בידוד וטיהור של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים באמצעות פרפוזיה של לנגנדורף ושקיעת כבידה

סיכום

מחקר זה נועד לאופטימיזציה ולייעל את תהליך החילוץ עבור קרדיומיוציטים של עכבר בוגרים, במטרה הסופית לשפר את שיטות המחקר במחלות לב וכלי דם. פרוטוקול זה משיג ביעילות קרדיומיוציטים בעלי חיוניות וטוהר גבוהים בזמן עיבוד קצר יותר, ומאפשר ניסויים אמינים יותר ומאיץ התקדמות טיפולית.

תקציר

מחלות לב וכלי דם נותרות אתגר בריאותי עולמי משמעותי, ויוצרות צורך קריטי במודלים אמינים במבחנה. מחקר זה מציג פרוטוקול אופטימלי לבידוד ותרבות של קרדיומיוציטים בוגרים של עכברים, כדי להתמודד עם מגבלות של זיהום חיוניות נמוכה ולא-קרדיומיוציטים בשיטות קיימות. הפרוטוקול מבוסס על פרפוזיה לנגנדורף רטרוגרדית, תוך שימוש בהפארין נתרן לנוגדי קרישה ושימוש בקולגנאז סוג II בלבד (1.2 מ"ג/מ"ל) לעיכול. קרדיומיוציטים טוהרו באמצעות שקיעת כבידה וגודלו על משטחים מצופים למינין. שיטה זו הניבה באופן עקבי 8.75 ± 0.36 ×-10⁵ קרדיומיוציטים ללב עם אחוז גבוה של תאים בצורת מוט (91.2% ± 2.11%), וטוהר גבוה (אחוז תאי cTNT⁺DAPI⁺ ביחס לתאי DAPI⁺ היה כ-97.47% ± 1.365%), שהפגינו מבנים סרקומריים ברורים. על ידי מתן שיטה סטנדרטית וניתנת לשחזור לקבלת קרדיומיוציטים בוגרים באיכות גבוהה, פרוטוקול זה מגשר ביעילות על הפער בין מחקרים במבחנה לרלוונטיות פתופיזיולוגית, ובכך תומך במחקר קרדיווסקולרי מתקדם.

מבוא

מחלות לב וכלי דם נשארות הגורם המוביל לתמותה ברחבי העולם¹. קרדיומיוציטים, כמוקד מרכזי במחקר הלב, שימשו מזה זמן רב ככלים חיוניים לחקר פיזיולוגיה ופתולוגיה של הלב². בעוד שקווי תאי קרדיומיוציטים זמינים מסחרית והקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC-CMs) שהפכו לאחרונה לפופולריים, מציעים יתרונות גדולים יותר מבחינת נגישות וקלות מניפולציה ^3,4,5, קרדיומיוציטים ראשוניים מבודדים מחוץ לחיים מראים קורלציה מבנית ותפקודית מעולה עם מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים של הלב. לכן, שליטה בטכניקות לבידוד קרדיומיוציטים במבחנה היא בעלת חשיבות עליונה.

קרדיומיוציטים מציגים שינויים מורפולוגיים ותפקודיים מובחנים לאורך כל ההתפתחות. ראוי לציין שתאים אלו שומרים על פוטנציאל רבייה במהלך ההתפתחות העוברית ותקופת התינוקות (בתוך 7 ימים לאחר הלידה), אך יכולת ההתחדשות הזו אובדת לצמיתות לאחר מכן⁶. במהלך הבשלות לאחר הלידה, הקרדיומיוציטים עוברים שינוי מורפולוגי משמעותי, ולבסוף רוכשים את הפנוטיפ הבוגר האופייני שלהם עד גיל חודשיים - עם מורפולוגיה בצורת מוט עם מבנה סרקומרי מאורגן^{מאוד 7,8}. תכונות אלו התלויות בשלב ההתפתחותי מדגישות את החשיבות הקריטית של שימוש בקרדיומיוציטים של עכבר בוגרים למחקרים מכניים של פתופיזיולוגיה לבבית.

