ניתוח ספציפי לתת-סוג תא של פרוטאזום ממברנה עצבית בנוירונים סומטוסנסוריים

Summary

פרוטאזום הממברנה העצבית (NMP) זוהה לאחרונה בתת-קבוצה של נוירונים סומטוסנסוריים כמווסת מרכזי של תפיסת מגע, כאב וגירוד. מאמר זה מציג זרימת עבודה חזקה לניתוח ביטוי ותפקוד NMP ספציפי לסוג התא באמצעות מיון תאים, פרופיל טרנסקריפטום וניתוחים אימונו-פלואורסצנטיים מבוססי תרבית.

Abstract

איתות נוירונים חושיים תלוי בפרוטאזומים פונקציונליים, והלוקליזציה התת-תאית שלהם משפיעה על תפקודם. קומפלקס פרוטאזום מיוחד, פרוטאזום הממברנה העצבית (NMP), זוהה לאחרונה בתת-אוכלוסייה של נוירונים סומטוסנסוריים היקפיים. ה-NMP מתמקם אך ורק בקרום הפלזמה של הסומה ובאקסונים הפרוקסימליים והדיסטליים כאחד. ריצוף RNA של תא בודד (scRNA-seq) גילה כי בתנאים רגילים, ה-NMP מתבטא בעיקר בתאי עצב MrgprA3⁺ ו-Cysltr2⁺, המתווכים תחושות מכניות, גירוד וכאב. עיכוב NMP חריף וסלקטיבי בעור הכפות של עכברים הפחית את הרגישות המכנית והכאב מבלי להשפיע על התחושה התרמית. יש לציין כי בניגוד לעיכוב פרוטאזום גלובלי, עיכוב NMP סלקטיבי אינו גורם לנוירופתיה. מחקרי מבחנה מצביעים על כך שה-NMP מקל על תקשורת בין נוירונים לנוירונים, פוטנציאלית באמצעות שחרור פפטידי איתות, והוא חיוני לתגובות עצביות תקינות לגירוי. ממצאים אלה מזהים את ה-NMP כמווסת מרכזי של דיבור צולב של נוירונים חושיים הנדרש למגע, כאב ותחושת גירוד רגילה. לפיכך, התמ"מ מייצג יעד פוטנציאלי לטיפול בכאב. מאמר זה מציג שיטות לבידוד אוכלוסיות עצביות המבטאות NMP ואינן מבטאות NMP באמצעות הזנת נוגדנים ומיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS). אוכלוסיות אלו מתאימות לפרופיל ביטוי ספציפי לסוג התא באמצעות scRNA-seq או ניתוחים מבוססי תרבית של דינמיקת ביטוי NMP. יחד, שיטות אלו מספקות זרימת עבודה חזקה לחקירת דינמיקת ביטוי NMP ותרומתה למצבי מחלה רלוונטיים לכאב.

Introduction

תפקוד הפרוטאזום חיוני להתפתחות ותחזוקה מיטבית של מערכת העצבים ההיקפית (PNS)1,2,3,4,5,6. גם מחקרים במבחנה וגם במחקרי in vivo המשתמשים במעכבי פרוטאזום מדגימים כי פעילות פרוטאזומלית חיונית להתפתחות נוירולוגית, מיאלינציה, ריגוש ותפקוד תאי גליה 7,8,9,10. יתר על כן, כימותרפיה מבוססת מעכב פרוטאזום גורמת לנוירופתיות כואבות ב-30-60% מהחולים, המאופיינות לעתים קרובות בכאב כרוני ותחושה משתנה בגפיים 8,9,11,12,13. מעניין לציין כי מתן מינון נמוך של אותם מעכבים מפחית את הרגישות לגירויים כואבים, מה שמרמז על תפקיד מורכב לפרוטאזום בעיבוד החושי ^6,14,15. עם זאת, למרות מחקרים מקיפים אלה, התפקיד הספציפי של פרוטאזומים ב-PNS נותר לא מובן היטב.

