מאמר שיטה

מוטגנזה מדויקת של פאג'ים עם מערכות CRISPR-Cas בסיוע NgTET

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69022

⸱

14 באוקטובר 2025

 ,  , 
1Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 2Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 3Department of Bionanoscience, Delft University of Technology, 4Philipps-Universität Marburg, Department of Chemistry, Center for Synthetic Microbiology (SYNMIKRO), 5Institute of Pharmaceutical Biology and Biotechnology, Department of Pharmacy, Marburg University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפחתת שינויים ב-DNA בבקטריופאג'ים באמצעות האנזים NgTET, המאפשר מוטגנזה יעילה וללא צלקות של CRISPR-Cas. שיטה זו מאפשרת הנדסה גנטית של פאג'ים ליישומים בביוטכנולוגיה וטיפול בפאג'ים.

תקציר

בקטריופאג'ים, וירוסים המכוונים ספציפית למארחי החיידקים שלהם, מחזיקים בפוטנציאל משמעותי לביוטכנולוגיה ורפואה, במיוחד במאבק בזיהומים עמידים לתרופות מרובות. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס זיהום הפאג'ים נותרו לא נחקרים במידה רבה. מוטגנזה מדויקת וספציפית לאתר של פאג'ים היא כלי רב עוצמה להבהרת תפקודי גנים ואינטראקציות פאג'-מארח.

עם זאת, אתגר מרכזי במוטגנזה של גנום פאג'ים הוא נוכחותם של שינויים ב-DNA של פאג'ים המפריעים לכלי עריכת גנום קונבנציונליים כמו CRISPR-Cas.

בעוד שמערכות CRISPR-Cas שימשו בהצלחה למוטגנזה ממוקדת באורגניזמים שונים, יעילותן במוטגנזה של פאג'ים מוגבלת לרוב על ידי שינויים ב-DNA כגון גליקוזילציה של ציטוזין. כדי להתגבר על מחסום זה, פיתחנו שיטה יעילה המפחיתה באופן זמני את שפע השינויים ב-DNA של פאג'ים, ומאפשרת מיקוד יעיל של CRISPR-Cas והחדרת מוטציות מדויקות לגנום הפאג'ים. באופן ספציפי, אנו משתמשים ב-Ten Eleven Translocation (TET) methylcytosine dioxygenase מ-Naegleria gruberi (NgTET), אשר מבצע באופן איטרטיבי ציטוזינים שעברו מתילציה והידרוקסימתילציה ב-DNA. על ידי חמצון ציטוזינים הידרוקסימתיליים בתוך ה-DNA של הפאג'ים, NgTET מונע שינוי ציטוזין לאחר מכן כמו גליקוזילציה ומשפר משמעותית את היעילות של מחשוף DNA בתיווך Cas.

לסיכום, גישת עריכת הגנום המדויקת ונטולת הצלקות המוצגת כאן מאפשרת החדרה יעילה של מוטציות נקודתיות תוך שמירה על ארכיטקטורת הגנים המקומיים בגנום הפאג'ים. על ידי שמירה על מסגרות תמלול ותרגום שלמות, שיטה זו ממזערת שיבושים לא מכוונים ברשתות רגולטוריות מורכבות. זה חשוב במיוחד לחקירת חלבוני פאג'ים חיוניים או רב תפקודיים. היכולת ליצור שינויים גנטיים ממוקדים מבלי להכניס רצפים זרים מרחיבה משמעותית את ערכת הכלים הניסויית לביולוגיה של פאג'ים. אסטרטגיה זו לא רק מאפשרת מחקרים פונקציונליים מפורטים אלא גם משפרת את הפוטנציאל להנדסה רציונלית של פאג'ים ליישומים טיפוליים וביוטכנולוגיים.

מבוא

בקטריופאג'ים הם וירוסים שמכוונים ספציפית לחיידקים. הם משכו עניין מחקרי משמעותי בשל הפוטנציאל העצום שלהם בביוטכנולוגיה וברפואה, במיוחד במאבק נגד חיידקים עמידים לתרופותמרובות 1,2,3. למרות זאת, הביולוגיה של הפאג'ים נותרה יחסית לא נחקרת. הבנה מעמיקה יותר של המנגנונים המולקולריים שלהם לחטיפת מארחי החיידקים שלהם חיונית כדי לרתום את מלוא הפוטנציאל הטיפולי והביוטכנולוגי שלהם4. כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס זיהום הפאג'ים היעיל ובהמשך להנדס את הפאג'ים ליישומים ספציפיים, היכולת לשנות גנטית גנומים של פאג'ים היא חיונית. עם זאת, זה נותר אחד האתגרים המשמעותיים ביותר בתחום הביולוגיה של פאג'ים 3,5,6.

DNA של פאג'ים משתנה לעתים קרובות על ידי שינויים כימיים ספציפיים של בסיסי הפורין והפירימידין, למשל, גליקוזילציה של ציטוזין ומתילציה. שינויים אלה מגנים על החומר הגנטי של הפאג'ים מפני זיהוי ופירוק על ידי נוקלאזות מארח6. בעוד ששינויים אלה חיוניים לכושר הפאג'ים, הם מהווים מכשול משמעותי עבור גישות הנדסת גנום פאג'ים המסתמכות על מערכות מיקוד DNA 2,3,7.

אסטרטגיות מוטגנזה קיימות, כולל מערכות הגבלה-שינוי וטכנולוגיות מבוססות חלבון המבוססות על חלבון (CRISPR)-CRISPR-associated (Cas), מתמודדות עם אתגרים משמעותיים בעת שינוי DNA של פאג'ים עקב שינויים אפיגנטיים מגנים כמו גליקוזילציה של ציטוזין8. עריכת גנום בתיווך CRISPR-Cas, היעילה ביותר בתאי חיידקים ואאוקריוטים, מסתמכת על שני שלבים מרכזיים: פיצול מדויק של DNA במיקומים גנומיים ממוקדים על ידי נוקלאז Cas, ואחריו תיקון DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית עם DNA תורם הנושא את המוטציה הרצויה1. עם זאת, בפאג'ים, שינויים ב-DNA מונעים לעתים קרובות מנוקלאזות Cas להיקשר או לבקע את הגנום ביעילות. בנוסף, האופי המהיר והחולף של שכפול פאג'ים יכול להגביל עוד יותר את היעילות של רקומבינציה הומולוגית. מחסומים אלה מקשים במיוחד על יישום טכנולוגיית CRISPR-Cas מכוונת DNA למוטגנזה של פאג'ים. הוכח כי שינויים ב-DNA של פאג'ים פוגעים במיקוד ה-DNA של פאג'ים עם CRISPR-Cas הן במבחנה והן ב-vivo 6,7.

כדי להתמודד עם האתגרים שמציבים שינויי DNA מגנים בפאג'ים, אנו מציגים אסטרטגיית מוטגנזה גנומית הרותמת את הפעילות של מתילציטוזין דיאוקסיגנאז של עשר-אחת עשרה (TET), במיוחד NgTET. באיקריוטים, אנזימי TET מזרזים את החמצון ההדרגתי של ציטוזין שעבר מתילציה באמצעות תהליכים איטרטיביים: מתילציטוזין (5mdC) מומר תחילה להידרוקסימתילציטוזין (5hmdC), לאחר מכן לפורמיל ציטוזין (5fdC), ולבסוף לקרבוקסיציטוזין (5cadC) (איור 1).

