הקמה והערכה של מודל עכברי המושרה על ידי תמצית מסיסה במים של קנדידה אלביקנס של דלקת עורקים כליליים הקשורה למחלת קוואסאקי

מחלת קוואסאקי (KD), סוג של תסמונת בלוטות הלימפה הריריות, היא מחלה אוטואימונית המופיעה בילדים מתחת לגיל 5 ומלווה בדלקת כלי דם חום ^1,2,3. מחקרים מצביעים על כך שקורסים לא מטופלים או טיפוליים העולים על 10 ימים של KD חמור נוטים לגרום לסיבוכים קרדיווסקולריים חמורים, בעיקר כולל מפרצת כלילית והיצרות עורקים כליליים ^4,5. קרע של מפרצת כלילית עלול להוביל להלם קרדיוגני או אפילו למוות פתאומי, שהוא הגורם העיקרי למחלות לב נרכשות בילדים ^6,7. למרות שהיישום של אימונוגלובולין תוך ורידי שיפר משמעותית את הפרוגנוזה, האטיולוגיה והפתוגנזה שלו נותרו לא ברורים, מה שמגביל את הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות ^8,9. לכן, הקמת מודלים של בעלי חיים שיכולים לדמות במדויק את המאפיינים של מחלות אנושיות הפכה לצורך דחוף במחקר הנוכחי.

נכון לעכשיו, מכשול מרכזי בחקר מחלת קוואסאקי הוא היעדר מודלים של בעלי חיים מאופיינים היטב המסכמים באופן מלא את הפתולוגיה של מחלות אנושיות. בין המודלים השונים שפותחו כעת, מודל וסקוליטיס המושרה על ידי תמצית דופן התא של לקטובצילוס קזאי (LCWE) הוא מערכת בוגרת יחסית, ומודל זה יכול לגרום לדלקת עורקים כליליים. הוא נמצא בשימוש נרחב לחקר המנגנון של חוסר ויסות חיסוני וציטוקינים ספציפיים בכלי דם דמויי KD^10,11. מודל דלקת כלי הדם המושרה על ידי תמצית מסיסה במים של קנדידה אלביקנס (CAWS) משך גם הוא תשומת לב רבה בשל הדמיון הגבוה שלו למאפיינים הפתולוגיים של מחלת קוואסאקי האנושית^12,13. לאחר אופטימיזציה ושיפור שיטתי על ידי צוותי מחקר מרובים, המודל המושרה על ידי CAWS התפתח לכלי חשוב לחקר מחלת קוואסאקי¹⁴. למרות ש-CAWS יכול לגרום לדלקת בעורקים הכליליים באמצעות הזרקה תוך-צפקית, יש לו מגבלות בכך שהוא אינו יכול לשחזר באופן מלא את התהליך הפתולוגי המדויק של דלקת כלי דם ב-KD אנושי. לדוגמה, לא נמצאו נויטרופילים בפתולוגיה המאוחרת של KD¹⁵ אנושי, אך חדירת נויטרופילים עדיין התרחשה במודל זה עד 16 שבועות לאחר הזרקת CAWS¹⁶. יתר על כן, מנגנון דלקת כלי הדם הנגרמת על ידי CAWS לא הובהר במלואו כיום, מה שמגביל את ההבנה והיישום המעמיק של מודל⁹. מחקר זה נועד לבסס מודל סטנדרטי של KD בבעלי חיים על ידי אופטימיזציה של פרוטוקול האינדוקציה של CAWS, הבהרת מנגנון המחלה והקלה על פיתוח טיפולים ממוקדים.

