מאמר שיטה

מידול תיקון דיספלסטי ותפקודי של מכתשית ריאות לאחר זיהום בשפעת

898 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69062

⸱

19 בספטמבר 2025

 ,  ,  , 
1Cancer and Developmental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק הוראות למתן תוך-אף של IAV וניתוח במורד הזרם של נזק לריאות עכברים ושינויים שעתוק נלווים לסוגי תאי ריאה.

תקציר

זיהום ויראלי גורם לנזק חריף וארוך טווח למכתשית הריאה, מבנה הרקמה המיוחד האחראי על חילופי גזים בין מערכת הלב וכלי הדם לסביבה החיצונית. זיהום בנגיף שפעת A (IAV) בעכברים מייצג מודל תרגומי לתגובת הריאה האנושית לזיהום נגיפי וגורם לשינויים חולפים ומתמשכים במצב התא במכתשית. במקרים מסוימים, מצבי תאים חריגים הנגרמים על ידי פגיעה ויראלית שאינם נפתרים לאורך זמן עלולים לפגוע לצמיתות בתפקוד חילופי הגזים הקריטי של הריאה. מאמר זה מדגים שיטות להדבקה תוך-אפית של עכברים עם A/PR/8/34 IAV ואפיון שינויים חולפים וארוכי טווח בהרכב התאים ובמבנה הרקמות של ריאות פגועות. מודל זה מאפשר חקירה מפורטת של המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס תיקון הריאות ותפקוד לקוי כרוני. גישה זו מציעה גם פלטפורמה להערכת התערבויות טיפוליות שמטרתן לקדם התחדשות ריאות יעילה ושיקום תפקוד הנשימה לאחר פגיעה ויראלית.

מבוא

הריאות ממלאות תפקיד מכריע באספקת חמצן וחומרים מזינים לרקמות מקומיות. תאי אנדותל (ECs) המאכלסים כלי דם נימיים קטנים של הריאות חיוניים לתפקוד תקין של רקמת הריאה, שמירה על שלמות כלי הדם וחילופי גזים יעילים1. ECs יוצרים את נישת כלי הדם ומדברים הדדית עם תאים אחרים כגון תאי אפיתל, תאי חיסון ותאים מזנכימליים. זה תורם לוויסות התפתחות הריאות ותיקון רקמות בתגובה לפציעה או מחלה2.

זיהום בנגיף שפעת H1N1 A הוא בעיה עולמית3. חולים עם זיהום H1N1 מאובחנים לעתים קרובות עם נזק אלבאולרי מפושט (DAD)4. זיהום ב-H1N1 יכול להוביל לנזק חמור לריאות ולהשלכות חמורות, כולל דלקת ריאות, פגיעה ריאתית חריפה חמורה (ALI) ותסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS)5. הנזק נובע בעיקר מהנגיף שמדביק את תאי האפיתל של הריאות, מה שגורם לתגובה חיסונית מוגזמת וכתוצאה מכך לדלקת, נזק לרקמות והצטברות נוזלים בריאות. תאי האפיתל המצפים את דרכי הנשימה והנאדיות, האחראים על חילופי הגזים, נפגעים אפוא ישירות מנגיף H1N1, מה שמוביל לשיבוש המבנה התקין של הריאה 6,7. התברר שסוגי תאים אחרים, למרות שאינם נגועים ישירות ב-IAV, יכולים להינזק בתגובה לזיהום 8,9. נזק לרקמות לאחר זיהום בשפעת, אם כן, משפיע על כל התאים של הריאה, ולאחרונה הוכח כי זיהום IAV גורם לשינויים חולפים ומתמשכים במצב התא במספר תאים9. פלסטיות תאים זו בתגובה למחלה יכולה להועיל או להזיק לתיקון רקמות מוצלח ומצדיקה מחקר נוסף.

המודל הניסיוני המאומץ ביותר לחקר שפעת והפתוגנזה שלה הוא זיהום תוך-אף של עכברים בנגיף השפעת A/PR/8/3410. זוהי טכניקה חשובה המאפשרת לחקור את חומרת המחלה, התמותה והזיהום הנגיפי. זיהום תוך-אף של עכברים מחקה את מסלול ההדבקה הטבעי בבני אדם ומאפשר לחקור תגובות חיסוניות נרכשות ומולדות כנגד הנגיף. בשנת 1934, זן ספציפי של נגיף השפעת A "A/PR/8/34" בודד מחולה בפוארטו ריקו11. זן זה של נגיף השפעת הותאם כעת לעכברים וכבר אינו מדביק בני אדם באופן פרודוקטיבי. בגלל הדמיון במערכת החיסון של עכברים ובני אדם, עכברים הם מודל החיות הפופולרי ביותר למחקר IAV12. בשיטה זו, זן A/PR/8/34 H1N1 ניתן ישירות לעכברים דרך הנחיריים, ומחקה זיהום טבעי13. זוהי שיטה קלה, חסכונית ונוחה לחקור את ההשפעות של זיהום ויראלי על רקמת הריאה המארחת בתנאי פרא (WT) כמו גם נוקאאוט (KO). לטכניקות אלטרנטיביות יש יתרונות וחסרונות בהשוואה למודל התוך-אף. חיסון תוך-קנה (IT) מאפשר העברה מדויקת של הנגיף לריאות, אך טכניקה זו אינה מחקה באופן מלא זיהום בשאיפה ואינה מספקת מידע על רעילות בדרכי הנשימה העליונות. חיסון IT דורש גם מיומנות רבה כדי להפחית את הסיכון לפגיעה בקנה הנשימה13,14. חיסון בשאיפת אירוסול (AR) מחקה את המסלול הטבעי של ההדבקה ויוצר פתולוגיה ריאתית אחידה יותר בהשוואה לזיהום תוך-אף, אך יכול להיות קשה לשמור על ריכוז אחיד של הנגיף בתרסיס ולהשיג אספקה מדויקת של תרסיס נגיפי. בטיחות היא גם דאגה חשובה בשיטת החיסון AR10. לכן, טכניקת החיסון התוך-אף של מתן IAV היא גישה חיונית למחקר ממוקד ריאות על ההשפעות במורד הזרם של זיהום ויראלי בפגיעה ותיקון רקמות. בניגוד למודלים כימיים או מכניים, הוא מספק דרך מציאותית יותר ופחות פולשנית לחקור נזק לריאות הנגרם על ידי שפעת ואינטראקציות מארח-פתוגן.