קריטי לקידום תחום זה הוא רכש אמין של קרדיומיוציטים באיכות גבוהה, במיוחד תאים שמקורם במבוגרים המדמים בדיוק את פיזיולוגיית הלב האנושית. פרוטוקולי הבידוד הנוכחיים לקרדיומיוציטים של עכברים בוגרים מתמודדים עם מספר אתגרים מתמשכים: (i) פגיעה בחיוניות התאים, (ii) מאפייני אוכלוסייה הטרוגניים, ו-(iii) פרוצדורות טכניות תובעניות - כולם יחד מעכבים את התקדמות המחקר ^9,10. דבר זה מדגיש את הצורך הדחוף לאופטימיזציה של שיטות בידוד כדי להשיג גם תפוקה טובה יותר וגם טוהר, ובכך לספק פלטפורמות תאיות פיזיולוגיות רלוונטיות יותר לחקר מחלות לב וכלי דם.

באמצעות אופטימיזציה שיטתית של פרמטרי הפרפוזיה, פרוטוקולי עיכול אנזימטיים ונוסחאות תגובה, מחקר זה הצליח לבסס שיטה משופרת לבידוד וטיפוח קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים. הפרוטוקול האופטימלי מניב קרדיומיוציטים עם שלמות מורפולוגית שמורה היטב, המאופיין ביחס גבוה בצורת מוט ומבנים סרקומריים ברורים. התקדמויות אלו מספקות פלטפורמה ניסויית איתנה לחקירה מעמיקה של פתופיזיולוגיה של קרדיומיוציטים, ומסייעות באופן משמעותי על מחקר מחלות לב וכלי דם המתמקדות במנגנוני תאים של שריר הלב.

פרוטוקול

כל ההליכים של בעלי החיים במחקר זה בוצעו בקפדנות בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC) שאושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים העממי דקינג. המחקר השתמש בעכברים זכרים בני 8-12 שבועות מסוג C57BL/6 שנרכשו מחברת GemPharmatech Co., Ltd. כל בעלי החיים הוחזקו במתקני הגנה בדרגת SPF עם פרמטרים סביבתיים העומדים בסטנדרטים הלאומיים (טמפרטורת החדר 22 ± 2 מעלות צלזיוס, לחות יחסית 50 ± 10%, מחזור אור/חושך של 12/12 שעות). במהלך כל הניסויים, המחקר הזה דבק בקפדנות בעקרונות "3R" (החלפה, הפחתה, עידון) ויישם נהלים סטנדרטיים, כולל הרדמה והרדמה למזעור סבל בעלי חיים.

הערה: בקצרה, הלב השלם מנותק במהירות מחלל החזה של העכברים ונחשף לפרפוזיה רטרוגרדית עם תמיסת קולגנאז סוג II דרך מכשיר לנגנדורף לעיכול אנזימטי של המטריצה החוץ-תאית. לאחר עיכול רקמתי מלא, שריר הלב המתרכך מתנתק בזהירות לתלייה חד-תאית. ההשעיה התאית המתקבלת מסוננת ברצף להסרת שברי רקמה לא מעוכלים, ולאחר מכן מתבצעת השקעה בכוח הכבידה להעשיר קרדיומיוציטים חיים. הקרדיומיוציטים המטוהרים יכולים לשמש ליישומים ניסיוניים עתידיים.

1. הכנת מכשיר פרפוזיה לנגנדורף

הערה: למערכת לנגנדורף נפח צינורות כולל של 15.5 מ"ל. קצב זרימת הפרפוזיה הוא 3.5 מ"ל לדקה עבור פרפוזיה לבבית ו-10-15 מ"ל לדקה לשטיפה במערכת.

1. שטוף את מערכת הפרפוזיה לנגנדורף עם 50 מ"ל של 75% אתנול.
   הערה: בצע ניקוי חודשי של צינורות זכוכית עם 1 M HCl כדי להבטיח סטריליות.
2. שטוף עם 250 מ"ל של DDH₂O סטרילי כדי להסיר שאריות אתנול ולסלק בועות אוויר.
3. הגדר את טמפרטורת אמבט המים ל-42 מעלות צלזיוס. הפעל את המשאבה כדי להתחיל חימום במעגל ומילוי את חלל הצינור החיצוני של צינור הסרפנטין במים חמים.
   הערה: זה מבטיח שהפרפוזאט יגיע ללב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

