הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

PAK5 מעודד התקדמות קרצינומה של תאי קשקש הוושט המתגלה באמצעות פרופיל טרנסקריפטומי

349 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69085

⸱

16 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Center, The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University, 2Department of Radiology, The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University, 3Department of Pathology, The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג שיטה להערכת תפקוד PAK5 ב-ESCC, ומראה כי הביטוי המופרז שלו מנבא פרוגנוזה לקויה ומקדם התקדמות גידול דרך ציר האיתות PAK5-GAREM1.

תקציר

קרצינומה של תאי קשקשי הוושט (ESCC) היא גורם מוביל לתמותה הקשורה לסרטן ברחבי העולם, במיוחד באסיה. עקב היעדר תסמינים מוקדמים, רוב המטופלים מאובחנים בשלבים מתקדמים, מה שמגביל את יעילות הטיפול ומחמיר את התחזית. הבנת המנגנונים שמאחורי ESCC וזיהוי סמנים ביולוגיים או מטרות טיפוליות הם חיוניים לשיפור תוצאות המטופלים. קינאז חלבון 5 (PAK5) שמופעל על ידי P21, חבר במשפחת קינאזים חלבונים המופעלים על ידי מיטוגנים, היה מעורב במאירויות שונות על ידי ויסות מחזור התאים, נדידה ופלישה. עם זאת, תפקידו ב-ESCC נותר לא ברור. מחקר זה העריך את ביטוי PAK5 ברקמות ESCC וברקמות תקינות סמוכות באמצעות אימונוהיסטוכימיה וביצע ניתוח הישרדות קפלן-מאייר להערכת הקשר בין PAK5 לתחזית. מודלים של תאי ESCC עם ביטוי יתר והנקה של PAK5 הוקמו, ובוצעו בדיקות פונקציונליות, כולל CCK-8, יצירת מושבות ובדיקות טרנסוול. בנוסף, בוצע ריצוף mRNA לזיהוי מטרות במורד הזרם ומסלולי איתות המוסדרים על ידי PAK5. תוצאות אלו הראו כי ביטוי PAK5 היה גבוה באופן משמעותי ברקמות ESCC בהשוואה לרקמות תקינות והיה קשור לתחזית לקויה. בדיקות פונקציונליות חשפו כי PAK5 קידם התרבות תאי ESCC, יצירת מושבות, נדידה ופלישה, בעוד שניתוח טרנסקריפטומי הדגיש את GAREM1 כאפקטור מרכזי במורד הזרם. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-PAK5 תורם להתקדמות ESCC ועשוי לשמש כסמן ביולוגי פרוגנוסטי ומטרה טיפולית.

מבוא

בעולם, סרטן הוושט מדורג בין הממאירויות הקטלניות ביותר. בסין, קרצינומה של תאי קשקש הוושט (ESCC) מייצגת את תת-הסוג ההיסטולוגי הדומיננטי. למרות שהושגו התקדמויות טיפוליות, התחזית עבור חולי ESCC ממשיכה להיות עגומה, ומתבטאתבשיעור הישרדות של 10% עד 25% בלבד במשך 5 שנים. הדבר נובע בעיקר מהאתגרים בגילוי מוקדם ומהזמינות המוגבלת של טיפולים ממוקדים מולקולריתיעילים 2. בניגוד לגידולים מוצקים אחרים שבהם טיפולים ממוקדים הראו פוטנציאל משמעותי, גישות כאלה ב-ESCC עדיין בתחילת דרכן, מוגבלות בשל מחסור במטרות מולקולריות מעשיות.

PAK5, PAK מקבוצה II, משלב דינמיקת שלד ציטו-שלד ואיתות תומך הישרדות ונקשר לכימורזיסטנס במספר ממאירות 3,4,5,6,7,8,9,10,11. בהתחשב בתפקיד הבולט של איתות MAPK בביולוגיה של ESCC ובתגובה טיפולית 1,2,12, הועלתה ההשערה ש-PAK5 מווסת ב-ESCC ומקדם פנוטיפים ממאירים באמצעות מודולציה של איתות MAPK, מה שעשוי לכלול את GAREM1 כמתאם/רגולטור 13,14,15,16. נעשה שימוש ב-IHC כמותי, הפרעה גנטית פונקציונלית ופרופיל טרנסקריפטומי לבדיקת השערה זו.