מחקר זה השתמש ב-CAWS כדי לבסס מודל בעלי חיים סטנדרטי יותר של מחלת קוואסאקי. באמצעות ניסויי אופטימיזציה שיטתיים של מינון, נקבע כי הזרקה תוך-צפקית של 8 מ"ג ביום במשך חמישה ימים רצופים היא משטר המתן האופטימלי. משטר זה יכול לגרום ביציבות לנגעים בעורקים הכליליים תוך שמירה על שיעור הישרדות גבוה בבעלי חיים. בנוסף, חקרנו עוד את התפקיד של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בהיווצרות פיברוזיס במהלך השלב הכרוני של KD, תוך התמקדות במנגנון האפשרי של ערוץ אניון תלוי מתח 1 (VDAC1), חלבון מפתח המווסת אפופטוזיס מיטוכונדריאלי, במהלך המעבר מדלקת לפיברוזיס¹⁷. ראוי לציין כי באמצעות ניתוח לוקליזציה משותפת של אוטופאגוזום/ליזוזום במחקר זה, נצפתה תפקוד אוטופגיה לא תקין במודל זה. מודל אופטימלי זה מספק כלי חשוב למחקר שיטתי של הפתוגנזה של נגעי עורקים כליליים במחלת קוואסאקי ולהערכת אסטרטגיות טיפול חדשות.

כל ניסויי המחקר הכוללים נתונים מבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים העממי מס' 1 של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג (KY-2024-250-01). הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת CAWS

1. חיסון קנדידה אלביקנס במרק דקסטרוז Sabouraud על פי הפרוטוקול שנקבע על ידי Duong et ^al.18. לאחר מכן, תרבית את המרק המחוסן באופן אנאירובי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות בתא אנאירובי אטום עם תערובת גז.
   הערה: כדי להבטיח את הסטריליות של מדיום התרבית, יש לשלוט בקפדנות על מצב התרבות האנאירובית ב-37 מעלות צלזיוס כדי למנוע זיהום על ידי חיידקים שונים.
2. יש לשטוף שוב ושוב עם מדיום מגביל C ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות במהירות סיבוב של 4.5 x גרם.
3. הוסף נפח שווה של אתנול נטול מים ותן לו לעמוד למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס.
4. צנטריפוגה ב-4.5 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט, הוסף נפח שווה של אתנול נטול מים למשקעים, והשאיר אותו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
5. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 50 מ"ל אצטון למשקעים, צנטריפוגה וייבשו את המשקעים. יש להמיס את המשקעים במי מלח סטריליים רגילים לשימוש מאוחר יותר.

2. בניית מודל עכברי של מחלת קוואסאקי

1. בחר שמונים עכברים זכרים C57BL/6 בדרגת SPF בגילאי 4-6 שבועות, ושכן אותם בתנאים מבוקרים עם גישה חופשית למזון ומים.
   הערה: כדי למזער את ההפרעה הפוטנציאלית של תנודות ברמת האסטרוגן על תגובות חיסוניות ודלקתיות, נעשה שימוש רק בעכברים זכרים במחקר ראשוני זה של הקמת מודל ואפיון¹⁹.
2. חלקו עכברים ל-4 קבוצות באופן שווה בשיטת טבלת מספרים אקראית, כולל 3 קבוצות הזרקת CAWS במינון שונה (4 מ"ג, 8 מ"ג, 12 מ"ג) וקבוצת ביקורת אחת עם מי מלח רגילים, עם 20 עכברים בכל קבוצה.
3. הכינו אבקת CAWS לשלושה ריכוזים של 40 מ"ג/מ"ל, 80 מ"ג/מ"ל ו-120 מ"ג/מ"ל באמצעות תמיסת מלח סטרילית רגילה (0.9% NaCl). הזריק לקבוצת הניסוי 0.1 מ"ל של CAWS בבוקר מהיום הראשון עד החמישי של הניסוי, ומתן נפח שווה של מי מלח רגילים לקבוצת הביקורת באותו לוח זמנים.
   הערה: הזרקה תוך צפקית בוצעה באמצעות מזרק אינסולין של 1 מ"ל. בעת הניתוח, מקם את העכבר עם ראשו למטה וזנבו גבוה יותר כדי למנוע נזק לאיברים כמו המעי הגס והמעי הדק בעת החדרת המזרק.
4. השתמש ביתרה אלקטרונית בשעה 9 בבוקר בכל יום כדי לשקול בו-זמנית את ההזנה שנותרה במזין ולחשב את צריכת המזון ל-24 שעות עבור כל כלוב עכברים.
5. בימים ה-3, ה-7, ה-14 וה-28 לאחר הזריקה האחרונה, בחרו והקריבו באופן אקראי 3 עכברים מכל קבוצה בכל נקודת זמן.
6. הניחו עכברים בתא סגור מלא מראש באוויר בחדר. הכנס CO₂ דחוס בקצב זרימה של 30% מנפח החדר לדקה. לאחר 5 דקות, בוצעה פריקת צוואר הרחם כדי לאשר את המוות.
7. אוספים ושוקלים דגימות לב. התבונן בנגעים דלקתיים של הלב וכלי הדם על ידי צביעת HE.