בגישת המוטגנזה של הפאג'ים שלנו, NgTET משמש להפחתה זמנית של שפע שינויי ה-DNA המגנים, ובכך משפר את הנגישות של DNA פאג'ים לכלי עריכת גנום כגון אנזימי Cas9. NgTET, נבחר לווסת את גנום הבקטריופאג'ים בשל דיווחים קודמים על ביטויו המוצלח בצורה מסיסה פעילה במארח חיידקים הטרולוגי, במיוחד E. coli. מאפיין זה חיוני, מכיוון ש-NgTET חייב להישאר פעיל במהלך זיהום פאג'ים10.

figure-introduction-1
איור 1: חמצון מדורג של 5-מתילציטוזין על ידי TET Dioxygenase1. ה-TET dioxygenase מזרז את החמצון העוקב של 5-methyl-2'-deoxycytidine (5mdC) ל-5hmdC, 5-formyl-2'-deoxycytidine (5fdC), ובסופו של דבר ל-5-carboxyl-2'-deoxycytidine (5cadC). התוצר הסופי, 5cadC, חוזר באופן ספונטני או אנזימטי לציטוזין (dC) לא מותאם, ובכך תורם לוויסות אפיגנטי דינמי. תהליך רב-שלבי זה הוא מרכזי למתילציה פעילה של DNA באיקריוטים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מכיוון שמתילציטוזין והידרוקסימתילציטוזין הם קודמנים נפוצים לשינויים יתר של DNA פאג'ים, כולל מבני הגנה מגושמים כמו גליקוזילציה, ניתן לנצל את הפעילות החמצונית של TET dioxygenase כדי למנוע היווצרות של שינויים יתר אלה ב-DNA9. בגישת מוטגנזה גנומית מבוססת TET, אנו מבטאים באופן הטרולוגי NgTET באופן רקומביננטי ב- E. coli כדי לחמצן ציטוזינים הידרוקסימתיליים בגנום הפאג'ים בעת זיהום, ובכך למנוע היווצרות גליקוזילציה מגושמת. על ידי הפחתת השפע של שינויי ה-DNA המגושמים הללו, הגישה שלנו יכולה להגביר את הנגישות של ה-DNA של הפאג'ים לנוקלאזות CRISPR-Cas. נגישות משופרת זו מאפשרת זיהוי מטרה יעיל, מחשוף DNA מדויק והכנסת מוטציות נקודתיות ללא צלקת לגנום הפאג'ים, מה שמבדיל אותו משיטות מוטגנזה מסורתיות של פאג'ים המסתמכות על מחיקות גנים, החדרת גנים מדווחים, או שילוב של צמתים מלאכותיים לבחירת מוטנטים מבוססי PCR 1,11. אסטרטגיות קונבנציונליות אלו היו עד כה הכלים היחידים הזמינים למוטגנזה ממוקדת בגנום של פאג'ים ולכן מייצגות בסיס חשוב לשיטה המוצגת כאן. עם זאת, חלבוני פאג' בודדים יכולים להיות בעלי פונקציות מרובות. מחיקת הגן כולו המקודד חלבון מעניין משבשת את כל הפונקציות הקשורות. לעומת זאת, החדרה ממוקדת של מוטציות נקודתיות מאפשרת השבתה סלקטיבית של פונקציות ספציפיות, ומאפשרת ניתוח מפורט של תפקידיהן. נכון להיום, הפונקציות של חלבוני פאג'ים רבים נותרו ברובן לא מאופיינות; לפיכך, אנו עשויים להתעלם מפעילויות נוספות הקשורות לגן נתון. לכן, גישה מינימליסטית שמטרתה להסיר רק פונקציה אחת תוך גרימת שינויים מינימליים בחלבון הכללי עדיפה12,13. השיטה המתוארת כאן מאפשרת שינויים גנטיים מדויקים מבלי לשבש את הארגון או התפקוד הגנומי הכולל. אתגר מרכזי נוסף של שיטות מוטגנזה קודמות של פאג'ים היה היעילות הנמוכה שלהן, שהניבה בדרך כלל שיעורי מוטציות של כ-0.1%1,11. בטכניקה זו, אנו מציגים את אסטרטגיית המוטגנזה הראשונה המסוגלת להציג שינויים בקודון יחיד, ולהשיג עלייה ניכרת פי שבעה ביעילות המיקוד. על ידי שילובו עם שיטת סינון בתפוקה גבוהה מבוססת ONT, זיהוי מוטציות נקודתיות מפושט, ומבטל את הצורך לסנן אוכלוסיות פאג'ים גדולות כדי לבודד מוטציה אחת. אסטרטגיית המוטגנזה מבוססת TET המתוארת כאן מתייחסת למגבלה ארוכת שנים בתחום ומאפשרת עריכה גנומית אמינה יותר14.

בסך הכל, שיטה זו לא יכולה להיות מיושמת רק כדי לקדם את ההבנה שלנו לגבי מנגנוני זיהום בקטריופאג'ים, אלא גם טומנת בחובה הבטחה משמעותית לביולוגיה סינתטית. על ידי מתן אפשרות להנדסת גנום פאג'ים מדויקת ויעילה, היא סוללת את הדרך להתאמת הפאג'ים ליישומים ספציפיים, ובכך משפרת את הפוטנציאל שלהם ליישומים ביוטכנולוגיים ורפואיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

סכמטית המדגימה את הדור של פאג' T4 שטופל ב-NgTET מוצגת באיור 2.

figure-protocol-1
איור 2: סקירה סכמטית של זרימת העבודה שהוקמה עבור מוטגנזה של פאג'ים T4 וסינון מוטאנטים. זרימת העבודה כוללת יצירת פאג' T4 היפוmodified באמצעות NgTET, אותו ניתן לאמת על ידי ניתוח LC-MS או לחילופין באמצעות בדיקת מחשוף CRISPR-Cas. לאחר מכן, המוטציה המעניינת מוכנסת לגנום הפאג'ים באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר בתיווך CRISPR-Cas ומזוהה על ידי ברירה נגדית. לאחר מכן ניתן לאשר את נוכחות המוטציה הרצויה באמצעות ריצוף ננופור. לאחר האימות, ניתן להפיץ את הפאג' המוטנטי כדי לשחזר שינויים ב-DNA. זה מאפשר שימוש בפאג' המהונדס ביישומים במורד הזרם, כולל ניתוח פנוטיפים של זיהום באמצעות מבחני ליזה ומדידות גודל פרץ. כל שלב באיור מוסבר עם מספר הפרוטוקול המתאים בסוגריים כדי להקל על קישור שלבי הפרוטוקול עם החלקים המתאימים של האיור. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הפחתת שינויים ב-DNA של פאג'ים באמצעות טיפול מקדים של NgTET (~2 ימים)

הערה: שלב זה הוא קריטי לאפשר מיקוד יעיל של נוקלאז Cas במהלך מוטגנזה על ידי הפחתת שפע השינויים ב-DNA של פאג'ים.