ניהול ESCC כולל בדרך כלל שילוב של וושט וושטי, כימותרפיה וקרינות. בעוד שזופגקטומיה יכולה להיות מרפאת, היא טומנת בחובה סיכון גבוה לתחלואה 4,8. בנוסף, גם כימותרפיה וגם רדיותרפיה לעיתים קרובות לא מצליחות לחסל את כל תאי הסרטן, מה שמוביל לעמידות, הישנות וגרורות 8,9. אימונותרפיה הפכה לאחרונה למוקד מרכזי באונקולוגיה, והוכיחה יעילות בטיפול בסרטן מתקדם. עניין גובר זה מדגיש את הצורך הדחוף בסמנים ביולוגיים חדשים שיכולים לסייע באבחון מוקדם ובתכנון טיפול ל-ESCC. מחקרים קודמים הראו כי בני משפחת PAK אחרים, כמו PAK1 ו-PAK4, מקדמים התפשטות, פלישה ועמידות לטיפול ב-ESCC, מה שמדגיש את חשיבות משפחת הקינאז הזו בביולוגיה של ESCC. עם זאת, תפקידו של PAK5, PAK קבוצה II שנחקרה פחות, נותר לא מוגדר היטב, מה שמניע את המחקר הנוכחי17,18.

קינאז 5 מופעל על ידי P21 (PAK5), חבר בתת-משפחת PAK II, זוהה לראשונה כקינאז ספציפי למוח בשנת 2002. ממוקם על כרומוזום 20p12, PAK5 מקודד חלבון של כ-80 kDa ונמצא בעיקר במיטוכונדריה ובגרעין, שם הוא ממלא תפקידים מגוונים בוויסות התאים 10,11,13. תפקידיו במיטוכונדריה כוללים מטבוליזם ווויסות אנרגיה, בעוד שנוכחותו הגרעינית קשורה לשעתוק גנים ולבקרת מחזור התא. למרות ש-PAK5 נחקר פחות ממקביליו, הוא נחשב חיוני להתפתחות הנוירולוגית, הישרדות תאים והתקדמות סרטן10. ראוי לציין כי PAK5 היה מעורב בוויסות ציטוסקלטי, מנגנונים אנטי-אפופטוטיים והתרבות תאית12. ההגברת הוויסות שלה בתאי ניאופלסטיים נקשרה לעמידות מתפתחת לתרופות, מה שמקשר בין ביטוי יתר של PAK5 לעמידות מוגברת בתאי הגידול לכימותרפיה 10,11,13,14. עם זאת, התפקיד המדויק של PAK5 בהתקדמות ESCC נותר בלתי מושג. מחקר זה בוחן את השפעתו של PAK5 על הסביבה הטרנסקריפטומית של ESCC ואת ההשלכות התפקודיות שלו. בוצעה פרופילינג טרנסקריפטומי לזיהוי שינויים בביטוי גנים הקשורים לפעילות PAK5 בתאי ESCC. בנוסף, נוצר מודל תא ESCC עם מודולציה מבוקרת של PAK5 כדי להבהיר את תפקידו בצמיחת הגידול ובפוטנציאל הגרורות. בניגוד לאסטרטגיות גילוי ביולוגיות קונבנציונליות ב-ESCC שמתבססות בעיקר על מדידות תמלול ווסטרן בלוטינג או תמלול חד-מודאלי, זרימת העבודה הנוכחית משלבת אימונוהיסטוכימיה כמותית, פרופילינג טרנסקריפטומי ובדיקות פונקציונליות. גישה משולבת זו מאפשרת אימות מולקולרי ופנוטיפי בו-זמני, ומספקת תובנות מכניות תוך שיפור הרלוונטיות הביולוגית. בנוסף, הפרוטוקול מדגיש שחזוריות ניסויית, תוך שימוש בדגימות גידול זוגיות ורקמות סמוכות, הליכים סטנדרטיים של צביעת חיסון וקלטי RNA איכותיים (מספר שלמות RNA ≥ 7) לריצוף. תכונות אלו משפרות את עמידות ויישום הבדיקות במעבדות, במיוחד במחקרים שמטרתם להגדיר רשתות רגולטוריות מונעות קינאז בעלי משמעות קלינית ב-ESCC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים השני המסונף של האוניברסיטה הרפואית של היינאן (אישור מס' LW2022602), והסכמה מדעת התקבלה מכל משתתף בהתאם להצהרת הלסינקי. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. איסוף דגימות מטופלים ורקמות

בסך הכל נרשמו 40 מטופלים עם ESCC מאומת פתולוגית, כולם עם תפקוד כבדי וכלייתי תקין לפני הניתוח. דגימות גידול (קבוצה T) ורקמות תקינות סמוכות (קבוצה N; ≥2 ס"מ משפת הגידול) נאספו מיד לאחר כריתה ניתוחית. הרקמות הוקצו ב-4% פאראפורמלדהיד (PFA) ב-PBS בטמפרטורת החדר במשך 7 ימים לפני הטמעת הפרפין.