כאן, אנו מקימים שיטה ניתנת לשחזור לזיהום תוך-אף של עכברים בנגיף שפעת A (A/PR/8/34) ולאפיון השינויים התאיים והמבניים לטווח הקצר והארוך במכתשית הריאה הנובעים מפגיעה ויראלית. מחקרים המשתמשים בשיטה זו יכולים לסייע בגילוי מנגנונים של נזק ותיקון רקמות ריאה לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות למחלות ריאה.

פרוטוקול

עבודה עם נגיף שפעת A במודל של בעלי חיים נחשבת לרמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) ורמת בטיחות ביולוגית של בעלי חיים 2 (ABSL2). כל ההליכים בבעלי חיים ששימשו להפקת נתונים אלה אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות (פרוטוקול #24-452). פרוטוקול זה מאושר גם על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית של המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות. לפני תחילת פרוטוקול זה, מומלץ למשתמשים לבקש אישור מהוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים וועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית.

1. הכנת מלאי עבודה

הערה: כל העבודה עם נגיף השפעת צריכה להתבצע על קרח בארון בטיחות ביולוגית. יש להוציא טיפים וכל דבר אחר שנוגע בנגיף לתוך מיכל של 10% אקונומיקה. יש לרסס דליי קרח, פיפטות וקופסאות טיפים בתמיסת אקונומיקה של 10% ולא לטבול. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. השלך פסולת מוצקה למיכל פסולת ביולוגית והשליך פסולת נוזלית בכיור, שטוף במים.

  1. הפשירו מלאי קפוא (0.5 מ"ל) של וירוס על קרח בארון בטיחות ביולוגית.
  2. הקימו מיכל פסולת המכיל 10% אקונומיקה במי ברז. הנח שתי קופסאות מקפיא מפלסטיק או קרטון שיכולות להכיל עד 100 צינורות דגימה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס לצינון מראש.
  3. סמן מראש 160 שפופרות של 1.5 מ"ל עבור ציטוטים של נגיף. צינורות עם הברגה עדיפים על צינורות עם מכסה הפוך כדי למנוע יצירת אירוסולים בעת פתיחת צינורות מלאי ויראליים לשימוש. הניחו את השפופרות על קרח כדי לקרר מראש לפני שתכינו את הנגיף.
  4. הכינו 3 מיקרוליטר של וירוס באמצעות פיפטה מכוילת P20 וקצוות, הכניסו את הנגיף רק לצינורות מקוררים מראש ושמרו את האליקוטים על הקרח כל הזמן.
  5. לאחר הכנת ציטוטים, אחסן אותם בקופסת מקפיא מקוררת מראש עם הכיתוב "A/PR/8/34 Influenza Virus (IAV)", המספר הקטלוגי, מספר האצווה ותאריך התפוגה.
    הערה: להמון וירוסים שונים יש יכולת הדבקה שונה ואין לערבב ביניהם.
  6. מניחים את הקופסה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. הקפידו לשמור על הכל קר ככל האפשר, מכיוון שהטיטר הנגיפי יקטן עם כל מחזור הקפאה/הפשרה.

2. דילול אליקוטים של הנגיף לשימוש בניסויים בזיהום תוך-אף

  1. הפשירו כמות אחת של 3 מיקרוליטר של מלאי ויראלי על קרח בארון הבטיחות הביולוגית.
  2. בצע דילול של 1:100 (דילול A) על ידי העברת 2 מיקרוליטר מתוך 3 מיקרוליטר לצינור מקורר מראש של 1.5 מ"ל המכיל 198 מיקרוליטר של D-PBS קר.
  3. המשך לדלל את המלאי הנגיפי עד שהוא מגיע לריכוז המתאים ל-0.5-1 LD50 ברקע הזן של עכברים בשימוש. שמור הכל על קרח והשתמש בצינורות מקוררים מראש כדי למנוע התחממות יתר של הנגיף.
    הערה: לדוגמה, עבור VR-95PQ, אצווה 70063082, הדביקו עכברים בנגיף CEID50/μL של 12,600 עד 31,500 (בקנה מידה לפי משקל גוף) בדילול של 1:500,000.
  4. מדילול A (1:100), בצע דילול של 1:50,000 (דילול B) על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של דילול A ל-4990 מיקרוליטר של D-PBS קר בשפופרת מקוררת מראש של 15 מ"ל. מערבבים היטב על ידי פיפטה למעלה ולמטה באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל.
  5. מדילול B, בצע דילול של 1:500,000 (דילול C) על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של דילול B ל-1.8 מ"ל של D-PBS בצינור מקורר מראש של 5 מ"ל. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
    הערה: כדי לקבוע את הדילול האידיאלי של הנגיף שישמש להדבקת בעלי החיים בעת רכישת אצווה חדשה, ניתן להעריך באמצעות טיטר הנגיף המצוין בגיליון המוצר והתאמת הדילול על סמך הטיטר של האצווה הקודמת. הדרך הטובה ביותר לקבוע את הדילול האידיאלי היא לטיטר באופן אמפירי את מנת הנגיף החדשה באמצעות עכברי C57BL/6 מסוג בר. תכננו מגוון של דילולים המשתרעים על פני 1:50,000 עד 1:500,000 והזמינו 1-2 כלובים של עכברי נקבות C57BL/6 בכל דילול לבדיקה. להדביק עכברים בריכוזים שונים ולעקוב אחר הירידה במשקל שלהם. כדי לבדוק טיטרים ויראליים, המחקר מציע להשתמש רק בעכברים נקבות כדי להפחית את השונות שעלולה להיגרם על ידי הבדלי מין או משקל בין עכברים. עכברים נקבות לעיתים קרובות חולים יותר מעכברים זכרים, אולי בגלל גודלם הקטן יותר, או בגלל הבדלים ספציפיים למין בתגובה לזיהום בשפעת, כפי שקורה בצורות אחרות של פגיעה ריאתית בעכברים15. למרות שזה לא נחקר בפירוט, עכברים נקבות שימשו בניסויי הטיטר מכיוון שאם הטיטר נקבע באמצעות עכברים זכרים, עכברים נקבות עלולות למות במינון שנקבע. עם זאת, נמצא כי עכברים זכרים חולים במידה ניכרת ויש להם פגיעות ריאות ניכרות כאשר הם נגועים בטיטר ויראלי, שנקבע באמצעות עכברים נקבות בלבד. דילול אידיאלי אם משתמשים בעכברים בעלי רקע מעורב או עכברים שנולדו יהיה "1 LD50", הדילול שבו 50% מעכברי C57BL/6 מסוג בר מתים. עכברים שנולדו עמידים יותר לזיהום16 וייפצעו ויתאוששו היטב בדילול זה. אם העכברים לניסוי יהיו על רקע C57BL/6 מולד, המינון האידיאלי יהיה מחצית מ-"0.5 LD50" זה. מאחר שמטרת הניסויים האלה היא לחקור פציעה ותיקון, אידיאלי להגדיר מינון שבו עכברים חולים ומאבדים 20-25% ממשקל גופם, אולם רוב העכברים מתאוששים בסופו של דבר (איור 1). אם כל העכברים במחקר הם בערך באותו משקל (~25 גרם), ניתן לתת את נגיף השפעת ב-50 מיקרוליטר מהדילול המתאים לכל עכבר. עם זאת, משקל העכברים נע בין 15-35 גרם. לכן, יש לתת 2 מיקרוליטר של דילול ויראלי לכל גרם של משקל גוף (לדוגמה, עכבר של 15 גרם יקבל שפעת של 30 מיקרוליטר, בעוד שעכבר של 35 גרם יקבל 70 מיקרוליטר). התוצאה היא רמה עקבית יותר של זיהום ונזק לרקמות בקרב בעלי חיים בגדלים שונים. מידע זה נחוץ כדי לתכנן את נפח הדילול C.