  1. חסנו את זן E. coli BL21 (DE3) שהפך עם pET28a_NgTET על ידי העברת חומר ממאגר גליצרול ל-10 מ"ל של מדיום LB בתוספת 30 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין. דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-160 סל"ד.
  2. למחרת, השתמש בתרבית הלילה כדי לחסן תרבית ראשית ל-OD600 ראשוני של 0.1 ב-50 מ"ל של מדיום LB המכיל 30 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין. השרה את התרבית עם 50 מיקרומטר IPTG כאשר מגיעים ל-OD600 של 0.4.
  3. מגדלים את התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב -160 סל"ד עד שהיא מגיעה ל- OD600 של 0.8.
  4. הדביקו את התרבית בפאג' המעניין בריבוי זיהום (MOI) של 0.1 ודגרו במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר עם טלטול ב-120 סל"ד.
  5. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בחום של 4000 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  6. העבירו את הסופרנטנט דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר כדי לקבל פאג'ים שטופלו ב-NgTET עם DNA היפו-שונה. אחסן את הפאג'ים המסוננים ב-4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
    הערה: (נקודת הפסקה) פאג'ים מסוננים יציבים במשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מאוחסנים במדיום LB בבקבוק זכוכית.

2. אימות

הערה: מטרת שלב זה היא לאמת באופן ניסיוני את השפע המופחת של שינויים ב-DNA של פאג'ים.

  1. תיקוף טיפול באמצעות LC-MS (~ יומיים)
    1. טיהור פאג'ים באמצעות שיפוע סוכרוז
      1. כדי להסיר את שאריות חומצת הגרעין מהליזאט, יש לטפל ב-500 מיקרוליטר של תרחיף הפאג'ים (>1010 PFU/mL) עם 20 מיקרוליטר של DNase I ו-2 מיקרוליטר של תערובת RNase A/T1 (4 מיקרוגרם של RNase A, 10 U של RNase T1).
      2. דוגרים את התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      3. הכן שיפוע סוכרוז של 0-45% במאגר TM (50 מ"מ Tris-HCl, 10 מ"מ MgCl2, pH 7.5). הכן את השיפוע באמצעות מערבל שיפוע או באופן ידני.
        הערה: להכנה ידנית, התחל בהזרמת 5 מ"ל של מאגר TM לתוך צינור שיפוע. לאחר מכן, בעזרת צינורית קהה, פיפטה לאט 5 מ"ל מתמיסת הסוכרוז של 45% מתחתית הצינור, מה שמאפשר לתמיסת 0% לעלות בהדרגה.
      4. טען 500 מיקרוליטר מתמיסת הפאג'ים המטופלת על גבי השיפוע.
      5. צנטריפוגה בטמפרטורה של 70,000 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      6. הדליקו את צינור הצנטריפוגה מלמטה. זה יאפשר הדמיה של הפאג', המופיע כרצועה עכורה בשיפוע. הסר את השבר המכיל פאג'ים בזהירות באמצעות צינורית קהה.
      7. העבירו את שבר הפאג שחולץ לצינור אולטרה-צנטריפוגה חדש.
      8. הוסף 30 מ"ל של מאגר TM קר כקרח וצנטריפוגה ב-100,000 × גרם למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס.
      9. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר TM.
      10. אחסן את הפאג'ים התלויים בבקבוקון זכוכית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. בידוד DNA של פאג'ים
      1. הוסף 1 מיקרוגרם של פרוטאינאז K לפאג'ים התלויים.
      2. יש לדגור למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
      3. יש להוסיף נפח 1 של תערובת פנול/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (P/C/I). מיקס על ידי היפוך. הפרד את השלבים על ידי צנטריפוגה ב-15,000 x גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו את השלב המימי לצינור תגובה חדש. חזור על החילוץ שלוש פעמים.
        אזהרה: פנול/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (P/C/I) הוא רעיל מאוד, קורוזיבי ונדיף. טפל בו תמיד בתוך מכסה אדים תוך לבישת ציוד מגן מתאים, כולל מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל כפולות. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים, ולאחסן בכלי אטום היטב בארון כימיקלים ייעודי. השלך פסולת דרך ערוצי פסולת מסוכנת מאושרים. במקרה של מגע, יש לשטוף מיד במים ולפנות לטיפול רפואי.
      4. כדי להסיר שאריות פנול, בצע שלוש פעמים מיצוי חוזר של כלורופורם עם נפח אחד של כלורופורם.
      5. זרז DNA בן לילה עם נפח של 0.1 M NaOAc (pH 5.5) ונפח 2.5 של אתנול ב-20 מעלות צלזיוס.
      6. למחרת, גלולה את ה-DNA על ידי צנטריפוגה ב-15,000 × גרם למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס.
      7. שטפו את כדור ה-DNA פעמיים עם 200 מיקרוליטר של 70% אתנול, נערו בעדינות, צנטריפוגה ב-15,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, והסירו בזהירות את הסופרנטנט.
      8. השעו מחדש את ה-DNA המטוהר במים טהורים במיוחד.
      9. אחסן את ה-DNA ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
        הערה: (נקודת הפסקה) ניתן לאחסן DNA משקע בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
