מאמר שיטה

הדמיה של שומר הסף: ההערכה מבוססת הצבע הכחול של אוון על חדירות מחסום דם-מוח בדג זברה בוגר

DOI:

10.3791/69010

⸱

30 בספטמבר 2025

 ,  ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, Kulliyyah of Medicine, International Islamic University Malaysia (IIUM), 2Department of Biotechnology, Kulliyyah of Science, International Islamic University Malaysia (IIUM), 3Department of Physiology, Faculty of Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia, 4Clinical Pharmacology Department, Menoufia Medical School, Menoufia University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטה אמינה להערכת תקינות מחסום הדם-מוח (BBB) במודל דג זברה בוגר (Danio rerio) באמצעות הערכה מבוססת צבע כחול של אוון, המאפשרת ניתוח איכותי וכמותי של הפרעה נוירו-וסקולרית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא ממשק חדיר למחצה השומר על הומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית (CNS) על ידי ויסות תנועת החומרים לתוך המוח והחוצה ממנו, ובכך מגן על רקמת העצב מפני גורמים שעלולים להזיק. הפרעה ב-BBB היא תכונה מבוססת היטב במחלות נוירודגנרטיביות רבות, כולל מחלת פרקינסון (PD) ומחלת אלצהיימר (AD), שבהן חדירות מוגברת תורמת להתקדמות המחלה ומחמירה. למרות שדג הזברה הבוגר (Danio rerio) מוכר יותר ויותר כמודל רב ערך לחקר מחלות ניווניות, שיטות סטנדרטיות להערכת שלמות BBB במין זה נותרו מוגבלות. פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה, ניתנת לשחזור וחסכונית להערכת חדירות BBB בדגי זברה בוגרים על ידי ניתוח הוצאת הצבע הכחול של אוון (EB) מהנוירו-וסקולטורה לרקמת המוח. השיטה משלבת הדמיה איכותית עם ניתוח תמונה כמותי של התפלגות EB כדי לזהות הפרעה ב-BBB. השלבים העיקריים כוללים הזרקה תוך-צפקית נכונה של צבע EB, אישור זרימת צבע מערכתית, דיסקציה זהירה של המוח והדמיה עקבית ומדידת עוצמת גווני אפור. בקרות חיוביות ושליליות משולבות כדי לאמת את חדירת הצבע ולתמוך בפרשנות מדויקת. תוצאות מייצגות מדגימות אקסטרווזן EB גדול יותר במוחות של דגי זברה פרקינסוניים בהשוואה לבקרות שהוזרקו במי מלח, מה שמעיד על חדירות BBB מוגברת. טכניקה זו דורשת ציוד מיוחד מינימלי ומתאימה למעבדות עם משאבים מוגבלים. בסך הכל, פרוטוקול זה מציע כלי מעשי לחקירת שלמות BBB במודלים של דגי זברה בוגרים וניתן להתאים אותו ליישומים מגוונים, כולל מחקרים על מנגנוני מחלה והערכת התערבויות טיפוליות המכוונות לתפקוד נוירו-וסקולרי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא ממשק פיזיולוגי סלקטיבי וחדיר למחצה שנוצר בעיקר על ידי תאי אנדותל מוחיים מיוחדים, הנתמכים על ידי פריציטים ואסטרוציטים, המווסת את ההחלפה המולקולרית בין זרם הדם למרחב הבין-תאי של המוח כדי לשמר את המיקרו-סביבה של מערכת העצבים המרכזית (CNS). שלמותו חיונית לשימור הומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית ולהגנה על רקמות עצביות מפני חומרים מזיקים או רעילים1. הפרעה ב-BBB היא מאפיין פתולוגי מוכר היטב במחלות ניווניות שונות, כולל מחלת פרקינסון (PD), מחלת אלצהיימר וטרשת אמיוטרופית צידית 2,3. פגיעה בתפקוד ה-BBB מובילה לחדירות מוגברת, ומאפשרת לתרכובות נוירוטוקסיות ולמתווכים דלקתיים לחדור לרקמת המוח, ובכך להחמיר את התקדמות המחלה4. לכן, הערכת שלמות ה-BBB היא קריטית להשגת תובנות מעמיקות יותר לגבי המנגנונים הנוירו-וסקולריים והדלקתיים העומדים בבסיס הפרעות אלו.