3. הובלת חומרים נגיפיים למתקנים לבעלי חיים

  1. הנח את הצינור של 5 מ"ל עם הדילול הנגיפי הסופי לתוך הקרח וסמן את המיכל במדבקת סכנה ביולוגית. מרפדים קופסת מנשא דוגמאות מפלסטיק במגבות נייר כדי לספוג שפיכות אפשריות.
  2. הניחו את החומרים הדרושים לזיהום תוך-אף בתוך הקופסה המסומנת בסכנה ביולוגית: פיפטה P200, קופסה לא פתוחה של קצות פיפטות P200 מסוננות, עט וצינור חרוטי של 50 מ"ל מלא באקונומיקה טרייה של 10% לפסולת ויראלית. כבקרת זיהום, מלאו שפופרת של 1.5 מ"ל באותו D-PBS קר המשמש לדילול ה-IAV.

4. מתן IAV לעכברים

הערה: עבודה עם נגיף השפעת במתקן לבעלי חיים דורשת מתקן ברמת בטיחות ABSL2. ציוד הגנה אישי סטנדרטי כולל קרצוף, מעיל מעבדה חד פעמי, שני מצנפות שיער, כפפות ניטריל כפולות, כיסויי נעליים כפולים, משקפי מגן (משקפי בטיחות) ומסכה. יש לשמור על נגיף השפעת המדולל על הקרח לאורך כל פרוטוקול המתן כדי למנוע אובדן הדבקה.

  1. כל העבודה עם וירוסים חייבת להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. למרות שנגיף השפעת A/PR/8/34 הוא זן מותאם לעכברים, נגיפי השפעת מועדים למוטציות, ולכן מתייחסים לנגיף כאילו הוא עלול להדביק בני אדם.
  2. יש לתת הרדמה איזופלורן לבעלי חיים בזה אחר זה בקצב זרימה של 2.5-3% במכונת האידוי. העבר בעלי חיים מקופסת הרדמה לקונוס אף לפני מתן שפעת.
  3. כאשר עכבר נמצא תחת הרדמה, בדוק את נשימתו ובצע צביטה בבוהן כדי לראות אם הוא מגיב. עכברים מוכנים להידבק ב-IAV כאשר הם מגיבים לצביטה בבוהן בעווית קטנה או "קפיצה" - אך לא אם הם ערים מספיק כדי להזיז את ראשם.
  4. בעזרת פיפטה P200 המוגדרת ל-50 מיקרוליטר (או 2 מיקרוליטר/גרם משקל גוף; ראה הערה להלן שלב 2.5), שאפו IAV מדולל (או בקרת PBS) מהבקבוקון על קרח והניחו את הפיפטה על קופסת הקצה או מגבת הנייר שבה הקצה לא ייגע בכפפות או במשטח ארון הבטיחות הביולוגית.
  5. הרם את העכבר המורדם על-ידי קשקוש והחזק את העכבר עם הפנים זקוף בזווית של 45°. קשקש את העכבר מספיק חזק כדי שקנה הנשימה יהיה מוארך לשאיפה טובה יותר, אך לא כל כך חזק עד שהנשימה נחסמת. ודא שהנשימה של העכבר רדודה אך עקבית, מבלי להתנשף.
  6. פיפטה איטית את דילול ה-IAV לנחיריים של העכבר. ניתן לעשות זאת בהצלחה באמצעות אחת משתי השיטות כמתואר בשלבים 4.6.1 ו- 4.6.2.
    1. זרוק את הדילול הנגיפי לנחיריים טיפה, לסירוגין בין הנחיריים כך שהנגיף ייכנס לשני צידי האף.
    2. צור "בועה" של וירוס המשתרעת על פני שני הנחיריים, מתוחזקת על ידי פיפטינג עקבי ואיטי בזמן שהעכבר שואף את הנוזל.
      הערה: מחקר זה השתמש באופן עקבי בשיטת החדרת בועות, שהייתה מבוקרת וניתנת לשחזור יותר. שיטה זו מאפשרת העברה קלה של תרחיף הנגיף לנחיריים בהרדמה ומאפשרת נשימה טבעית. שיטת הטיפה תקפה באותה מידה, אך בכל שיטה בה משתמשים, יש ליישם עקביות בשיטה על פני ניסויים כדי להבטיח פחות שונות בתוצאות.
  7. החזק את קצה הפיפטה קרוב לאף, אך אל תיגע באף. אם העכבר מתעורר, יש לתת מחצית מהמינון ולהחזיר את העכבר לקונוס האף איזופלורן לפני מתן המחצית השנייה של המנה.
  8. אם העכבר ער מספיק כדי לנענע את ראשו, להשתעל או לירוק את הנגיף, יש צורך בהרדמה נוספת כדי להימנע מגרימת וירוס תרסיס וכדי להבטיח זיהום טוב. אם העכבר אינו ער, יש לתת את כל המינון. אם העכבר הונח בחזרה על חרוט האף, חזור על שלב 4.6 כדי לתת את ה-IAV הנותר.
  9. הוציאו את הקצה למיכל פסולת המכיל אקונומיקה טרייה של 10%. השתמש בקצה טרי לכל כלוב עכברים.
  10. לאחר כל מתן IAV, החזק את העכבר זקוף למשך 1-2 דקות כדי לשמור על דרכי הנשימה פתוחות ולוודא שהשפעת הועברה כראוי לריאות. אם נגיף השפעת הועבר בהצלחה לריאות העכבר, ניתן להרגיש פצפוצים על ידי הנחת אצבע אחת על כל צד של חזה העכבר.
  11. לאחר שהעכבר התחיל להתאושש, הכנס את העכבר בחזרה לכלוב כדי להתאושש באופן מלא. עכברים יתאוששו במהירות מאיזופלורן, אך יש לעקוב אחריהם עד שהם יהיו אמבולטוריים.
  12. תיעדו אירועים כמו פצפוצים בחזה ונשימות עמוקות המעידים על שאיפה טובה של IAV, או בועות וריסוס לאף המעידים על כך שחלק ממנו נפלט מנחיריו של העכבר. עקוב אחר מידע זה בגיליון אלקטרוני של יומן פציעות (קובץ משלים 1) ובמחברת מעבדה.
  13. חזור על שלבים 4.2-4.12 כדי שכל עכבר יידבק.