פרוטאזומים הם מנגנון פירוק החלבון העיקרי בכל תחומי החיים והם חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס חלבון¹⁶. פרוטאזום הליבה 20S מורכב מארבע טבעות הפטמריות של תת-יחידות α, β, β, α ומתווך פירוק חלבון שאינו תלוי ביוביקוויטין^17,18. אסוציאציה עם חלקיקים רגולטוריים יוצרת את הפרוטאזום המכוסה 26S ו-30S, המתווך פירוק חלבון תלוי יוביקוויטין ^4,17. בנוירונים, זוהו פרוטאזומים בכל התאים, וידוע כי הלוקליזציה התת-תאית שלהם משפיעה על תפקוד¹⁹. עם זאת, מעכבי פרוטאזום נפוצים רבים חסרים ספציפיות כדי למקד באופן סלקטיבי אוכלוסיות פרוטאזום מקומיות דיפרנציאליות.

ואכן, באמצעות מעכבי פרוטאזום אטומים לממברנה ותיוג נוגדנים בתאים שאינם חדירים נמצא קומפלקס פרוטאזום ספציפי לנוירונים כמתמקם בקרום הפלזמה בתת-קבוצה של נוירונים סומטוסנסוריים²⁰. ניתוח scRNA-seq של נוירונים ראשוניים של גנגליון שורש גבי (DRG), שהופרדו לאוכלוסיות NMP^{+ ו-NMP} באמצעות הזנת נוגדנים כנגד תת-יחידת פרוטאזום ומיון FACS, הביא ל-20 אשכולות תאים נפרדים מבחינת שעתוק²⁰. ניתוח נוסף גילה שתאי NMP⁺ התקבצו רק ב-3 מתוך 20 האשכולות. באמצעות ערכות סמנים גנטיים עבור תת-סוגים נוירונים ספציפיים, זוהו 13 תת-סוגים שונים של נוירונים סומטוסנסוריים²⁰. רוב הנוירונים NMP⁺ התקבצו עם נוירונים חושיים MrgprA3⁺ ו-Cysltr2^{+ 20}. מספר מינימלי של תאי NMP⁺ התקבצו לאשכול שלישי, שבו לא זוהו קבוצות גנים ספציפיות, ולכן אשכול זה נותר ללא הקצאה^{של 20}. נוירונים MrgprA3⁺ ו-Cysltr2⁺ הם קולטני כאב מסוג C, רגישים לחום, גירויים מכניים וגרודוגניים, המתאימים לתת-סוגים עצביים CGRP-θ ו-SST, בהתאמה^21,22. מתוך 20 אשכולות התאים שזוהו, ^{7 אשכולות} NMP ביטאו סמנים גנטיים התואמים לתאים שאינם עצביים, כולל תאי שוואן, גליה לוויינית ותאי חיסון, וגם נותרו ללא הקצאה²⁰. אוכלוסיות תאים אלה היו צפויות, מכיוון שלא ניתן להפריד בין תאים שאינם עצביים לתאים עצביים במהלך תרבית נוירונים DRG²⁰.

בחקירת תפקידו, עיכוב במבחנה של ה-NMP שינה את הריגוש העצבי לגירוי KCl, היסטמין ו-αβ-methyleneadenosine 5'-triphosphate²⁰. in vivo, עיכוב NMP הפחית את הרגישות לגירויים מכניים וכאב ללא השפעות על התחושה התרמית²⁰. ממצאים אלה מגלים כי ה-NMP הוא מווסת מרכזי של תחושות מכניות, כאב וגירוד, ויעד טיפולי פוטנציאלי לניהול כאב²⁰. עם זאת, המנגנונים הספציפיים המקשרים בין פעילות NMP להתפתחות כאב בהקשרי מחלה שונים נותרו לא מובנים היטב. לכן, יש צורך בחקירה נוספת של דינמיקת ביטוי ותפקוד NMP במצבים הקשורים לכאב ונוירופתיה.