3. תקני צביעה ודירוג HE

1. הלב וקשת אבי העורקים (כ-3 מ"מ ×-3 מ"מ) בודדו במהירות. בצע סטרנוטומיה חציונית לפי השיטה המתוארת²⁰. הפרד במהירות את הלב מקשת אבי העורקים (כ -3 מ"מ × 3 מ"מ). הרקמות שנאספו קובעו בפורמלין ניטרלי של 10% למשך 24 שעות.
2. לאחר הקיבוע, יש לייבש את הרקמות באמצעות סדרת אתנול מדורגת (70% אתנול למשך שעה, 80% אתנול למשך שעה, 95% אתנול למשך שעה אחת ו-100% אתנול למשך שעה), לנקות בקסילן ולהטמיע בפרפין. לבסוף, חתכו את הבלוקים לפרוסות רציפות של 5 מיקרומטר.
3. לצביעה של H&E, יש להכתים את החלקים בהמטוקסילין למשך 5 דקות, לשטוף במים זורמים למשך 10 דקות, לצבוע עם אאוזין למשך 2 דקות, ולאחר מכן להמשיך בהתייבשות והרכבה²¹.
   הערה: על פי מידת הפגיעה האינטימית בכלי הדם, היא מסווגת לשלוש דרגות: דרגה I מאופיינת בעיקר בנפיחות אנדותל וצבירת נויטרופילים; דרגה II מתבטאת בניוון שרירים חלקים, חדירת תאים דלקתיים ונזק לאברונים; דרגה III מציגה נגעים חמורים כגון נמק אנדותל ונשירה, ותצהיר פיברין.

4. צביעת טריכרום מאסון

1. לאחר הקיבוע, יש לייבש את דגימות הרקמה באמצעות סדרת אתנול מדורגת, לנקות בקסילן ולהטמיע בפרפין.
2. לאחר הסרת שעווה, יש להרטיב את החלקים דרך סדרת אתנול מדורגת למים מזוקקים כהכנה לצביעה.
3. צבעו את הגרעינים בהמטוקסילין הברזל של וייגרט למשך 5 דקות, שטפו היטב תחת מים זורמים, ולאחר מכן צבעו את הציטופלזמה בפוקסין חומצה אדומה של ליצ'ון למשך 5 דקות.
4. יש להבדיל עם חומצה פוספומוליבדית 1% למשך דקה אחת, ולאחר מכן לצבוע ישירות את סיבי הקולגן בכחול אנילין למשך 3 דקות. יש לשטוף במהירות עם 1% חומצה אצטית קרחונית
   הערה: שלוט בקפדנות בתזמון שלב ההבחנה כדי להבטיח את ספציפיות הצביעה.
5. לאחר התייבשות עם אתנול וקסילן, שהופכים לשקופים, אטמו את הסרט הנייטרלי.
6. שוטפים את החלקים המוכתמים תחת מים זורמים כדי להסיר עודפי צבע.
7. ייבשו את החלקים באמצעות סדרת אתנול מדורגת, שקופה בקסילן, והרכיבו עם מסטיק ניטרלי.
8. התבונן בקטעים תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה עקבית. סיבי קולגן צריכים להופיע כחולים, סיבי שריר וציטופלזמה אדומים וגרעינים כחולים עמוקים.