בעוד שמודלים של מכרסמים in vivo ו-in vitro נותרו תקני הזהב למחקר BBB5, דג הזברה (Danio rerio) התגלה כמודל בעל ערך לחולייתנים במדעי המוח בשל יכולת המעקב הגנטית שלהם, עלות-תועלת, קלות הטיפול והמאפיינים הנוירו-אנטומיים וה-BBB המשומרים עם יונקים6. למרות השימוש הגובר בהם במחקרים ניווניים, שיטות להערכת שלמות BBB בדגי זברה בוגרים עדיין מוגבלות 7,8. טכניקות כגון הזרקות עוקב פלואורסצנטיות או מדווחים טרנסגניים היו בשימוש נרחב בזחלים 9,10, אך מהוות אתגרים משמעותיים אצל מבוגרים עקב פיגמנטציה וירידה בשקיפות. לפיכך, מטרת המחקר הנוכחי היא לבסס פרוטוקול פשוט, ניתן לשחזור וניתן להדגמה ויזואלית להערכת חדירות BBB בדגי זברה בוגרים באמצעות אקסטרוואזציה של צבע כחול אוון (EB). שיטה זו משלבת הן תצפית איכותית והן מדידה כמותית של דליפת צבע לרקמת המוח, ומספקת כלי מעשי להערכת שלמות נוירו-וסקולרית בתנאים פתולוגיים.

הצבע הכחול של אוון, שנקשר לאלבומין בסרום ובדרך כלל אינו יכול לחצות את ה-BBB11 השלם, מציע אלטרנטיבה מעשית להערכת שיבוש מחסום12. אקסטרוואזציה של EB יושמה באופן נרחב במודלים של מכרסמים לאיתור דליפת BBB במצבים כגון פגיעה מוחית טראומטית, שבץ מוחי ודלקת עצבית13. עם זאת, היישום שלו בדג זברה בוגר נותר ברובו לא נחקר. מחקר זה מציג התאמה חדשה של טכניקת צבע EB המותאמת לדגי זברה בוגרים, המאפשרת הערכה איכותית וכמותית אמינה של חדירות BBB. השיטה חסכונית, דורשת ציוד מיוחד מינימלי, וניתן להתאים אותה בקלות למספר בעלי חיים, ומציעה יתרון מעשי על פני גישות מבוססות הדמיה מורכבות יותר המשמשות בדרך כלל בזחלים.

באמצעות פרוטוקול זה, הערכנו את תקינות ה-BBB בדג זברה בוגר בריא ופרקינסון כאחד. כדי לגרום לפרקינסוניזם בדגי הזברה, הנוירוטוקסין 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרה-הידרופירידין (MPTP) ניתן תוך צפק, בהתאם לשיטה שתוארה קודם לכן14. התוצאות חשפו אקסטרווזיציה גדולה משמעותית של EB במוחם של דגי זברה פרקינסוניים, בהתאם להפרעה המתועדת היטב ב-BBB שנצפתה במחלת פרקינסון. ממצאים אלה מאמתים את הרגישות והאמינות של השיטה, ותומכים בתועלת שלה בקישור בין פתולוגיה של כלי הדם לתוצאות מולקולריות והתנהגותיות. טכניקה זו מייצגת אפוא כלי רב ערך עבור חוקרים החוקרים תרומות נוירו-וסקולריות למחלות ניווניות ועשויה להיות מיושמת הן במודלים גנטיים והן במודלים של דג זברה המושרים על ידי רעלנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה בוצע והותר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) תחת האוניברסיטה האסלאמית הבינלאומית של מלזיה (IIUM), בהתייחס לאישור האתיקה של בעלי חיים (מס' סימוכין: IIUM/504/14/2/IACUC).