5. הובלה חזרה למעבדה

  1. הנח 50 מ"ל אקונומיקה חרוטית המכילה קצוות בחזרה לקופסת מנשא דגימות הפלסטיק, יחד עם שאריות דילול IAV (אם יש) ופריטי המעבדה המשמשים לזיהום בשפעת.
  2. לאחר החזרה למעבדה, דגרו על כל דבר שבא במגע עם הנגיף עם 10% אקונומיקה. רססו דליי קרח, פיפטות וקופסאות טיפים בתמיסת אקונומיקה של 10% במקום לטבול. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. השלך פסולת מוצקה למיכל הפסולת הביולוגית והשליך פסולת נוזלית בכיור, שטוף במים.

6. ניטור עכברים והליכי ניסוי נוספים

  1. עקוב אחר ציון מצב הגוף (BCS)17 ומשקל הגוף של כל השליטה (PBS) ועכברים נגועים ב-IAV מדי יום לאחר הדבקה בשפעת, החל מהיום שלאחר ההדבקה (יום 1) או 3 ימים לאחר ההדבקה (יום 4). עכברים שנדבקו ב-IAV לא צפויים לרדת משמעותית במשקל עד היום הרביעי לאחר ההדבקה (איור 1).
    הערה: יש להמית עכברים שמאבדים יותר מ-30% ממשקל גופם או מגיעים לציון מצב גוף של 1.
  2. אם תרצה, תן EdU לעכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית (i.p.) או במי השתייה כדי לעקוב אחר התפשטות התאים לאחר זיהום בשפעת.
    הערה: סוגי תאים רבים בריאה של העכבר מתרבים לאחר נזק שנגרם על ידי IAV9. ניתן לתת תרופות אחרות, מזון מיוחד או מים מיוחדים לפי הצורך למטרות ניסוי ספציפיות. זכור כי עכברים אינם אוכלים או שותים כרגיל במהלך החלמתם משפעת, ולכן שיטת מתן מבוססת זריקה עשויה להיות רצויה יותר; מצד שני, זה יכול להיות קשה להזריק לעכברים BCS של 2-2.5.