5. צביעה אימונופלואורסצנטית

1. תקן קטעי תאים או רקמות, וחסום עם 5% BSA למשך שעה אחת כדי להפחית קשירה לא ספציפית.
2. השתמש בסרום רגיל מאותו מוצא מין כמו הנוגדן המשני, דלל אותו ב-PBS ביחס של 1:10 והפיל אותו על הדגימה. אוטמים אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר האיטום, יש לשטוף בעדינות פעמיים עם PBS.
3. דגרו את החלקים עם הנוגדן הראשוני למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה עם PBS, הוסיפו את הנוגדן המשני הפלואורסצנטי ודגרו בחושך למשך שעה.
4. צביעת הליבה ב-DAPI, איטום עם חומר הרכבה נגד מרווה והתבוננות במיקרוסקופיה קונפוקלית.

6. אימונוהיסטוכימיה

1. לאחר הסרת שעווה ולחות של קטעי פרפין, בצע תיקון אנטיגן וחסום את הפרוקסידאז האנדוגני.
2. דגירה של נוגדנים והתפתחות צבע: ראשית, יש לחסום עם סרום רגיל, לאחר מכן לדגור את הנוגדן הראשוני והנוגדן המשני המסומן ב-HRP ברצף, ולבסוף, פיתוח צבע DAB. שלוט במידת התגובה במיקרוסקופ.
3. צבעו מחדש את גרעיני התא בהמטוקסילין. לאחר התייבשות ושקיפות, אטמו את הלוחות והתבוננו באות החיובי החום-צהוב תחת מיקרוסקופ.
   הערה: הניסוי צריך להגדיר בקרות ולשלוט בקפדנות בתנאים לשיקום ופיתוח צבע.

7. זיהוי אוטוליזוזום

1. תרבית משותפת של מקרופאגים RAW264.7 עם נבגי קנדידה אלביקנס בפרופורציה מתאימה (10:1), ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 4 שעות, 8 שעות, 12 שעות, 16 שעות, 20 שעות, 24 שעות, 28 שעות, 32 שעות, 36 שעות, 40 שעות, 44 שעות ו-48 שעות כדי לבסס מודל פגוציטי.
2. שטפו שלוש פעמים עם PBS מקורר מראש כדי להסיר את הנבגים הלא פגוציטים.
3. ראשית, חסום את הדגימות עם 5% BSA למשך 30 דקות. לאחר מכן, דגרו ברציפות עם הנוגדן הראשוני כנגד LC3 (דילול של 1:200) בטמפרטורת החדר למשך שעה, ואחריו הנוגדן המשני המסומן על ידי Alexa Fluor 488 בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
4. הוסף בדיקת ליזוזום אדום Lyso-Tracker ישירות לתאים כדי לדמיין לוקליזציה ליזוזומלית. לבסוף, צבעו את הגרעינים עם DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 5 דקות.
   הערה: כל תהליך הפעולה צריך להתבצע בחושך כדי להבטיח שזמן הדגירה וריכוז הנוגדן נשלטים במדויק.