    3. הכנת DNA פאג'ים לניתוח LC-MS
      1. עכל את ה-DNA המטוהר לנוקלאוזידים בודדים באמצעות תערובת עיכול נוקלאוזיד.
      2. ניתוח הרכב ה-DNA באמצעות LC-MS.
        הערה: שלב זה מאפשר לאמת את יעילות הטיפול ב-NgTET. הפרוטוקול מותאם לציוד ולעמודה הספציפיים הזמינים במעבדה, אך ניתן לכוונן אותו על סמך המשאבים והתנאים הזמינים.
      3. השתמשו בדנ"א מעוכל שבודד מפאג'ים מטוהרים (שלב 2.1.10).
      4. כלול את התקנים הבאים הזמינים מסחרית למדידות: dA, dT, dG, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC. אם זמין, כלול את הסטנדרט של שינוי יתר של ציטוזין הקיים ב- DNA של הפאג'.
      5. השתמש במערכת HPLC המצוידת בעמודת C18 (150 × 2.1 מ"מ, 100 Å, 3 מיקרומטר) ועמוד הגנה של 20 × 2.1 מ"מ.
      6. הגדר את טמפרטורת העמודה ל-40 מעלות צלזיוס ואת קצב זרימת הנוזל ל-0.2 מ"ל/דקה.
      7. הכן נוזלים באופן הבא:
        חומר חומר A: 10 מ"מ אמוניום אצטט במים (pH 4.5).
        חומר B: 0.1% חומצה פורמית במתנול.
        זהירות: 0.1% חומצה פורמית במתנול היא דליקה ועלולה לגרות את העור, העיניים ודרכי הנשימה. השתמש תמיד באזור מאוורר היטב או במכסה אדים. יש ללבוש ציוד מגן מתאים, כולל חלוק מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל. הרחק מחום, ניצוצות ולהבות פתוחות. אחסנו בארון אחסון דליק. השלך באמצעות פרוטוקולי פסולת מסוכנת מאושרים.
      8. החל את פרופיל הפאזה הנייד הבא: 0-1 דקות: קבוע ב-5% B; 1-5 דקות: שיפוע מ-5% ל-90% B; 5-7 דקות: קבוע ב-90% B; 7-7.1 דקות: שיפוע מ-90% ל-5% B; 7.1-12 דקות: קבוע ב-5% B.
      9. השתמש בספקטרומטר מסה במצבי יינון שליליים וחיוביים (זריקות נפרדות) עם מקור יינון אלקטרוספריי בטמפרטורה גבוהה (H-ESI) בתנאים הבאים:
        מתח ריסוס H-ESI: 3400 וולט (+), 2400 וולט (-), גז נדן: 35 יחידות שרירותיות, גז עזר: 7 יחידות שרירותיות, גז טאטא: 0 יחידות שרירותיות, טמפרטורת צינור העברת יונים: 300 מעלות צלזיוס, טמפרטורת וופורייזר: 275 מעלות צלזיוס, מצב זיהוי: סריקה מלאה באמצעות מנתח המסה של אורביטראפ, רזולוציית מסה: 120,000, טווח מסה: 200-450 (m/z).
      10. חלץ כרומטוגרמות יונים של הצורות [M-H]- (dA, dT, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC) ו-[M+H]+ (5ghmdC) באמצעות תוכנת Tracefinder.
      11. חשב את השפע היחסי של כל שינוי על ידי נורמליזציה של שטח השיא של כל אות לאזור השיא של dG בתוך הדגימה, תוך שימוש ב-dG כתקן פנימי ספציפי לדגימה.
  2. אימות באמצעות בדיקת מחשוף CRISPR-Cas (~2.5 ימים)
    הערה: שלב זה מאפשר הערכה פנוטיפית של הצלחת הטיפול ב-NgTET והשפעתו על מחשוף CRISPR-Cas. אם NgTET פעיל, לא אמורים להיווצר פלאק מה-DNA של הפאג'ים המטופלים, או להפחית את טיטר הפאג'ים, מכיוון שהסרת שינויים ב-DNA המגן הופכת את הגנום לרגיש למחשוף CRISPR-Cas12 או 9. לעומת זאת, אם ה-DNA של הפאג'ים אינו מטופל, מספר הפלאקים שנוצרו יתאים לטיטר של הפאג'ים, מה שמצביע על כך שגנום הפאג'ים T4 שהשתנה יתר על המידה עמיד בפני מחשוף CRISPR-Cas12 או 9.
    1. לחסן את E. coli BL21 (DE3) מתרבית לילה, שהשתנה הן עם פלסמיד pET28a_NgTET והן עם פלסמיד ביטוי Cas12 או Cas9 (למשל, DS-spCas או pCpf1 ללא מרווח). ניתן למצוא את כל הפלסמידים עם מידע נוסף בטבלה 1.
      1. גדל את התאים במדיום LB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה ב-3 מעלות צלזיוס עם טלטול, החל מ-OD600 של 0.1. ברגע שהתרבית מגיעה ל-OD600 של כ-0.4, יש לגרום לביטוי NgTET על ידי הוספת 0.05 מ"מ IPTG ולדגור למשך שעתיים נוספות ב-3 מעלות צלזיוס.
      2. כבקרה, השווה זני E. coli BL21 (DE3) עם ובלי ביטוי יתר של NgTET. בהיעדר פעילות NgTET, צפוי מספר גבוה יותר של יחידות יוצרות פלאק, מה שמעיד על יעילות מופחתת של CRISPR-Cas עקב נוכחות של 5ghmdC מסוכרר ב-DNA של הפאג'ים.
    2. מעבירים 300 מיקרוליטר מתרביות E. coli לצינור סטרילי.
    3. הדביקו את התרבית ב-T4 WT או בפאג' שטופל ב-NgTET עם MOI 0.01. עבור ניסוי זה, השתמשו ב-MOI נמוך כדי להבטיח שחיידקים נגועים רק בפאג' אחד בכל פעם. זה ממקסם את היעילות של סינון המחשוף CRISPR-Cas ומפשט את הפרשנות של התוצאות. מערבבים בעדינות כדי להבטיח פיזור אחיד של הפאג'ים.
    4. דגרו על תרחיף החיידקים-פאג'ים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
    5. הוסף את תערובת החיידקים-פאג'ים ל-4 מ"ל של אגר רך LB (0.75%) בתוספת אנטיביוטיקה. יש לערבב היטב אך בעדינות כדי למנוע החדרת בועות.
    6. יוצקים את תערובת האגר הרכה על צלחת אגר LB שחוממה מראש.
    7. הניחו לצלחות להתמצק לזמן קצר בטמפרטורת החדר. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    8. למחרת, ספרו את הפלאקים המתקבלים כדי לקבוע יחידות יוצרות פלאק (PFU).