2. צביעה אימונוהיסטוכימית

בלוקים משובצים בפרפין חולקו ב-5 מיקרון ונאפו בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה. החתכים עברו דה-פרפין עם תחליף קסילן, הודרו מחדש באמצעות אתנול מדורג, ונחשפו לשאיבת אנטיגנים בבופר נתרן ציטראט של 10 מ"מ (pH 6.0) בטמפרטורה של 95-98 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. פעילות פרוקסידאז אנדוגנית הוקפאה עם 3% מי חמצן למשך 10 דקות, ולאחר מכן חסימה עם 5% סרום תקין למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. החתכים נדגרו במהלך הלילה (12-16 שעות) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדן ראשוני אנטי-PAK5 (דילול של 1:100, ראו טבלת החומרים). לאחר שטיפות PBS, הוסתפו עם נוגדן משני צמוד לפרוקסידאז של חזרת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, פותחו עם DAB עד הופעת צבע (1-5 דקות, במעקב במיקרוסקופ למניעת כתמים יתר), וצבועו עם המטוקסילין למשך 30-60 שניות. החתכים יובשו, הותקנו וצולמו תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. עוצמת הצביעה ויחס התאים החיוביים נמדדו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה עם לפחות חמישה שדות אקראיים בכל חתך (הגדלה של 200×). שיטת הכימות אימצה חישוב ציון H, עם הנוסחה: H-score = ∑ (דירוג עוצמת צביעה × אחוז התאים החיוביים) (עוצמה מדורגת כ-0 = שלילי, 1 = חלש, 2 = בינוני, 3 = חזק; אחוזים מסווגים כ-0-25%, 26-50%, 51-75%, 76-100%). כדי להבטיח אמינות, שני פתולוגים עצמאיים ביצעו ניקוד עיוור, כאשר ערך κ בין צופים ≥ 0.75. קריטריוני בקרת איכות יושמו בקפדנות: ביקורות חיוביות (רקמת ESCC חיובית ידועה ל-PAK5) וביקורות שליליות (נוגדן ראשוני שהוחלף ב-PBS) חייבות לעבור אימות; עוצמת צביעת הרקע חייבת להיות מתחת לסף שנקבע מראש (למשל, ציון H < 50); מקדם השונות (CV) של תוצאות צביעה בין אצולות כפולות חייב להיות <20% כדי לשלול שונות ניסיונית.

3. קווי תאים ותרבות

תאי KYSE-150 (ESCC אנושי) ו-HEK-293 (אריזה ויראלית) אומתו באמצעות פרופילינג קצר טנדם (STR) ואושרו כחסרי מיקופלזמה. תאי KYSE-150 גודלו בחומר RPMI-1640 שהושלמו ב-10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין). תאי HEK-293 נשמרו ב-DMEM עם אותם תוספים. התאים עברו תרבית משנה באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA כאשר הגיעו למפגש של 70%-80%, וזרעו לצפיפויות מתאימות 24 שעות לפני כל ניסוי.

