ספיקת שחלות מוקדמת (POI) משפיעה קשות על בריאותן הגופנית ואיכות חייהן של נשים, ושכיחותה העולמית עולה משנה לשנה. עם זאת, נכון לעכשיו, עדיין חסרות שיטות טיפול בטוחות ויעילות ל-POI. ביסוס מודל בעלי חיים אמין וניתן לשחזור הוא חיוני לקידום המחקר על POI. מבחינה קלינית, הגורמים ל-POI מגוונים, ותרופות כימותרפיות הן גורמים פתוגניים ידועים חשובים8. כתרופה כימותרפית לחומר אלקילטי, CTX גורם בעיקר לרעילות שחלתית באמצעות עקה חמצונית ואפופטוזיס של תאי גרנולוזה, מה שמוביל לאטרז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

המחברים מודים בהכרת תודה על התמיכה הכספית שהתקבלה מהקרן הרפואית וו ג'יפינג באמצעות תוכנית המימון המיוחדת למחקר קליני שלה (מענק מס' 320.6750.17067). אנו גם אסירי תודה על פלטפורמת המחקר והתמיכה הטכנית שסיפקה Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4% פרפורמלדהידסנגון ביו-הנדסה ושות', בע"מA500684-0500
75% אלכוהולשאנדונג Dexinkang טכנולוגיה רפואית ושות', בע"מ200603
אתנול נטול מיםמפעל ריאגנטים כימיים של בנגבו
צינורות צנטריפוגהביושארפבס-15-מ
שולחן קרקוואנלין מדיקלQL-LT20230003
כדורי צמר גפןשאנדונג Brilliance ושות', בע"מ20241008
כיסוייםג'יאנגסו שיטאי ציוד ניסיוני ושות', בע"מ80312-3412
ציקלופוספאמידבקסטר אונקולוגיה בע"מ3K645א
מייבשהוביי שיאוגן Haikuo טכנולוגיה רפואית ושות', בע"מKH-TS
מכונת צביעההוביי שיאוגן Haikuo טכנולוגיה רפואית ושות', בע"מKH-S101 
תמיסת מכתים EA50הוביי Taikang ציוד רפואי ושות', בע"מJ7EC20
צבת תג אוזןShenzhen Ruiwode מדע וטכנולוגיה של החייםC22002-10
חתך יעיל של פרפיןTongxiang Hualing שעווה תעשיה ושות', בע"מ20241018
תנור ייבוש פיצוץ חשמלי (תנור)שנחאי Yuejin ציוד רפואי ושות', בע"מHCZF-11
חממת מים תרמוסטטיים מחוממת חשמליתשנחאי Yuejin ציוד רפואי ושות', בע"מHSW-600
מכונת הטבעהפריסטאר צ'אנגג'ואו מכשור רפואי ושות', בע"מPMB-A
כתם אאוזיןSewell ביוטכנולוגיה ושות', בע"מG1005-2
תמיסת התמיינות המטוקסיליןSewell ביוטכנולוגיה ושות', בע"מG1039-500 מ"ל
תמיסת מכתים המטוקסיליןSewell ביוטכנולוגיה ושות', בע"מG1005-1
איזופלורןשאנדונג אנטה גידול בעלי חיים טכנולוגיה ושות', בע"מ2024101501
מיקרוסקופאנהוי Jiashang ביוטכנולוגיה ושות', בע"מSQS-12P
ערכת ELISA של הורמון אנטי-מולרי לעכבר (AMH)הנגיואן ביוטכנולוגיהHB1334-מו
ערכת בדיקה חיסונית מקושרת לאנזים אסטרדיול (E2) של עכברהנגיואן ביוטכנולוגיהHB975-מו
ערכת ELISA של הורמון מגרה זקיקי עכבר (FSH)הנגיואן ביוטכנולוגיהHB967-מו
מסטיק ניטרליNanchang Yulu ציוד ניסיוני ושות', בע"מ240504
מכשיר הלבנת רקמות פתולוגיפריסטאר צ'אנגג'ואו מכשור רפואי ושות', בע"מפי-ג'
מאגר PBSביושארפBL302א
טיפים לפיפטהביושארפBS-10-T
פיפטותDalong ציוד רפואי ושות', בע"מYE213AT0257922
מייבש רקמות מהירהוביי שיאוגן Haikuo טכנולוגיה רפואית ושות', בע"מKH-TS
מבצעהגדיי"ד-315
שקופיותג'יאנגסו שיטאי ציוד ניסיוני ושות', בע"מ80312-3161
מכונת מריחההוביי Taikang ציוד רפואי ושות', בע"מ131001305
הזרקת נתרן כלוריווהאן בינהו שואנגה פרמצבטיקה ושות', בע"מברקוד 240525K04
מזרקג'יאנגסו Zhiyu מכשור רפואי ושות', בע"מ
פורס רוטטשנחאי Zhixin מכשיר ושות', בע"מZQP-86
קסילןטיאנג'ין Kaitong מגיב כימי ושות', בע"מ20240102