2. הכנת בופר

1. הכינו בופר תמיסת קרבס-ביקרבונט (KB), בופר פרפוזיה (PB), בופר עיכול (DB), מדיום ציפוי מיוציטים (MPM) ומדיום תרבית מיוציטים (MCM) בהתאם לנוסחאות המפורטות בטבלה 1.
   הערה: הכינו טרי ביום השימוש.
2. קירור מוקדם של 10 מ"ל של בופר KB על קרח.
3. מלא את הלומן ב-PB. הגדר את קצב הזרימה ל-3.5 מ"ל לדקה ומדד טמפרטורת שפכים (37 מעלות צלזיוס היא אופטימלית).
4. שטוף 7 מ"ל DB לתוך הצינור, ואז סגור את קו הפרפוזיה.
5. הכינו תמיסת הפארין נתרן (0.5%, 62.5 KU) וטענו 300 מיקרולטר למזרק אינסולין.
6. עליקוט 10 מ"ל PB ו-10 מ"ל KB לשני צלחות פטרי נפרדות ומקררים אותן מראש על הקרח.
7. מניחים מסננת תאים של 100 מיקרון על מכסה צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, הרטיבו אותו מראש עם 1 מ"ל KB, וקבע אותו על צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.

3. הוצאת לב וקנולציה

הערה: בפרוטוקול זה, כפפות סטריליות, מכשירים, גזה ומקליות כותנה שימשו לאורך כל ההליך כדי למזער זיהום חיצוני. בעוד שטכניקת אספטיקה מלאה חיונית לתרבות תאים ראשונית, כאן היא שימשה לתמיכה ברווחת בעלי החיים ושלמות הרקמה לניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים במורד הזרם, ולא לשמירה על עקרות לבידוד תאים.

1. הרדמו את העכבר באמצעות הזרקה תוך-מצפקית של 80 מ"ג/ק"ג פנטוברביטל נתרן (דרגת פרמצבטיה) בשילוב עם 5 IU/g הפארין נתרן. יש לעקוב מקרוב עד להשגת הרדמה עמוקה. צבוט את אצבעות הרגליים של העכבר וצפה בהיעלמות רפלקס הצביטה של האצבע כדי לאשר את הצלחת ההרדמה.
2. הסרת שיער חזה באמצעות קרם הסרת שיער.
3. תקן את העכבר על לוח קצף וחטא את עור החזה עם 75% אלכוהול.
4. הרימו את עור החזה עם מלקחיים, ובצעו חתך בתהליך הזיקפואיד.
5. הרימו את הזיפויד וחתכו את הצלעות דו-צדדית לכיוון אזורי האקסילרי, ואז חתכו לחלוטין את הסרעפת.
   הערה: הימנע מפגיעה בלב.
6. השתק את עצם החזה והצלעות באמצעות מלקחיים המוסטטיים כדי לחשוף את הלב במלואו.
7. סופג דם, והזיז בעדינות את הכבד לכיוון הגפיים האחוריות עם רקמה. השתמש במקליות כותנה בזהירות כדי לשלוט בלב ולחשוף את וריד הנוב התחתון.
8. הזרקו 300 מיקרוליטר של תמיסת נפרן הפארין (משלב 2.5) לתוך הווריד הנוב התחתון באמצעות מזרק האינסולין המוכן.
   הערה: יש להיזהר למנוע כניסת בועות אוויר.
9. כריתה את רקמת התימית, ואז חתך את הוורידים והעורקים הסובבים. העבר את הלב מיד לבופר PB מקורר מראש (משלב 2.6).
   הערה: הסרת תימוס משפרת את נראות האאורטה. שמרו על קטע אאורטה במהלך כריתתה. התכווצות שריר הלב הואטה על ידי תמיסת PB מקוררת מראש. כריתת לב תחת הרדמה מביאה להמתת חסד הומאנית.
10. באמצעות מיקרופוספס, אוחז באאורטה והתקן אותו על הקנולה של מערכת הפרפוזיה של לנגנדורף. אבטח עם תפר משי 5-0.
    הערה: בצע את השלב הזה במהירות. ודא שמערכת הפרפוזיה כבויה בזמן התקנת הלב.

