CD44 מקל על פתוגנזה של מחלה על ידי תזמור מפלים דלקתיים והתמיינות אוסטאוקלסטית באמצעות הפעלת מסלול PI3K/Akt. לגליציטין יש השפעות טיפוליות על ביטויי אוסטאופורוזיס נלווית (OP) + דלקת חניכיים (PD) באמצעות הנחתה ממוקדת של איתות בתיווך CD44.
מאמר מחקר
CD44 מקל על פתוגנזה של מחלה על ידי תזמור מפלים דלקתיים והתמיינות אוסטאוקלסטית באמצעות הפעלת מסלול PI3K/Akt. לגליציטין יש השפעות טיפוליות על ביטויי אוסטאופורוזיס נלווית (OP) + דלקת חניכיים (PD) באמצעות הנחתה ממוקדת של איתות בתיווך CD44.
מחקר זה מבהיר את הגורמים המולקולריים הקריטיים הקשורים לתחלואה נלווית של אוסטאופורוזיס (OP) ודלקת חניכיים (PD) באמצעות פרופיל פרוטאומי, תוך תיחום הפונקציה הרגולטורית של CD44 בדלקת חניכיים ניסויית במודל עכברי OP. שלב I כלל איסוף דגימות סרום מחולים עם OP+PD (n = 3) ובקרות בריאות (n = 6) שעברו הערכות בריאות שגרתיות במוסד שלנו לניתוח פרוטאומי השוואתי. אימות תרגומי לאחר מכן של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) ומפלי איתות קשורים נערך על פני דגימות קליניות ומודלים של עכברים OP+PD. כדי לאפיין באופן מכני את תפקידו של CD44 בהתקדמות מחלת פרקינסון בתנאים אוסטאופורוטיים, נוצר מודל עכברי זרחנים אורגניים באמצעות כריתת שחלות דו-צדדית, ואחריה אינדוקציה ניסיונית של מחלת פרקינסון באמצעות מיקום קשירה. ההערכות המקיפות כללו שינויים היסטומורפומטריים באמצעות צביעת המטוקסילין-אאוזין, ניתוח עצמות מיקרו-ארכיטקטוני באזור הטוחנת הראשונה של הלסת העליונה באמצעות מיקרו-CT, והערכת אימונובלוטינג של רכיבי מסלול פוספואינוזיטיד-3-קינאז (PI3K)/Akt. סריקה פרמקולוגית ברשת מקבילה בשילוב עם סימולציות עגינה מולקולרית בוצעה כדי לזהות מרכיבים ביו-אקטיביים של אנג'ליקה סיננסיס עם פוטנציאל טיפולי. חקירה פרוטאומית זיהתה CST3, A2M, CD44, CDH13, CETP ו-VWF כמתווכים פתוגניים מועמדים בפתוגנזה של OP+PD. בידינו, ניתוח העשרת מערכי גנים גילה כי איתות PI3K/Akt מתפקד כמתווך עיקרי של התקדמות מחלת OP+PD. אימות מבוסס PCR מבוסס שעתוק הפוך כמותי אישר ויסות משמעותי של CD44 בקבוצות קליניות וניסיוניות של OP+PD. אפנון in vivo באמצעות דיכוי CD44 החזיר באופן משמעותי את שלמות רקמת החניכיים, הפחית את חדירת התאים הדלקתיים וחיזק את המיקרו-ארכיטקטורת העצם המכתשית בעכברי זרחנים אורגניים, במקביל לעיכוב מסלול PI3K/Akt. פרמקולוגיה של הרשת חשפה את הגליציטין כפיטוכימיקל הביו-אקטיבי העיקרי באנג'ליקה סיננסיס, כאשר CD44 זוהה כמטרה המולקולרית המרכזית שלו. גליציטין שיפר את מבנה העצם המכתשית בעכברי OP+PD, הגדיל את נפח העצם (BV/TV), עובי טרבקולרי (Tb.Th), צפיפות מינרלים בעצם (BMD), והפחית את מספר הטרבקולרי (Tb.N), יחס פני העצם לנפח העצם (BS/BV), מה שמעיד על איכות עצם בריאה יותר, המיוחסת מכנית להנחתת ציר האיתות CD44.
דלקת חניכיים (PD) היא מחלה מיקרוביאלית מורכבת ומעורבת הנגרמת על ידי שקיעה של ביופילמים פתולוגיים בחריץ החניכיים1. הוא מאופיין בחוסר איזון בסביבה המיקרואקולוגית המפעיל מפל דלקתי פתולוגי בתוך המארח, מה שמוביל בסופו של דבר לנזק פרוגרסיבי בלתי הפיך לצמנטום, לרצועה החניכיים ולעצם המכתשית, שהם מרכיבים של מערכת ההתקשרות החניכיים. זה יכול לגרום להתרופפות שיניים או אפילו לאובדן2. הכמות תוקננה להשוואה, והנתונים האפידמיולוגיים העדכניים ביותרמצביעים על כך שלמעלה מ-1.066 מיליארד אנשים ברחבי העולם סובלים מדלקת חניכיים חמורה, עם שכיחות מתוקננת לגיל של כ-12.5%, מה שמדגיש שונות ניכרת בין אוכלוסיות בינלאומיות.