4. בנייה וזיהום וקטורי לנטיוויראלי

וקטורים לנטיויראליים תוכננו כדי לבטא יותר מדי PAK5 (pLV-EF1α-PAK5-PGK-Puro) או להשתיק PAK5 (pLV-U6-shRNA-PAK5-PGK-Puro). תאי HEK-293 זרעו בצלחות של 10 ס"מ והועברו במפגש של 70%-80% עם פלסמיד ההעברה, פלסמידי האריזה (gag/pol ו-rev) ופלסמיד מעטפת (VSV-G) ביחס של 4:3:1 באמצעות תגובת טרנספקציה מבוסס שומנים, עם כמות DNA כוללת של ~20 מיקרוגרם לכל צלחת 10 ס"מ. המדיום הוחלף 6-8 שעות לאחר ההעברה. סופרנטנטים ויראליים נאספו ב-48 שעות ו-72 שעות, צנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 10 דקות להסרת פסולת, סיננו דרך פילטר של 0.45 מיקרון, ואוחסנו או מרוכזים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. לצורך טרנסדוקציה, תאי KYSE-150 זרעו יום אחד לפני ההדבקה ונחשפו לסופרנטנט ויראלי בריבוי זיהום (MOI) של 5-10 בנוכחות של 8 מיקרוגרם/מ"ל פוליברן. MOI הוגדר כיחס בין יחידות זיהום למספר התאים היעד. נערך ניסוי מקדים להערכת MOI באמצעות ספירת GFP או qPCR, ונבחר MOI של 5-10. המדיום הוחלף לאחר 12-16 שעות, ונוצרה עקומת הרג פורומיצין על ידי טיפול בתאים לא מומרת בריכוזי פורומיצין שנעו בין 0-4 מיקרוגרם/מ"ל במשך 72-96 שעות כדי לקבוע את הריכוז הקטלני המינימלי. הריכוז שנבחר לבחירה היה 1-2 מיקרוגרם/מ"ל, וריכוז התחזוקה היה 0.5-1 מיקרוגרם/מ"ל. תאים נבחרו עם פורומיצין (1-2 מיקרוגרם/מ"ל) החל 48 שעות לאחר מכן. ביטוי יתר או השתקה של PAK5 אומת על ידי RT-qPCR באמצעות פריימרים ספציפיים ל-PAK5 (קדימה 5′-CCAAAGCCTATGGTGTGGGGACCC-3′, הפוך 5′-AGGCCGTTGATGGGGTTC-3′) ו-GAPDH (קדימה 5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′, הפוך 5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′). הביטוי היחסי של PAK5 חושב בשיטת 2−ΔΔCt . כל הניסויים בוצעו עם לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים.

5. בדיקת כיד-קיימא של תאי CCK-8

הכדאיות של התאים הוערכה באמצעות ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8), המבוססת על הפחתת תגובת WST-8 על ידי דה-הידרוגנאזות תאיות. תאי KYSE-150 שגדלו לוגריתמית נזרעו ב-2,000 תאים לבאר בלוחות של 96 בארות בתווך מלא של 100 מיקרוליטר. ב-0 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות ו-96 שעות, נוספו 10 מיקרוליטר של תגובת CCK-8 (המכילה את WST-8) לכל באר. לאחר דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, נמדדה הספיגה ב-450 ננומטר (A450) באמצעות קורא מיקרופלט. בארות ריקות המכילות רק מדיום נכללו. כל קבוצת ניסוי כללה לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים, וכל מדידה בוצעה עם חמישה שכפולים טכניים.

6. מבחן היווצרות מושבות

תליות חד-תאיות של KYSE-150 נזרעו בכמות של 1,000 תאים לבאר בלוחות של 6 בארות ונתרבו במשך 14 ימים, כאשר המדיום הוחלף כל 2-3 ימים. המושבות קיבעו עם 4% PFA למשך 15 דקות, צובקו ב-0.1% קריסטל וויל ב-20% מתנול במשך 15 דקות, נשטפו במים ויובשו באוויר. מושבות שכללו יותר מ-50 תאים נספרו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, וקצב היווצרות המושבות חושב.

7. בדיקת פלישת טרנסוול

אינסרטים עם נקבוביות של 8 מיקרון צופו מראש במטריצת ממברנה בסיסית (50 מיקרוליטר לכל אינסרט, דילול של 1:8) ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה; בוצעה בקרת איכות לפני זריעת התאים: הוכנסו אינסרטים ריקים (ללא תאים) והוספות שליליות (ללא כימואטרקנט) לאימות תקפות הבדיקה, ואושרה אחידות שכבת מטריצת ממברנת הבסיס באמצעות בדיקה ויזואלית (או מדידת משקל לצורך בקרה מחמירה יותר). תאים היו רעבים לסרום בתווך FBS של 1% למשך 6-12 שעות, ו-2 תאים × 10⁵ למ"ל (200 מיקרוליטר לכל הכנסה) הוזרעו לתוך החדר העליון. התא התחתון הכיל 600 מיקרוליטר בינוני עם 20% FBS ככימואטרטנט. לאחר 24 שעות דגירה הוסרו תאים שלא נפלצו מהמשטח העליון, ותאים שפלשו על המשטח התחתון הוקבעו במתנול למשך 10 דקות וצבועו ב-0.1% קריסטל סגול למשך 15 דקות. תאים מוצבעים צולמו תחת מיקרוסקופ שדה בהיר ונספרו לפחות בחמישה שדות מיקרוסקופיים אקראיים בכל אינסרט (200× הגדלה); הספירה בוצעה בשיטה עיוורת (צוות הספירה לא היה מודע להקצאות הקבוצות) כדי למנוע הטיה סובייקטיבית.