3. מוטגנזה של CRISPR-Cas (~ שבוע אחד)

הערה: מוטגנזה של CRISPR-Cas מבוססת על העיקרון שאתר ספציפי בגנום הפאג'ים ממוקד על ידי נוקלאז Cas במהלך זיהום בפאג'ים, וכתוצאה מכך שבירת גדיל כפול. שבר זה מתוקן באמצעות רקומבינציה הומולוגית באמצעות DNA תורם, המסופק על פלסמיד שני הקיים בזן המארח הנגוע במהלך מוטגנזה. הפלסמיד המכיל את ה-DNA של התורם מקודד גם NgTET, החיוני לשמירה על נגישות ה-DNA של הפאג' לנוקלאז Cas על ידי הפחתת שפע הציטוזינים ששונו, כפי שתואר קודם לכן. בשלב זה, מוטציות מטרה מוכנסות לגנום של פאג'ים T4 שטופלו ב-NgTET עם הדבקה ב-E. coli15. כדי להבטיח רמות נמוכות באופן עקבי של שינויים ב-DNA בגנום T4, NgTET dioxygenase מתבטא על ידי תוספת של 50 מיקרומטר IPTG (אנלוגית לשלב 1.2) לאורך תהליך המוטגנזה.

  1. יצירת פלסמידים של DNA pET28a_NgTET_donor באמצעות שיבוט שער זהב15
    1. ליצירת ה-DNA התורם, סדרו את הרצף הרצוי כגן שלם או הגבירו מגנום, למשל, מגנום הפאג', והציגו את המוטציה הרצויה.
      הערה: לתכנון DNA של תורם, כלול אזורים הומולוגיים המאגפים את אתר המטרה (≈200 bp מכל צד עבור מוטציות נקודתיות; אזורים ארוכים יותר עבור תוספות גדולות יותר). שבר התורם הליניארי צריך לשאת אתרי זיהוי BsaI המייצרים תלויות תואמות עם הפלסמיד בעת המחשוף. בסיליקו מומלץ שיבוט כדי לאמת את עיצוב המבנה. בתוצאות המייצגות, כל המרכיבים הקריטיים ל-DNA של התורם מומחשים בדוגמה.
    2. הציגו את מקטע ה-DNA של התורם במורד הזרם של רצף הקידוד והסיומת של NgTET בעמוד השדרה pET28a_NgTET באמצעות מכלול Golden Gate.
      1. הכן את תגובות ההרכבה על ידי שילוב של 70 fmol של pET28a_NgTET פלסמיד, 140 fmol של הכנסת DNA תורם, 1 μL של BsaI (20 U/μL), 5 U של T4 DNA ligase ו-2 μL של 10× מאגר ליגאז, עם מים נטולי נוקלאז שנוספו לנפח סופי של 20 מיקרוליטר.
      2. הפעל תגובות ב-25 מחזורים ב-PCR-cycler עם ההגדרות הבאות: 1) הגבלה, 37 מעלות צלזיוס למשך 1.5 דקות, 2) קשירה, 16 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 3) הגבלה סופית, 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ו-4) דנטורציה, 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. הוסף 6 מיקרוליטר מתערובת התגובה (משלב 3.1.2) ל-100 מיקרוליטר של E. coli DH5α בעל יכולת כימית, דגירה על קרח למשך 10 דקות והלם חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות. מניחים מיד את התאים על קרח למשך דקה אחת, ואז מוסיפים 750 מיקרוליטר מדיום LB. יש להתאושש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור (500 סל"ד) למשך שעה אחת. צלחת על אגר LB המכילה קנמיצין (30 מיקרוגרם/מ"ל) ודגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
    4. בחר מושבה אחת וחסן 20 מ"ל של מדיום LB בתוספת קנמיצין (30 מיקרוגרם/מ"ל). דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-160 סל"ד.
    5. מ-5 מ"ל של תרבית הלילה, גלולה את התאים ובודד DNA פלסמיד בשיטת מיצוי פלסמיד סטנדרטית. יש לסלק את הפלסמיד ב-40 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
    6. אשר שיבוט נכון על ידי ריצוף אתר ההחדרה של הפלסמיד באמצעות ריצוף Sanger.
  2. בניית פלסמידים CRISPR-Cas המכילים מרווח (pCpf1-sp כמודל)15
    הערה: הפלסמיד המתואר בפרק זה מאפשר את הצעד הראשון של מוטגנזה על ידי הכנסת שבירת גדיל כפול ספציפית לאתר בגנום הפאג'ים. בעוד שההליך מודגם כאן עם מערכת CRISPR-Cas12 (פלסמיד pCpfl-sp), ניתן להשתמש בנוקלאזות חלופיות כגון CRISPR-Cas9 (פלסמיד DS-spCas)15 .
    1. תכנן מרווח של 20 nt המכוון לאתר המוטגנזה (PAM: TTTV). זיהוי ותכנון פרוטו-ספייסרים מתאימים ומרווחים מתאימים באמצעות כלים ביואינפורמטיים.
    2. סנתז שני אוליגונוקלאוטידים 5′-זרחן. ודא שכל אחד מהם נושא 10 nt מרצף המרווח הרצוי (יחד יוצרים את המרווח המלא של 20 nt) ואזור נוסף של 10 nt המשלים לאתר ההחדרה בתוך הפלסמיד pCpf1-sp.
    3. הכנס את מרווח ה-CRISPR-Cas המעוצב לתוך הפלסמיד pCpf1-sp על ידי PCR ampampבאמצעות הפריימרים משלב 2. הגדר את התגובה באופן הבא (נפח סופי 50 μL): 5 μL 10× מאגר GC, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL פריימר קדימה (10 μM), 1 μL פריימר הפוך (10 μM), 2.5 μL DMSO, תבנית פלסמיד המתאימה ל-2 fmol, 1 μL Phusion DNA פולימראז (2 U/μL), ומים נטולי נוקלאז עד 50 μL.
    4. הנח את צינורות התגובה בתרמו-סייקלר והפעל את התוכנית הבאה: דנטורציה ראשונית ב-98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 25 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, חישול בטמפרטורה המתאימה (X °C) למשך 30 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות; ואחריה הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. החזק את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף.
    5. מערבבים 5 מיקרוליטר של תגובת ה-PCR עם מאגר טעינת DNA (10×) ומעמיסים על ג'ל אגרוז 1%. הפעל את הג'ל ב-130 וולט למשך 20 דקות ודמיין את רצועות ה-DNA באמצעות תאורת טרנס UV. אם ההגברה מצליחה, יש לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת ניקוי מתאימה ולשטוף פנימה 20 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
    6. הקיפו את הפלסמיד על ידי קשירה באמצעות 100 ננוגרם של המוצר המוגבר מעורבב עם 1× T4 DNA ligase מאגר ו-60 U T4 DNA ligase בנפח תגובה כולל של 15 מיקרוליטר. הפוך 100 מיקרוליטר של E. coli בעל יכולת כימית עם תוצר הקשירה כמתואר בשלב 3.1.3. צלחת את התאים על אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ודגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
    7. בחרו מושבה אחת מהצלחת וחסנו אותה ל-20 מ"ל של מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-160 סל"ד. מ-5 מ"ל של תרבית הלילה, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה ובודדו DNA פלסמיד בשיטת מיצוי פלסמיד לבחירה. יש לסלק את הפלסמיד ב-40 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
    8. אשר שיבוט מוצלח על ידי ריצוף הפלסמיד באתר ההחדרה באמצעות ריצוף Sanger.
  3. מוטגנזה של פאג'ים
    1. טרנספורמציה של תאי E. coli BL21 (DE3) עם שני פלסמידים: מרווח pET28a_NgTET_donor-DNA ו-pCpf1-sp (Cas12)/DS-SPcas (Cas9) (נוצר בשלבים 3.1 ו-3.2). מערבבים 1 מיקרוליטר מכל פלסמיד עם 100 מיקרוליטר של E. coli BL21 (DE3) בעל יכולת כימית. עקוב אחר הפרוטוקול המתואר בשלב 3.1.3. צלחת את התאים המותמרים על אגר המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-30 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין, ודגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. לחסן את זן ה-E. coli שעבר טרנספורמציה (E. coli BL21 (DE3) pET28a_NgTET_donor-DNA ו-pCpf1-sp(Cas12)/DS-SPcas(Cas9)_spacer) ל-10 מ"ל של מדיום LB בתוספת 30 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-160 סל"ד.
    3. למחרת, יש לדלל את תרבית הלילה ל-OD600 ראשוני של 0.1 ב-50 מ"ל של מדיום LB המכיל 30 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין.
    4. מגדלים את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-160 סל"ד עד שמגיעים ל-OD600 של 0.8. הורד את הטמפרטורה לטמפרטורת החדר (RT) והפחת את מהירות התסיסה ל-130 סל"ד.
      1. כדי לשפר את ספיחת הפאג'ים והזרקת ה-DNA, הוסף MgCl2 ו-CaCl2 לריכוזים סופיים של 1 מ"מ כל אחד, מכיוון שקטיונים דו-ערכיים אלה מאפשרים אינטראקציות יעילות בין פאג'ים למארח.
      2. להדביק את התרבית בפאג'ים T4 שטופלו מראש ב-NgTET, וכביקורת שלילית, עם פאג'ים T4 שלא טופלו ב-NgTET ב-MOI של 0.1. המשך הדגירה ב-RT למשך 4 שעות.
    5. לאחר הדגירה, העבירו את התרביות לצינור חרוטי של 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-4000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לגלול את התאים. סננו את הסופרנטנטים דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר שאריות של תאי חיידקים. השתמש בסופרנטנטים המסוננים לבדיקות פלאק (המתואר בשלב 2.2) כדי לקבוע את ריכוז הפאג'ים או לבצע ברירה נגדית.