אוסטאופורוזיס (OP), מחלת עצם מערכתית, מאופיינת בהשפלה משמעותית של מיקרו-מבנה העצם ואובדן שיטתי של מסת העצם 4,5. הסיכון לשברים מוגבר מאוד על ידי חולשה מבנית זו, במיוחד אצל אנשים מבוגרים. יש לציין כי לאנשים בני 65 ומעלה ביפן הייתה שכיחות גבוהה יותר של מחלות חניכיים מאשר מבוגרים בגילאי 30 עד 64. לנשים לאחר גיל המעבר יש שכיחות גבוהה יותר של מחלות חניכיים ולעתים קרובות חוות בעיות בריאותיות אחרות 6,7. המחקר צופה כי בין השנים 2005 ל-2025, נטל התחלואה יגדל ביותר מ-50%, כאשר העלות הכלכלית צפויה לעלות מ-17 מיליארד דולר ל-25 מיליארד דולר. המחקר צופה כי בין השנים 2005 ל-2025, נטל התחלואה יגדל ביותר מ-50%, כאשר העלות הכלכלית צפויה לעלות מ-17 מיליארד דולר ל-25 מיליארד דולר. מגמה זו מדגישה את ההשפעה הסוציו-אקונומית המשמעותית של מחלות חניכיים אלה. בנוסף, בנשים חולות עם מחלת חניכיים ודלקת חניכיים, יש מתאם חיובי ברור בין משך המחלה והכרוניות שלה לבין הסיכונים הבריאותיים המוגברים8.
מחקרים קודמים הצביעו על כך שזרחנים אורגניים עשויים לקדם התפתחות של מחלת פרקינסון ולהיפך, בשל גורמי סיכון נפוצים לשתי המחלות, כגון הזדקנות, עישון וצריכה לא מספקת של סידן וויטמין D. באוכלוסיית הנקבות לאחר גיל המעבר, זרחנים אורגניים חמורים יכולים להיות מלווים בתכולת מינרלים מופחתת של הלסת התחתונה, מה שעשוי להיות קשור לרמות חסרות של התקשרות חניכיים9. הוכח כי צפיפות עצם מופחתת הקשורה ל-OP עשויה להאיץ את ספיגת העצם המכתשית הנגרמת על ידי מחלת פרקינסון, ובכך להעדיף פלישה של פתוגנים חניכיים10. מבין מגוון האתגרים הבריאותיים הקשורים לגיל ולשינויים פיזיולוגיים, מחלת פרקינסון וזרחנים אורגניים בולטים במיוחד עם האצת הזדקנות האוכלוסייה העולמית והגידול המשמעותי במספר הנשים בגיל המעבר. לכן, להבהרת האינדיקטורים הרלוונטיים והקשרים שלהם יש חשיבות מכרעת למניעת מחלות, טיפול והערכה פרוגנוסטית. מונע על ידי היבטים אלה, מחקר זה השתמש בפרוטאומיקה כדי לסנן חלבוני מפתח, בדגש על איתות PI3K/Akt בתיווך CD44, בפיתוח OP+PD, תוך בחינת תפקידי הרגולציה והמנגנונים האפשריים של חלבוני מפתח באמצעות מודל PD ניסיוני בעכברי זרחנים אורגניים. בדיקה נוספת של חומרים טיפוליים ממוקדים הקיימים באנג'ליקה סיננסיס - צמח מרפא סיני מסורתי הנמצא בשימוש נרחב בפרקטיקה הקלינית בשל תכונותיו האנטי דלקתיות והמגנות על העצם, ודווח בעבר כמקל על אובדן עצם ומווסת תגובות דלקתיות באוסטאופורוזיס ומחלות חניכיים. בהנחיית פרמקולוגיה של רשת ועגינה מולקולרית, גליציטין זוהה כפיטוכימיקל הביו-אקטיבי העיקרי ומועמד רציונלי להתערבות ב-OP+PD.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. פרוטוקול המחקר נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים. כל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של בעלי החיים.
מחקר זה נועד להעריך את תפקידו של ויסות בתיווך CD44 של מסלול PI3K/Akt בהתמיינות אוסטאוקלסטית והתקדמות דלקתית במהלך אוסטאופורוזיס נלווית ודלקת חניכיים (OP+PD) ולקבוע אם גליציטין, תרכובת ביו-אקטיבית מ-Angelica sinensis, יכול לווסת את ההשפעות הללו מבחינה טיפולית. הרציונל נובע מראיות מתפתחות המקשרות ביטוי יתר של CD44 לספיגת עצם פתולוגית וחוסר ויסות חיסוני ב-OP+PD 11,12,13. על ידי שילוב פרוטאומיקה, מודלים in vivo ופרמקולוגיה רשתית, הפרוטוקול חוקר באופן שיטתי מנגנונים מולקולריים והתערבויות טיפוליות כדי להפחית את התקדמות המחלה14.