7. קצירת רקמת ריאה לגישות במורד הזרם

  1. קצירת רקמת ריאה ליישומים במורד הזרם, כולל ניתוח אימונופלואורסצנטי, ציטומטריית זרימה או ריצוף RNA של תא בודד במתקן העכברים או במעבדה בארון בטיחות ביולוגית.
  2. המתת חסד של עכברים בזה אחר זה באמצעות CO2. אין לעקור את צוואר הרחם כדי למנוע פריקת קנה הנשימה. כריתת בית חזה דו-צדדית היא בדרך כלל שיטת המתת חסד משנית מאושרת.
    הערה: מחקר זה עוקב אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים שאושרו על ידי המוסד ופרוטוקול המתת חסדCO2 והשתמש בשיטה זו באופן עקבי במחקרי שפעת קודמים מבלי להציג שונות משמעותית בפגיעה ריאתית או בתוצאות היסטופתולוגיות. ניתן להשתמש בקטמין/קסילזין גם להמתת חסד של עכברים כדי למנוע נזק הנגרם משאיפתCO2 . עם זאת, שאיפת CO2 היא שיטה מקובלת אם רכישת קטמין/קסילזין יקרה מדי או אם קבלת רישיון DEA קשה מדי.
  3. לנתח, לפתוח את חלל החזה ולחשוף את כלוב הצלעות ואת קנה הנשימה.
  4. חותכים את הסרעפת ומנתחים אותה מכלוב הצלעות בזהירות כדי לא לנקב את הריאות. חותכים לאורך דפנות כלוב הצלעות ומסירים את כלוב הצלעות בחלקו העליון. חותכים את עצם הבריח ומנתחים את העצם והרקמות הרכות מהחלק הקדמי של קנה הנשימה.
  5. נתח את השריר והרקמה המקיפים את קנה הנשימה עד שטבעות הסחוס נראות לעין, אך אל תנקב את קנה הנשימה. בעזרת מלקחיים מעוקלים, דחף את הוושט החוצה מאחורי קנה הנשימה ונתח אותו הרחק מקנה הנשימה.
  6. השחילו חתיכת תפר מאחורי קנה הנשימה וקשרו קשר תפר רופף (לולאה כפולה קצה אחד סביב מלקחיים אחד עם אחר, תפסו את הקצה הרופף של התפר ומשכו את הקצה הרופף דרך הלולאות).
  7. לחלחל את מערכת הדם עם D-PBS. הצמד כלי גדול (מתחת לגפה הקדמית או בתחתית הסרעפת) והחדיר D-PBS דרך החדר הימני (תחתית הלב, פונה כלפי מעלה) על ידי דחיפה איטית בקצה המזרק. אם המחט אינה נראית דרך דופן הלב, סביר להניח שהיא נמצאת בחדר השמאלי. זה מסיר דם מהריאות.
    הערה: אין לדחוף בועות. אם יש בועות בקו, הוצא אותן לפני שתלחץ על D-PBS עם המזרק. אם מוות של תאי אנדותל הוא דאגה, עדין יותר להשתמש בזילוף כבידה במקום לדחוף PBS ביד.
  8. אם אוספים רקמה להיסטולוגיה או אימונופלואורסצנציה בלבד, המשך לשלב 7.9; אם אוספים לתרחיף תא בודד בלבד, חתכו את כל אונות הריאה והניחו אותן ב-PBS על קרח, ולאחר מכן המשיכו לשלב 7.11.
  9. ניפוח ריאות עבור אימונופלואורסצנציה או היסטולוגיה במורד הזרם:
    1. לנפח את הריאות ב-2% פרפורמלדהיד (PFA) ולייבש באמצעות אתנול להטמעת פרפין או לנפח ב-2% PFA ולייבש באמצעות סוכרוז להקפאה.
    2. עבור טכניקות זיהוי RNA כגון RNAscope או תגובת שרשרת היברידיזציה (HCR), תקן את הריאות ב-4% PFA. לקיבוע הטוב ביותר, נפחו את הריאות באגרוז נמס נמוך במיוחד של 2% וחתכו מיד מיקרוטום רוטט ל-2% או 4% PFA בצלחת תרבית רקמה לאימונופלואורסצנציה במורד הזרם.
  10. ניפוח ריאות ביד:
    1. נפח את הריאות ביד עם מזרק ומחט 21-23 גרם עם או בלי צינורות או שימוש בכוח הכבידה על ידי הדבקת צינור של PFA למעמד טבעת 30 ס"מ מעל פני הספסל.
    2. לאחר בידוד קנה הנשימה, יש להכניס את המחט לחלק העליון של קנה הנשימה, לשפוע כלפי מעלה, מבלי לנקב את תחתית קנה הנשימה, ולהדק את התפר סביב קנה הנשימה והמחט לפני החדרת הנוזל.
      הערה: שימוש במחט חדה טומן בחובו סיכון קל לניקוב קנה הנשימה בהשוואה למחט קהה, ועל החוקרים לנקוט משנה זהירות במהלך ההליך כדי למנוע נזק. אם מחט חדה מנקבת את קנה הנשימה, יש להשתמש במחט קהה.
  11. כדי ליצור תרחיף של תא בודד עבור ציטומטריית זרימה במורד הזרם או ניתוח ריצוף של תא בודד, הסר רקמת ריאה מ-D-PBS וטחון רקמת ריאה במספריים, ולאחר מכן קוצץ בעזרת סכין גילוח למשך 2-3 דקות כדי להשיג חתיכות רקמה עדינות עוד יותר.
  12. דיסוציאט במאגר עיכול המכיל 480 U/mL קולגנאז I, 100 מיקרוליטר/מ"ל דיספאז ו-2 מיקרוליטר/מ"ל DNase ב-D-PBS, ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30-35 דקות. סנן דרך מסננים של 100 מיקרומטר ו-40 מיקרומטר, לייז את כל תאי הדם האדומים שנותרו באמצעות מאגר ליזה אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK), והשהה מחדש ב-1% BSA ב-PBS לעיבוד וניתוח במורד הזרם.
    הערה: כדי לזהות זיהום ויראלי ופינוי לאחר זיהום בריאות, ניתן להעריך את העומס הנגיפי באמצעות בדיקת qRT-PCR או TCID50 בהומוגנטים ריאתיים כדי למדוד את שכפול הנגיף. ניתן להשתמש בצביעת נויראמינידאז וקפסיד גם לאיתור זיהום ויראלי. פינוי הנגיף אמור להתרחש בימים 8-9 לאחר ההדבקה18,19, בעוד שתיקון והתחדשות רקמת הריאה נמשכים מספר שבועות9.

תוצאות

בהשוואה לעכברים לא נגועים שטופלו ב-PBS, עכברים שנדבקו ב-IAV ידגימו נזק הטרוגני לרקמות (איור 1A). ניתן לכמת נזק לרקמות באמצעות אלגוריתם אשכולות k-means ב-MATLAB20 (איור 1B). עכברים נגועים ב-IAV יתחילו לרדת במשקל בין 3-4 ימים לאחר ההדבקה. בטיטר אידיאלי, עכברים יאבדו בין 20% ל-30% ממשקל הגוף ההתחלתי שלהם, כאשר הירידה המקסימלית במשקל תתרחש 8-10 ימים לאחר ההדבקה (dpi) (איור 1C). עד 11-12 dpi, עכברים אמורים להתחיל לעלות במשקל ולחזור לטווח של 10-15% ממשקל גופם ההתחלתי ב-14 dpi. עבור מחקרי התחדשות, זה שימושי אם רוב העכברים בניסוי יורדים במשקל וחווים נזק לרקמות אך לא מתים. אולם בשל ההטרוגניות בנזק לרקמות (איור 1A,B) והשונות האפשרית במתן תוך-אף, זה נורמלי שכמה עכברים בניסוי לא ירדו במשקל או יחוו נזק לרקמות, ועבור כמה עכברים לאבד >30% ממשקל הגוף, מה שמוביל להמתת חסד (איור 1D). ניסויים המנסים לקבוע הבדל בהישרדות וירידה במשקל בין, למשל, עכברים עם KO של גן מסוים ובקרות ה-WT שלהם עשויים להזדקק להתאמה של הטיטר והמינון של IAV ויצטרכו לבצע חישוב כוח כדי לקבוע את גודל המדגם הדרוש כדי לזהות הבדל כזה בשני הפרמטרים הללו.

