מאמר שיטה

In-Vitro התמיינות תאי T בזיכרון תושב CD8 באמצעות מערכת קו-קולטורציה של תא אורגנואיד-T אפיתל

DOI:

10.3791/69120

⸱

3 בפברואר 2026

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Brown University, 2Pathobiology Graduate Program, Brown University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לחקור התמיינות ותפקוד תאי T של CD8 במבחנה, ניתן לבודד את תאי ה-CD8 T מהעכבר כדי לעבור תרבית משותפת לטווח ארוך עם אורגנואידים אפיתליים נרתיקיים של עכברים שנדבקו מראש. כאן, אנו מתארים תהליך זה ומעריכים את רכישת סמני תאי T בזיכרון התושבים במהלך קו-קולטורציה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות ריריות מחסום ממלאות תפקיד חשוב בהבדלה ובתפקוד של תאי T תושבים. מבין אוכלוסיות התאים המגוונות בתוך רקמות אלו, תאי אפיתל הם מניעים מרכזיים להתמיינות תאי T. עם זאת, ההבנה שלנו לגבי האותות שמקורם באפיתל שמעצבים את הביולוגיה של תאי T בסביבות ריריות נותרת מוגבלת, בעיקר בשל מחסור בכלים ספציפיים ומורכבות מערכות המודל הזמינות. כאן, אנו מתארים מערכת תרכזת תאי T אורגנואידית של עכברו, אשר מדמה אינטראקציות דינמיות בין אפיתל נגוע לתאי CD8 T ספציפיים לווירוס. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח פנוטיפי ותפקודי של תגובות תאי T בתוך מיקרוסביבה תלת-ממדית פיזיולוגית רלוונטית לאפיתלי. באמצעות מערכת זו, אנו מדגימים את התמיינות תאי CD8 T אפקטורים לתאי זיכרון T תושבי רקמה (TRM). מערכת תרביות חוץ-גופית זו מספקת הזדמנויות רדוקציוניסטיות לחקור פרטים מולקולריים של רמזים אפיתליים מאחורי התמיינות תאי T של CD8, השולטים במערכת החיסון המגנה והאימונופתולוגיה באיברי מחסום.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי T זיכרון תושבי CD8 (TRMs) מייצגים אוכלוסייה ייחודית של תאי זיכרון CD8 T הנשמרים באופן קבוע ברקמות ההיקפיות מבלי להסתובב באופן שגרתי בדם וברקמות לימפואידיות. תאי TRM אלו ממוקמים באופן אסטרטגי באיברי מחסום, כולל עור, ריאות, מעיים ומערכת הרבייה, שם הם פועלים כשומרים נגד פתוגנים וגידולים מתהווים 1,2. עם זיהוי פתוגן, תאי TRM של CD8 משחררים במהירות גרנולות ציטוטוקסיות כדי להשמיד ישירות תאים נגועים, תוך הפרשת ציטוקינים דלקתיים שמתריעים לתאי רקמה סביב ומגייסים אפקטורים חיסוניים במחזור הפעולה כדי להכיל הפצת פתוגנים 3,4. היעילות של CD8 TRM במערכת החיסון נגד פתוגנים וכן באימונותרפיה לסרטן כבר הוכחה 5,6. בהתאם לכך, מיקום כמות מספקת של CD8 TRM פונקציונלית ברקמות ריריות מחסום היא מטרה קריטית לחיסונים ולאסטרטגיות אימונותרפיות.

היווצרות ותחזוקה של CD8 TRM באיברים היקפיים תלויים באופן קריטי בתכנות המקומי הספציפי לרקמה. רמזים סביבתיים מקומיים אלו כוללים ציטוקינים ייחודיים שמקורם ברקמה וסוכנים מטבוליים, וכן אינטראקציות בין-תאיות שמחזקות יחד את זהות ה-TRM הספציפית לרקמה 7,8,9. תכנות רקמות זה מאפשר ל-TRM להסתגל לדרישות ספציפיות לרקמות בביצוע משימות הפיקוח החיסוני שלהם. עם זאת, ההבנה שלנו לגבי טיב האינטראקציות הללו אינה שלמה, בשל היעדר מערכות מודל חזקות שתופסות את התהליכים הללו בנאמנות. מודלים של בעלי חיים קטנים, למרות שהם אינפורמטיביים מאוד, סובלים לעיתים קרובות מרשת אינטראקציות מורכבת ומקושרת שמונעת מחקרים מהירים ובעלי תפוקה גבוהה.