בתחילה, הערכנו באופן שיטתי את השינויים הפתולוגיים בשריר הלב הנגרמים על ידי מינונים שונים של CAWS בעכברים. לא נצפו מקרי מוות בקבוצת הביקורת PBS, בקבוצת ה-CAWS של 4 מ"ג ובקבוצת ה-CAWS של 8 מ"ג (n=20 בכל קבוצה). לעומת זאת, התגובה הדלקתית בקבוצת ה-4 מ"ג הייתה קלה ולא עמדה בדרישות המודל. שיעור התמותה היה גבוה יותר בקבוצת ה-CAWS של 12 מ"ג (9/20, 45%), ומקרי המוות התרחשו מהיום השלישי עד העשירי לאחר ההזרקה. ממצאים אלה מצביעים על כך שמינון של 12 מ"ג יכול לגרום לנזק דלקתי מקומי מוגזם ולרעילות מערכתית. לכן, מינון זה לא נכלל במחקרים הבאים. המינון של 8 מ"ג נבחר בסופו של דבר כמשטר המינון האופטימלי מכיוון שהוא יכול לגרום ביעילות לדלקת עורקים כלילית משמעותית תוך שמירה על שיעור הישרדות מקובל ומינימום תופעות לוואי מקומיות. (איור 1A). בסופו של דבר, נקבע כי הזרקה תוך צפקית של 8 מ"ג CAWS היא מינון הדוגמנות האופטימלי. תוצאות צביעת ה-HE של קבוצת הניסוי הראו תהליך דינמי טיפוסי של דלקת ופיברוזיס. ביום השלישי התרחשה הסננה דלקתית מוקדית, המורכבת בעיקר מנויטרופילים פרי-וסקולריים ומונוציטים. ביום השביעי, הטווח הדלקתי התרחב לאינטרסטיציום שריר הלב, מלווה בנפיחות משמעותית של תאי שריר הלב ובצקת אינטרסטיציאלית. ביום ה-14 הדלקת הגיעה לשיאה, והתרחשה הפרעה בסידור סיבי שריר הלב ונמק מוקדי. ביום ה-28, למרות שהדלקת הוקלה, נוצרה פיברוזיס מוקדם (איור 1B ואיור 2A). לעומת זאת, מבנה שריר הלב נשאר תקין בכל נקודות הזמן בקבוצת הביקורת. כל התוצאות אושרו באמצעות הערכה כפולת סמיות, שאימתה כי מינון של 8 מ"ג CAWS יכול לגרום ביציבות למודל פגיעה בשריר הלב התואם את המאפיינים של מחלת קוואסאקי.

לאחר מכן, נעשה שימוש בשיטת צביעת הטריקולור של מאסון כדי לחקור אם דלקת כלי דם דמוית מחלת קוואסאקי הנגרמת על ידי CAWS תגרום לפיברוזיס מתמשך סביב העורקים הכליליים (CA). תוצאות הניסוי הראו כי בקבוצת הזרקת CAWS של עכברים, התגלו משקעי סיבי קולגן ברורים סביב דפנות העורקים הכליליים המודלקים ואבי העורקים, ואזורים פיברוטיים אלה חפפו מאוד למיקומי התפוצה של חדירת תאים דלקתיים. לעומת זאת, עכברים בקבוצת הביקורת PBS הראו רק צביעת קולגן חלשה, שהייתה מוגבלת בטווח המבני הנורמלי של דופן כלי הדם (איור 2A). ניתוח כמותי הראה כי שקיעה משמעותית של סיבי קולגן התרחשה לאחר 14 יום, ומידת הפיברוזיס הייתה שונה סטטיסטית מזו של קבוצת הביקורת (איור 2C).