8. זיהוי ציטומטרי זרימה של אפופטוזיס

תאים נאספו (כולל תאים צפים), נשטפו פעמיים עם PBS, והושמו מחדש בבופר קישור ב-1 ×-106 תאים למ"ל. אנקסין V-FITC (5 מיקרוליטר) ויודיד פרופידיום (5 מיקרוליטר) נוספו ל-100 מיקרולטר של המתלה, ואחריהם דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בחושך; לאחר הדגירה, נוסף 400 מיקרוליטר בופר קישור לכל דגימה. לפני ניתוח ציטומטריית זרימה, בוצעה התאמת פיצוי באמצעות בקרות צביעה בודדות (Annexin V-FITC עם תאים צבועים בודדים ותאי PI עם צביעה יחידה) כדי לבטל פליטת פלואורסצנטיות, ושער FSC/SSC הוגדר לבחירת תאים בודדים (למעט פסולת תאים ואגרגטים). הדגימות נותחו תוך שעה על ציטומטר זרימה המצויד בלייזר 488 ננומטר, עם לפחות 10,000 אירועים שנאספו בכל דגימה. מדדי אפופטוטיה נמדדו באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה: הוחל סף שער אחיד על כל הדגימות כדי להבטיח עקביות, ופרופורציות של תאי אפופטוטיה מוקדמים (Annexin V⁺/PI⁻) ותאי אפופטוטיה מאוחרים (Annexin V⁺/PI⁺) דווחו בנפרד כדי לאפיין את פרופיל האפופטוטי של כל קבוצה.

9. ריצוף RNA וניתוח ביואינפורמטיקה

ה-RNA הכולל הוצא והוערך לטוהר (A260/280 בין 1.8 ל-2.1) ולשלמות (RIN ≥7 כסף בקרת איכות). mRNA טוהר באמצעות חרוזי אוליגו(dT), פורק בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס במשך 5-7 דקות, והועתק לאחור ל-cDNA. הספריות הוכנו על ידי תיקון קצה, קישור מתאם והגברה של PCR (8-12 מחזורים), ורצפו על פלטפורמת Illumina ליצירת קריאות זוג של 150 bp בעומק של 30-50 מיליון זוגות קריאה לדגימה. הקריאות גוזרו והותארו לגנום הייחוס האנושי באמצעות STAR או HISAT2. הושגו ספירות גנים באמצעות featureCounts, ובוצעה ניתוח ביטוי דיפרנציאלי עם DESeq2, תוך יישום ספי FDR < 0.05 ו-|log 2 fold change| ≥ 1. ניתוח העשרה פונקציונלית של גנים מבוטאים באופן שונה בוצע באמצעות clusterProfiler למסלולי אונטולוגיית גנים ו-KEGG (עם Benjamini-Hochberg (BH) מתוקן FDR < 0.05), ונבנו רשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון באמצעות מאגר הנתונים STRING.

10. ניתוח סטטיסטי

נתונים רציפים הובעו כממוצע ± SD לפחות משלושה ניסויים עצמאיים. השוואות בין שתי קבוצות בוצעו עם מבחני t דו-זנביים ללא זוגיות, והשוואות בין שלוש קבוצות או יותר בוצעו עם ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי. מבחנים לא-פרמטריים יושמו במידת הצורך. התפלגויות ההישרדות הוערכו באמצעות ניתוח קפלן-מאייר עם מבחני לוג-ראנק. לנתוני RNA-seq בוצעו תיקון בדיקות מרובות באמצעות שיטת בנג'מיני-הוכברג. ערכי p מדויקים מדווחים באגדות איורים; מובהקות סטטיסטית נחשבה ב-P < 0.05, כאשר * מציין p < 0.05 ו**מציין p < 0.01.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