4. פרפוזיה קרדיאלית

1. הפעל את מערכת הפרפוזיה והתחל תזמון למשך 2 דקות ו-30 שניות. במהלך תקופה זו, השפכים מורכבים ממאגר PB ואינם דורשים איסוף.
2. בסיום המרווח של 2 דקות ו-30 שניות, התחל לאסוף ולמחזור את בופר ה-DB תוך תזמון של 15 דקות.
   הערה: יש לעקוב אחרי מצב שריר הלב - עיכול מיטבי מיוצג על ידי ירידה בגמישות הרקמה ובשקיפות מוגברת. אם נראה שהעיכול לא שלם, משך הזמן יכול להיות מוארך במידה מתונה, אך לא לעלות על 20 דקות בסך הכל כדי למנוע נזק לקרדיומיוציטים.
3. לאחר התקופה המוגבלת, עברו מ-DB ל-PB buffer והמשיכו את הפרפוזיה עוד 4 דקות ו-30 שניות. השפכים בשלב זה מכילים בופר DB; אסוף את זה.
4. סיימו את הפרפוזיה על ידי כיבוי המערכת לאחר מרווח התזמון הסופי.

5. דיסוציאציה וטיהור תאים

1. הסר את הלב מהקנולה והעבר אותו לבופר KB מקורר מראש (מוכן בשלב 2.6).
   הערה: העיכול האנזימטי הופסק על ידי העברה מיידית של הלב לבופר KB. זה מדלל במהירות את האנזים הנותר, מונע עיכול יתר, ומבטיח חיוניות גבוהה של התאים.
2. באמצעות מספריים דקים, כריתה בזהירות את רקמות העלייה והאאורטה, תוך שמירה רק על שריר הלב.
3. מפרקים מכנית את רקמת שריר הלב לשברים קטנים (<1 מ"^{מ 3}) באמצעות מיקרופורספים.
4. נשפו בעדינות את שברי הרקמה באמצעות מטפטפת של 2 מ"ל כדי להשיג תלייה חד-תאית.
   הערה: נהגו בזהירות רבה במהלך הנשיפה כדי לשמור על מורפולוגיית הקרדיומיוציטים בצורת מוט. הימנע משימוש בקצות פיפטות סטנדרטיות, שכן הקוטר הצר שלהם עלול לפגוע בשלמות התא באופן מכני.
5. מסננים את המתלה של התא המתקבל דרך מסננת תא ה-100 מיקרון הרטובה מראש (מורכבת בשלב 2.7) לצינור בנפח 50 מ"ל.
6. העבר את המתלה המסונן לצינור של 15 מ"ל ואפשר לקרדיומיוציטים לשקוע באמצעות שקיעת כבידה (15 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
   הערה: שטח הפנים הבסיסי המופחת של צינורות בגודל 15 מ"ל משפר משמעותית את יעילות התאוששות התאים בהשוואה לצינורות של 50 מ"ל.
7. שואף בזהירות את הסופרנאנט, החזיר את הקרדיומיוציטים הגלגולים ל-10 מ"ל של בופר KB קר באמצעות פיפטת העברה של 2 מ"ל, וחזר על השקיעה (15 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
8. חזור על השלבים 5.4-5.7 כדי לקבל הכנה מטוהרת של קרדיומיוציטים שלמים בצורת מוט המתאימים ליישומים.

6. תרבית תאים

1. ציפוי את מנות התרבות ב-10 מיקרוגרם/מ"ל למינין ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
   הערה: כדי למזער נזק מכני לקרדיומיוציטים בצורת מוט ולהפחית את זמן העיבוד הארוך הקשור לציפוי דיפרנציאלי, מחקר זה השתמש בציפוי למינין במקום ציפוי דיפרנציאלי, אסטרטגיה שלא רק משפרת את יעילות ההתקשרות התאית אלא גם משמרת את המאפיינים הפיזיולוגיים הטבעיים של הקרדיומיוציטים.
2. החזירו את הקרדיומיוציטים ל-4 מ"ל של MPM מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס). לאחר הסרת תמיסת הלמינין, זרעו את הקרדיומיוציטים בכלים המצופים. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 2%_CO2 למשך שעה. התבוננו במורפולוגיה, בגודל ובצפיפות התאים תחת מיקרוסקופ.
3. לאחר הדגירה, יש להוציא בזהירות את ה-MPM ולהחליפו ב-MCM מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס). שמרו על דגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם 2%_CO2 למשך 24 שעות.
4. לאחר 24 שעות, בדוק את הקרדיומיוציטים לאישום שלמות מבנית ומורפולוגיה.
   הערה: שמרו על טכניקת אספטיקה קפדנית לאורך כל ההליך.
   אזהרה: קולגנאז סוג II עלול לגרום לאלרגיות נשימתיות, גירוי בעור ובעיניים. הקפידו לפעול באזור מאוורר היטב ולהימנע משאיפת אבק או במגע עם עור וריריות. כל רקמות הלב של העכברים שהושלכו, דגימות דם וכל אספקה חד-פעמית שבאה במגע עליהן חייבות להיאסף כפסולת ביו-מסוכנת במיכלים ייעודיים ועמידים לדליפות המסומנים בסמל הסכנה הביולוגית. חומרים אלו עוברים לאחר מכן הליכי ניקוי וטיפול מרכזיים.

