הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה רדיוכימית של פעילות אנזים גליקוגן סינתאז ברקמות בעלי חיים

436 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69103

⸱

24 באוקטובר 2025

 , 
1Indiana University School of Medicine-Muncie and Ball State University

במאמר זה

סיכום

בדיקת רקמת בעלי החיים משתמשת בזיהוי נצנוץ גרעיני כדי לקבוע את הפעילות האנזימטית של גליקוגן סינתאז על ידי מדידת השילוב של גלוקוז מסומן רדיו בגליקוגן.

תקציר

גליקוגן הוא מטבוליט חשוב לתאים אוקריוטיים רבים, חלק בלתי נפרד מאחסון אנרגיה ושחרור אנרגיה מהיר. בניית המולקולה תלויה בגליקוגן סינתאז, אנזים מווסת מאוד שתפקידו העיקרי הוא להקל על ההצמדה הרציפה של יחידות גלוקוז בפולימר גליקוגן הולך וגדל. אנזים זה מופעל באופן אלוסטרי על ידי גלוקוז-6-פוספט ומעוכב במספר אתרים על ידי זרחון. ידע על פעילות אנזימטית של גליקוגן סינתאז הוא מרכיב מרכזי בהבנת חילוף החומרים של גליקוגן, רמות האנרגיה בשרירים והפרעות מטבוליות כגון סוכרת ומחלות אגירת גליקוגן. מתוארת כאן שיטה רגישה ויעילה ביותר לקביעת הפעילות של גליקוגן סינתאז ברקמת שריר בעלי חיים על ידי מדידת כמות הגלוקוז המשולב, מגלוקוז [14C]-UDP-גלוקוז, לתוך מולקולות גליקוגן. הליך זה משתמש ברדיואקטיבי 14C וידרוש אישור מתאים ושטח מעבדה לשימוש וסילוק. הליך זה ידרוש גם גישה לדלפק נצנוץ נוזלי.

מבוא

גליקוגן, פוליסכריד מסועף מאוד המורכב מיחידות גלוקוז, משמש כמאגר אנרגיה חשוב ברקמות שונות, כולל שרירים, כבד ומוח1. הסינתזה והפירוק שלו מתוזמרים על ידי מערכת מורכבת של אנזימים מיוחדים וחלבונים רגולטוריים. חיוני לביוסינתזה שלו הוא האנזים גליקוגן סינתאז (GYS), ממנו ישנם שני איזופורמים (GYS1 ו-GYS2). GYS1 הוא אנזים רגולטורי האחראי ישירות ליצירת גליקוגן מגלוקוז בתאים שאינם כבד, בעוד ש-GYS2 מתפקד בכבד. תהליך זה, המכונה גליקוגנזה, הוא הוספה רציפה של יחידת גלוקוז בודדת לשרשרת גליקוגן הולכת וגדלה. GYS מזרז את העברת הגלוקוז מגלוקוז הביניים אורידין דיפוספט גלוקוז (UDP-גלוקוז) לקצה שרשרת הגליקוגן, ויוצר קישור אלפא-1,4-גליקוזיד2. בתיאום עם האנזים המסתעף גליקוגן, תגובה זו מרחיבה את מולקולות הגליקוגן, ומספקת הן אחסון אנרגיה יעיל והן שחרור.