כאן, מאמר זה מתאר זרימת עבודה חזקה (איור 1) לזיהוי ובידוד אוכלוסיות עצביות NMP⁺ DRG. גישה זו מאפשרת חקירה ספציפית לסוג התא של דינמיקת ביטוי NMP באמצעות מיון FACS, scRNA-seq וצביעה חיסונית. גישות אלו מאפשרות ניתוח ברזולוציה גבוהה של ביטוי NMP באופן ספציפי לסוג התא, שניתן להשתמש בו כדי לחקור את תפקיד ה-NMP במצבים נורמליים ושונים הקשורים לכאב.

Protocol

כל השיטות שתוארו באמצעות חיות ניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת לויולה בשיקגו.

1. הכנת תמיסות עיכול, מדיית DRG ומדיה FACS

1. הכן תמיסת מלח מלאה (CSS) המכילה 137 מ"מ NaCl, 5.3 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl₂·6H₂O, 25 מ"מ סורביטול, 10 מ"מ HEPES ו-3 מ"מ CaCl₂·2H₂O. התאם את ה-pH ל-7.2 עם NaOH ועיקר מסנן.
2. הכן את תמיסת העבודה של תערובת אנזימי דיסוציאציה של רקמות (טריטורציה מתונה) על ידי שילוב של 190 מיקרוליטר מהמלאי (5 מ"ג/מ"ל ב-H₂O), 84 מיקרוליטר של 50 מ"מ EDTA ו-6.5 מ"ל של CSS. הכן טרי ועיקר פילטר לפני השימוש.
3. הכן תערובת אנזימים לדיסוציאציה של רקמות (טריטורציה נמוכה)-תמיסת פפאין המכילה 190 מיקרוליטר של תמיסת מלאי תערובת אנזימים, 150 מיקרוליטר פפאין, 84 מיקרוליטר של 50 מ"מ EDTA ו-6.5 מ"ל CSS. הכן טרי ועיקר פילטר לפני השימוש.
4. הכן תמיסת BSA/TI/DMEM על ידי שילוב של 7.5 מ"ג של מעכב טריפסין ו-7.5 מ"ג של BSA ב-5 מ"ל של מדיום DMEM/F12. מכינים טרי ומעקרים מסננים.
5. הכן את מדיית הנוירונים של DRG על ידי שילוב של 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% גלוטמין ו-2% תוסף B27 50x ב-430 מ"ל של DMEM/F12.
6. הכן מאגר FACS על ידי שילוב של 1% FBS, 1x PBS, 25 מ"מ HEPES ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין במים שעברו חיטוי. מכינים טרי ומעקרים מסננים.
7. עשרים וארבע שעות לפני תחילת הפרוטוקול, יש לצפות שני צינורות פוליסטירן עגולים בנפח 5 מ"ל על ידי מילויים במאגר FACS והנחתם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

2. הכנת תרחיף נוירונים DRG חד תאיים

1. קצור את כל ה-DRGs מ-4-6 עכברי P20-P23 לפי שיטות שתוארו קודם לכן^20,23.
2. העבירו את ה-DRGs לצינור חרוטי של 15 מ"ל והוסיפו 7 מ"ל של תמיסת עבודה של תערובת אנזימים לדיסוציאציה של רקמות (טריטורציה בינונית). דגירה בתסיסה עדינה (על ידי סיבוב) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
3. סובב את הגרעינים ב -120 × גרם למשך 2 דקות. הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה והשהה מחדש את הגרעינים ב-7 מ"ל של תערובת אנזימי דיסוציאציה של רקמות (טריטורציה נמוכה)-תמיסת עבודה פפאין. דגירה עם תסיסה עדינה (על ידי סיבוב) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
4. מסתובבים בחום של 120 × גרם למשך 2 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגרעינים ב-500 מיקרוליטר של תמיסת BSA/TI/DMEM.
5. שלש את הגרעינים פי 12-16 עם פיפטת פסטר מזכוכית מלוטשת אש של 1 מ"ל.
6. סנן פסולת תאית על ידי העברת תאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. שטפו את המסננת עם 1 מ"ל של תמיסת BSA/TI/DMEM כדי להבטיח איסוף של כל נוירוני DRG. העבירו את מתלה התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
7. סובב ב -120 × גרם למשך 2 דקות. הסר את ה-supernatant והשהה מחדש בעדינות את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיה DRG.
   הערה: זהו תרחיף הנוירונים DRG החד-תאיים.