PAK5 מתבטא מאוד ב-ESCC ומקושר לתחזית לקויה
איור 1 ממחיש את זרימת העבודה הכוללת, מהאימות הקליני של PAK5 ועד לניתוח תפקודי וטרנסקריפטומי, שמזהה את GAREM1 כמטרה במורד הזרם. כדי לבדוק את ההשערה ש-PAK5 מקדם התקדמות ESCC על ידי ויסות מסלול MAPK באמצעות GAREM1, נבדקו דפוסי הביטוי של PAK5 ברקמות ESCC והקשר שלהם לתחזית קלינית. ראשית, מערך הנתונים של ביטוי גנים GSE269447, שמקורו במאגר Gene Expression Omnibus (GEO), שימש לסינון גנים (DEGs)...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מספק בחינה מעמיקה של תפקיד PAK5 בהתקדמות קרצינומה של תאי קשקשי הוושט (ESCC) באמצעות שילוב דגימות קליניות, בדיקות פונקציונליות וניתוח טרנסקריפטומי. ממצאים אלו מרחיבים את ההבנה לגבי מעורבות PAK5 ב-ESCC, ומדגישים את הפוטנציאל שלה הן כסמן פרוגנוסטי והן כמטרה טיפולית.

הביטוי המוגזם הבולט של PAK5 ברקמות ESCC והקשר שלו להישרדות חלשה יותר של מטופלים תואמים ממצאים מסרטנים אחרים, שבהם PAK5 נקשר להתקדמות הגידול ולפרוגנוזה לקויה 10,11<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים או מערכות יחסים אישיות שיכלו להיראות כמשפיעות על העבודה המדווחת במאמר זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדעים הטבעיים של מחוז היינאן בסין (מענק מס' 822QN474).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת גילוי אפופטוזיס Annexin V-FITCביוטכנולוגיה ביוטייםC1062Sערכת צביעת זיהוי אפופטוזיס
נוגדן אנטי-PAK5אבקאםab110069נוגדן ראשי ל-IHC, דילול 1:100
מערכת אלקטרופורזה אוטומטיתאג'ילנטביואנלייזר 2100הערכת שלמות ה-RNA
ערכת סינתזת cDNAInvitrogen1896649ערכת תמלול הפוך
תמיסת קריסטל סגולסיגמא-אלדריץ'C3886צביעת צבע למושבות ולפלישה
DMEM מדיוםגיבקו (תרמו פישר)11965092מדיום תרבית תאים
סרום בקר עוברי (FBS)גיבקו (תרמו פישר)16000044תוסף תרבית תאים
ציטומטר זרימהBD ביוסיינססFACSCanto IIמכשיר לניתוח תאים
פריזמת GraphPadתוכנת GraphPadגרסה 8תוכנת ניתוח סטטיסטי וגרפים
H& ערכת צביעת EסולרביולוגיהG1120תמיסת צביעת המטוקסילין ואאוזין
IgG אנטי-עכברוש מנוצל עם HRPאבקאםab150165נוגדן משני ל-IHC
סיקוונסר Illumina NovaSeqאילומינהNovaSeq 6000פלטפורמת רצף בתפוקה גבוהה
קו התאים KYSE-150בנק RIKEN CellRCB2057קו תאי קרצינומה קשקשית בוושט אנושי
ליפופקטמין 3000תרמופישרL3000008תגובת טרנספקציה
קורא מיקרופלטביו-טק אינסטרומנטסELx808מכשיר מדידת ספיגה
DynabeadTM Oligo(dT)25sתרמו פישר סיינטיפיק61005לצורך טיהור mRNA
פניצילין-סטרפטומיציןגיבקו (תרמו פישר)15140122אנטיביוטיקה לתרבות תאים
פרופידיום יודיד (PI)סיגמא-אלדריץ'P4864צבע צביעת DNA
RPMI-1640 בינוניגיבקו (תרמו פישר)11875093מדיום תרבית תאים
ספקטרופוטומטרתרמו פישרNanoDrop ND-1000ריכוז RNA ומדידת טוהר
תוכנת SPSSIBMגרסה 23תוכנת ניתוח סטטיסטי
תוספות טרנסוולקורנינג3422תוספות מבחן פלישה לתאים