1. הכן את תמיסת מלאי הצבע הכחול של אוונס

  1. ממיסים 0.1 גרם של צבע EB ב-10 מ"ל של 1x מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) להכנת תמיסת מלאי של 1% (w/v). מערבבים היטב עד להמסה מלאה של הצבע.
    זהירות: EB מסווג כמסרטן בקטגוריה 1B. יש להימנע ממגע ישיר עם העור והעיניים. השתמש בבגדי מגן, כפפות, משקפי בטיחות ומכונת הנשמה לאבק. הימנע משאיפת אבק ופעל לפי הוראות הטיפול של היצרן. אין להשליך צבע כחול של אוונס (מוצק או תמיסה) לכיור. שמור את הפסולת במיכלים מקוריים מסומנים. השלך בהתאם לתקנות הפסולת המסוכנת הלאומיות והמקומיות.
  2. סנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר. אוספים את המסנן לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל. עוטפים את הצינור בנייר אלומיניום ושומרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן להשתמש גם במסנן בגודל נקבוביות קטן יותר (למשל, 0.2 מיקרומטר). ניתן לאחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים, או בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד חודש, כאשר מומלץ למזער מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים כאשר הם מאוחסנים קפואים.

2. לתת צבע כחול של אוונס לדג זברה בוגר

  1. הרדמו את דג הזברה באמצעות הלם היפותרמי על ידי הורדה הדרגתית של טמפרטורת המים מ-12 מעלות צלזיוס ל-7 מעלות צלזיוס, עד שהדג כבר לא מגיב לגירויים מישוש.
    הערה: ניתן להשיג הפחתת טמפרטורה הדרגתית על ידי הוספת כמויות קטנות של קרח כתוש למים לאט במשך מספר דקות, מה שמאפשר לטמפרטורה לרדת בהדרגה. טבילת טריקאין היא גם שיטת הרדמה אלטרנטיבית מתאימה.
  2. הזריק 20 מיקרוליטר של צבע EB 1% לתוך החלל התוך-צפקי (IP) באמצעות מזרק אינסולין 31 גרם. הפעל לחץ עדין על מקום ההזרקה למשך 10 שניות כדי למנוע זרימה חוזרת.
    הערה: החלל התוך-צפקי של דג הזברה ממוקם מאחורי חגורת האגן. כדי להגדיל את אחוזי ההצלחה של מתן EB, צמו את הדגים במשך 24 שעות לפני ההזרקה. זה ירוקן את חלל הבטן כדי לספק גישה ודיוק טובים יותר לחלל התוך צפק.
  3. העבירו את הדג למיכל התאוששות ואפשרו התאוששות למשך 30 דקות. עקוב אחר פציעות, תמותה או שינויים התנהגותיים.