כאן, אנו מתארים אלטרנטיבה חוץ-גופית למודל העכבר, שתאפשר חקירה של פרטים מולקולריים של רמזים שמקורם בתאי אפיתל מאחורי התמיינות TRM של CD8. על ידי שילוב של אורגנואידים אפיתליים נרתיקיים (VEOs) עם תאי CD8 T מופעלים, יצרנו CD8 TRM במבחנה. תיאור מפורט של תהליך הפעלת תאי CD8 T ותהליך הקו-קולטורציה יאפשר אימוץ רחב יותר של תהליך זה ברקמות, מה שיוביל להבנה מעמיקה יותר של האינטראקציות התאיות המעצבות את זיכרון תאי CD8 T ברקמות קו חזית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית של אוניברסיטת בראון (מספר פרוטוקול 22-10-0001).

1. הקמה בסיסית והכנת לוח הפעלה

  1. יום לפני תחילת הניסוי, יש להכין צלחת תרבית רקמה לא מטופלת לזריעה עם תאי CD8 T נאיביים. הכינו תמיסה של נוגדנים מפעילים ב-dPBS סטרילי בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל עבור אנטי-CD3ε (2C11) ו-0.167 מיקרוגרם/מ"ל עבור B7-1 Fc. לפלטת 24 בארות, יש לחלק 600 מיקרוליטר מהתמיסה הזו לכל באר. דגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים לשימוש.
  2. הכנת בופר העשרת לימפוציטים ב-dPBS סטרילי על ידי הוספת 2% FBS מפורק מפחם ו-1 mM EDTA ל-dPBS סטרילי. אחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש.
  3. הכינו בופר פירוק תאי דם אדומים של אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK RBC) ב-DDH2O על ידי הוספת 10 מ"מ ביקרבונט אשלגן, 155 מ"מ אמוניום כלוריד ו-0.1 מ"מ EDTA. לסנן, לחטא ולשמור על טמפרטורת החדר.
  4. הכינו את כמות החומר הנכונה של חומר קציר ב-RPMI על ידי הוספת 5% מדיום FBS עם פחם עץ. אחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש. לכל עכבר שייקטף, מומלץ 50 מ"ל של חומר קציר.
    הערה: פניצילין/סטרפטומיצין ואמפוטריצין B הם אופציונליים, אך ריכוז סופי של 100 יחידות/מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-0.2 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B עשוי לסייע במניעת זיהום חיידקי ופטרייתי בתרבות תאי T במהלך בידוד רקמות, אם זה יוצר בעיה.
  5. הכינו את תווך תאי ה-T ב-RPMI על ידי הוספת 10% FBS מפוחם פחם, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 יחידות ל-מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, ו-1 מ"מ פירובט נתרן (1 מילימטר). לפלטת 24 בארות, השתמש ב-2 מ"ל מדיום תאי T לכל באר וב-50 מ"ל של מדיום תאי T לפלטה מלאה. אחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש.
  6. הכינו כלי חיתוך (מספריים מיקרו-דיסקטיים בקוטר 0.4 מ"מ ומלקחיים משוננים בעובי 0.8 מ"מ) על ידי אוטוקלב בשקית עיקור או השרייה ב-70% אתנול.

2. איסוף ופירוק של איברי לימפה משניים של עכברים בוגרים

  1. קרר צנטריפוגה מהר ל-4 מעלות צלזיוס עם מתאמים מתאימים לאחסון צינורות חרוטיים של 15 מ"ל.
  2. הכינו קרח להובלת רקמות ולימפוציטים בתקופות הקציר והדגירה.
  3. הכינו צינור חרוטי סטרילי בנפח 15 מ"ל עם לפחות 5 מ"ל מדיום קציר לכל עכבר לניתוח.
  4. הרדמו והרדימו עכבר בוגר מסוג CD8 T טרנסגני (~8 שבועות) בהתאם לפרוטוקול מוסדי במכסה זרימה למינרי.
  5. הצמיד את גפיו של העכבר למשטח קצף פוליסטירן נקי עם מחטים בכל גודל, וריסס 70% אתנול על הגוף כדי למנוע מפרווה לחסום את החתך ולהיצמד לכלים.
  6. באמצעות מספריים מיקרו-דיסקטיים נקיים ומלקחיים, יש לבצע חתך בטני אנכי ולהפריד את העור מהשכבה הדקה של רקמת החיבור שמתחת. הצמיד את העור למשטח קצף הפוליסטירן באמצעות מחטים בכל גודל, וחתוך כל רקמת חיבור שנותרה כדי לחשוף את האיברים בתוך הגוף.
  7. אתר ולהסיר בזהירות את הטחול, להסיר שומן עודף באמצעות מלקחיים מעוקלים, ולהעביר אותו לצינור קוני בקוטר 15 מ"ל המכיל מדיום קציר. השאירו את הטחול על קרח ובודדו כמה שיותר בלוטות לימפה (למשל, איליאק ומפשעה) כדי להתמזג עם הטחול באותו צינור חרוטי על הקרח.
    הערה: בלוטות הלימפה האיליאקיות ממוקמות משני צידי הווריד הנוב הזנב באזור הבטן התחתונה מתחת למערכת העיכול, ובלוטות הלימפה המפשעה ממוקמות סמוך להסתעפות הווריד האפיגסטרי השטחי משני צידי עור הבטן התחתון של הגוף. לבודד יותר בלוטות לימפה כדי לשפר את התפוקה של תאי CD8 T לאחר ההעשרה; עם זאת, בידוד הטחול בלבד בדרך כלל מספיק כדי לספק כמה מיליוני תאי CD8 T.
  8. העבר את הטחול ובלוטות הלימפה לצלחת מסודרת בקוטר 60 מ"מ, ובאמצעות קצה שטוח של בומפה בנפח 3 מ"ל, מפריד מכנית בין הטחול לבלוטות הלימפה על ידי טחינת הרקמה עד שלא יישארו שברים גדולים.
  9. אסוף את המתלה על ידי העברתו דרך מסננת תא סטרילית של 70 מיקרון לצינור חרוטי סטרילי חדש בנפח 15 מ"ל. שטפו את הצלחת בקוטר 60 מ"מ עם 5 מ"ל מדיום קציר כדי להבטיח העברה מלאה של תאים מפורקים וסינון לאותו צינור קוני של 15 מ"ל.
  10. צנטריפוגה את המתלה ב-584 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והעבירו את הצינור על ידי העברת התחתית במהירות ובעוצמה על רשת מחזיק צינור הצנטריפוגה כדי לשחרר את הכדור.
  11. אריתרוציטים של ליז על ידי השעיית הכדור המשוחרר ב-2 מ"ל של בופר ליזיס ACK RBC. מערבולת ודגרה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
  12. לאחר 2 דקות, מנטרל את בופר הליזיס על ידי הוספת 2 מ"ל מדיום קציר. שאיפת המתלה באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל ומסננת דרך פילטר סטרילי של 70 מיקרון חזרה לאותו צינור קוני של 15 מ"ל.
    הערה: סינון זה חשוב להבטחת הסרת כל הגושים.
  13. צנטריפוגה את המתלים ב-584 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט ותחזירו את הכדור לתוך 950 מיקרוליטר של בופר העשרת לימפוציטים.

3. העשרה והפעלה של תאי T ב-CD8

  1. המשיכו להעשיר תאי CD8 T נאיביים מלימפוציטים באמצעות ערכת בידוד מסחרית. עקבו אחרי הפרוטוקול של היצרן.
  2. לאחר שתאי CD8 T מועשרים, העבר את המתלה המועשר לצינור קוני סטרילי חדש בנפח 15 מ"ל וממלא את הנפח עד 10 מ"ל במדיום קציר.
  3. לספור באמצעות המוסיטומטר.
    הערה: מעכבר בוגר אחד ניתן לבודד לפחות 5-10 מיליון תאי CD8 T נאיביים בטוהר >95%.
  4. לוחות לפחות 500,000 תאים ב-2 מ"ל של מדיום תאי T לכל באר של פלטה עם 24 בארים. ערבבו תאי T היטב לפני הציפוי כדי להבטיח תלייה חד-תאית הומוגנית. הוסיפו למדיום תאי T ריכוז סופי של 100 יחידות/מ"ל IL-2, 2.5 ng/mL IL-12, ו-55 מיקרומום בטא-מרקפטואנול.
  5. הסר את לוח תרבית הרקמה שהיה מצופה בנוגדנים מ-4 מעלות צלזיוס ושאף בזהירות את תמיסת הציפוי מבלי לגעת בתחתית הבארות.
  6. מיד הלחין תאי T. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך יומיים.

4. הסרת אותות הפעלה ומנוחה של תאי CD8 T המופעלים

  1. התבונן בבארות מופעלות תחת מיקרוסקופ אור. לאחר יומיים של ההפעלה, חפש אשכולות קטנים של תאי T ברחבי הבארות. אשכולות גדולים יותר מעידים על הפעלה מוגברת. אם אין או יש מעט אשכולות, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך יום נוסף לפני שממשיכים במנוחה.
  2. הכינו קרח לאחסון תליית תאי T במהלך תקופות דגירה וכאשר אינם בשימוש.
  3. החזירו את תאי ה-T באמצעות פיפטת P1000 על ידי פיפטור למעלה ולמטה מספר פעמים בכל פינה של הבאר. כאשר תאי T התרוממו, העבר את תכולת הבאר לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל וספור.
    הערה: שטיפת כל באר עם 1 מ"ל dPBS היא אופציונלית, אך שילוב של שטיפת dPBS עם תליית T עשוי להגדיל את תפוקת תאי T.
  4. החליפו את תאי ה-T בריכוז זהה לשלב 3.4, 250,000 תאים/מ"ל ב-2 מ"ל לבאר. הכינו את הכמות המתאימה של מדיום תאי T עם תוספת של 100 יחידות/מ"ל IL-2 ו-55 מיקרומום בטא-מרקפטואנול.
  5. צנטריפוגה את המתלה ב-584 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט, והחזירו את הכדור בנפח המתאים של מדיום תא T שהוכן בשלב הקודם למספר הבארות שיש לציפויים. ערבבו היטב כדי להבטיח תלייה חד-תאית הומוגנית.
  6. צלחת 2 מ"ל של תליית תאי T (500,000 תאים/באר) בלוח תרבית רקמה חדש שלא טופל ללא ציפוי נוגדנים. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך יומיים.

5. זיהום אורגנואידים אפיתליים נרתיקיים של עכברים מוכנים בווירוס

הערה: השתמשנו גם בנגיף הרפס סימפלקס-2 (HSV-2) וגם בווירוס דלקת הכוריה הלימפוציטית (LCMV) כדי לבצע זיהום ויראלי של האורגנואידים. שניהם נחשבים לסוכני בטיחות ביולוגית רמה 2 (BSL-2). בצע את כל ההליכים עם חומרים זיהומיים בתוך ארון בטיחות ביולוגית מוסמך BSL-2. ניקו אזורי עבודה עם 70% אתנול לפני ואחרי השימוש, והשליכו את כל החומרים בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית. לפרוטוקול זה, קבענו VEOs מתאי אפיתל נרתיקיים שנקטפו מאפיתל נרתיקי של עכברים נקבות C57BL/6 כפי שתואר לפני10.

  1. VEOs בלוחות בצפיפות של 10,000 תאים ב-20 מיקרוליטר של תמצית ממברנת בסיס (BME) לכל באר של צלחת עם 24 בארות 7-10 ימים לפני ההדבקה.
  2. יום אחד לפני הקו-קולטורה, הקצה באר אחת של VEOs לטריפסיניזציה וספירה כדי לקבל ריבוי מדויק של זיהום (MOI). חימום מוקדם של Trypsin-EDTA 0.25% באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    הערה: 0.25% טריפסין-EDTA לא ישמשו במהלך ההדבקה; היא נחוצה רק לניתוק ה-VEOs במהלך חישובי MOI. ציפוי כלי פלסטיק (כלומר, קצות פיפטה, צינורות חרוטיים) עם 2.5% BSA ב-dPBS הוא אופציונלי בשלב זה, אך עשוי לסייע בהפחתת אובדן אורגנואיד ותאים לספירה מדויקת יותר.
  3. שאיפת מדיה לתרבות תאים מהבאר המיועדת ושוטפת עם dPBS.
  4. יש לשחרר 600 מיקרוליטר של טריפסין-EDTA מחומם מראש של 0.25% לבאר ולהחזיר היטב את הפיפטה P1000 המצופה ב-BSA כדי לשבש מכנית את ה-BME. העבר את תכולת הבאר לצינור קוני סטרילי מצופה BSA בנפח 15 מ"ל.
  5. דגרו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. אחרי 5 דקות, מוסיפים 10 מ"ל 10% FBS ב-RPMI כדי להרגיע את הטריפסיניזציה.
  6. צנטריפוגה את המתלים ב-500 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשפיעו מחדש באמצעות קצה פיפטה מצופה BSA ב-100-300 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי T אורגנואידי או DMEM/F12 פשוט.
    הערה: הנפח תלוי בגודל הכדור. אם הכדור כמעט לא נראה, תלייה מחדש בנפח נמוך יותר.
  7. לספור באמצעות המוסיטומטר. חשב את כמות הווירוס המתאימה להשגת 0.1 MOI באמצעות הטיטר הוויראלי הידוע וצפיפות התאים לכל באר של VEOs לפי המשוואה הבאה:
    figure-protocol-1
  8. שאפו מדיום תרבית תאים מבארות VEO כדי להידבק ולשטוף ב-500 מיקרוליטר של dPBS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס). דגרו את הבארות עם dPBS למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  9. לאחר 5 דקות, יש להשליך את ה-dPBS ולהוסיף 500 מיקרוליטר של מדיה אורגנואידית לכל באר שמכילה מספיק חלקיקי ויראליים כדי להגיע ל-MOI של 0.1. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך שעה עם סיבוב ידני עדין של צלחת תרבית הרקמה כל 20-30 דקות.
  10. לאחר הדגירה של שעה, שאיפת המדיה האורגנית הוויראלית ושוטפת עם 500 מיקרוליטר dPBS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס). לשאוף dPBS ולהחליף במדיה אורגנואידית טרייה.

6. שילוב של תאי T של CD8 עם אורגנואידים אפיתליים נרתיקיים של עכברים שנדבקו בוירוס ונוצרו מראש

  1. לפני קו-קולטורה (רצוי 4-24 שעות מראש), העבר את ה-BME מ-80°C ל-4°C להפשרה. צפוי את כמות ה-BME המתאימה להפשרה בהתבסס על עיצוב ניסוי הקו-קולטורה: לתכנן לציפוי 8 מיקרולטר BME לכל באר של לוח עם 96 בארות ו-20 מיקרוליטר BME לכל באר של לוח עם 24 בארות.
    הערה: ה-BME הוא צמיגי, ותקופת הפשרה ארוכה יותר ב-4°C תפחית את הצמיגות ותשפר את המניפולציה.
  2. הכינו 2.5% BSA ב-dPBS וסננו את הסטריליזציה. השתמש בתמיסת BSA זו כדי לצפות כל משטח פלסטיק שבא במגע עם ה-VEOs (כלומר, קצות פיפטה, צינורות חרוטיים).
    הערה: ציפוי זה מונע מ-VEOs להידבק למשטח הפלסטיק ולאבד במהלך הטיפול.
  3. בדוק VEOs תחת מיקרוסקופ אור לגודל ולבריאות כללית. ודאו ש-VEOs הם 7-10 ימים אחרי התרבית ובממוצע בקוטר ~100 מיקרון. VEOs בריאים יציגו מעט תאים בודדים או כלל לא יציגו תאים בודדים ומציגים מורפולוגיה אחידה ועגולה.
    הערה: החלפת VEOs ביחס 1:1 בקו-קולטורה אם מגדלים אותה בפלטת של 24 בארות ומבצעת מחדש בפלטת 24 בארות (כלומר, באר אחת של VEOs תזריע מחדש באר אחת של קו-קולטורה של תאי T-אורגנואיד). אם מצפים מחדש בלוח של 96 בארות מפלטת עם 24 בארות, בציפוי VEOs 1:2 (כלומר, באר אחת של VEOs תזריע מחדש שתי בארות של קו-קולטורה של תאי T-אורגנואיד).
  4. הניחו את המספר הנדרש של לוחות תרבית רקמה סטריליים עם 96 או 24 בארות לשימוש לקו-קולטור באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: צלחת מחוממת תזרז את ההידבקות וההתמצקות של BME.
  5. הכינו מדיום תרביית תאי T אורגנואיד ב-DMEM/F12 על ידי הוספת 2% תוסף B-27, 2 מילימטר L-גלוטמין, 100 יחידות למיל"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 1 מילימטר פירובט נתרן ו-0.2 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B. אחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד למוכן לשימוש.
  6. שואף מדיום תרבית תאים מבארות VEO ושוטף כל באר ב-500 מיקרוליטר של dPBS סטרילי קר (2-8 מעלות צלזיוס).
  7. שאיבת dPBS והוספה 200-500 מיקרוליטר של תמיסת קצירת אורנואידים קרה (2-8 מעלות צלזיוס) (לפחות פי 10 נפח של טיפת BME אורגנית). פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטת P200 מצופה BSA כדי לשבש מכנית את ה-BME.
  8. דגירה של לוח עם ניעור עדין (~100 סל"ד) על מנער אורביטלי בטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות. אם לא זמין, דגר את הפלטה על קרח עם ניעור ידני כל 5 דקות. אם ה-BME לא התפרק לאחר 20 דקות, האריך את זמן הדגירה לפי הצורך.
  9. העבר את תכולת הבארות באמצעות קצה פיפטה מצופה BSA לצינור קוני סטרילי מצופה BSA בגודל 15 מ"ל או 50 מ"ל על קרח. צנטריפוגה את המתלים ב-500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  10. להשליך את הסופרנטנט ולשטוף את ה-VEOs עם 5-10 מ"ל של dPBS קר (2-8 מעלות צלזיוס) (לפחות פי 10 נפח של טיפות משולבות של BME). צנטריפוגה את המתלים ב-500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  11. השליכו את ה-dPBS והחזירו את הכדור לתלייה ב-1 מ"ל של מדיום תרבית תאי T אורגנואידי באמצעות קצה פיפטה מצופה BSA. השאירו את תליית ה-VEO על הקרח עד שתאי T יהיו מוכנים לעיבוד משותף.
  12. התחילו לאסוף את תאי ה-T לתרבית משותפת. בדוק תאי T במנוחה תחת מיקרוסקופ אור לגבי גודל ובריאות כללית. ללא הפעלת אותות, תאי T יאטו את התרבות שלהם אך עדיין היו אמורים להיווצר אשכולות. יש לוודא שאין שברי תא או שברים, ולתאי T יש מורפולוגיה מוגדלת. החזירו את תאי ה-T באמצעות פיפטת P1000 על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים בכל פינה של הבאר וספור את מספר תאי ה-CD8 T החיים.
    הערה: לכל באר של לוח עם 96 בארות, זרע 100,000 תאי T לכל קו-קולטורה ב-8 מיקרוליטר BME. לכל באר של צלחת עם 24 בארות, זרעו 200,000 תאי T לכל קו-קולטורה ב-20 מיקרו-ליטר של BME.
  13. צנטריפוגה את המתלה ב-584 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט ותחזירו את הכדור ל-10 מ"ל של מדיום תרבית תאי T-אורגנואיד. לשלב תאי T עם VEOs על ידי העברת מספר מתאים של תאי T כדי שהבארות יוצפו לצינור הקוני המכיל את ה-VEOs.
  14. צנטריפוגה ב-584 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. להשליך את הסופרנטנט ולהחזיר VEOs ותאי T בכמות המתאימה של BME. מערבבים היטב באמצעות קצה פיפטה מצופה BSA, וצלחת על צלחת תרבית רקמה מחוממת מראש, 20 מיקרוליטר לבאר של פלטת 24 בארות או 8 מיקרוליטר לבאר של צלחת 96 בארות.
    הערה: שמור את BME על קרח או בבלוק קירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הציפוי. הנחת קצות הפיפטה במקרר בטמפרטורה 4°C למשך 30 דקות לפני השריון עשויה לסייע במניעת התגבשות מוקדמת של ה-BME.
  15. הנח את הפלטה הפוכה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס והמתין 30 דקות להיצמדות מלאה של BME.
  16. במהלך תקופת הדגירה זו, יש להכין את כל תווך תרבית תאי T אורגנואידי על ידי הוספת 100 ng/mL EGF של עכברים, 55 מיקרומום בטא-מרקפטואנול ו-10 יחידות למ"ל IL-2 של עכברים לתווך ה-T המוכן.
  17. לאחר תקופת הדגירה, יש להוסיף בזהירות 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים-אורגנואיד מלא לכל באר של לוח עם 24 בארות או 250 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי T אורגני מלא לכל באר של לוח עם 96 בארות. פזר מדיה על דפנות הבאר כדי לא להפריע לטיפה של ה-BME. החלף את המדיה כל יומיים עד שנקטף לניתוח.

7. איסוף תאי CD8 T משותפים לצורך ניתוח ציטומטריית זרימה

  1. לאחר שקו-קלטורות הגיעו לפחות ליום 7 בתרבית, יש לקצור לניתוח. אם תאי T אינם מבטאים סמנים דמויי TRM בקו-קולטורה עד יום 7, יש לייעל את תאריך הקציר בין היום 7-14, בהתאם לרכישה פנוטיפית ולחיוניות של תאי VEO ו-T.
  2. הכינו בופר מיון תאים מופעלים פלואורסצנטי (FACS) לצביעה וניתוח ציטומטריית זרימה, על ידי הוספת 0.2% עם וולט אלבומין סרום בקר ו-0.1% עם נתרן אזיד ל-dPBS.
    הערה: נתרן אזיד הוא חומר כימי רעיל מאוד. לפעול לפי המלצות מוסדיות בטיפול והשלכת כל הפסולת בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדיות.
  3. הכינו קוקטייל נוגדנים פלואורסצנטיים בבופר FACS לצביעה על פני השטח, בהתאם לאילו סמנים רצויים לניתוח. לכל באר, יש לקחת לפחות 50 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים.
  4. הכינו צבע פלואורסצנטי לחיוניות ב-dPBS. לכל באר, יש לקחת בחשבון לפחות 50 מיקרוליטר של צבע חיוני.
  5. הסר בזהירות את המדיה מכל באר ותלייה מחדש היטב בבופר FACS קר (2-8 מעלות צלזיוס), תוך פיפיפטינג 10-20 פעמים כדי לשבש מכנית את ה-BME. העבר את תכולת כל באר ללוח תחתית עגול עם 96 בארות מסומן.
  6. צנטריפוגה ב-859 × גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הורידו את מדרגת ההאטה בכל שלבי הצנטריפוגציה והלאה כדי למנוע אובדן דגימה כתוצאה מערבוב פלטים.
  7. הסר את הסופרנטנט על ידי הפיכת הלוח והוצאת הנוזל בתנועה אחת ויציבה כלפי מטה. תשתה מחדש ב-50 מיקרו ליטר של קוקטייל נוגדנים. פיפט למעלה ולמטה לפחות 5 פעמים באמצעות פיפטה רב-ערוצית כדי להבטיח השעיה מחדש יסודית של פלט התא.
  8. דגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר לפי הצורך, מוגנים מאור. בסיום תקופת הדגירה, מוסיפים 150 מיקרוליטר dPBS לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית וצנטריפוגה ב-859 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  9. פנק את הסופרנטנט על ידי הפיכת הלוח והטלתו כלפי מטה פעם אחת בתנועה רציפה. החזירו ל-50 מיקרו ליטר של צבע חיות. פיפט למעלה ולמטה לפחות 5 פעמים באמצעות פיפטה רב-ערוצית כדי להבטיח השעיה מחדש יסודית של פלט התא.
  10. דגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנים מאור. בסיום תקופת הדגירה, יש להוסיף 150 מיקרוליטר של בופר FACS לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית וצנטריפוגה ב-859 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4°C.
  11. שחרר את הסופרנטנט כרגיל, והחזיר אותו ל-150 מיקרוליטר של בופר FACS אם דגימות יופעלו מיד על ציטומטר זרימה או יתקבע ב-150 מיקרוליטר של 0.5% פאראפורמלדהיד וישארו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. פיפט למעלה ולמטה לפחות 5 פעמים באמצעות פיפטה רב-ערוצית כדי להבטיח השעיה מחדש יסודית של פלט התא. סנן דגימות קבועות למניעת סתימת מכשירים והרץ על ציטומטר זרימה בתוך 12-36 שעות כדי למנוע אובדן פלואורסצנציה.
    הערה: פאראפורמלדהיד נחשב לכימיקל מסוכן. פעלו לפי תקנות הבטיחות הביולוגית המוסדית בטיפול ובסילוק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה מיקרוסקופית של קו-קולטורה אורגנידית נגועה בתאי T מסוג CD8
עכברים מוכנים VEOs נדבקו ב-LCMV ותרבתו יחד עם תאי T CD8 ספציפיים ל-LCMV. ביצענו גם את התרביות המשותפות הללו עם מודל זיהום HSV-2 כדי לקבוע את הגמישות של הפרוטוקול, אך אנו מציגים נתונים מיקרוסקופיים למודל LCMV וכללנו נתוני התמיינות תאי T במודל HSV-2 להלן. ה-LCMV מבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP), כך שניתן לראות את התאים הנגועים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנציה שגרתית. לשם כך, VEOs בני 7 ימים נדבקו ב-LCMV-Y...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TRMs של CD8 מסתמכים על רמזים סביבתיים מקומיים להבדלה ותחזוקה. רמזים אלו מטמיעים תכנות ספציפי לרקמות המאפשר ל-CD8 TRM להסתגל לסביבה ולבצע את משימות המעקב החיסוני לפי הצורך. למרבה הצער, TRMs לא שרדו במבחנה לאחר שהוצאו מהרקמה, וזה הגביל את הניתוח המפורט שלהם12,13. בפרוטוקול זה, סיפקנו שיטה שבה ניתן לתרבות משותפת של תאי T מסוג CD8 עם תאי אפיתל ולהתפתח ל-TRMs עם תכונות פנוטיפיות הדומות לאלו של תאי TRM במצב חי. שיטה ז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים מנוגדים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכון הלאומי לבריאות R01AI177704-01A1, R21AI183017-01, מענק זרע של אוניברסיטת בראון (ל-L.K.B.) ו-F31AI186444 (ל-Y.L.). ברצוננו להודות לד"ר דוריאן ב. מקגאוורן (NINDS, NIH) על סיפק את וירוס הכוריומנינגיטיס הלימפוציטי המבטא YFP. אנו מודים לעזרתו של ד"ר סאנגהיון לי והמעבדה שלו על עזרה בהדמיית Cytation-5 וליבת ציטומטריית הזרימה של אוניברסיטת בראון, לסיוע בבדיקות מבוססות זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
16% תמיסה מימית פרפורמלדהידמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים15710-S
לוחות תרבית טיסוצ'ה מרובים של 24 בארים פוליסטירן ללא טיפולVWR אינטרנשיונל10861-558
2-מרקפטואנולגיבקו21985023
מזרקים סטריליים של 3 מ"לפישר סיינטיפיק14-955-457
5 מ"ל,   Snap Cap,  מבחנות פוליסטירן עגולות, סטריליות,פלקון352058
צלחות פטרי 60 מ"מפישר סיינטיפיקFB0875713A 
70 & mu; מסנני תאים סטרילייםפישר סיינטיפיק22-363-548
מיקרופלטות פוליסטירן לא מטופלות עם תחתית עגולה עם 96 בארותגריינר ביו-וואן650101
לוחות תרבית רקמה מרובות בארות פוליסטירן 96 בארות לא מטופלותVWR אינטרנשיונל10861-562
אלבומין בקר/שבר Vתרמו-סיינטיקה כימיקליםJ6465518
כלוריד אמוניוםפישר סיינטיפיקA661-500
Amphotericin B סיגמא-אלדריץ'A9528-100MG
תוספת B-27גיבקו17504044
קורא רב-מצבי של ioTek Cytation 5 Cell Imaging
DMEM/F12 1:1 בינוניציטיבהSH30271. FS
תמיסת מלח מפופר-פוספט של דולבקו פעם אחתקורנינג21031CV
אתילנדיאמינטרטראאצטית (תמיסה של 0.5 M/pH 8.0)פישר סיינטיפיקBP2482-500
מספריים מיקרו-דקים דקים במיוחדחברת Roboz Surgical Instrument.RS-5882
סרום בקר עוברי - טופל בפחם/דקסטרןR& D SystemsS11650
תוכנת Flowjo v10בקטון, דיקינסון ושות'FlowJo (RRID:SCR_008520)
מלקחי גרפהחברת Roboz Surgical Instrument.RS-5135
פתרון HEPESציטיבהSH30237.01
L-גלוטמין (200 מ"מ)גיבקוA2916801
מגנט 5 מ"לביולג'נד480019
עכבר CD8 Naï ערכת בידוד תאי Tביולג'נד480044
חלבון רקומביננטי EGF בעכברגיבקו315091MG
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)גיבקו11140050
תמיסת פניצילין-סטרפטומיציןציטיבהSV30010
אשלגן ביקרבונטביומדיקל MP0215255780
אנטי-עכבר מטוהר CD3 ואפסילון; נוגדןביולג'נד100360
עכבר רקומביננטי B7.1 (CD80)-Fc Chimera (ללא נשאי)ביולג'נד555406
עכבר רקומביננטי IL-12 (עמוד 70) (ללא נשאי)ביולג'נד577004
עכבר רקומביננטי IL-2 (ללא נשאי)ביולג'נד575406
תמצית ממברנת בסיס עם גורם גדילה מופחתR& D SystemsBME001-10
מדיה RPMI 1640ציטיבהSH30027.LS
אזיד נתרןפישר סיינטיפיקS227I-25
נתרן פירובט (100 מ"מ)גיבקו11360070
טריפסין 0.25% פרוטאז עם טריפסין חזירציטיבהSH30042.02
צבע חיוניות (אדום 780)סיטק ביוסיינסס13-0865-T100