קיימות טכניקות בדיקה למדידת פעילות האנזים, כאשר אחת הקבוצות הנפוצות יותר של שיטות מורכבת מאלו של הזן הספקטרופוטומטרי 3,4. בדיקות אלו מסתמכות בדרך כלל על מערכת של תגובות מצומדות עקיפות ומודדות את הספיגה של המוצר במורד הזרם, NADH, ב-340 ננומטר. יחידה אחת של NADH נצרכת עבור כל יחידת UDP המשוחררת מ-UDP-גלוקוז על ידי גליקוגן סינתאז, ומייצרת עירור מדיד הקשור ישירות לפעילות גליקוגן סינתאז 5,6. בעוד שמבחני ספקטרופוטומטריה הם זולים ונגישים יחסית, הם מגיעים עם החיסרון הקטן של הסתמכות על תגובה עקיפה וחסרונות גדולים של הפרעה על ידי עכירות הדגימה ורגישות נמוכה יותר, במיוחד בעיה עבור דגימות קטנות יותר או דגימות עם מעט / סינתאז גליקוגן זרחני מאוד. מבחנים פלואורומטריים, תוך שימוש בתגובות המשולבות שתוארו לעיל, פותחו כדי לשפר את הרגישות ברקמת שריר מאדם7 ועכבר8. קיימות טכניקות אחרות לכימות גליקוגן סינתאז, כגון אימונובלוטינג9 ואימונוהיסטוכימיה10; עם זאת, טכניקות אלה מסוגלות לכמת רק את הכמות הפיזית של האנזים, ובמקרה הטוב, יכולות להסיק פעילות מזרחון אך לא לכמת ישירות את פעילות האנזים11.

מבין טכניקות בדיקת האנזימים הללו, שיטות רדיוכימיות נותרו הנפוצות ביותר לקביעת פעילות גליקוגן סינתאז ברקמת יונקים בשל היעדר הפרעה על ידי עכירות הדגימה ורגישותן הגבוהה 8,9. בדיקות אלה משלבות גלוקוז עם תווית רדיו מ-UDP-גלוקוז המסומן ב-14C12 או 3H13 לגליקוגן, מה שמאפשר מדידה ישירה של פעילות האנזים לאורך פרק זמן מוגדר. בהליך הבא, דגימת רקמה המכילה גליקוגן סינתאז נחשפת ל-UDP-גלוקוז ולפריימר גליקוגן. גליקוגן סינתאז מזרז את התגובה המוצגת במשוואה שלהלן:

UDP-[14C]גלוקוז + (גליקוגן)n → (גליקוגן)n+1[14C] + UDP

לאחר פרק זמן מוגדר, התגובה מסתיימת והגליקוגן המכיל גלוקוז מסומן ברדיו מוזרם על נייר סינון12 (כמתואר להלן) או נתון לסינון ג'ל כמתואר על ידי Niederwanger et al.14 ונמדד באמצעות גלאי נצנוץ. שיטה זו כוללת גם תגובה זהה נפרדת הכוללת גלוקוז-6-פוספט (G6P), מפעיל אלוסטרי של גליקוגן סינתאז. בתנאים עם רמות מספיקות של G6P, פעילות הגליקוגן סינתאז מופעלת בצורה מקסימלית, ומציגה את הפוטנציאל המוחלט לפעילות גליקוגן סינתאז של דגימה נתונה. השיטה המתוארת כאן שונתה מסוזוקיועמיתיה 15 לפורמט של 96 בארות והיא מותאמת לשימוש ברקמת שריר עכבר; עם זאת, ניתן לשנות את הפרוטוקול עבור רקמות אחרות ומינים של בעלי חיים.

למרות שיקולי העלות והבטיחות המובנים הקשורים לחומרים רדיואקטיביים, בדיקות רדיוכימיות מציעות יתרונות משמעותיים על פני חלופות לא רדיואקטיביות, בתנאי שמכשירים זמינים. ההליך הבא מפרט אמצעי רגיש וחזק ביותר לקביעת הפעילות של גליקוגן סינתאז, אנזים מפתח במטבוליזם של גליקוגן, ברקמת שריר של בעלי חיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת בול סטייט. קבוצות זכר ונקבה של B6; עכברי פרא 129-Gaatm1Rabn/J, בני 3 חודשים, משמשים כדוגמה מייצגת בכתב יד זה. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה לפני הבדיקה