    הערה: כדי לעזור לדגי הזברה להתאושש, השתמש בטמפרטורת מים מופחתת מעט (20-24 מעלות צלזיוס) עבור מיכל ההתאוששות כדי לספק אפקט הרדמה קל ולעזור להקהות אי נוחות פוטנציאלית לאחר ההזרקה. דגים מוזרקים יציגו גוון כחול, מה שמצביע על זרימת צבע מוצלחת (איור 1).
  4. לאחר 30 דקות, המתת חסד של הדג באמצעות הלם היפותרמי בטמפרטורה של 1 מעלות צלזיוס עד 3 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ערפו את ראשו של הדג באמצעות להב סטרילי או מספריים כירורגיים.
    הערה: כדי לסייע בנתיחת המוח מאוחר יותר, השאירו בשר נוסף מאחורי הראש בעת עריפת הראש.
  5. שטפו את הראש פעמיים ב-1x PBS (יחס של 1:20 דגים ל-PBS) כדי להסיר עודפי דם וצבע EB.
    הערה: כביסה לא מספקת עלולה להוביל לתוצאות חיוביות כוזבות ולפגוע בדיוק הניתוח. כדי למנוע זאת, שטפו היטב את רקמת המוח לפחות פעמיים עם PBS 1x, וודא שכל הדם הנראה לעין והצבע הזורם חופשי יוסרו. אם נשאר שאריות צבע, מומלץ מאוד לשטוף שלישית.
  6. קבע את הראש ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (יחס של 1:20 דג לקיבוע). תסיסה אינה נדרשת במהלך הקיבוע, שכן גודלו הקטן של ראש דג הזברה ונפח קיבוע מספיק מאפשרים חדירה יעילה בתנאים סטטיים.
    אזהרה: PFA מזיק במקרה של בליעה, שאיפה או מגע עם העור. הכן את תמיסת ה-PFA מתחת למכסה אדים. השתמש בציוד מגן אישי מתאים והימנע משאיפת אבק. פעל לפי כל הנחיות הבטיחות לפי היצרן. התייחס ל-PFA כפסולת מסוכנת. הימנע מהשלכתו לטמיון. אסוף ותייג את הפסולת במיכלים אטומים והשליך אותה בהתאם לתקנות המקומיות והארציות.
  7. נתח את מוח דג הזברה
    1. הניחו את הראש הקבוע בצלחת פטרי נקייה ונתחו את המוח כפי שתואר קודם לכן15, באמצעות פינצטה מחודדת. הוסף ברציפות 1x PBS טיפה במהלך החיתוך כדי לשמור על לחות הרקמה ולמנוע התייבשות.
    2. הכן את צלחת האגרוז על ידי המסת 1 גרם אגרוז ב 100 מ"ל מים מזוקקים. מיקרוגל אותו עד להמסה מלאה, יוצקים אותו לצלחת פטרי ומניחים לו להתמצק.
    3. שטפו את המוח המנותח פעמיים בשתי אמבטיות PBS נפרדות. לאחר מכן, הניחו את הטישו על צלחת אגרוז של 1% כדי לשמור על לחות ולמנוע הצטמקות.
      הערה: כביסה לא מספקת עלולה להוביל לתוצאות חיוביות כוזבות ולפגוע בדיוק הניתוח. כדי למנוע זאת, שטפו היטב את רקמת המוח לפחות פעמיים עם 1× PBS, וודא שכל הדם הנראה לעין והצבע הזורם חופשי יוסרו. אם נשאר שאריות צבע, מומלץ מאוד לשטוף שלישית.