תוצאות

תהליך הבידוד והתרבית של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים מודגים בפרוטוקול, כאשר הכלים והמערכות הנדרשות מוצגים באיור 1. הערכה מורפולוגית גילתה כי קרדיומיוציטים מבודדים טריים, כמו גם אלו שגודלו במשך שעה ו-24 שעות, כולם הציגו מורפולוגיה אופיינית בצורת מוט או פוזיפורם עם פסים ברורים (איורים 2A-C). צביעת אימונופלואורסצנציה עבור טרופונין T קרדיאלי (cTNT) בקרדיומיוציטים מתורבתים במשך 24 שעות הראתה טוהר תאים גבוה

דיון

מחקר זה מציג פריצת דרך מתודולוגית משמעותית במחקר קרדיווסקולרי על ידי קביעת פרוטוקול אופטימלי לבידוד ותרבות קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים. באמצעות שיפור שיטתי של הרכב הבופר ופרמטרי העיכול האנזימטי, גישה זו משפרת משמעותית את אמינות מערכת התרביות תוך שיפור טוהר וחיוניות הקרדיומיוציטים. ההתקדמות הטכנולוגית הזו מספקת פלטפורמה איתנה למידול מחלות לב וכלי דם באמצעות קרדיומיוציטים ראשוניים של מבוגרים.

באופן כללי, עיכול עדין מקדם את ההיצמדות וההישרדות של הקרדיומיוציטים...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BDM	תאגיד אלאדין המדעי, שנגחאי, סין	D111028
BSA	תאגיד אלאדין המדעי, שנגחאי, סין	B265994
C57BL/6 עכברים	חברת GemPharmatech בע"מ		8– זכר בן 12 שבועות
CaCl2	תאגיד אלאדין המדעי, שנגחאי, סין	C431202
קולגנאז סוג II	תאגיד וורת'ינגטון ביוכימיק (ארה"ב)	LS004176	LOT#:43D23502    יחידות פעילות אנזימים: 270u/mg dw
FBS	ביוטכנולוגיה ביוטיים, סין	C0226
גלוקוז	תאגיד אלאדין המדעי, שנגחאי, סין	D639737
HEPES	סיגמא-אלדריץ'	H7006
KCl	תאגיד אלאדין המדעי, שנגחאי, סין	P112134
KH2PO4	תאגיד אלאדין המדעי, שנגחאי, סין	P104075
L-גלוטמין	תרמו פישר סיינטיפיק	25030081
MEM	תרמו פישר סיינטיפיק	11095080
MgSO4	תאגיד אלאדין המדעי, שנגחאי, סין	M116444
Na2HPO4	תאגיד אלאדין המדעי, שנגחאי, סין	S274390
NaCl	תאגיד אלאדין המדעי, שנגחאי, סין	C111547
NaH2PO4	תאגיד אלאדין המדעי, שנגחאי, סין	S108339
NaHCO3	תאגיד אלאדין המדעי, שנגחאי, סין	S112338
פניצילין-סטרפטומיצין (100x)	ביוטכנולוגיה ביוטיים, סין	C0222
מיקרוסקופ תרבית תאים הפוכית של פרימוברט	קרל צייס
טורין	תאגיד אלאדין המדעי, שנגחאי, סין	T103829