3. הזנת נוגדנים לסימון נוירונים חיוביים ל-NMP

1. חלקו את תרחיף הנוירונים DRG לשני צינורות של 1.5 מ"ל, כל אחד מכיל 500 מיקרוליטר, וסמנו את שני הצינורות: "ראשוני" ו"לא ראשוני".
2. הוסף 20 מיקרוליטר של נוגדן אלפא 2 אלפא 2 (PSMA2) אנטי-פרוטאזום עיזים לצינור המסומן "ראשוני" (דילול 1:25).
   1. אופציונלי: כדי לבדוק את תקינות הממברנה והספציפיות של נוגדן PSMA2, כלול דגימה נוספת של DRGs ראשוניים שהודגרו עם שרשרת כבדה נגד נוירופילמנט עוף (NF-H) (1:1,000) ואחריה אנטי עוף (למשל, 488 מצומד) משני (1:250) (שלב 3.10).
      הערה: בקרת התיוג נגד NF-H לא אמורה לגרום לתיוג תאים אם הממברנה העצבית שלמה.
3. דגרו את התאים בתסיסה עדינה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
4. PBS מסונן חם, מעוקר 1x במהלך הדגירה הראשונית של נוגדנים.
5. צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורה של 200 × גרם למשך 2 דקות והסר 90% מהסופרנטנט (זרוק).
6. השעו מחדש את הנוירונים ב-500 מיקרוליטר של PBS 1x חם. דגרו את הצינורות בתסיסה עדינה למשך 3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
7. חזור על שלבים 3.5-3.6 בסך הכל שלוש כביסות.
8. בזמן ששלבי הכביסה מתבצעים, הכינו נוגדן משני על ידי דילול 4 מיקרוליטר של IgG נגד עזים (פלואורופור 555 ננומטר) ב-1,000 מיקרוליטר של מדיה DRG חמה (דילול 1:250).
9. לאחר השטיפה השלישית, השעו מחדש את הצינורות "הראשוניים" וה"לא ראשוניים" ב-500 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים המשנית.
   הערה: מנקודה זו ואילך, הגן על הצינורות מפני אור על ידי עטיפתם בנייר אלומיניום.
10. דגרו את הצינורות בתסיסה עדינה למשך 40 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
11. שטפו את התאים על ידי חזרה על שלבים 3.5-3.6 בסך הכל שלוש כביסות.
12. לאחר הכביסה השלישית, השעו מחדש נוירונים ב-300 מיקרוליטר של מאגר FACS. העבירו את התאים המרחפים כדי להפריד בין צינורות פוליסטירן עגולים בנפח 5 מ"ל והניחו על קרח בדלי קרח עם מכסה כדי להגן מפני אור.
13. הנח את הצינורות התחתונים העגולים שטופלו מראש המכילים מאגר FACS מהיום הקודם בדלי הקרח עם הצינורות המכילים את התאים והמשך לשלב המיון של FACS.