  1. קצרו רקמה על ידי פריקת צוואר הרחם16 והקפיאו מיד בנוזל N2 כדי לשמר את מאגרי הגליקוגן ולאחסן בנוזל N2 או במקפיא נמוך במיוחד עד לתחילת הבדיקה.
  2. הכן את תמיסות המלאי לפני תחילת בדיקת הגליקוגן סינתאז (טבלה 1).
  3. קבע את מספר דגימות העכבר המשוכפלות והפקדים הרצויים לבדיקה. כל דגימת עכבר דורשת ארבעה שכפולים בסך הכל, שניים לכל תגובה (נוכחות או היעדר G6P) (ראה איור 1 וטבלה 2).
  4. חותכים נייר כרומטוגרפיה לרצועות של 4 ס"מ. גליקוגן נצמד לנייר זה ונשאר כרוך במהלך תהליך הכביסה. בעזרת הרוחב (6 מ"מ) של מגרסת נייר, גרוס נייר כרומטוגרפיה למקטעים בודדים דקים.
  5. בעזרת עיפרון, סמן רצועות נייר ייעודיות עם זיהוי עכבר, ריקים וסכומים. הימנע משימוש בדיו.
  6. טען ניירות כרומטוגרפיה לתבנית קוביות העץ. כל תבנית מכילה עד 12 ניירות, המתאימים לשורה אחת של צלחת של 96 בארות.
  7. השג מהדקי נייר כרומטוגרפיה (צמרות לוח).
  8. הכן מהדק אחד לכל שורת תגובה על ידי הידוק הקצוות של ניירות כרומטוגרפיה, והשארת רוב שטח הפנים של הניירות חשוף. ודא שהקצוות המסומנים גלויים.
  9. סמן צינורות מיקרופוגה של 1.7 מ"ל עם זיהוי מדגם. שתי שפופרות לכל דגימה; אחד להומוגנאט ואחד לסופרנטנט.
  10. לפני תחילת הבדיקה, הכינו גם את תערובות התגובה + וגם - G6P, ראה טבלה 3 למידע נוסף. הכן 2,400 מיקרוליטר של כל תערובת תגובה.

2. תגובת פעילות גליקוגן סינתאז רדיוכימית

זהירות: שלב זה מכיל את השימוש ב-[14C]-UDP-גלוקוז, שהוא חומר רדיואקטיבי. לטפל, לאחסן ולהשליך באופן שאושר על ידי הוועדה הרגולטורית הגרעינית (NRC).

  1. הוסף 30 מיקרוליטר של [14C]-UDP-גלוקוז (0.1 μCi/μL) ל-2,400 μL של שתי תערובות התגובה (+/- G6P) לריכוז סופי של 0.0012 μCi/μL. מתכון זה מתאים ל -18 דגימות.
    הערה: ניתן לשנות את עוצמת הקול של [14C]-UDP-גלוקוז כדי לחסוך בשימוש ולהבטיח רגישות נאותה. לדוגמה, השתמש ב-50 מיקרוליטר לרקמת מוח של עכבר ו-25 מיקרוליטר ללב עכבר.
  2. תערובות תגובת מערבולת ו-50 מיקרוליטר לכל באר של צלחת של 96 בארות שתכיל דגימות, ריקים וסכומים (טבלה 2). לאחר מכן, מכסים בניילון צלחת ומניחים בחום של 4 מעלות צלזיוס.
  3. הגדר את מעכבי הפרוטאז להפשרה בטמפרטורת החדר. מעכבים אלה מפורטים בטבלה 4 עם מידע נוסף.
  4. יש להוציא 30-50 מ"ג של רקמה קפואה. ~30 מ"ג הוא אופטימלי לדגימות שרירי שלד ולב; ~50 מ"ג למוח. שמור רקמות וצינורות מיקרופוגה בנוזל N2 ושקול במהירות רקמה כדי להבטיח שהרקמה תישאר קפואה. השתמש בעלי מקורר כדי לטחון רקמות נוספות.
  5. הכן מאגר הומוגניזציה עם מעכבי פרוטאז על קרח.
  6. דגימה אחת בכל פעם, העבירו את הצינור עם הרקמה מנוזל N2 לקרח עם מכסה קר למשך דקה. הוסף מכסה קר (מכסה צינור עם שלושה חורים קטנים מקוררים בנוזל N2) לצינור הדגימה כשהוא עדיין בנוזל N2. זה מונע אובדן רקמות כאשר שאריות נוזל N2 בצינור מתאדות. ברגע שנגמר הנוזל N2, הדגימות צריכות להישאר בקרח.
  7. לאחר הקרח, הוסף נפח (10-30 מיקרוליטר/מ"ג רקמה) של מאגר הומוגניזציה לדגימה והומוגניזציה של הדגימה עם Tissue-Tearor. לאחר השלמת שני השלבים הללו, עברו לדגימה הבאה.
    הערה: נפח המאגר שנוסף לדגימות עשוי להיות אופטימלי בהתאם למקור הרקמה. לדוגמה: 30 מיקרוליטר / מ"ג לשריר השלד, 15 מיקרוליטר / מ"ג ללב ו -10 מיקרוליטר / מ"ג למוח.
  8. דגימות צנטריפוגות למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ב-3,600 גרם ומעבירות סופרנטנט לצינור מיקרופוגה נקי. היזהר לא לגעת בגלולה. מערבולת ולהוסיף ~150 מיקרוליטר לבארות המתאימות בצלחת V-bottom של 96 בארות על קרח. שמור את השאר לבדיקת סופרנטנט לברדפורד (ראה שלב 2.15)
    הערה: אם תרצה, ניתן לשמור ציטוטי דגימה נוספים לבדיקות מאוחרות יותר כגון אימונובלוטינג.
    זהירות: שלבים 2.9 עד 2.14 דורשים טיפול ב-14C. השלך את כל החומרים המזוהמים באופן שאושר על ידי ה-NRC.
  9. הסר את צלחת תערובת התגובה מ-4 מעלות צלזיוס וחמם ל-30 מעלות צלזיוס על התרמו-סייקלר כשהסרט הוסר. במהלך תקופה זו, השג 1 ליטר של -20 מעלות צלזיוס 66% אתנול והוסף לכוס כביסה עם מוט ערבוב על צלחת ערבוב.
  10. התחל תגובה על ידי הוספת 25 מיקרוליטר של סופרנטנט דגימה לבארות תגובה ו-25 מיקרוליטר של מאגר הומוגניזציה לבארות ריקות וסה"כ. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף לשורה אחת על צלחת התגובה בכל פעם, והמתן לפחות דקה אחת בין השורות. רשום את השעה שבה התגובה הופעלה עבור כל שורה. ראה טבלה 2 למידע נוסף. השתמש בפיפטה רב ערוצית וודא שמוסיפים כמויות שוות של נוזלים.
  11. אפשר 10-15 דקות עד שהתגובה תפעל; עם זאת, זמן הריצה צריך להיות זהה בין השורות.
  12. שאפו 55 מיקרוליטר מכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית והוציאו על ניירות הכרומטוגרפיה המתאימים שהוכנו קודם לכן. מערבבים את התגובה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפני השאיפה. נקודתי נוזל במרכז ניירות הכרומטוגרפיה.
  13. הסר ניירות עם סיכומים מהמהדק באמצעות מלקחיים לאחר איתור נוזלים מהבאר. ניתן להניח אותם על נייר אלומיניום בבטחה לייבוש. זרוק את כל שאר ניירות הכרומטוגרפיה לאמבט אתנול 66% מערבב. גליקוגן אינו מסיס ב-66% אתנול, בעוד ש-[14C]-UDP-גלוקוז מסיס וישטוף ניירות כרומטוגרפיה.
  14. חזור על שלבים 2.11 ו-2.12 עבור כל שורה על לוחית התגובה. ודא שזמן התגובה של כל שורה זהה על ידי רישום זמני ההתחלה והעצירה של התגובה.
  15. לאחר שכל השורות נוספו לאתנול 66% המערבב, יש לשטוף במשך 15 דקות.
    הערה: במהלך שלב זה ושלבי הכביסה הבאים, ניתן להכין מדגמים לבדיקות משלימות, כגון בדיקת ברדפורד, האחראית על קביעת הנפח הכולל של החלבון לנורמליזציה, הנחוצה לחישוב הפעילות האנזימטית.
  16. השלך 66% אתנול מבלי לאבד ניירות כרומטוגרפיה. שטפו עם 1 ליטר אתנול 66% חדש למשך 30 דקות. 66% אתנול זה יכול להיות בטמפרטורת החדר.
  17. חזור על השלב הקודם בסך הכל שלוש שטיפות אתנול של 30 דקות 66%.
    הערה: אם תרצה, ניתן לשמור ולאחסן את האתנול של 66% משלב הכביסה הסופי בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לבדיקות הבאות.
  18. לאחר הסרת 66% אתנול, טבלו את כל ניירות הכרומטוגרפיה בכוס הכביסה באצטון. אצטון מקל על תהליך הייבוש.
  19. הסר ניירות כרומטוגרפיה מהאצטון והניח אותם על נייר אלומיניום. שמור או השלך אצטון.
  20. ניירות כרומטוגרפיה יבשים מתחת למנורת חום למשך 15 דקות.
    הערה: ניירות יבשים עשויים להיות מאוחסנים ללא הגבלת זמן. ניתן לאחסן ניירות בבטחה עד שהם מוכנים להמשיך לגילוי נצנוץ.

3. מדידת פעילות עם זיהוי נצנוץ

  1. בעזרת מלקחיים, העבירו ניירות כרומטוגרפיה לבקבוקוני נצנוץ המוחזקים במדפי נצנוץ. רשום את כיוון המאמרים לדוגמה.
  2. הוסף 5 מ"ל נוזל נצנוץ לכל בקבוקון באמצעות משאבת המכסה. הברג מכסים לכל בקבוקון.
  3. טען דגימות לגלאי הנצנוץ וטען את מתלה העצירה מאחורי הדגימות. ודא שנבחרה התוכנית לניטור 14C. התחל את הזיהוי על-ידי בחירה בספירה אוטומטית.
  4. תוצאות הדפסה
  5. השלך צינורות נצנוץ ותכולתם באופן שאושר על ידי ה-NRC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בהתאם לפרוטוקול, תדפיס שנוצר מגלאי הנצנוץ יכיל את הכמות הנמדדת של קרינה מייננת הנפלטת מכל נייר כרומטוגרפיה המכיל בקבוקון, בקורלציה ישירה לרמת הפעילות של גליקוגן סינתאז. גלאי הנצנוץ יחשב את הספירה לדקה (CPM) של קרינה שזוהתה עבור כל דגימה, ריקה וסך הכל על פני פרק זמן מוגדר. ראשית המר CPM ל-DPM (התפרקות לדקה), המבוססת על היעילות של מונה הנצנוץ המשמש (DPM = CPM / יעילות). היעילות נקבעת על ידי ספירת מקור סטנדרטי עם DPM ידוע. המשוואה לחישוב פעילות האנזים היא:

[ממוצע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מדידת פעילות אנזים גליקוגן סינתאז היא כלי רב ערך לניטור חילוף החומרים של גליקוגן במצבי חילוף חומרים ומחלות שונים. מדידה בהיעדר ונוכחות של גלוקוז-6-פוספט (G6P) מציעה תובנה לגבי המצב הרגולטורי של האנזים ואינדקס עקיף של מצב הזרחון. בדיקת שילוב גלוקוז [U-14C]-UDP היא טכניקה יעילה ומתועדת היטב למדידת פעילות אנזימטית של גליקוגן סינתאז, המציעה רגישות גבוהה, ספציפיות מצע ויכולת הסתגלות לדגימות רקמה קטנות כגון שריר השלד של העכבר. במאמר זה, הנוהל הכתוב מותאם לכימות פעילות GYS1 בליזטים ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המימון ניתן בחלקו על ידי אוניברסיטת בול סטייט, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה-מונסי ו-Aro Biotherapeutics.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
[<>14C] אורידין 5-דיפוספו-גלוקוזכימיקלים אמריקאיים מתויגים ברדיוARC 0154
31 נייר כרומטוגרפיה ETCHRווטמן3031 915
הידראט בנזמידין הידרוכלורידסיגמאB6506
בטא מרקפטואנולסיגמאM3148
אמבטיה יבשהטורי פיינס סיינטיפיקSC25
אתנול (200 proof)PharmcoAaper111000200
אתילן גליקול טטראצטית (EGTA)סיגמאE4378
אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA)סיגמאE5134
מלח נתרן גלוקוז-6-פוספטסיגמאG7879
גליקוגן מכבד ארנב (סוג III)סיגמאG8876
מיקרופלטה, תחתית שטוחה, באר 96גריינר655101
מיקרופלטה, pcr, באר 96DOT Scientific951-PCR
מונה סינטילציה רב-תכליתיבקמן קולטרLS 6500
דיהידרט פלואוריד אשלגןסיגמא221872
קוקטייל מעכב פרוטאזGoldBioGB-108-2
קוקטייל סינטילציהReasearch Products International111195
בקבוקי סינטילציהReasearch Products International125509
פלואוריד נתרןסיגמאS7920
קריעת רקמותמוצרי Biospecדגם 398
טוזיליזין כלורומתיל קטון (TLCK)סיגמאT7254
בסיס טריזמה (99.9%)סיגמאT1503
טריזמה הידרוכלורידסיגמאT3253
אורידין 5-דיפוספו-גלוקוזסיגמאU-4625

מקורות

  1. Preiss, J., Walsh, D. A. Biology of Carbohydrates. Ginsburg, V., Robbins, P. 1, John Wiley. 199-314 (1981).
  2. Pederson, B. A. Enzymology of Complex Alpha-Glucans. , CRC Press. 84-137 (2021).
  3. Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Mol Biol Rep. 39 (1), 585-591 (2012).
  4. Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J Vis Exp. (174), e63046(2021).
  5. Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. J Biol Chem. 240, 588-593 (1965).
  6. Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Arch Biochem Biophys. 81 (2), 508-520 (1959).
  7. Schalin-Jantti, C., Harkonen, M., Groop, L. C. Impaired activation of glycogen synthase in people at increased risk for developing NIDDM. Diabetes. 41 (5), 598-604 (1992).
  8. Huang, X., Hansson, M., Laurila, E., Ahren, B., Groop, L. Fat feeding impairs glycogen synthase activity in mice without effects on its gene expression. Metabolism. 52 (5), 535-539 (2003).
  9. Holt, B. D., et al. A novel CD71 Centyrin: Gys1 siRNA conjugate reduces glycogen synthesis and glycogen levels in a mouse model of Pompe disease. Mol Ther. 33 (1), 235-248 (2025).
  10. Prats, C., et al. Phosphorylation-dependent translocation of glycogen synthase to a novel structure during glycogen resynthesis. J Biol Chem. 280 (24), 23165-23172 (2005).
  11. Perezleon, J. A., Osorio-Paz, I., Francois, L., Salceda, R. Immunohistochemical localization of glycogen synthase and GSK3beta: Control of glycogen content in retina. Neurochem Res. 38 (5), 1063-1069 (2013).
  12. Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDP-glucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
  13. Parker, G. J., Lund, K. C., Taylor, R. P., McClain, D. A. Insulin resistance of glycogen synthase mediated by O-linked N-acetylglucosamine. J Biol Chem. 278 (12), 10022-10027 (2003).
  14. Niederwanger, A., Kranebitter, M., Ritsch, A., Patsch, J. R., Pedrini, M. T. A gel filtration assay to determine glycogen synthase activity. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 820 (1), 143-145 (2005).
  15. Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/RGL. Mol Cell Biol. 21 (8), 2683-2694 (2001).
  16. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Quick and humane sacrifice of a mouse by cervical dislocation. CSH Protoc. 2006 (1), prot4357(2006).
  17. Gomes, F. R., et al. Glycogen storage and muscle glucose transporters (GLUT-4) of mice selectively bred for high voluntary wheel running. J Exp Biol. 212 (Pt 2), 238-248 (2009).
  18. Greenberg, C. C., Jurczak, M. J., Danos, A. M., Brady, M. J. Glycogen branches out: new perspectives on the role of glycogen metabolism in the integration of metabolic pathways. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (1), E1-E8 (2006).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  20. Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Anal Biochem. 47 (1), 20-27 (1972).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

UDP Glucose6
הערכה רדיוכימית של פעילות אנזים גליקוגן סינתאז ברקמות בעלי חיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.