גודל המדגם עבור ניסויים in vivo התבסס על מחקרים קודמים וניתוח כוח, וכתוצאה מכך n = 6 לקבוצה, מה שמבטיח כוח סטטיסטי הולם לאיתור הבדלים משמעותיים (P < 0.05) בין תנאי הטיפול. גליציטין ניתן במינונים של 50 מ"ג/ק"ג ו-100 מ"ג/ק"ג, מושהה ב-5% DMSO בשמן זית, ומועבר דרך הפה היומית. עכברים היו במעקב במשך 8 שבועות לאחר השראת מחלת פרקינסון. מיקום קשירה כדי לגרום לדלקת חניכיים השתמש בחוט משי 5-0, וכריתת שחלות דו-צדדית בוצעה תחת הרדמת נתרן פנטוברביטל של 0.3% (0.5 מ"ל/100 גרם)15. בנוסף, בדיקות מולקולריות, כולל RT-qPCR, Western Blotting ו-ELISA, נערכו באמצעות פרוטוקולים מאומתים16, והערכות היסטולוגיות, כגון המטוקסילין-אאוזין (H&E) וצביעה כחולה מתילן, עקבו אחר לוחות זמנים קבועים ומשכי צביעה.
כל ההליכים הניסויים הכוללים ריאגנטים כימיים, חומרי צביעה ודגימות ביולוגיות נערכו בהתאם לפרוטוקולי בטיחות ביולוגית סטנדרטיים כדי למזער סיכונים בריאותיים. חומרים מסוכנים כגון פורמלין, EDTA, מתילן כחול ופוקסין חומצי טופלו בציוד מגן אישי (PPE), כולל כפפות, מסכות ומשקפי מגן. כל חומרי הפסולת, כולל ריאגנטים משומשים וכלים חד פעמיים מזוהמים, נאספו במיכלים ייעודיים לסיכון ביולוגי והושלכו באמצעות שירותי סילוק פסולת מסוכנת מוסמכים על פי הנחיות בטיחות מוסדיות וסביבתיות. איור 1 מציג את זרימת העבודה הניסיונית הכוללת.
איסוף נתונים קליניים
במחקר שלנו, אספנו וניתחנו באופן מקיף נתונים קליניים בסיסיים והיסטוריה רפואית מפורטת של שלושה חולי OP+PD ושישה נבדקי ביקורת, כולל גורמים דמוגרפיים ואורח חיים, כמו גם פרופילים אנטומיים וגרורות. בנוסף, בוצע אישור קפדני של תוצאת הבדיקה לזיהום HPV (חיובי או שלילי). שלב ההתקדמות או דפוס ההישנות של נגעים גרורתיים תועד בפירוט. במהלך 7 הימים הראשונים של האימונותרפיה, דגימות הדם של המטופלים נאספו באופן שיטתי ותוקנו, כולל אינדיקטורים ביוכימיים כגון בדיקות דם שגרתיות. בדיקות דם שגרתיות בוצעו בהתאמה קפדנית לנהלים סטנדרטיים כדי להעריך במדויק פרמטרים מרכזיים כגון טסיות דם, לימפוציטים ונויטרופילים. אלבומין בסרום נמדד במקביל, ותפקודי הכבד הוערכו על ידי ניתוח כמותי של מדד ריכוז הגלובולין.
חולים
הערכת צפיפות מינרלים בעצם וריבוד המשתתפים
ערכנו השוואה שיטתית של מדידות צפיפות העצם באזור המותני ובצוואר הירך. כל הבדיקות בוצעו על ידי רדיולוגים מנוסים במחלקתנו, תוך שימוש בציוד מדויק לכימות מדויק של ערכי צפיפות העצם. כדי להבטיח איסוף דגימות סטנדרטי, המשתתפים נדרשו לצום לפחות 8 שעות לפני הדגימה. על ידי שילוב נתוני צפיפות העצם עם נתוני הערכה פריודונטלית מקיפים, סיווגנו בקפדנות את הנבדקים לקבוצת אוסטאופורוזיס עם דלקת חניכיים (OP+PD) או לקבוצת הביקורת הבריאה (HC), והבטחנו שיחס המין תואם באופן מושלם בין שתי הקבוצות. התאמת המין מתייחסת להתפלגות השווה של הנקבות בין OP+PD לקבוצות ביקורת בריאות. עם זאת, רק משתתפות נכללו במחקר זה כדי להתמקד באוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר; לא היו נבדקים גברים באף אחת מהקבוצות. המחקר דבק בקווים המנחים האתיים של הצהרת הלסינקי, כאשר כל המשתתפים חתמו על טפסי הסכמה מדעת רשמיים, תוך הגנה מלאה על זכויותיהם.
פרמטרים אבחנתיים
אוסטאופורוזיס הוגדרה על פי ההנחיות הסיניות לאבחון וניהול של אוסטאופורוזיס ראשוני (2022)17, עם סף אבחון שנקבע ב-T-score ≤-2.5 סטיות תקן (SD) עבור BMD מותני (L1-L4) או ירך. שלב דלקת חניכיים עקב אחר סיווג הסדנה העולמית של מחלות חניכיים18 לשנת 2018, עם הכללה מוגבלת למקרים בדרגה A, שלב II-III. קריטריונים להכללה: נשים לאחר גיל המעבר בגילאי 50-65 שנים, אבחנה כפולה של זרחנים אורגניים ומחלת פרקינסון העומדות בקריטריונים לעיל, היעדר הפרעות אוטואימוניות, ללא היסטוריה של ניאופלזמות ממאירות, תפקוד לב-ריאה, כבד וכליות תקין. קריטריונים לאי הכללה: דחיית השתתפות של מטופל או משפחה, טיפול תרופתי אחרון (≤6 חודשים) לזרחנים אורגניים או פרקינסון.