בנוסף לשינויים במבנה הרקמה הכללי ובבריאות העכברים, שינויים שעתוק בכל תאי הריאות מתרחשים במהלך תגובת הרקמה לנזק. זה כולל גם מצבי תאים חולפים שנפתרים בסופו של דבר עם תיקון הרקמה, כולל מצבי תאי אפיתל מעבר או ביניים ומצבי תאי חיסון מיאלואידים, ומצבי תאים מתמשכים שאינם תורמים לתיקון תפקודי, כולל תאי אפיתל Krt5+ ותאי אנדותל TrkB+9. לדוגמה, באנדותל הנימים של ריאת העכבר, מצב תאי אנדותל חולף מגורה אינטרפרון מתעורר ב-6 dpi, המאופיין בביטוי גבוה של גנים מגורים על ידי אינטרפרון (איור 2A). מצב זה נפתר ב-11-19 dpi (איור 2A). מצב אנדותל נימי (iCAP) המושרה על ידי פציעה מתעורר ב-11 dpi, המאופיין בביטוי גבוה של Ntrk2 (TRKB), Sparcl1 ו-Bnip3 (איור 2B). בניגוד למצב תאי אנדותל מגורה על ידי אינטרפרון, מצב תאי האנדותל של iCAP נמשך באזורים של רקמה פגועה קשה, ועדיין קיים שנה לאחר ההדבקה (איור 2C). מצבי תאי אפיתל מכתשית חולפים, כולל תאי מעבר מכתשית ומצבי תאי אפיתל מכתשית לא בשלים מסוג I (AT1), מתעוררים גם הם לאחר הזיהום (איור 2D). לבסוף, זיהום גורם לאובדן של מקרופאגים אנדוגניים רבים (aMAC_a) והרכבתם מחדש הן ממונוציטים דלקתיים (iMON) והן מ-aMACs אנדוגניים. למקרופאגים המכתשית שנה אחת לאחר ההדבקה יש מצבי שעתוק שונים (aMAC_a ו-aMAC_b) כתלות במקור שלהם (איור 2E)9. מצבי תאים חולפים ומתמשכים המתעוררים בעקבות פגיעה ריאתית חריפה מצדיקים מחקר נוסף, שכן התנהגותם החריגה בתוך הנישה עשויה לתרום באופן פרודוקטיבי או שלילי לתיקון רקמות מוצלח ולתפקוד הרקמות לאחר מכן. נתוני ריצוף RNA של תא בודד פורסמו בעבר9 ומופקדים באומניבוס ביטוי גנים כ- GEO: GSE262927.

figure-results-1
איור 1: ניטור פגיעות ריאות ובריאות בעלי חיים. (A) צביעה של המטוקסילין ואאוזין (HE) של מקטעי רקמת ריאה מריאה מזוהמת (שטופלה ב-PBS) משמאל וריאה נגועה ב-IAV מימין. בהשוואה לריאה הלא פגועה, הריאה הנגועה ב-IAV מראה נזק הטרוגני לרקמות. פסי קנה מידה, 1 מ"מ. (B) באמצעות אלגוריתם אשכולות k-means ב-MATLAB20, ניתן לאפיין נזק לרקמות כחמור (אדום), פגום (ירוק) או נורמלי (כחול). חשוב לציין כי באונה הריאה שטופלה ב-PBS משמאל, מבני דרכי הנשימה מסווגים כ"חמורים" בשל הצפיפות ועוצמת הצביעה של תאי אפיתל דרכי הנשימה. עם זאת, עדיין ניתן להבחין בקלות בהבדל בין ריאות שטופלו ב-PBS לבין ריאות נגועות בשפעת בהינתן קו בסיס זה. מוטות קנה מידה, 1 מ"מ. (C) דוגמה לעקומת ירידה במשקל מניסוי זיהום IAV מייצג שבו נאספו ריאות עכבר 13 ימים לאחר ההדבקה (dpi). העקומה מכילה נתונים משישה עכברים מסוג בר, ונקודות מייצגות את הממוצע, בעוד שקווי שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע. (D) עקומת הישרדות לדוגמה מניסוי זיהום IAV מייצג שבו ריאות עכברים נאספו 14 ימים לאחר ההדבקה (dpi). העקומה מכילה נתונים משבעה עכברים מסוג בר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ניטור שינויים במצב תאי אנדותל נימי לאחר זיהום IAV. (A) מצב EC מגורה על ידי אינטרפרון מתעורר ב-6 dpi שנפתר בין 11-19 dpi. ניתוח מחדש של נתוני ריצוף RNA חד-תאיים שפורסמו מריאות עכברים במספר נקודות זמן שונות לאחר זיהום בשפעת מראה כי ציון מודול האינטרפרון בכל סוגי תאי האנדותל הנימים הוא הגבוה ביותר ב-6 dpi. הנתונים נותחו מחדש באמצעות R, וציון מודול האינטרפרון מבוסס על ביטוי של 87 גנים מגורים אינטרפרון בתוך כל סוג תא. CAP1, תא אנדותל נימי מסוג 1; iCAP, תא אנדותל המושרה על ידי פציעה; CAP2, תא אנדותל נימי מסוג 2; EC, תא אנדותל. (B) לעומת זאת, מצב EC שנגרם על ידי פגיעה שמאופיין בביטוי של Ntrk2 (TRKB) מתעורר ב-11 dpi ונמשך עד שנה לאחר ההדבקה. סרגל קנה מידה, 500 מיקרומטר. (C) נתוני שעתוק מריצוף RNA של תא בודד של תאי אנדותל נימי ריאה לאחר זיהום בשפעת מדגימים את האופי הדינמי של מצב תאי אנדותל נימי במהלך תיקון רקמות. (D) תאי אפיתל המכתשית גם חווים גמישות תאים לאחר זיהום בשפעת. סוג תא מעבר מכתשית מתעורר בין 6-11 dpi ונפתר על ידי 19 dpi. מצב תא AT1 לא בוגר (AT1_c) מתעורר ב-11 dpi ונמשך עד 90 dpi. (E) אחרי הזיהום, הרבה מקרופאגים מכתשית (aMAC_a) הולכים לאיבוד, וזרם של מונוציטים דלקתיים (iMON) נראה בעוצמה של 6 dpi. אוכלוסיית המקרופאגים המכתשית מורכבת מחדש הן על ידי aMACs קיימים כדי לחדש את אוכלוסיית aMAC_a, והן על ידי מונוציטים דלקתיים, היוצרים את האוכלוסייה aMAC_b. למרות ששניהם מייצגים מצב מקרופאגים מכתשית, ניתן להבחין ב-aMACs המתקבלים באמצעות שעתוק. גרפים ב-(C-E) מציינים את אחוז התאים בכל אוכלוסייה בכל נקודת זמן במערך הנתונים של זיהום שפעת אורכי ונוצרו באמצעות R. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: יומן פציעות לדוגמה, יומן משקל וציון מצב גוף (BCS) לניטור בעלי חיים לאחר זיהום בשפעת. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