בהתחשב בכך שהשינוי הפתולוגי המרכזי במחלת קוואסאקי הוא התגובה החיסונית-דלקתית של דופן כלי הדם, הכוללת פעולה מתואמת של תאי חיסון מרובים22,23, לאחר מכן חקרנו את השינויים האופייניים למיקרו-סביבה החיסונית במודל CAWS באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית (IF). ביום ה-14 לאחר הזרקת CAWS, בוצעה צביעת IF של סמני תאי חיסון על רקמות הלב של עכברים שהוזרקו להם CAWS. תוצאות הניסוי הראו כי ביום ה-14 למידול עבור עכברים בקבוצת הטיפול ב-CAWS, החדירה של תאי CD3+ T, תאי T ציטוטוקסיים CD8+, מקרופאגים מסוג CD86+ M1, מקרופאגים F4/80+ ותאי הרג טבעיים NK1.1+ בעורקים הכליליים וברקמות שריר הלב גדלה באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת PBS (איור 2B,D). על ידי ניתוח שיטתי של שינויי הביטוי של סמנים חיסוניים אלה, הוא לא רק אימת שמודל CAWS יכול לדמות במדויק את המאפיינים האימונולוגיים של מחלת קוואסאקי אנושית, אלא חשוב מכך, הוא חשף את המנגנון האפשרי של תת-קבוצות שונות של תאים חיסוניים בהתרחשות והתפתחות המחלה, ומספק בסיס תיאורטי לפיתוח מאוחר יותר של אסטרטגיות התערבות חיסונית ממוקדות.

מחקרים קבעו כי תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא מנגנון מרכזי העומד בבסיס פיברוזיס בשריר הלב 24,25,26. ידוע כי תחת לחץ דלקתי, ערוץ אניון תלוי מתח 1 (VDAC1), חלבון קריטי לבקרת איכות מיטוכונדריאלית, יכול לעורר פתיחה לא תקינה של נקבוביות מעבר חדירות מיטוכונדריאלית (mPTP) כאשר ביטויו מווסת. זה, בתורו, גורם לאפופטוזיס ומפעיל פיברובלסטים 17,27. כדי לחקור מנגנון זה, הערכנו את ביטוי VDAC1 בשלב הכרוני באמצעות אימונוהיסטוכימיה. הממצאים שלנו גילו כי בהשוואה לקבוצת הביקורת PBS, ביטוי חלבון VDAC1 ברקמת שריר הלב של עכברים בקבוצה שטופלה ב-CAWS היה גבוה משמעותית 28 ימים לאחר המודלים (איור 3). אותות חיוביים היו ממוקמים בעיקר באזורים פיברוטיים וסביב כלי הדם, מה שמצביע על כך שתפקוד לקוי של המיטוכונדריה בתיווך VDAC1 עשוי לתרום לפיברוזיס בשריר הלב במודל מחלת קוואסאקי. נתונים אלה מספקים ראיות ניסיוניות לגבי המנגנונים המולקולריים של פגיעה בשריר הלב הנגרמת על ידי CAWS.

מחקרים קודמים מצאו כי תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בתיווך VDAC1 מעורב בתהליך פיברוזיס שריר הלב של מחלת קוואסאקי, אך המנגנון הספציפי שלו טרם הובהר. בהתחשב בכך ששמירה על הומאוסטזיס מיטוכונדריאלי תלויה בתפקוד התקין של המערכת האוטופגית-ליזוזומלית. אנו משערים כי VDAC1 עלול להחמיר פיברוזיס על ידי השפעה על היווצרותם או תפקודם של אוטופאגוליזוזומים, מה שמוביל להצטברות מיטוכונדריאלית חריגה. כדי לאמת השערה זו, הקמנו תחילה מודל זיהום נבגי קנדידה אלביקנס במקרופאגים (RAW264.7) (איור 4) וזיהינו את השינויים הדינמיים של זרימה אוטופאגית ופעילות ליזוזומלית במודל. תוצאות הניסוי מראות כי היווצרות ליזוזומים אוטופגיים עולה בשלב המוקדם (תוך 2-3 שעות לאחר הדבקה בתאים), בעוד שהזרימה האוטופאגית נחסמת בשלב מאוחר יותר (3-4 שעות לאחר הדבקה בתאים). ניתן להעריך את השינוי בזרימת האוטופגיה על ידי שינוי צביעת המיזוג לאחר לוקליזציה משותפת של אוטופאגוזום וליזוזום. תוצאה זו מאשרת כי תפקוד לקוי של אוטופאגוליזוזומים אכן יכול להוביל לפגיעה בפינוי התאים.

איור 1: ניתוח היסטופתולוגי של הלב והעורקים הכליליים. (A) עקומות הישרדות של עכברים שהוזרקו עם PBS או מינונים שונים של CAWS (4 מ"ג, 8 מ"ג ו-12 מ"ג; n = 20 לקבוצה). (B) הוצגו תוצאות צביעת HE של הלב בקבוצת הטיפול ב-CAWS (8 מ"ג) בנקודות זמן שונות (3 d, 7 d, 14 d, 28 d). פסי קנה מידה: 1500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ניתוח של פיברוזיס קולגן וחדירת תאי חיסון. (A) תוצאות צביעת מאסון של קבוצת CAWS 8 מ"ג וקבוצת הביקורת. סיבי קולגן מציגים צבע כחול אופייני, סיבי השריר והציטופלזמה אדומים, וגרעין התא כחול כהה. חיצים מצביעים על נבגי פטרייה. פסי קנה מידה: 1500 מיקרומטר. (B) תוצאות צביעה אימונופלואורסצנטיות של קבוצת CAWS 8 מ"ג וקבוצת הביקורת (CD3 מסומן CD3+ תאי T, CD8 מסומן CD8+ תאי T ציטוטוקסיים, CD86 מסומן CD86+ M1 מקרופאגים, F4/80 מסומן F4/80+ מקרופאגים, ו-NK1.1 מסומן NK1.1+ תאי הרג טבעיים). מוטות קנה מידה: 200 מיקרומטר. (C) להעריך את מידת הפיברוזיס הלבבי. מידת הפיברוזיס הלבבי הוערכה על סמך אחוז אזור הצביעה הטריכרומטי ברקמת הלב של שדה הראייה בהגדלה של פי 800. השיטה הספציפית היא כדלקמן: מכיוון שסיבי קולגן צבועים בירוק בוהק בצבעים אניונים מקרומולקולריים, נצפו 100 שדות ראייה בהגדלה של פי 800 (כל הפרוסות בעובי של 5 מיקרומטר), ומידת הפיברוזיס הלבבי נקבעה על פי אחוז השטח הירוק בשטח הכולל. ככל שהאחוז גבוה יותר, כך הפיברוזיס חמור יותר. (D) אחוז התאים החיסוניים נותח סטטיסטית בהתאם לתוצאות של צביעה אימונופלואורסצנטית,***p < 0.001. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ניתוח אימונוהיסטוכימי של ביטוי VDAC1 בקבוצת PBS וקבוצת CAWS ביום 28. (A) ניתוח אימונוהיסטוכימי של ביטוי VDAC1. סרגל קנה מידה: 800 מיקרומטר. חלקיקים שחורים חומים הם תוצאות חיוביות. (B) ניתוח סטטיסטי של אחוז התאים החיוביים מבחינה אימונוהיסטוכימית VDAC1, עמ ' < 0.001. (C) ניתוח סטטיסטי של ציון H של אימונוהיסטוכימיה VDAC1. הנתונים נגזרו ממספר שכפולים ביולוגיים (n = 20 עכברים לקבוצה), והתוצאות בוטאו כממוצע ± סטיית תקן ונותחו סטטיסטית (***p < 0.001). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: זיהוי של אוטוליזוזום אחרי פגוציטוזיס של קנדידה אלביקנס על ידי תאי RAW264.7 של עכבר. (A) חיצים מצביעים על נבגי פטרייה. פסי קנה מידה: 25 מיקרומטר. ניתן להעריך את השינוי בזרימת האוטופגיה על ידי שינוי צביעת המיזוג לאחר לוקליזציה משותפת של אוטופאגוזום וליזוזום. (ב) ניתוח מהלך זמן של קצב היווצרות האוטוליזוזום מכמת את הפרמטרים הרלוונטיים. התוצאות בוטאו כממוצע ± סטיית תקן ונותחו סטטיסטית (***p < 0.001). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין מה לחשוף.