מקורות

  1. Federici, S., et al. Primary ovarian insufficiency: update on clinical and genetic findings. Front Endocrinol. 15, 1464803(2024).
  2. Soleimani, R., Heytens, E., Darzynkiewicz, Z., Oktay, K. Mechanisms of chemotherapy-induced human ovarian aging: Double-strand DNA breaks and microvascular compromise. Aging (Albany NY). 3 (8), 782-793 (2011).
  3. Bellusci, G., et al. Kinase-independent inhibition of cyclophosphamide-induced pathways protects the ovarian reserve and prolongs fertility. Cell Death Dis. 10 (10), 726(2019).
  4. Yuksel, A., et al. The magnitude of gonadotoxicity of chemotherapy drugs on ovarian follicles and granulosa cells varies depending upon the category of the drugs and the type of granulosa cells. Hum Reprod. 30 (12), 2926-2935 (2015).
  5. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertil Re Pract. 6, 5(2020).
  6. Wang, Z., Wang, Y., Yang, T., Li, J., Yang, X. Study of the reparative effects of menstrual-derived stem cells on premature ovarian failure in mice. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 11(2017).
  7. Shen, J., et al. Transplantation of the LRP1(high) subpopulation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells improves ovarian function in mice with premature ovarian failure and aged mice. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 64(2024).
  8. Letourneau, J. M., et al. Acute ovarian failure underestimates age-specific reproductive impairment for young women undergoing chemotherapy for cancer. Cancer. 118 (7), 1933-1939 (2012).
  9. Nynca, A., et al. Tamoxifen decreases ovarian toxicity without compromising cancer treatment in a rat model of mammary cancer. BMC Genomics. 24 (1), 325(2023).
  10. Feng, Y., et al. Protective effect of Luffa cylindrica fermentation liquid on cyclophosphamide-induced premature ovarian failure in female mice by attenuating oxidative stress, inflammation and apoptosis. J Ovarian Res. 17 (1), 24(2024).
  11. Huang, Y., et al. Bushen Huoxue recipe ameliorates ovarian function via promoting BMSCs proliferation and homing to ovaries in POI mice. Phytomedicine. 129, 155630(2024).
  12. Ai, G., et al. Adipose-derived stem cells promote the repair of chemotherapy-induced premature ovarian failure by inhibiting granulosa cells apoptosis and senescence. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 75(2023).
  13. Anderson, R. A., et al. Anti-Müllerian hormone as a marker of ovarian reserve and premature ovarian insufficiency in children and women with cancer: A systematic review. Hum Reprod Update. 28 (3), 417-434 (2022).
  14. Jiao, X., et al. Ovarian reserve markers in premature ovarian insufficiency: within different clinical stages and different etiologies. Front Endocrinol. 12, 601752(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

POI
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.