כאן, דיווחנו על שיטה נוחה להעברת נגיף השפעת לעכברים כדי ליזום נזק מהיר ויעיל לריאות עכברים ולחקור מנגנונים של התחדשות מוצלחת ותיקון דיספלסטי. אנו מדגימים כי חיסון תוך-אף של A/PR/8/34 IAV יכול להיות טכניקה נטולת מתח. לוקח פחות מ-2 דקות לכל עכבר להשלים את החיסון לאחר הרדמה איזופלורן. זוהי טכניקה פשוטה ולא פולשנית של חיסון ויראלי העוקבת אחר מסלול ההדבקה הטבעי ומאפשרת לחקור את תגובת הרקמה ומערכת החיסון בצורה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית. נגיף המחוסן דרך נחירי העכבר יכול לגרום לחסינות רירית ומערכתית21. חשוב מכך, הנזק שנגרם על ידי זיהום ויראלי נראה בבירור בפרוסות רקמת ריאה מוכתמות בהמטוקסילין וצביעה של אאוזין (HE)22 (איור 1). ציר זמן מלא של שינויים צפויים בשעתוק בסוגי תאי הריאה בכל תא של הריאה פורסם בעבר9. כאן, ניתחנו מחדש תת-קבוצה של נתונים אלה כדי להראות כי בתאי החיסון האנדותל הנימים, האפיתל המכתשית והמיאלואיד של ריאות העכבר, מתרחשים שינויים חולפים ומתמשכים במהלך התגובה לזיהום בשפעת מעכברים לא נגועים עד שנה לאחר ההדבקה (איור 2).

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה, ופתרון בעיות מתאים של שלבים אלה יניב ניסוי מוצלח. נגיף השפעת A/PR/8/34 הוא זן שפעת מותאם לעכברים שאינו מדביק בני אדם באופן פרודוקטיבי23, אך תמיד חשוב לעקוב אחר כל נהלי הבטיחות שצוינו במהלך הניסוי כדי למנוע כל אפשרות של הדבקה של אנשי מעבדה. מתן הרדמה של איזופלורן הוא צעד קריטי להבטחת העברה מוצלחת של הנגיף, שכן עכברים לא ישאפו היטב את הנגיף כשהם ערים. בדוק את הנשימה ועקוב אחר תנועת ראש העכבר במהלך ההליך כדי לוודא שהנגיף מחוסן לשני הנחיריים. אם עכברים אינם מורדמים לחלוטין, עלולות להיווצר בועות, שגם מגבילות את שאיפת הנגיף וגם מייצרות אירוסולים. יש להימנע משתי התוצאות, ולהחזיר עכברים לחרוט האף האיזופלורן אם נצפות התעטשויות או בועות בנחיריים. ניטור לאחר הדבקה, כגון מדידת ירידה במשקל, ציון מצב הגוף ומצב בריאותי, כמו גם מתן תוסף מזון להתאוששות, הוא גם מרכיב חשוב בניסוי זה. אם נצפה שעכברים אינם מאבדים משקל מספיק או שאין להם את הכמות הצפויה של נזק לרקמות (איור 1), ייתכן שהמינון נמוך מדי; מצד שני, אם עכברים רבים מגיעים לנקודת הקצה של ירידה של 30% במשקל הגוף, ייתכן שהמינון גבוה מדי. בכל מקרה, עדיף לקבוע את המינון הנכון באמצעות טיטר אמפירי של גורל הנגיף באמצעות עוקבה של עכברי C57BL/6 כפי שאנו מתארים כאן.

מכיוון שזיהום בשפעת ממשיך להיות נפוץ ברחבי העולם, גורם למחלות נשימה קשות ועלול להיות קטלני, יש חשיבות עליונה להבנת תהליך ההדבקה הנגיפית והתגובה התאית לזיהום ולפגיעה ברקמות בריאה. שיטת הזיהום התוך-אף המתוארת במחקר זה עשויה אפוא לסייע בזיהוי מנגנוני ויסות חשובים ובפיתוח גישות טיפוליות חדשות למחלות ריאה. בנוסף, יישומים עתידיים של הטכניקה יכולים להשתמש בזן אחר של נגיף שפעת מותאם לעכברים, כגון X31, כדי לקבוע את ההשפעות על מבנה ותפקוד רקמת הריאה במקרה של זיהומים נשימתיים חוזרים. מכיוון שאנשים רבים חשופים לזיהומים מרובים בדרכי הנשימה במהלך חייהם, להרחבה כזו של מודל זה עשויות להיות השלכות חשובות על חקר התחדשות רקמות הריאה, ולכן על בריאות הציבור.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר התוך-מוראלי של המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (NIH), המכון הלאומי לסרטן, המרכז לחקר הסרטן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור 1.5 מ"ל ו-nbsp;פישר סיינטיפיק02-682-557
100 ומיקרו; מסננת תא Mפלקון352360
צינור קוני בקוטר 15 מ"לפלקון352196
1x PBSGibc010010-023
40 ומיקרו; מסננת תא Mפלקון352340
צינור 5 מ"לגלוב6101C
צינור קוני בנפח 50 מ"לפלקון352098
A/PR/8/34 מלאי וירוס השפעתATCC VR-95PQמגרשים שונים עם טיטר ויראלי שונה
מאגר ACK Lysisאיכות ביולוגית118-156-101
נוגדן אנטי-TRKBR& D SystemsAF1494
אקונומיקהקלורוקס10% אקונומיקה
אלבומין סרום בקרסיגמא אולדריץ'A8022
תא הרדמה CO2כללא זמין
קולגנאז סוג Iגיבקו17100017
DAPIמיליפור סיגמא28718-90-3
DispaseקורנינגCB-40235
כלי חיתוך: מספריים, מלקחיים מעוקלים, מלקחיים ישריםכללא זמין
Dnaseסיגמא אולדריץ'4716728001
D-PBSקורנינג21-031-CM
אתנולפארמקו111000200
בקבוקי זכוכיתDWK מדעי החיים986562
דלי קרחכללא זמין
איזופלוראןקובטרוס29404
מחטים, 21– 23 Gכללא זמין
פיפטה P20/P200 פיפטמןF144056M/F144058M,
קצות פיפטות P20/P200תומאס סיינטיפיק1159M43/1159M40
פאראפורמלדהיד (PFA) תרמו-סיינטיפיקJ19943-k22% PFA
פיפטמןכללא זמין
קופסאות מקפיא מפלסטיק או קרטוןכללא זמין
להב סכין גילוחכללא זמין
עמדת טבעתכללא זמין
פיפטים סרולוגיים, 5 מ"לפלקון357543
תא איזופלוראן לעכבר עם סלייד טופסומני סיינטיפיק
תפרפישר סיינטיפיקNC9422522
צינורות מזרקים ונעילות לוארכללא זמין
מזרק, 10 מ"לכללא זמין
מכונת הרדמה שולחנית איזופלוראןאוהמדהאוהמדה איזוטק- 4קצב הזרימה אמור להיות 2.5– 3%
אגרוז עם התכה אולטרה-נמוכהסיגמא אולדריץ'A5030-1G
מאזן שקילהOHAUSCS200

מקורות

  1. Mammoto, A., Mammoto, T. Vascular niche in lung alveolar development, homeostasis, and regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 7, 318(2019).
  2. Tsikis, S. T., Hirsch, T. I., Fligor, S. C., Quigley, M., Puder, M. Targeting the lung endothelial niche to promote angiogenesis and regeneration: a review of applications. Front Mol Biosci. 9, 1093369(2022).
  3. Torrego, A., Pajares, V., Mola, A., Lerma, E., Franquet, T. Influenza A (H1N1) organising pneumonia: figure 1. BMJ Case Rep. 2010, bcr1220092531(2010).
  4. Murota, M., et al. Influenza H1N1 virus-associated pneumonia often resembles rapidly progressive interstitial lung disease seen in collagen vascular diseases and COVID-19 pneumonia; CT-pathologic correlation in 24 patients. Eur J Radiol Open. 7, 100297(2020).
  5. Niethamer, T. K., et al. Defining the role of pulmonary endothelial cell heterogeneity in the response to acute lung injury. eLife. 9, e53072(2020).
  6. Klomp, M., Ghosh, S., Mohammed, S., Khan, M. N. From virus to inflammation, how influenza promotes lung damage. J Leukoc Biol. 110 (1), 115-122 (2021).
  7. Newton, A. H., Cardani, A., Braciale, T. J. The host immune response in respiratory virus infection: balancing virus clearance and immunopathology. Semin Immunopathol. 38 (4), 471-482 (2016).
  8. Jones, D. L., et al. An injury-induced mesenchymal-epithelial cell niche coordinates regenerative responses in the lung. Science. 386 (6727), eado5561(2024).
  9. Niethamer, T. K., et al. Longitudinal single-cell profiles of lung regeneration after viral infection reveal persistent injury-associated cell states. Cell Stem Cell. 32 (2), 302-321.e6 (2025).
  10. Belser, J. A., Gustin, K. M., Katz, J. M., Maines, T. R., Tumpey, T. M. Comparison of traditional intranasal and aerosol inhalation inoculation of mice with influenza A viruses. Virology. 481, 107-112 (2015).
  11. Oltean, T., Maelfait, J., Saelens, X., Vandenabeele, P. Need for standardization of influenza A virus-induced cell death in vivo to improve consistency of inter-laboratory research findings. Cell Death Discov. 10 (1), 247(2024).
  12. Nguyen, T. -Q., Rollon, R., Choi, Y. -K. Animal models for influenza research: strengths and weaknesses. Viruses. 13 (6), 1011(2021).
  13. Jin, X. -Y., et al. Comparative pathogenicity of influenza virus-induced pneumonia mouse model following intranasal and aerosolized intratracheal inoculation. Virol J. 21 (1), 240(2024).
  14. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164(2012).
  15. Cantu, A., Gutierrez, M. C., Dong, X., Leek, C., Anguera, M., Lingappan, K. Modulation of recovery from neonatal hyperoxic lung injury by sex as a biological variable. Redox Biol. 68, 102933(2023).
  16. Sunagar, R., Kumar, S., Namjoshi, P., Rosa, S. J., Hazlett, K. R. O., Gosselin, E. J. Evaluation of an outbred mouse model for Francisella tularensis vaccine development and testing. PLoS One. 13 (12), e0207587(2018).
  17. Cowley, P. M., Roberts, C. R., Baker, A. J. Monitoring the health status of mice with bleomycin-induced lung injury by using body condition scoring. Comp Med. 69 (2), 95-102 (2019).
  18. Gonzalez, A. J., Ijezie, E. C., Balemba, O. B., Miura, T. A. Attenuation of influenza A virus disease severity by viral coinfection in a mouse model. J Virol. 92 (23), e00881-e00918 (2018).
  19. Lv, J., et al. Kinetics of pulmonary immune cells, antibody responses and their correlations with the viral clearance of influenza A fatal infection in mice. Virol J. 11, 57(2014).
  20. Liberti, D. C., et al. Alveolar epithelial cell fate is maintained in a spatially restricted manner to promote lung regeneration after acute injury. Cell Rep. 35 (6), 109092(2021).
  21. Cipolla, D., et al. Inhalable and nasal biologics: analytical, formulation, development, and regulatory considerations. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 2024, (2025).
  22. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), (2014).
  23. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal models for influenza virus pathogenesis and transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מידול תיקון דיספלסטי ותפקודי של מכתשית ריאות לאחר זיהום בשפעת
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.