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosato, P. C., Beura, L. K., Masopust, D. Tissue resident memory T cells and viral immunity. Curr Opin Virol. 22, 44-50 (2017).
  2. Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nat Med. 21, 688-697 (2015).
  3. Schenkel, J. M., et al. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346 (6205), 98-101 (2014).
  4. Ariotti, S., et al. Skin-resident memory CD8 + T cells trigger a state of tissue-wide pathogen alert. Science. 346 (6205), 101-105 (2014).
  5. Christo, S. N., Park, S. L., Mueller, S. N., Mackay, L. K. The Multifaceted Role of Tissue-Resident Memory T Cells. Annu Rev Immunol. 42 (1), 317-345 (2024).
  6. Gavil, N. V., Cheng, K., Masopust, D. Resident memory T cells and cancer. Immunity. 57 (8), 1734-1751 (2024).
  7. Christo, S. N., et al. Discrete tissue microenvironments instruct diversity in resident memory T cell function and plasticity. Nat Immunol. 22 (9), 1140-1151 (2021).
  8. Pan, Y., et al. Survival of tissue-resident memory T cells requires exogenous lipid uptake and metabolism. Nature. 543, 252-256 (2017).
  9. Hasan, M. H., Beura, L. K. Cellular interactions in resident memory T cell establishment and function. Curr Opin Immunol. 74, 68-75 (2022).
  10. Ulibarri, M. R., et al. Epithelial organoid supports resident memory CD8 T cell differentiation. Cell Rep. 43 (8), 114621(2024).
  11. Evrard, M., et al. Single-cell protein expression profiling resolves circulating and resident memory T cell diversity across tissues and infection contexts. Immunity. 56 (7), 1664-1680.e9 (2023).
  12. Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8+ T Cell and Invariant NKT Subsets. J Immunol. 202 (7), 2153-2163 (2019).
  13. Künzli, M., et al. Long-lived T follicular helper cells retain plasticity and help sustain humoral immunity. Sci Immunol. 5 (45), eaay5552(2020).
  14. Kang, J. S., et al. Generation of induced alveolar assembloids with functional alveolar-like macrophages. Nat Commun. 16, 3346(2025).
  15. Lin, M., et al. Establishment of gastrointestinal assembloids to study the interplay between epithelial crypts and their mesenchymal niche. Nat Commun. 14, 3025(2023).
  16. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
  17. Quintard, C., et al. A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip. Nat Commun. 15, 1452(2024).
  18. Vincenti, I., et al. Tissue-resident memory CD8+ T cells cooperate with CD4+ T cells to drive compartmentalized immunopathology in the CNS. Sci Transl Med. 14 (640), eabl6058(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TT CD8

מאמרים קשורים