פרופיל פרוטאומי של דגימות סרום
דגימות סרום משלושה חולי OP+PD ושישה נבדקי ביקורת נאספו לניתוח פרוטאומי. כימות חלבון יחסי הושג באמצעות פרוצדורות סטנדרטיות, וחלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי הוגדרו כאלו עם P < 0.05 ושינוי קיפול > 1.519.
ניתוח העשרת סט גנים (GSEA)
GSEA שימש לזיהוי מסלולי איתות מרכזיים שאינם מווסתים בין קבוצת הביקורת לקבוצות OP+PD. נתונים טרנסקריפטומיים גולמיים הומרו לראשונה באמצעות המרת log2 ונורמלו באמצעות נורמליזציה קוונטילית כדי להסיר השפעות אצווה. ערכות גנים עם פונקציות ביולוגיות מרובות נבדקו ממאגר החתימות המולקולריות (MSigDB), והמובהקות הסטטיסטית הוערכה באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum הלא פרמטרי. תוצאות ההעשרה דווחו באמצעות ציוני העשרה מנורמלים ושיעורי גילוי כוזבים (FDR < 0.25).
ניתוח רשת ביטוי משותף משוקלל של גנים (WGCNA)
WGCNA שימש לזיהוי מודולי גנים הקשורים באופן משמעותי לפנוטיפים של OP+PD. כוח סף רך של 12 נבחר כדי להשיג טופולוגיית רשת נטולת קנה מידה (R2 > 0.85), וניתוח מתאם פירסון שימש להערכת קשרים בין הגנים העצמיים של המודול לתכונות קליניות. ניתוחי העשרה פונקציונליים נערכו כדי לחשוף מסלולים ביולוגיים רלוונטיים במודולים בעלי קורלציה חזקה.
הקמת מודלים של עכברים אוסטאופורוטיים המושרים על ידי כריתת שחלות
במחקר זה השתתפו 116 עכברים נקבות בדרגת SPF. לפני הניסויים, בעלי החיים שוכנו בתנאי טמפרטורה ולחות מבוקרים למשך שלב הסתגלות של 7 ימים, במהלכו הם קיבלו צ'או מכרסמים סטנדרטי ומים מזוקקים. כל הליכי הטיפול בבעלי חיים פעלו בקפדנות על פי הפרוטוקולים האתיים שאושרו על ידי ועדת האתיקה של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג, תחת אישור מזהה 0609. המחקר נרשם תחת מספר פרויקט [2024-054].
פרוטוקול כירורגי לכריתת שחלות דו-צדדית (OVX):
עכברים הורדמו באמצעות הזרקה תוך-צפקית של 0.3% נתרן פנטוברביטל (0.5 מ"ל/100 גרם משקל גוף). פרוות הגב הוסרה בניתוח, ובעלי חיים הוצבו בשכיבה גבית על משטח כירורגי מחומם וסטרילי. לאחר הכנה אספטית עם 75% אתנול, נעשו חתכים פרה-חולייתיים דו-צדדיים (1 ס"מ לרוחב עמוד השדרה) בגובה רפידות השומן הכלייתי. בורסת השחלות הוצאה, וצינור הביצית נקשר פרוקסימלי לשחלה באמצעות תפרי משי 5-0, ואחריו כריתה של שחלות דו-צדדיות, רקמת שומן קשורה ומבני ביצית חלקיים. שכבות שרירים ועוריות נסגרו ברצף עם 4-0 תפרים נספגים. אנטיספסיס לאחר הניתוח בוצע עם 75% אתנול.
בקרות ניתוח דמה:
עכברים שנותחו בדמה עברו שלבים פרוצדורליים זהים, כולל חשיפה לשחלות וכריתת רקמת שומן סביב השחלות, ללא כריתת שחלות.
ניהול לאחר הניתוח:
ההתאוששות לאחר ההרדמה הקלה באמצעות כריות חימום מים במחזור עד לתנועה מלאה. משככי כאבים נשמרו באמצעות מתן קרפרופן תת עורי (5 מ"ג/ק"ג ביום) במשך 72 שעות לאחר הניתוח, בתוספת פניצילין G מניעתי (50,000 יחב"ל/ק"ג) למשך 48 שעות למניעת זיהומים באתר הניתוח. מסת הגוף נוטרה מדי שבוע במהלך שלב המודלים האוסטאופורוטיים של 6 שבועות, עם קריטריונים להחרגה שהוחלו על בעלי חיים שהפגינו ירידה של >20% במשקל או מצוקה קלינית.
בניית מודל ניסיוני של בעלי חיים OP+PD
מודל PD הניסיוני פותח על בסיס מודל בעלי החיים של זרחנים אורגניים שהוקם בעבר. כדי למנוע שבירת חוטים ולהבטיח החדרה חלקה בין הטוחנות נעשה שימוש בתפר משי 5-0 לקשירה. במהלך ההליך, זווית הפה של העכבר נסוגה בעדינות, והחוט נתפס במלקחיים והונח בזהירות באזור צוואר הרחם בין הטוחנות הראשונה והשנייה. החוט וקצה המלקחיים נשמרו מאוזנים כדי למזער את הטראומה לרירית הבוקאלית, ובכך להפחית את הסיכון לדימום או לתמותה. היד השנייה משכה בעדינות את הקצה הנגדי של החוט, והנחתה אותו בהדרגה לתוך החלל הבין-פרוקסימלי שבין הטוחנות לאחר שהחוט הוצב כראוי, קטע ליד הצד הבוקאלי היה מהודק במלקחיים והועבר בזהירות בין הטוחנות השנייה והשלישית באותה טכניקה. מתיחה עדינה כלפי מטה הבטיחה מעבר חלק של המשי. לבסוף, החוט נקשר היטב סביב הטוחנת השנייה באזור אמצע צוואר הרחם. העכברים הורשו לאחר מכן להתאושש.
תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך (RT-qPCR)
טבלת החומרים מפרטת רצפי פריימר ספציפיים קדימה ואחורה עבור RT-qPCR המכוונים לגנים הקשורים לדלקת, קרישה והדבקה של תאים, כולל CD44, CDH13, VWF ו-GAPDH. רצפי הפריימר המשמשים לניתוח RT-qPCR מסוכמים בטבלה 1.
ניתוח כתמים מערביים
מאפייני הביטוי של חלבוני מסלול איתות מרכזיים ברקמות חניכיים נחקרו באופן שיטתי באמצעות כתמים מערביים. רקמות החניכיים עברו הומוגניזציה בהקפאה-הפשרה באמצעות מאגר RIPA, המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז, כדי לחלץ ביעילות את החלבון הכולל. לאחר צנטריפוגה במהירות גבוהה (12,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 10 דקות) להפרדת הליזאט, נעשה שימוש בסופרנטנט למדידה מדויקת של ריכוז החלבון עם ערכת BCA, וסיפק נתונים אמינים לניסויים הבאים.
עבור כל קבוצת ניסוי, 30 מיקרוגרם של חלבון כולל נטענו והופרדו באמצעות מערכת SDS-PAGE של 10%. החלבונים שנפתרו הועברו לאחר מכן לממברנות PVDF בשיטת ספיגה חצי יבשה. כדי למזער הפרעות רקע, הממברנות נחסמו עם חלב יבש ללא שומן של 5% למשך שעה בטמפרטורת הסביבה. לאחר מכן, הממברנות נשמרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בסביבה יציבה להמשך עיבוד.
לאחר מכן הודגרו הממברנות עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים (ראה טבלת חומרים) למשך שעתיים בטמפרטורה של מעלות צלזיוס. למחרת, נעשה שימוש במאגר TBST לשטיפה יסודית, ולאחר מכן טופלו הממברנות בנוגדנים משניים מצומדים ל-HRP בדילול של 1:10,000 למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר. כל שלבי הזיהוי החיסוני בוצעו בהתאמה קפדנית לפרוטוקולים סטנדרטיים כדי להבטיח את העקביות והתוקף של ניתוח מסלול האיתות20.
על ידי שימוש במצעי כימילומינסנציה משופרים (ECL) כדי ללכוד אותות וציוד הדמיה ברזולוציה גבוהה לאיתור מדויק של רצועות חלבון, ערכי הצפיפות האופטית של הלהקות נותחו כמותית באמצעות תוכנת ImageJ. בסופו של דבר, על ידי השוואה שיטתית של רמות הביטוי היחסיות של חלבוני המטרה/β-אקטין בכל קבוצה עם קבוצת הביקורת, מידת ההפעלה והשינויים הדינמיים של מסלול PI3K/Akt תחת התערבויות שונות הוערכו במדויק.
בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA)
באמצעות ערכות ELISA (ראה טבלת חומרים), מחקר זה השיג כימות מדויק של ציטוקינים דלקתיים שונים, כולל TNF-α, IL-6, IL-1β ו-IL-4, בדגימות סרום. הוא גם העריך ריכוזים של TRAP5b, ALP ו-TGF-β כסמנים לפעילות אוסטאוקלסטים. צלחת של 96 בארות מצופה מראש בנוגדני לכידה הודגרה ב-25 מעלות צלזיוס עם דגימות סרום מדוללות 1:10 ב-PBS למשך שעתיים, מה שמאפשר לאנטיגנים להיקשר במיוחד לנוגדני הלכידה המשותקים. לאחר הדגירה, חומרים לא קשורים הוסרו באמצעות שלוש שטיפות באמצעות PBS-T (תמיסת מלח עם חוצץ פוספט עם Tween-20). לאחר מכן, נוספו נוגדנים לזיהוי המסומנים בביוטין והודגרו למשך שעה אחת באותה טמפרטורה. לאחר מכן, הוכנס סטרפטווידין-HRP כדי לקשור את הנוגדנים הביוטיניליים, והתערובת הודגרה למשך 20 דקות נוספות בטמפרטורת החדר בתנאים מוגנים מאור. התגובה האנזימטית הופסקה לאחר מכן באמצעות תמיסת העצירה, והספיגה נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות לקביעת ריכוזי הציטוקינים.
צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)
נעשה שימוש בשיטות סטנדרטיות לביצוע צביעת H&E על מקטעים משובצים בפרפין של רקמת חניכיים כדי לנתח שינויים מיקרו-מבניים. תהליך הכנת הדגימה כלל קיבוע ראשוני בתמיסת פרפורמלדהיד של 4% למשך 24 שעות, ואחריו התייבשות אתנול מדורגת (70%, 80%, 95% ו-100%) ופינוי בקסילן, ולבסוף הטמעה בפרפין להפקת קטעים בעובי 4 מיקרומטר21. לאחר הסרת שעווה בקסילן, הדגימות עברו התייבשות באמצעות ירידה בריכוזי אתנול (100% עד 70%). תהליך הצביעה החל בטבילה של 5 דקות בהמטוקסילין (של מייזנר), לאחר מכן שטיפה במים זורמים, התמיינות באלכוהול חומצי 1% באתנול ושטיפה נוספת. לאחר מכן הקטעים הוכתמו ב-0.5% אאוזין למשך 10 שניות כדי להשלים את הפרוטוקול.