figure-protocol-1
איור 1: השוואה של צבע העור בין דג זברה רגיל לדג זברה מוזרק EB. (A) דג זברה רגיל שמציג גוון עור חום טיפוסי. (B) דג זברה מוזרק EB שמציג גוון כחלחל בולט, מה שמעיד על זרימה מערכתית מוצלחת של הצבע. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. ביסוס שליטה חיובית באמצעות פציעת פצע דקירה (SWI)

הערה: פציעת פצע דקירה שוברת את ה-BBB ומאפשרת אקסטרוואזציה של EB במקום הפציעה.

  1. להרדים את הדגים בשיטת הלם היפותרמי (ראה שלב 2.1). לאחר ההרדמה, הזריקו 20 מיקרוליטר של צבע EB 1% ואפשרו לדגים להתאושש במשך 30 דקות כמתואר בשלבים 2.2 ו-2.3.
  2. לאחר תקופת החלמה של 30 דקות, הכינו מחט סטרילית 31 גרם המחוברת למזרק אינסולין ובצעו הליך פציעה בפצע דקירה כדלקמן:
    1. הרדמו את הדג שוב.
    2. מקם את הדג זקוף על משטח שטוח וקר (למשל, חבילת ג'ל קרח). הכנס את המחט לצד אחד של הטלנצפלון בזווית של 90 מעלות לעומק שלא יעלה על 1.5 מ"מ (איור 2).
      הערה: כדי למנוע מגע ישיר של העור עם חבילת ג'ל הקרח ולמנוע נזק פוטנציאלי לעור, הניחו שכבה של גזה או מגבת נייר בין הדג למשטח הקר (איור 2). לחלופין, ניתן למקם את הדג בצלחת פטרי רדודה המונחת על גבי החבילה הקרה כדי לשמור על קירור ללא מגע ישיר. סמן 1.5 מ"מ על המחט כדי למנוע חדירת יתר.
    3. מעבירים את הדג למיכל התאוששות ומניחים להתאושש למשך 30 דקות.
    4. המתת חסד, עריפת ראש, תיקון וניתוח המוח כמתואר בשלבים 2.4 עד 2.7.
    5. לבקרה שלילית, חזור על שלבים 2.1 עד 2.7 באמצעות 20 מיקרוליטר של 1x PBS במקום צבע EB.

figure-protocol-2
איור 2: פצע דקירה לשליטה חיובית. (A) הכניסו לזמן קצר מחט 31G לתוך הטלנצפלון (עיגול אדום) כדי להקל על חדירת צבע EB לרקמת המוח; השוואה זו לצד זו של מוח לא פגוע ומוח שנדקר, (B) מבט גבי של אתר הדקירה (עיגול אדום), (C) מבט רוחבי של אתר הדקירה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. ניתוח איכותני של אקסטרוואזציה של הברונזה הקדומה

  1. התבוננו ברקמות מוח מנותחות תחת סטריאומיקרוסקופ. בצע אופטימיזציה של הגדרות התמונה (זום, איזון לבן, חשיפה, ניגודיות וכו') כדי להבטיח עקביות.
  2. צלם תמונות באמצעות מצלמה המותקנת במיקרוסקופ ושמור ב- . תבנית TIFF.
    הערה: השתמש בהגדרות הדמיה זהות עבור כל הדגימות כדי להבטיח תוקף השוואתי.

5. ניתוח כמותי של אקסטרוואזציה של הברונזה הקדומה

  1. הורד והתקן את פיג'י (קישור להורדת התוכנה זמין בטבלת החומרים). פתח את התמונה בפיג'י.
  2. בצע דה-קונבולוציה של צבעים על-ידי לחיצה: תמונה > צבע > דה-קונבולוציה של צבע >-RGB, והתוצאה היא שלוש תמונות נפרדות המייצגות גוונים אדומים, ירוקים וכחולים.
    הערה: שלב זה מבודד את הגוון הכחול משאר מרכיבי הצבע, ומבטיח שרק עוצמת הצבע הכחול נמדדת.
  3. הפעל את תמונת הערוץ הכחול (בדרך כלל מסומנת "Color_3") על ידי לחיצה על התמונה. המר אותו לגווני אפור של 8 סיביות על-ידי לחיצה: Image > Type > 8 סיביות.
    הערה: המרה בגווני אפור ממזערת את חפצי הצבע ומשפרת ניתוח מבוסס עוצמה.
  4. מדוד את עוצמת האפור של תמונת 8 הסיביות.
    1. קביעת מדידות על-ידי בחירה: Analyze > Set Measurements; בחירת Area ו-Mean Grey Value.
    2. בעזרת הכלי בחירת מלבן, ציירו אזור עניין (ROI) בגודל אחיד ומדדו את עוצמת האפור באמצעות בחירה באפשרות Analyze > Measure, או הקשה על Ctrl + M.
      הערה: יש להשתמש באותו גודל החזר ROI בכל הדגימות. הממדים המוחלטים של החזר ה-ROI עשויים להשתנות בהתאם להגדלה ולרזולוציה של התמונה שנרכשה, ולכן על החוקרים לתקן את גודל ההחזר על ההשקעה בתוך מערך הנתונים שלהם כדי להבטיח השוואה. לכל פיקסל בתמונה בגווני אפור של 8 סיביות יש ערך עוצמה שנע בין 0 ל- 255, כאשר 0 מייצג שחור טהור, 255 מייצג לבן טהור וערכים ביניהם מייצגים גוונים שונים של אפור.
    3. כדי להפחית את ההטיה, צייר שלושה עד חמישה החזר ROI בתוך אזורים עקביים מבחינה אנטומית במוח בכל הדגימות. הימנע מאזורים עם חפצים או צביעה לא עקבית.
      הערה: ניתן להשיג עקביות מיקום על ידי התייחסות לציוני דרך אנטומיים והבטחת מיקום החזר ההשקעה סימטרי בין קבוצות ניסוי.
    4. ממוצע את ערכי האפור הממוצעים מה-ROI עבור כל תמונה כדי לקבל ערך עוצמה יחיד לכל מוח. השתמש בממוצע זה להשוואה סטטיסטית בין קבוצות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה נבדק על מודל דג זברה פרקינסוני. פגיעה ב-BBB היא תופעה מתועדת היטב בחולי פרקינסון 16,17,18 ובמודלים שונים של בעלי חיים פרקינסוניים 19,20,21. כדי לחקור את שלמות ה-BBB במודל הפרקינסוני של דג הזברה הבוגר, הושוותה הזרקת צבע EB לרקמות המוח בין דג זברה שהוזרק במי מלח (ביקורת) לבין דג זברה פרקינסוני. מודל PD של דג הזברה הבוגר הוקם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת שלמות ה-BBB חיונית להבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות הקשורות למוח, שכן פגיעה ב-BBB עלולה לגרום להתקדמות המחלה ולהחמיראותה. למרות שדג הזברה הבוגר התגלה כמודל יעיל לחקר מחלות ניווניות, שיטות להערכת שלמות BBB במין זה נותרו לא מפותחות8. הפרוטוקול המוצג כאן מספק גישה פשוטה וחסכונית להערכת חדירות BBB בדגי זברה בוגרים על ידי ניתוח אקסטרוואזציה של צבע EB מהנוירו-וסקולטורה לרקמות המוח. שיטה זו דורשת מומחיות טכנית מינימלית ומסתמכת על חומרים זמינים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי משרד ההשכלה הגבוהה של מלזיה (MoHE) במסגרת תוכנית מענקי המחקר הבסיסי (FRGS), מספר מענק FRGS19-125-0734. סיוע הפרסום למחקר זה נתמך על ידי הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת קבנגסאן מלזיה (UKM).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אבקת אגרוזויונטיסPC0701
הצבע הכחול של אווןסיגמא-אולדריץ'E2129
פיג'י אימג'יהמכונים הלאומיים לבריאות, ארה"בקישור להורדה: https://imagej.net/software/fiji/downloads
מצלמת מיקרוסקופשנז'ן השנה אלקטרוניקה בע"מHY-500 מיליון
אבקת פרפורמלדהיד (PFA)סיגמא-אולדריץ'158127
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)סיגמא-אולדריץ'עמ' 4417
נתרן כלורי (NaCl)כימיקלים של HmbG7647-14-5
סטריאומיקרוסקופתאגיד אולימפוסSZ40
יחידת מסנן מזרק, 0.45 ומיקרו; mמרק מיליפור SLHV004SL

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17, 1-24 (2020).
  2. Knox, E. G., Aburto, M. R., Clarke, G., Cryan, J. F., O'Driscoll, C. M. The blood-brain barrier in aging and neurodegeneration. Mol Psychiatry. 27 (6), 2659-2673 (2022).
  3. Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurol. 14 (3), 133-150 (2018).
  4. Kim, S., Jung, U. J., Kim, S. R. The crucial role of the blood-brain barrier in neurodegenerative diseases: Mechanisms of disruption and therapeutic implications. J Clin Med. 14 (2), 386(2025).
  5. Guarino, V., et al. Advancements in modelling human blood-brain barrier on a chip. Biofabrication. 15 (2), 022003(2023).
  6. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends Pharmacol Sci. 35 (2), 63-75 (2014).
  7. Eliceiri, B. P., Gonzalez, A. M., Baird, A. The blood-brain and other neural barriers: reviews and protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2010).
  8. Li, Y., et al. Zebrafish: A promising in vivo model for assessing the delivery of natural products, fluorescence dyes and drugs across the blood-brain barrier. Pharmacol Res. 125, 246-257 (2017).
  9. Fleming, A., Diekmann, H., Goldsmith, P. Functional characterisation of the maturation of the blood-brain barrier in larval zebrafish. PLoS One. 8 (10), e77548(2013).
  10. Kislyuk, S., van den Bosch, W., Adams, E., De Witte, P., Cabooter, D. Development of a sensitive and quantitative capillary LC-UV method to study the uptake of pharmaceuticals in zebrafish brain. Anal Bioanal Chem. 410, 2751-2764 (2018).
  11. Jaffer, H., Adjei, I. M., Labhasetwar, V. Optical imaging to map blood-brain barrier leakage. Sci Rep. 3 (1), 3117(2013).
  12. Yao, L., Xue, X., Yu, P., Ni, Y., Chen, F. Evans blue dye: A revisit of its applications in biomedicine. Contrast Media Mol Imaging. 2018 (1), 7628037(2018).
  13. Goldim, M. P. S., Della Giustina, A., Petronilho, F. Using Evans blue dye to determine blood-brain barrier integrity in rodents. Curr Protoc Immunol. 126 (1), e83(2019).
  14. Razali, K., Kumar, J., Mohamed, W. M. Characterizing the adult zebrafish model of Parkinson's disease: a systematic review of dynamic changes in behavior and physiology post-MPTP administration. Front Neurosci. 18, 1432102(2024).
  15. Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. J Vis Exp. (108), e53617(2016).
  16. Al-Bachari, S., Naish, J. H., Parker, G. J., Emsley, H. C., Parkes, L. M. Blood-brain barrier leakage is increased in Parkinson's disease. Front Physiol. 11, 593026(2020).
  17. Gray, M. T., Woulfe, J. M. Striatal blood-brain barrier permeability in Parkinson's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (5), 747-750 (2015).
  18. Hourfar, H., et al. The impact of α-synuclein aggregates on blood-brain barrier integrity in the presence of neurovascular unit cells. Int J Biol Macromol. 229, 305-320 (2023).
  19. Olmedo-Díaz, S., et al. An altered blood-brain barrier contributes to brain iron accumulation and neuroinflammation in the 6-OHDA rat model of Parkinson's disease. Neuroscience. 362, 141-151 (2017).
  20. Ravenstijn, P. G., et al. Evaluation of blood-brain barrier transport and CNS drug metabolism in diseased and control brain after intravenous L-dopa in a unilateral rat model of Parkinson's disease. Fluids Barriers CNS. 9, 1-14 (2012).
  21. Wu, Y. C., Sonninen, T. M., Peltonen, S., Koistinaho, J., Lehtonen, Š Blood-brain barrier and neurodegenerative diseases-modeling with iPSC-derived brain cells. Int J Mol Sci. 22 (14), 7710(2021).
  22. Hosseini, S., et al. Efficient phenotypic sex classification of zebrafish using machine learning methods. Ecol Evol. 9 (23), 13332-13343 (2019).
  23. Dithmer, S., Blasig, I. E., Fraser, P. A., Qin, Z., Haseloff, R. F. The basic requirement of tight junction proteins in blood-brain barrier function and their role in pathologies. Int J Mol Sci. 25 (11), 5601(2024).
  24. Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), e2126(2010).
  25. Nishimura, Y., et al. Identification of a novel indoline derivative for in vivo fluorescent imaging of blood-brain barrier disruption in animal models. ACS Chem Neurosci. 4 (8), 1183-1193 (2013).
  26. Schoknecht, K., Eilers, J. Brain-to-blood transport of fluorescein in vitro. Sci Rep. 14 (1), 25572(2024).
  27. Harris, W. J., et al. In vivo methods for imaging blood-brain barrier function and dysfunction. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 50 (4), 1051-1083 (2023).
  28. Hamilton, N., Allen, C., Reynolds, S. Longitudinal MRI brain studies in live adult zebrafish. NMR Biomed. 36 (7), e4891(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Evans BlueBBBFiji

מאמרים קשורים