4. הפרדת נוירונים חיוביים ל-NMP (NMP⁺) ו-NMP שליליים (NMP^-) באמצעות מיון FACS

1. מיד לאחר הזנת נוגדנים ותיוג של נוירונים DRG, קח את התאים והצינורות המצופים לממיין FACS.
2. הוסף 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (1:1,000) הן לצינורות ה"ראשוניים" והן לצינורות ה"לא ראשוניים". דגירה במשך 10-30 דקות על קרח.
   הערה: 7-AAD משמש להוצאת תאים מתים מתהליך המיון.
3. הסר את מאגר ה-FACS מהצינורות שצופו למשך הלילה והחלף ב-1 מ"ל של מאגר FACS טרי. צינורות אלה משמשים כצינורות איסוף עבור תאי העצב הממוינים.
4. השתמש בשפופרת המסומנת "ללא ראשי" כדי להגדיר פרמטרים ושער עבור נוירונים ללא תווית.
5. החל שער פיזור קדימה (FSC) כדי לבודד תאים התואמים את גודלם של נוירונים חושיים. קוטר הנוירונים החושיים נע בין 10 ל-50 מיקרומטר.
6. החל שער פיזור צד (SSC) כדי לא לכלול תאים מתים ופסולת (פיזור צד תחתון) ולבודד אירועים התואמים את הגרעיניות של נוירוני DRG (פיזור צד גדול יותר).
7. טען את הצינור "הראשוני" והגדר פרמטרי שער כפי שנקבעו עם הדגימה "ללא ראשוני" כדי לזהות אוכלוסיות עצביות לא מסומנות (NMP^-) ו-555 חיוביות (NMP⁺).
8. בעזרת זרבובית של 100 מיקרומטר ולחץ מיון של 15-20 psi, מיין את הנוירונים ל-555^{+ ו-555-}.
9. המשך לניתוח במורד הזרם של נוירונים ממוינים.

5. ריצוף RNA חד-תאי של נוירונים NMP^{+ ו-NMP}

1. מעבירים את התאים הממוינים לצינורות של 1.5 מ"ל ומניחים על קרח. העבר את התאים לליבת ריצוף של תא יחיד.
2. בצע ריצוף RNA של תא בודד על הנוירונים הממוינים NMP⁺ ו^- NMP בעומק של 30,000 עד 100,000 קריאות לתא.
3. נתח את נתוני scRNA-seq באמצעות תוכנות שונות הזמינות בחינם כדי ליצור אשכולות תאים על פי פרופילי ביטוי גנים ספציפיים. לפרטים נוספים על שלבי הניתוח והתוכניות ששימשו בעבר, עיין ב-Villalón Landeros et ^al.20.
4. לבנות רשימה של סמני גנים ספציפיים כדי לזהות אוכלוסיות עצביות בודדות באמצעות מאגרי מידע זמינים כגון https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ או https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all
5. השתמש ברשימת סמני הגנים הספציפיים כדי לזהות את אשכולות התאים המתקבלים.
   הערה: ניתוח scRNA-seq שבוצע בעבר נערך על ידי חברת ייעוץ עצמאית (www.cmcherryconsulting.com).

6. תרביות ראשוניות של נוירונים מועשרים NMP^{+ ו-NMP}

1. יום לפני הניסוי, הניחו כיסויים עגולים בגודל 12 מ"מ בצלחת תרבית של 24 בארות (כיסוי אחד לבאר) ושטפו עם 70% אתנול למשך 15 דקות. לאחר מכן, יש לשטוף במים סטריליים פי 3 ולייבש באוויר בקולט אדים סטרילי לתרבית רקמות.
2. לאחר שהכיסויים יבשים, מצפים אותם ב-0.1 מ"ג/מ"ל פולי-L-ליזין הידרוברומיד (PLL) ומניחים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. ביום הניסוי יש להסיר את ה- PLL, לשטוף את הכיסויים במים סטריליים פי 3 ולאפשר להתייבש במכסה המנוע לתרבית רקמות.
   הערה: ניתן לשמור את ה-PLL ולעשות בו שימוש חוזר.
4. יש לדלל 10 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל למינין ב-125 מיקרוליטר של מדיית DRG ולאתר 20-30 מיקרוליטר במרכז כל כיסוי.
5. מצפים את הכיסויים בלמינין לפחות 40 דקות לפני השימוש.
6. העבירו את התאים הממוינים ב-FACS לצינור של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות לאיסוף תאים. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את תאי העצב ב-50 מיקרוליטר של מדיה DRG חמה.
7. שאפו למינין מהכיסוי והניחו לכיסוי להתייבש.
8. זרע 15-20 מיקרוליטר של נוירונים תלויים על כל כיסוי. העבירו בזהירות את הצלחת עם כיסויים זרעים לחממת תרבית רקמות ודגרו למשך 30 דקות לפחות (לא יותר משעה) כדי לאפשר לתאים להידבק.
9. העבר את הצלחת בחזרה למכסה המנוע של תרבית רקמות והוסף 1 מ"ל של מדיה DRG חמה סטרילית לכל באר המכילה תאים על כיסויים.
   הערה: הורד את קצה הפיפטה לפינה התחתונה של הבאר והוציא לאט כדי למנוע נגיעה בכיסוי ושיבוש התאים. הוספת מדיה מהירה מדי עלולה ליצור מערבולת ולעקור תאים.
10. שמור על תרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO_{, 2}/95% לחות עם 75% החלפת חומרי הדפסה כל 2-3 ימים.

7. ניתוח ביטוי NMP ספציפי לסוג התא

1. הכן צלחת תרבית 140 מ"מ או מגש צביעה אימונופלואורסצנטי על ידי ריפוד בחתיכת פרפילם גדולה.
2. בעזרת מלקחיים סטריליים 5/45, העבירו את הכיסויים מצלחת תרבית הרקמה לפרפילם על מגש הצביעה, וודאו שהצד המכיל את נוירוני ה-DRG פונה כלפי מעלה.
3. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיית DRG לכל כיסוי על הפרפילם כדי למנוע מהתאים להתייבש.
   הערה: הוסף נוזלים על ידי פיפטינג איטי ממש מעל קצה הכיסוי.
4. יש לדלל את הנוגדן העיקרי נגד PSMA2 במצע DRG חם בדילול של 1:20.
5. בעזרת שואב המצויד בקצה לא מסונן, הסר את המדיה מהחלקה לאט על ידי שאיבה מהקצה. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים נגד PSMA2 לעיזים לכיסויים ודגר בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות.
6. שאפו בזהירות את תמיסת הנוגדנים העיקרית מהכיסויים. מוסיפים 100 מיקרוליטר PBS (בטמפרטורת החדר) ודוגרים למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר לכביסה.
7. שאפו PBS מהכיסוי וחזרו על ההוספה והשאיפה של PBS בסך הכל שלוש כביסות.
8. הכן נוגדן משני נגד עזים (למשל, 555 מצומד) במצע DRG חם בדילול של 1:250.
9. לאחר השטיפה השלישית, הוסף 100 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המדולל לכיסוי ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות.
   הערה: משלב זה ואילך, הגן על התאים מפני אור.
10. שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית מהכיסוי ושטפו פי 3 כמתואר בשלבים 7.6-7.7.
11. הסר את שטיפת ה-PBS האחרונה ותקן את התאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסה מקבעת המכילה 4% פרפורמלדהיד (PFA), 4% סוכרוז ב-1x PBS. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
12. שאפו קיבוע ושטפו פי 3 על ידי חזרה על שלבים 7.6-7.7.
13. לחדור לתאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 0.1% חומר ניקוי לא יוני (למשל, Triton X-100) ב-1x PBS ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
14. שאפו תמיסה חדירה ושטפו פי 3 על ידי חזרה על שלבים 7.6-7.7.
15. יש להוסיף 100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה המורכבת מ-5% FBS, 5% סרום חמור ב-1x PBS ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות.
16. הכינו תערובת נוגדנים ראשונית ספציפית לתאי נוירון DRG בהתאם לדילולים הבאים בתמיסת החסימה: פפטיד הקשור לגן אנטי-קלציטונין של ארנב (CGRP) (1:500); איזולקטין B4, מצומד ביוטין (IB4) (1:50); עוף נגד NF-H (1:1000).
    הערה: נוגדנים אלה אינם מפריעים זה לזה וניתן להוסיף אותם יחד באותה תמיסה.
17. הסר את תמיסת החסימה והוסף את תערובת הנוגדנים העיקרית לכיסוי. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
18. הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף 3 פעמים על ידי חזרה על שלבים 7.6-7.7.
19. הכן תמיסת תערובת נוגדנים משנית על ידי דילול סטרפטווידין (למשל, 647 מצומד), חמור נגד ארנב (למשל, 488 מצומד) וחמור נגד עוף (למשל, 405 מצומד) עד 1:500 כל אחד.
20. הסר את שטיפת ה-PBS האחרונה והוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית לכיסויים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
21. שטפו 3x על ידי חזרה על שלבים 7.6-7.7.
22. אופציונלי: הכינו כתם גרעיני בטמפרטורה של 1-10 מיקרוגרם/מ"ל. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת כתם גרעיני, דגירה למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר ושטוף פי 2 במים נטולי יונים (diH₂O) על ידי חזרה על שלבים 7.6-7.7.
23. שאפו את השטיפה האחרונה מהכיסוי ובעזרת מלקחיים עדינים הרם את הכיסוי מהפרפילם. נקה את עודפי הנוזל על ידי נגיעה עדינה בקצה הכיסויהחלקה על רקמה נטולת מוך.
24. הנח טיפה של 7 מיקרוליטר של מדיום הרכבה על שקופית מיקרוסקופ. הנח בעדינות את הכיסוי מעל טיפת אמצעי ההרכבה, וודא שהתאים פונים כלפי מטה ונמצאים במגע עם המדיום.
25. הנח את שקופיות המיקרוסקופ עם כיסויים במגירה או קופסה חשוכה ויבשה למשך שעה אחת לפחות לייבוש ואטום את קצה הכיסוי. סיים לאטום את קצה הכיסויים עם לק המתייבש במהירות והמתן 10-15 דקות לפני ההדמיה.
26. שקופיות תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי או דיסק מסתובב המצויד במסנני אור מתאימים כדי להמחיש פלואורסצנטיות כחולה, ירוקה, אדומה ואדומה רחוקה.

Results

היכולת להבחין בין NMP לפרוטאזומים תוך-תאיים מסתמכת על גישות תיוג אטומות לממברנה. הזנת נוגדנים מאפשרת שימוש בנוגדנים ספציפיים לתת-יחידה של פרוטאזום על נוירונים חיים כדי לסמן פרוטאזומים הנגישים רק מהחלק החיצוני של התא. בשל גודלם והידרופיליותם, נוגדנים אינם מסוגלים לחצות ממברנות תאים שלמות²⁴. נוירונים חיים שומרים על שלמות הממברנה, ומונעים מנוגדנים להיכנס לתא. באמצעות הגישה הזו אפשר לתייג באופן אמין את התמ"מ ולהבחין בין תאי עצב שמבטאים אותו (^+NMP) לבין אלה ש...

Discussion

פרוטאזומים חיוניים בכל התאים וניתן למצוא אותם בכל התאים ברחבי התא¹⁹. הגילוי האחרון של קומפלקס פרוטאזום מיוחד, ה-NMP, בתאי עצב של מערכת העצבים המרכזית ^{25,26,27 ו-20} ההיקפית שינה את ההבנה הנוכחית שלנו לגבי תפקודם של פרוטאזומים. עבודות קודמות הראו כי ה-NMP מתפקד כפרוטאזום איתות המתווך דיבור צולב בין נוירונים חושיים כדי לווסת את הרגישות לתחושות מכניות,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
תמיסת חיץ HEPES 1 M, pH 7.3	ביולוגי איכותי	118-089-721	מאגר FACS
10x PBS	תרמו פישר סיינטיפיק	70011-044	מאגר FACS
תמיסת מלאי של 16% פרפורמלדהיד (PFA); דרגת EM	EMS	15710	פתרון מקבע
1x תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS)	פישר סיינטיפיק	10-010-023	שטיפות FACS
צינור תחתון עגול פוליסטירן 5 מ"ל	פישר סיינטיפיק	14-959-6	צינורות FACS
7-אמינואקטינומיצין D (7-AAD)	Invitrogen	A1310	מסמן תאים מתים
תוסף B27	תרמו פישר סיינטיפיק	17504044	מדיום תרבות
אלבומין סרום בקר	מיליפורסיגמא	A9647; CAS: 9048-46-8	BSA/TI/DMEM
סידן כלוריד דיהידראט (CaCl?-2H? O)	מיליפורסיגמא	C7902	תמיסת מלח מלאה
שרשרת כבדה נגד נוירופילמנט עוף (NF-H)	מיליפורסיגמא	AB5539	נוגדן
DMEM/F12 1:1	תרמו פישר סיינטיפיק	11320033	מדיום תרבות; BSA/TI/DMEM
חמור נגד עזים IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 555	תרמו פישר סיינטיפיק	א32816	נוגדן
חמור נגד ארנב IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 488	תרמו פישר סיינטיפיק	א32790	נוגדן
DyLight 405 חמור נגד עוף	ג'קסון אימונוסקר	703-475-155	נוגדן
EDTA	מיליפורסיגמא	E5134; CAS: 6381-92-6	פתרונות עבודה של Liberase TM/Liberase TL-papain
סרום בקר עוברי (FBS)	מיליפורסיגמא	א9647	מדיום תרבית/מאגר FACS/פתרון חסימה
פיפטת פסטר מזכוכית, 9 אינץ'	פישר סיינטיפיק	1367820ד	טיטרוציה
עז נגד PSMA2	תוצרת הבית	נה	נוגדן
אבקת HEPES	מיליפורסיגמא	H4034	תמיסת מלח מלאה
הוכסט	תרמו פישר סיינטיפיק	H21492	כתם גרעיני
סרום לסוסים	תרמו פישר סיינטיפיק	26050070	פתרון חסימה
IB4, מצומד ביוטין	מיליפורסיגמא	L2140	נוגדן
למינין	סיגמא-אולדריץ'	L2020-1MG	צלחת תרבות
ל-גלוטמין	תרמו פישר סיינטיפיק	25030081	מדיום תרבות
טריטורציה ליברלית נמוכה (TL)	מיליפורסיגמא	54010200001	פתרון מלאי Liberase TL
ליבראז טריטורציה בינונית (TM)	מיליפורסיגמא	5401119001	פתרון מלאי Liberase TM
מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl?-6H? O)	מיליפורסיגמא	M2393	תמיסת מלח מלאה
מדיית הרכבה	סאות'רן ביוטק	0100-01	פלואורומאונט - G
פפאין	וורטינגטון	קט#: 9001-73-4	פתרון עבודה של Liberase TL-papain
פניצילין/סטרפטומיצין	מיליפורסיגמא	15140122	מדיום תרבית/מאגר FACS
פולי-ליזין הידרוברומיד (PLL)	מיליפורסיגמא	עמ' 4707	צלחת תרבות
אשלגן כלורי (KCl)	מיליפורסיגמא	עמ' 5405	תמיסת מלח מלאה
ארנב נגד CGRP	אימונוסטאר	24112	נוגדן
נתרן כלורי (NaCl)	מיליפורסיגמא	S9888; CAS: 7647-14-5	תמיסת מלח מלאה
סורביטול	מיליפורסיגמא	56755-מ	תמיסת מלח מלאה
סטרפטווידין אלקסה פלואור 647 מצומד	תרמו פישר סיינטיפיק	S21374	נוגדן
סוכרוז	סיגמא-אולדריץ'	S0389-500G	פתרון מקבע
מעכב טריפסין	מיליפורסיגמא	T9253; CAS: 9035-91-8	BSA/TI/DMEM