לאחר הצביעה, השקופיות יובשו שוב בסדרת אתנול מדורגת, נוקו בקסילן ונאטמו במדיום הרכבה. התצפיות נעשו תחת מיקרוסקופ המצויד במטרות פי 10 ו-40 לרכישת תמונות ברזולוציה גבוהה. ניתוח היסטולוגי העריך את השלמות המבנית של רקמת חיבור חניכיים, חדירת תאים דלקתיים ומורפולוגיה של ספיגת עצם המכתשית. רמת הדלקת נקבעה באמצעות מדד Loe-Silness משופר, כאשר שני פתולוגים עיוורים לזהות הדגימה העריכו באופן עצמאי את הדגימות באמצעות סולם כמותי למחצה כדי להבטיח אובייקטיביות ושחזור22.
צביעת מתילן כחול
מחקר זה השתמש בשיטת צביעת מתילן כחול על קטעי עצם מכתשית מתוקננים ומעובדים כדי לכמת את מידת ספיגת העצם. הליך הניסוי החל בקיבוע רקמות: רקמות חניכיים קובעו בתמיסת פורמלין ניטרלית של 10% למשך 24 שעות, ולאחר מכן טיפול הסרת אבדן של 21 יום בתמיסת EDTA (pH 7.4). לאחר הסרת האבדן, הדגימות הוטמעו בפרפין והוכנו לחלקי רקמה בעובי 4 מיקרומטר, אשר הורכבו לאחר מכן על שקופיות סילאני. תהליך הטיפול המקדים בקטע כלל הסרת שעווה של קסילן, הידרציה של אתנול בשיפוע ודגירה באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השקופיות הוכתמו בתמיסת מתילן כחולה של 0.1% למשך 15 דקות.
לאחר הצביעה, החלקים נשטפו במשך דקה אחת במים מזוקקים שחוממו מראש ל-60 מעלות צלזיוס, מה שמבטיח הסרה יעילה של עודפי צבע מבלי לפגוע במבנה הרקמה. לאחר מכן הם נצבעו בפוקסין חומצה של 0.1% למשך 5 דקות כדי לשפר את הניגודיות בין מבני הרקמה. פרוטוקול צביעה זה סיפק הדמיה עקבית ואמינה לניתוח כמותי של ספיגת עצם המכתשית23. לבסוף, המגלשות יובשו באמצעות אתנול מדורג, נוקו בקסילן והורכבו. רקמת העצם המוכתמת נותחה תחת מיקרוסקופ שדה אור, ותמונות ברזולוציה גבוהה נרכשו כדי להעריך במדויק את ספיגת קצה העצם המכתשית להערכה מורפולוגית לאחר מכן.
ניתוח טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT)
סריקת מיקרו-CT בוצעה כדי להעריך שינויים מיקרו-מבניים תלת מימדיים בעצם המכתשית של עכברי מודל OP+PD, תוך התמקדות ספציפית באזור הטוחנת הראשונה של הלסת העליונה. לאחר 8 שבועות של ניטור לאחר הניתוח, העכברים הומתו באופן אנושי באמצעות שאיפת CO2 , שיטה המתאימה לשימור מבנים פנים ולסתות. לאחר מכן נקטפו דגימות מקסילריות וקובעו ב-4% פרפורמלדהיד ב-4 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות24.
ניתוח מיקרו-CT בוצע עם תמונות DICOM משוחזרות של אזור הלסת העליונה שיובאו לתוכנה על ידי בחירת מערך הנתונים המתאים לדגימות הסרוקות. אזור עניין סטנדרטי (ROI) הוגדר באופן ידני כחלק הבוקאלי המזיאלי של שורש הטוחנת הראשונה המקסילרית על ידי מתאר מבנה העצם המכתשית בתצוגות סגיטליות ועטרה, וכ-50 פרוסות רצופות נכללו בדרך כלל כדי לכסות את האזור במלואו.
כדי להפריד את העצם הטרבקולרית מהרקמה הרכה והרקע שמסביב, הוחל סף צפיפות של 180-220 מ"ג HA / ס"מ3 . לאחר מכן בוצע סגמנטציה ליצירת מבנה בינארי המייצג רק את העצם הטרבקולרית. ניתוח מורפומטרי בוצע באמצעות מודול מורפומטריית העצם בתוך התוכנה. הפרמטרים חושבו אוטומטית, כולל חלק נפח העצם (BV/TV), עובי טרבקולרי (Tb.Th), מספר טרבקולרי (Tb.N), יחס נפח פני העצם לעצם (BS/BV) וצפיפות מינרלים בעצם (BMD). בעקבות הניתוח, התוצאות המספריות יוצאו כגיליונות אלקטרוניים.