4. זיהוי מוטאנטים

הערה: מטרת הברירה הנגדית היא להפחית את שיעור הפאג'ים מסוג הבר שנותרו באוכלוסייה לאחר מוטגנזה. לשם כך, פאג'ים המתקבלים משלב המוטגנזה (שלב 3.3) משמשים להדבקת E. coli הנושא את אותה מערכת CRISPR-Cas13, המקודדת על ידי פלסמיד אחר pBA560 (מידע נוסף בטבלה 1) ואותו רצף מרווח המופעל במהלך מוטגנזה. במערך זה, נוקלאזות Cas מזהות באופן סלקטיבי וחותכות DNA של פאג'ים מסוג בר, בעוד שפאג'ים הנושאים את המוטציות הרצויות נותרים ללא השפעה. לחץ סלקטיבי זה מדכא שכפול מסוג פרא ומעשיר את האוכלוסייה עבור פאג'ים מוטנטיים14.

  1. בחירה נגדית עם Cas13
    1. להדביק E. coli Cas13a_spacer (פלסמיד pBA560) עם הפאג'ים לברירה נגדית. שלב זה מקל על ברירה נגדית על ידי פירוק RNA פאג'ים שלא עבר את המוטציה המיועדת.
    2. בצע את הבחירה הנגדית באותם תנאים המשמשים במהלך מוטגנזה (ראה שלבים 3.3.1-3.3.5). השתמש ב-E. coli המבטא מרווח Cas13a שאינו ממוקד כבקרה שלילית כדי לאשר שהפחתת הפלאק היא ספציפית לספייסר.
    3. לאחר הדגירה, סננו את הסופרנטנט שמכיל פאג'ים שנבחרו דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת חיידקית.
      הערה: (נקודת הפסקה) פאג'ים מסוננים יציבים במשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מאוחסנים במדיום LB בבקבוק זכוכית.
    4. השתמש בפאג'ים שנבחרו ומסוננים לבדיקת פלאק על זן E. coli B כדי לבודד פלאקים בודדים לאימות במורד הזרם.
  2. ריצוף מהדור הבא (~ שבוע אחד)
    הערה: השיטה לגישת ריצוף מרובה מאוד כוללת תהליך PCR דו-שלבי ליצירת DNA אמפליקון מרובה המתאים לריצוף הדור הבא לקריאה ארוכה16.
    1. הפרד את הפאג'ים מהמוטגנזה על ידי ציפוי שלהם כמתואר בשלב 2.2. כלול בקרות מתאימות על ידי שימוש בפאג'ים המתקבלים ממוטגנזה המבוצעת הן בנוכחות והן בהיעדר ביטוי NgTET. כבקרה, מיקוד CRISPR-Cas9 ו-Cas12 ללא NgTET לא אמור לגרום להכנסת מוטציות נקודתיות. לעומת זאת, ביטוי משותף של NgTET צפוי לאפשר עריכה מוצלחת, מה שיוביל ליעילות מוטגנזה גבוהה יותר.
    2. כדי לבודד את הפאג'ים הבודדים, בחר פלאק בודד מהצלחת והעביר אותם לצינור המכיל 100 מיקרוליטר של מאגר Pi-Mg (26 מ"מ Na2PHO4, 68 מ"מ NaCl, 22 מ"מ KH2PO4, 1 מ"מ MgSO4, pH 7.5) ו-1 מיקרוליטר של CHCl3.
      זהירות: כלורופורם רעיל, נדיף ועלול להיות מסרטן, אפילו בכמויות קטנות. טפל רק במכסה אדים ולבש ציוד מגן מלא, כולל מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל. הימנע משאיפה ומגע בעור. יש לאחסן בכלי אטום היטב בארון כימיקלים מאוורר ודליק. השלך פסולת כלורופורם באמצעות איסוף פסולת מסוכנת.
    3. השתמש ב-1 מיקרוליטר של פאג' T4 מבודד במאגר Pi-Mg כתבנית להקרנה.
    4. הכן את תערובת התגובה עם 0.125 מיקרומטר מכל פריימר (סביב מיקום ההכנסה) ותערובת מאסטר פולימראז 1x דיוק גבוה, תוך התאמת הנפח הכולל של תגובת ההגברה ל-10 מיקרוליטר. הפעל תגובת PCR עם 30 מחזורי הגברה.
    5. בצע PCR שני כדי לחבר את הברקודים. לכן, השתמש ב-1 מיקרוליטר של דילול של 1:10 של המוצר מה-PCR הראשון כתבנית.
    6. הכן את תערובת התגובה עם פריימרים ברקודים של 0.3 מיקרומטר ותערובת פולימראז התחלה חמה בנאמנות גבוהה בנפח כולל של 7 מיקרוליטר. בצע PCR עם 20 מחזורי הגברה.
      הערה: (נקודת הפסקה) ניתן לאחסן מוצרי PCR בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
    7. אסוף את כל מוצרי ה-PCR הברקודים וטהר אותם באמצעות ניקוי מבוסס חרוזים מגנטיים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת ספריית ריצוף מהדור הבא.
    8. ללכוד DNA באמצעות חרוזים מגנטיים, לשטוף פעמיים עם 80% אתנול ולשטוף פנימה 100 מיקרוליטר של מאגר פליטה (5 מ"מ Tris-HCl, pH 8.5).
    9. מדוד את ריכוז ה-DNA בשיטות ספקטרופוטומטריות ופלואורומטריות, תוך יישום מבחן רחב טווח או רגישות גבוהה לפי הצורך.
      הערה: (נקודת השהייה) ניתן לאחסן DNA בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
    10. יצירת ספריות ריצוף באמצעות פרוטוקול מבוסס קשירה בהתאם להוראות היצרן, החל מ-1 מיקרוגרם של קלט DNA.

5. שחזור התפשטות מוטנטית של שינויים והוכחות DNA

הערה: לאחר זיהוי מוטנט הפאג'ים הרצוי, הוא מופץ ב-E. coli מסוג בר כדי לשחזר את רמות שינוי ה-DNA הדומות לאלו של פאג' WT. זה מבטיח שניתן יהיה להשתמש בפאג' המוטנטי בניסויים ביולוגיים עוקבים ללא כל פשרות, מלבד המוטציה שהוצגה.

  1. הכינו תרבית של 10 מ"ל של זן E. coli B במדיום LB ודגרו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-160 סל"ד.
  2. למחרת, יש לחסן מדיום טרי של 50 מ"ל עם תרבית הלילה כדי להשיג OD600 ראשוני של 0.1.
  3. אפשר לתרבית לצמוח ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-160 סל"ד עד שהיא מגיעה ל-OD600 של 0.8.
  4. הוסף 50 מיקרוליטר ממלאי הפאג'ים המוטנטיים (4.2.2) לתרבית. הסר את השלב בזהירות כדי למנוע העברת CHCl3.
  5. דגרו את התרבית הנגועה למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין ב-120 סל"ד.
  6. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התרבית ב -4000 × גרם להסרת תאי חיידקים. סננו את הסופרנטנט דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר כדי לאסוף את הפאג'.
  7. העבירו את הפאג' המוטנטי המסונן למיכל זכוכית ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
    הערה: (נקודת הפסקה) פאג'ים מסוננים יציבים במשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מאוחסנים במדיום LB בבקבוק זכוכית.
  8. כאימות אופציונלי של התחדשות שינויים ב-DNA, במיוחד ציטוזינים מסוכררים, בצע ניתוח LC-MS כמתואר בשלב 2.1.
    1. למטרה זו, יש לטהר את ה-DNA של הפאג'ים ששוחזר מצאצאי הפאג'ים כמתואר בשלב 2.1.1, לבודד כמו בשלב 2.1.2, ולאחר מכן להתכונן לניתוח LC-MS כמתואר בשלב 2.1.3.
    2. נתח כרומטוגרמות יונים וחשב את השפע היחסי של כל שינוי על ידי נורמליזציה של שטח השיא של כל אות לאזור השיא של dG בתוך הדגימה, תוך שימוש ב-dG כתקן פנימי ספציפי לדגימה כמתואר בשלבים 2.1.3.
      הערה: מומלץ לכלול פאג' T4 מסוג בר, פאג' T4 שטופל ב-NgTET ופאג' T4 שטופל בגרסה הלא פעילה של NgTET D234A כבקרות, על מנת לאמת ולהשוות ישירות את השפע של 5ghmdC10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהוי פס הפאג'ים בשיפוע.
הנראות של פס הפאג'ים בשיפוע תלויה בריכוז הפאג'ים בדגימה הראשונית שנטענה על השיפוע. כאשר הפאג' מרוכז מספיק (~>1 × 1011 PFU/mL), ניתן לראות את הרצועה בבירור על ידי הארת השיפוע מלמטה עם מקור אור (ראה איור 3).

עם זאת, בריכוזי פאג'ים נמוכים, ייתכן שהרצועה לא תהיה גלויה בקלות. במקרה זה, אנו ממליצים לחזור על ניסיון ההדמיה על ידי הארת הצינור מלמטה בחושך, מה שיכול לאפשר זיהוי של הפאג'ים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מציג אסטרטגיה חזקה וניתנת להתאמה להכנסת מוטציות נקודתיות מדויקות לגנום של בקטריופאג'ים, כולל שינויים בנוקלאוטידים בודדים. מרכיב מרכזי בזרימת העבודה הוא שילוב שלבי אימות מחמירים בכל שלב, החיוני להבטחת הדיוק והיעילות של עריכת הגנום. זה קריטי במיוחד בהתחשב באופי הרב-שלבי של זרימת העבודה והאינטראקציות הדינמיות בין פאג'ים למארחי החיידקים שלהם, המציגים משתנים רבים שיכולים להשפיע ישירות על הצלחת מוטגנזה של פאג'ים. גורמים אלה כוללים, בין היתר: I) הנגישות של אזורי ה-DNA המטרה, II) הפעילות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

KH ו-NP הגישו בקשת פטנט אירופאית עבור "הנדסת פאג'ים", בקשת פטנט אירופאית מס' 23 175 257.7. המחברים האחרים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

פרויקט זה קיבל מימון ממועצת המחקר הגרמנית (DFG; SPP 2330 פרויקט מספר 464500427, RTG 2355 פרויקט 11 ו-RTG 2937 (פרויקט מספר 505997786) מאגודת מקס פלאנק (מימון ראש קבוצת המחקר של מקס פלאנק ל-K.H.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות תגובה של 1.5 מ"לסרשטדט72.690.001
צינורות קנוציאליים 15 מ"לסרשטדט62.554.502
15 מ"ל צינורות פוליפרופילן פתוחיםבקמן קולטר מדעי החיים36170616 מ"מ x 95 מ"מ (עבור אולטרה-צנטריפוגה)
צינורות קנוניים 50 מ"לסרשטדט62.547.254
מאגר GC 5xתרמו פישר סיינטיפיק F519L
6x TriTrack DNA טוען צבע תרמו פישר סיינטיפיק ₪1161
אגרוזמרידיאן ביו-סיינסביו-41025דרגה מולקולרית
צנטריפוגה Avanti J-30Iבקמן קולטר מדעי החייםללא קטלוג  מספרSerien-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe
חומצה בורית מרק10043-35-3
BsaI-HF v2נב₪733S
סידן כלוריד הקסהידרטאקרוס אורגניקס7774-34-797%, טהור במיוחד 
מד צפיפות תאיםהרווארד ביוכרום 80211630
ChemiDoc MP ביורד12003154
כלורופורםVWR650498
קובטותסרשטדט67.742
דימתיל סולפוקסיד (DMSO) סיגמא אולדריץ'D4540
די-סודיום מימן פוספטneoFroxx GmbH7558-79-4בדרגת פארמה
פיפטות פסטר זכוכית חד פעמיותVWR612-1702230 מ"מ
DNase I רוש471672800110 U/&מיקרו; L
תערובת dNTP (10 מ"מ כל אחד dNTP) סיגמא-אולדריץ'72004
DS_SPcas_ModAמוצר פנימי.https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_mapsמבנה פלסמיד המכיל CRISPR-Cas12/ModA sgRNA
DS-spCas (מערכת CRISPR-Cas9)אדג'ן 48645 (מספר אביזר addgene)פלסמיד לבניית פלסמידים CRISPR-Cas המכילים מרווח (מערכת CRISPR-Cas9) למוטגנזה של פאג'ים (שלב 3.2)
זן E. coli B שימש לזיהום T4DSMZללא קטלוג  מספרEscherichia coli (Migula 1895) Castellani and Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)
E. coli BL21 (DE3) זן ביטוי, תא מוכשרInvitrogenC600003מתח ביטוי, תאים מוכשרים.
אי קולי DH5 ואלפא; זן שיבוט, תאים מוכשריםInvitrogen18265017זן שיבוט, תאים מוכשרים. 
EDTAרוט8043.2
אתנול (אבסולוטי) VWR200-578-6
תא זרימה ארוךאוקספורד ננופור טכנולוגיותללא קטלוג  מספרR10.4.1. כימיה, https://nanoporetech.com/document/flongle
Gene JET Plasmid Miniprep Kit תרמו פישר סיינטיפיק 10242490
GeneRuler 1 kb פלוס סולם DNAתרמו פישר סיינטיפיק SM1331
סולם DNA של GeneRuler ULR תרמו פישר סיינטיפיק SM1213
גרדיאנט מאסטר 108ביו-קומפללא קטלוג  מספרhttps://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming
צנטריפוגה הראוס פיקו 17תרמו סיינטיפיק75002410
Infors HT Incubator MinitronInfors AGללא קטלוג  מספרhttps://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs
איזופרופיל-&בטא;-D-1-תיוגלקטופירנוזיד (IPTG)סיגמא-אולדריץ'367-93-1
קנמיציןקארל רוטT832.1
LB-אגרקרל-רוטX969.1
LB-בינוני (לוריא/מילר) קרל-רוטX968.1
מגנזיום כלוריד הקסהידרט סיגמא-אולדריץ'7791-18-6
מגנזיום גופרתי סיגמא-אולדריץ'7487-88-9
מכשיר MinION אוקספורד ננופור טכנולוגיותללא קטלוג  מספרhttps://store.nanoporetech.com/eu/minion.html
ModA E165A_fwIDTGAATTAGTTTCAGATGA
ACAAGCGGTAATGATAC
CAGCT		פריימר קדימה להכנסת מוטציה נקודתית ל-ModA E165A ולהצגת קצוות דביקים לשיבוט שער הזהב (שלב 3.1)
ModA E165A_revIDTCATATTACGATAACGA
TGACTATCCGGAAAC		פריימר הפוך להכנסת מוטציה נקודתית ל-ModA E165A ולהצגת קצוות דביקים לשיבוט שער הזהב (שלב 3.1)
ModA_sgRNA_Cas12_fwIDTTCTTGTTCATCTACAAC
AGTAGAAATTAATTTAAA
GTTCTTAGACCCG		פריימר קדמי ליצירת מרווח עבור מערכות CRISPR-Cas12 / CRISPR-Cas9 / CRISPR-Cas13 למוטגנזה של פאג'ים ובחירה נגדית (שלב 3.2 ושלב 4.1)
ModA_sgRNA_Cas12_revIDTAGTAATGATAAAGAACT
TTAAATAATTTCTACT
TGTAGATGCTAC		פריימר הפוך ליצירת מרווח למערכות CRISPR-Cas12 / CRISPR-Cas9 / CRISPR-Cas13 למוטגנזה של פאג'ים ובחירה נגדית (שלב 3.2 ושלב 4.1)
ספקטרופוטומטר NanoDrop ND-1000 תרמו פישר סיינטיפיקAZY2019944
ערכת NucleoMag מצ'רי נייגלמספר סימוכין למוצר 744970.50
תערובת עיכול נוקלאוזיד מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדM0649S
pBA560 (מערכת CRISPR-Cas13)אדג'ן186236 (מספר אביזר addgene)קידוד פלסמיד מערכת CRISPR-Cas13 לבחירה נגדית (שלב 4.1)
פלסמיד pCpfl-sp (מערכת CRISPR-Cas12)אדג'ן122186
פלסמיד pCpfl-sp (מערכת CRISPR-Cas12)אדג'ן122186 (מספר אביזר addgene)פלסמיד לבניית פלסמידים CRISPR-Cas המכילים מרווח (מערכת CRISPR-Cas12) למוטגנזה של פאג'ים (שלב 3.2)
כלי תגובת PCRסרשטדט72.991.002
פקגריןVWR732-3196
pET28a_NgTET מוצר פנימי.ללא קטלוג  מספרפלסמיד זמין על פי בקשה, ניתן למצוא את מפת הפלסמיד https://zenodo.org/records/10615143  הבאה;
pET28a_NgTET מוצר פנימי.ללא קטלוג  מספרפלסמיד לבניית DNA pET28a_NgTET_donor באמצעות שיבוט שער הזהב (שלב 3.1), פלסמיד  זמין על פי בקשה, ניתן למצוא את מפת הפלסמיד https://zenodo.org/records/10615143  הבאה;
צלחות פטריסרשטדט82.1473.00192 x 16 מ"מ עם מצלמות
פולימראז DNA Phusion תרמו פישר סיינטיפיק F-530XL2 U/&מיקרו; L
אשלגן פוספטסיגמא אולדריץ'7778-77-0מונובייסיק
ספק כוח אוניברסלי PowerPacביו ראד1645070
פרוטאינאז K קארל רות' 7528.1100 מ"ג/מ"ל
ערכת טיהור PCR מהירה קיאג'ן28506
פלואורמטר קוונטי, מערכת dsDNA של QuantiFluorפרומגהE2670
RNase A/T1 תרמו פישר סיינטיפיקEN0551מערבבים 2 מ"ג/מ"ל של RNase A 5000 U/mL של RNase T1 
Roti-Aqua P/C/I למיצוי DNA קארל רוטX985.1
נתרן אצטט סיגמא-אולדריץ'127-09-3
נתרן כלורי סיגמא-אולדריץ'7647-14-5
ערכת ריצוף קשירה SQK-LSK109אוקספורד ננופור טכנולוגיותללא קטלוג  מספרhttps://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109
מסנני Steritop, 0.22 ומיקרו; גודל נקבוביות MמיליפורS2GPT05RE250 מ"ל ו-500 מ"ל
סטרפטומיצין 50 מ"ג/ליטרקארל רוטHP66.1
סוכרוזNeoFroxx GmbH57-50-1לביולוגיה מולקולרית 
רוטור אלומיניום דלי מתנדנד בקמן קולטר מדעי החייםJS[1]24.15
T4 DNA Ligase 5 U/µ Lתרמו פישר סיינטיפיק EL0011
מאגר ליגאז T4 DNAתרמו פישר סיינטיפיק ב69
מבחנות, קיר כבד, ללא שולייםקרל הכט בע"מ42775054100 מ"מ x 18 מ"מ
מחזור תרמי, T100ביורד1861096
נוחות תרמו-מיקסראפנדורף5382000015
בסיס טריזמהסיגמא אולדריץ'77-86-1
וואטר באת', VWB2 VWR462-0557נפח 12 ליטר

מקורות

  1. Pozhydaieva, N., et al. Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications. PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).
  2. Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation. FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).
  3. Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. Bacteriophage applications for food production and processing. Viruses. 10 (4), 205(2018).
  4. Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels. Viruses. 14 (11), 2502(2022).
  5. Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics. Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).
  6. Vlot, M., et al. Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes. Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).
  7. Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9. ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).
  8. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), aad5147(2016).
  9. Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation. Science. 328 (5980), 916-919 (2010).
  10. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
  11. Shitrit, D., et al. Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages. ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).
  12. Dedrick, R. M., et al. Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).
  13. Marinelli, L. J., et al. BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes. PLoS One. 3 (12), e3957(2008).
  14. Adler, B. A., et al. Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing. Nat Microbiol. 7 (12), 1967-1979 (2022).
  15. Pozhydaieva, N., Höfer, K. Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis. Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).
  16. Ramírez Rojas, A. A., et al. DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs. ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).
  17. Lagerbäck, P., et al. Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates. Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).
  18. Lagerbäck, P., Carlson, K. Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis. J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).
  19. Shembrey, C., et al. Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision. Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).
  20. Molina Vargas, A. M., et al. New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity. Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).
  21. Shi, P., Wu, X. Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13. RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).
  22. Levin, B. R., et al. The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity. PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).
  23. Hershey, A. D., Chase, M. Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).
  24. Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI. J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NgTET DioxygenaseDNAGolden Gate CloningT4 Ecoli

מאמרים קשורים