מקורות

  1. Chen, W., et al. Cancer statistics in China, 2015. CA Cancer J Clin. 66 (2), 115-132 (2016).
  2. Pennathur, A., Gibson, M. K., Jobe, B. A., Luketich, J. D. Oesophageal carcinoma. Lancet. 381 (9864), 400-412 (2013).
  3. Zhang, D. G., et al. P21-activated kinase 5 potentiates the chemoresistant phenotype of liver cancer. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 47(2021).
  4. Kumar, R., Sanawar, R., Li, X., Li, F. Structure, biochemistry, and biology of PAK kinases. Gene. 605, 20-31 (2017).
  5. Wang, X. X., et al. PAK5-EGR1-MMP2 signaling controls the migration and invasion in breast cancer cell. Tumour Biol. 34 (5), 2721-2729 (2013).
  6. Li, D., Yao, X., Zhang, P. The overexpression of p21-activated kinase 5 (PAK5) promotes paclitaxel-chemoresistance of epithelial ovarian cancer. Mol Cell Biochem. 383 (1-2), 191-199 (2013).
  7. Zhang, D. G., et al. P21-activated kinase 5 affects cisplatin-induced apoptosis and proliferation in hepatocellular carcinoma cells. Tumour Biol. 36 (5), 3685-3691 (2015).
  8. Li, T. T., et al. Microrna-138-1-3p sensitizes sorafenib to hepatocellular carcinoma by targeting PAK5 mediated β-catenin/ABCB1 signaling pathway. J Biomed Sci. 28 (1), 56(2021).
  9. Huo, F. C., Pan, Y. J., Li, T. T., Mou, J., Pei, D. S. PAK5 promotes the migration and invasion of cervical cancer cells by phosphorylating satb1. Cell Death Differ. 26 (6), 994-1006 (2019).
  10. Zhang, Y. C., et al. PAK5-mediated phosphorylation and nuclear translocation of nf-κb-p65 promotes breast cancer cell proliferation in vitro and in vivo. J Exp Clin Cancer Res. 36 (1), 146(2017).
  11. Chen, S., et al. Vaccinia-related kinase 2 blunts sorafenib's efficacy against hepatocellular carcinoma by disturbing the apoptosis-autophagy balance. Oncogene. 40 (19), 3378-3393 (2021).
  12. Cao, J. X., Lu, Y. Targeting CDC7 improves sensitivity to chemotherapy of esophageal squamous cell carcinoma. Onco Targets Ther. 12, 63-74 (2019).
  13. Blagoev, B., Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. Nat Biotechnol. 22 (9), 1139-1145 (2004).
  14. Kratchmarova, I., Blagoev, B., Haack-Sorensen, M., Kassem, M., Mann, M. Mechanism of divergent growth factor effects in mesenchymal stem cell differentiation. Science. 308 (5727), 1472-1477 (2005).
  15. Olsen, J. V., et al. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell. 127 (3), 635-648 (2006).
  16. Tashiro, K., et al. a novel adaptor protein for growth factor receptor-bound protein 2, contributes to cellular transformation through the activation of extracellular signal-regulated kinase signaling. J Biol Chem. 284 (30), 20206-20214 (2009).
  17. Zou, X., et al. PRMT5-PAK1 signaling participates in metastasis and is associated with poor prognosis in human esophageal carcinoma. Anticancer Res. 44 (2), 593-604 (2024).
  18. Wei, Y., et al. Nuplazid suppresses esophageal squamous cell carcinoma growth in vitro and in vivo by targeting PAK4. Br J Cancer. 126 (7), 1037-1046 (2022).
  19. Nakagawa, S., et al. An organoid library of human esophageal squamous cell carcinomas (ESCCs) uncovers the chemotherapy-resistant ESCC features. Commun Biol. 8 (1), 507(2025).
  20. Huang, H., et al. P21-activated kinase 4 promotes the progression of esophageal squamous cell carcinoma by targeting lasp1. Mol Carcinog. 60 (1), 38-50 (2020).
  21. Zhong, H., et al. Overexpression of microrna-19a-3p promotes lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma via the rAC1/CDC42-PAK1 pathway. Transl Cancer Res. 10 (6), 2694-2706 (2021).
  22. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. Clusterprofiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביטוי PAK5ביומרקר פרוגנוסטימטרה טיפוליתפרוליפרציה של תאיםנדידת תאיםאימונוהיסטוכימיהניתוח קפלן-מייררצף mRNA
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.