מדידות אלו שימשו להערכת היקף הנזק המיקרו-מבני בעצם המכתשית הקשורה למצב הפתולוגי של OP+PD ולהערכת היעילות הטיפולית של גליציטין בשיקום איכות העצם. גישה זו אפשרה הערכה ברזולוציה גבוהה, ניתנת לשחזור וכמותית של שלמות מבנית בסביבת העצם הפריודונטלית, והציעה תובנות מורפולוגיות מרכזיות לגבי תוצאות הטיפול.
פרופיל פרמקולוגיה ברשת
כדי לחקור באופן שיטתי את המרכיבים הביו-אקטיביים של הרפואה הסינית המסורתית (TCM) שעשויים לווסת מסלולים ביולוגיים מרכזיים הרלוונטיים לאוסטאופורוזיס ודלקת חניכיים נלווית (OP+PD), מחקר זה השתמש בגישה פרמקולוגיה רשת כדי לנתח את Angelica sinensis. צמח זה נבחר על סמך השימוש ההיסטורי שלו ברפואה הסינית המסורתית לטיפול בהפרעות ודלקות הקשורות לעצמות, כולל תסמינים הקשורים הן לאוסטאופורוזיס והן למחלות חניכיים כרוניות. בשלב סינון התרכובות, החומרים הפעילים של Angelica sinensis אוחזרו באמצעות מסדי נתונים TCMSP ו-TCMID [פרטי מסד הנתונים הועברו ל-ToM], וסוננו באמצעות קריטריונים של זמינות ביולוגית אוראלית (OB) ≥-30% ודמיון לתרופה (DL) ≥0.18. אינטראקציות מורכבות-מטרה נחזו באמצעות STITCH, עם אימות אתר יעד באמצעות DisGeNET ו-OMIM. ניתוח העשרת המסלול נערך באמצעות פלטפורמת DAVID 2021 כדי לזהות מסלולי איתות KEGG שעשויים להיות מווסתים על ידי התרכובות שנבחרו. כדי להמחיש אינטראקציות מולקולריות, נבנתה רשת "תרכובת-מטרה-מסלול" המבוססת על מדדים טופולוגיים (מרכזיות דרגה, מרכזיות ביניים). הניתוח זיהה גליציטין, פלבנואיד טבעי, כתרכובת בעלת תכונות פרמקוקינטיות חיוביות וקישוריות חזקה ל-CD44, מה שמרמז על רלוונטיות טיפולית פוטנציאלית ב-OP+PD. עם זאת, גליציטין לא אושר קלינית לטיפול באוסטאופורוזיס או דלקת חניכיים; ממצאים אלה מבוססים על תחזיות In Silico ומספקים מסגרת תיאורטית לניסויי אימות in vivo הבאים 25.
אימות עגינה מולקולרית
מבני חלבון של CD44 (PDB ID: 1UUH) ו-PI3K (PDB ID: 4L23) אוחזרו ממאגר נתוני החלבון RCSB (https://www.rcsb.org). מבני ליגנד (גליציטין, ליגוסטיליד) עברו אופטימיזציה באמצעות מזעור אנרגיה באמצעות שדה כוח מולקולרי. סימולציות עגינה נערכו עם אלגוריתם גנטי תחת הפרמטרים הבאים: 100 ריצות, גודל אוכלוסייה 150 ו-25×106 הערכות אנרגיה. כיסי הכריכה הוגדרו על סמך קואורדינטות ליגנד קריסטלוגרפיות (CD44: 20×20×20 Å3; PI3K: 25×25×25 å3). תנוחות העגינה שהתקבלו דורגו לפי אנרגיית קשירה (ΔG, kcal/mol), ויכולת השחזור אומתה באמצעות סף סטייה שורש-ממוצע-ריבועי (RMSD) של <2.0 Å.
הערכה טיפולית של ג'יציטאין במודלים של עכברי OP+PD
גליציטין (טוהר ≥ 98%) הושג מספק ביוכימי מוסמך בדרגה אנליטית עבור ניסויים in vivo הוא איזופלבון טבעי הידוע כנוכח באנג'ליקה סיננסיס, עם תכונות אנטי דלקתיות ואוסטאו-פרוטקטיביות מדווחות26. דלקת חניכיים אוסטאופורוטית הושרה בעכברי C57BL/6 נקבות בנות 11 שבועות באמצעות כריתת שחלות דו-צדדית (OVX) ודלקת חניכיים הנגרמת על ידי קשירה. העכברים חולקו באקראי לארבע קבוצות (n = 6 לקבוצה):
בושה: ניתוח דמה + רכב (5% דימתיל סולפוקסיד [DMSO] בשמן זית, גבאז' אוראלי יומיומי)
OP+PD: דגם מחלה + רכב
OP+PD + גליציטין במינון נמוך (50 מ"ג/ק"ג): מודל מחלה + תרחיף גליציטין ברכב
OP+PD + גליציטין במינון גבוה (100 מ"ג/ק"ג): מודל מחלה + תרחיף גליציטין ברכב
ניתוח סטטיסטי
בוצעו בדיקות סטטיסטיות מסקנות, ונוצרו ייצוגי נתונים חזותיים ליצירת גרפים והדמיית נתונים. הנתונים המספריים בוטאו כממוצע ± SD. השוואות קבוצתיות הוערכו באמצעות מבחני t דו-זנביים לא מזווגים, תוך התחשבות בערכים עם &l 0.05 כמובהקים סטטיסטית. שיטות אלו הבטיחו את חוסן הנתונים ושיפרו את האמינות של התוצאות האנליטיות הבאות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרופיל פרוטאומי של קבוצות OP+PD
ניתוח פרוטאומי כמותי של סרום מחולי OP+PD (n=3) ובקרות בריאות (n=6) זיהה חלבונים לא מווסתים המעורבים בפתוגנזה של המחלה. ניתוח השוואתי חשף תשעה חלבונים מווסתים (APOL1, CST3, IGLV3-27, IGHV3-33, PF4, CLEC3B, SRGN, C6, SELL) ושישה חלבונים מווסתים (IGLV9-49, A2M, VWF, CETP, CD44, CDH13) בסרום OP+PD לעומת ביקורת (איור 2A,B). ניתוח רשת ביטוי משותף משוקלל של גנים (WGCNA) תיאר מודולי שעתוק הקשורים לפנוטיפ. האשכולות ההיררכיים שלנו של...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מחקר זה מציע מסגרת מחקר תרגומית המשלבת פרופיל פרוטאומי, אימות ביטוי גנים, מודלים של בעלי חיים in vivo ופרמקולוגיה של רשת כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחלואה הנלווית של אוסטאופורוזיס ודלקת חניכיים (OP+PD). ההשערה המרכזית היא ש-CD44 מווסת את ציר האיתות PI3K/Akt, ובכך מחמיר את אובדן העצם הדלקתי בתנאי OP+PD, וכי גליציטין, פלבנואיד מ-Angelica sinensis, עשוי להחליש תהליך זה על ידי עיכוב CD44. גישה משולבת זו מגשרת בין פתוגנזה מולקולרית לפרמקולוגיה צמחית ומקימה פלטפורמה לגילוי טיפולי בהפרעו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.
מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע והטכנולוגיה לתעשיית שירותי הבריאות של מחוז גאנסו, סין (מענק מס. GSWSKY2020-77), הקרן למדעי הטבע של מחוז גאנסו (מענק מס' 25JRRA314 ו-21JR7RA620), תוכנית הכישרונות המחוזית של גאנסו ותוכנית מחקר חממת הנוער של בית החולים המחוזי גאנסו (מענק מס' 23GSSYF-35).
תרומת המחברים:
ג'ינג צ'י ביצע את רוב העבודה הניסויית וניתוח הנתונים. יונצ'ינג פאנג תרם לאיסוף דגימות, איסוף נתונים וניתוח סטטיסטי. יו וואנג סייע בתכנון ניסויים וסיפק תמיכה טכנית. דאווי הו וג'ינג וואנג פיקחו במשותף על הפרויקט, תיקנו את כתב היד באופן ביקורתי עבור תוכן אינטלקטואלי חשוב, ואישרו את הגרסה הסופית. כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד הסופי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכות ELISA | ביוטכנולוגיה של שנחאי אנזים לינק | כימות ציטוקינים דלקתיים (TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-4, ALP, TRAP5b, TGF-β, VWF, CD44) | |
| ערכת מיצוי RNA | שנחאי יישנג ביוטכנולוגיה | מיצוי RNA בסרום | |
| ערכת סינתזת cDNA | שנחאי יישנג ביוטכנולוגיה | שעתוק הפוך בעל פעילות גבוהה | |
| ערכת qPCR | שנחאי יישנג ביוטכנולוגיה | הגברת PCR כמותית | |
| נוגדנים (ראשוניים/משניים) | טכנולוגיית איתות תאים / Abcam / האנגג'ואו שיאנלי ביוטכנולוגיה / בייג'ינג ג'ונגשאן ג'ינצ'יאו ביוטכנולוגיה | נוגדנים ראשוניים ספציפיים; β-actin בקרה פנימית; נוגדן משני IgG נגד ארנב עז | |
| ריאגנטים היסטולוגיים | ביוטיים ביוטכנולוגיה / שנגחאי שאנגשאנג | המטוקסילין– צביעת אאוזין ומתילן כחול | |
| מצע כימילומינסנט | יאקן ביוטכנולוגיה | זיהוי כתמים מערביים | |
| מערכת מיקרו-CT | Scanco Medical AG (Viva CT40) | ניתוח מיקרו-מבני ברזולוציה גבוהה | |
| מערכת LC-MS/MS | תרמו סיינטיפיק Q אקטיבי HF-X | ניתוח פרוטאומי ברזולוציה גבוהה | |
| תוכנה: MaxQuant (v2.1.0), אנדרומדה | מכון ברוד | עיבוד מקדים של נתוני פרוטאומיקה | |
| תוכנה: GSEA (v4.3.2) | מכון ברוד | ניתוח העשרה במסלול | |
| תוכנה: R (v4.0.3), WGCNA (v1.73), pheatmap (v1.0.12) | קרן R | מחשוב סטטיסטי, ניתוח רשתות, אשכולות, מפות חום | |
| תוכנה: AutoDock 4.2, AutoDockTools 1.5.7 | מכון המחקר סקריפס | עגינה מולקולרית והגדרת רשת | |
| תוכנה: Open Babel 3.1.1 | פרויקט בבל פתוח | אופטימיזציה של מבנה ליגנד | |
| תוכנה: PyMOL 2.5.2 | Schrö דינגר, LLC | הדמיית עגינה מולקולרית |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה