ציר Mettl3/NRF2 מדכא את התקדמות מחלת הפרקינסון באמצעות עיכוב פירופטוזיס המושרה על ידי NLRP3 בתאי עצב סרוטונין

מחלת פרקינסון (PD) מדורגת כהפרעה הנוירודגנרטיבית השנייה בשכיחותה בקרב קשישים, המשפיעה על כ-2-3% מבני 65 ומעלה, מה שמהווה נטל משמעותי הן על המשפחה והן^{על החברה.} למרות שהמנגנונים המדויקים מאחורי מחלת פרקינסון עדיין מובנים חלקית, עדויות מצטברות מצביעות על קשר בין התפתחות מחלת פרקינסון לבין אתגרים בהולכה עצבית, יחד עם דלקת עצבית המונעת על ידי תאי מיקרוגליה, שהיא תכונה נפוצה הנראית במוח מזדקן ובמחלות ניווניות שונות, כולל מחלת פרקינסון 2,3,4,5 . מיקרוגליה משמשת כתאי החיסון המולדים במערכת העצבים המרכזית (CNS) והיא חיונית לשמירה על הומאוסטזיס במוח⁶. עם זאת, הפעלת יתר מתמשכת של מיקרוגליה זו עלולה לעורר תגובות נוירו-דלקתיות כרוניות, ובסופו של דבר לתרום להתקדמות המחלה הנוירודגנרטיבית.

תהליכים דלקתיים מרכזיים והיקפיים משפיעים באופן משמעותי על הפתולוגיה של מחלת פרקינסון ^7,8. הפעלת תאי מיקרוגליה מעוררת תגובות דלקתיות המשפיעות על הישרדות העצבים⁹, כאשר ראיות מתפתחות מדגישות את תחולתו על ידי יוביקוויטין ליגאזות¹⁰. בין מסלולים דלקתיים שונים, הפעלת NOD-, LRR וחלבון 3 המכיל תחום פירין (NLRP3) משמשת כתורם עיקרי לוויסות דלקתי של מיקרוגליה¹¹. ההפעלה מובילה לביטוי NLRP3 ולהרכבה לאחר מכן של קומפלקס הדלקת המורכב מחלבון מתאם תחום ההפעלה והגיוס של קספאז (CARD) ופרו-קספאז-1, ומגיע לשיאו במחשוף חלבון ושחרור ציטוקינים¹². הפעלה מוגברת של NLRP3 נצפתה בחולי פרקינסון ובמודלים שונים של המחלה בבעלי חיים, וכתוצאה מכך מוות עצבי. יש לציין כי עיכוב NLRP3 הוכיח השפעות מגנות מפני פתולוגיה של מחלת פרקינסון במודלים של עכברים, מה שמדגיש את התפקיד המכריע של הדלקת NLRP3 בהופעת מחלת פרקינסון^13,14.

איתות סרוטונין (5-HT) הוא מנגנון משמעותי של ויסות עצבי, המשפיע על התנהגויות ותפקודים פיזיולוגיים רבים באמצעות אינטראקציות עם לפחות 14 תת-סוגים של קולטנים פוסט-סינפטיים^15,16, כולל תפקידים בפתולוגיה של מערכת העצבים המרכזית כמפורט בסקירות מקיפות¹⁷. ההשפעה הנוירומודולטורית הנרחבת של מערכת 5-HT נשלטת על ידי כ-26,000 נוירונים במוח המכרסמים¹⁸. בעוד שספרות משמעותית קושרת את מחלת פרקינסון בעיקר לאובדן נוירונים דופמינרגיים, הקשר בין נוירונים 5-HT למחלת פרקינסון נבדק פחות ביסודיות.

שינוי N6-methyladenosine (m6A), שינוי ה-mRNA הנפוץ ביותר בתאים אוקריוטיים, הוא המפתח לוויסות שחבור, יציבות וייצוא mRNA, ובכך להשפיע על פעילויות תאיות שונות¹⁹. רמות m6A מווסתות על ידי מתילטרנספראזות ודמתילאזות. שינויים מוגברים ב-m6A במוח נקשרו להתפתחות נוירולוגית, כאשר חוסר הוויסות שלו קשור קשר הדוק למצבים ניווניים^20,21, כולל ביטוי METTL3 שונה במודלים של אלצהיימר²². לדוגמה, הצטברות של מתילטרנספראז דמוי 3 (METTL3) בחלק הבלתי מסיס של רקמות מוח לאחר המוות של חולי אלצהיימר נמצאה בקורלציה חיובית עם רמות חלבון טאו בלתי מסיס²³. יתר על כן, ירידה משמעותית ברמות m6A בסטריאטום יכולה להוביל לירידה משמעותית ברמות המוליכים העצביים של הדופמין²⁴. יש לציין כי שנים עשר פולימורפיזמים חד-נוקלאוטידים הקשורים ל-m6A הראו קשרים משמעותיים עם רגישות למחלת פרקינסון²⁵. פרוטוקול זה קובע מתודולוגיות מקיפות לחקירת האופן שבו שינויים ב-m6A בתיווך METTL3 מווסתים את הפירופטוזיס של מיקרוגליה דרך ציר Nrf2/NLRP3, ובסופו של דבר משפיעים על הישרדות נוירוני סרוטונין במודלים של מחלת פרקינסון. מודל MPTP in vivo החריף ומודל LPS במבחנה נבחרו בשל האינדוקציה החזקה שלהם של תגובות נוירו-דלקתיות, אם כי פרדיגמות כרוניות יכולות להשלים מחקרים עתידיים כפי שנדון להלן.

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים העממי Feicheng (מספר אישור IACUC-2024-118) ובוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות ולעקרונות אתיים שנקבעו למחקר בחיות מעבדה. פרוטוקולי המחקר הבטיחו טיפול וטיפול אנושי בכל בעלי החיים, עם דגש מיוחד על מזעור סבל ומצוקה, תוך הקפדה על סטנדרטים מוסדיים והנחיות ARRIVE לשיטות מחקר אחראיות בבעלי חיים.

1. תרבית תאים ומודל הפעלת מיקרוגליה

1. הכנה ותחזוקה של תאי BV2
   1. הפשרה מהירה של תאי מיקרוגליה BV2 קפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, מה שמבטיח מערבולת עדינה למניעת הלם תרמי.
   2. צנטריפוגה מתלה התא המופשר ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) להסרת חומר קריאופרוטקנט.
   3. יש להשליך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את גלולת התא ב-10 מ"ל של מדיום DMEM מלא בעל גלוקוז גבוה בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-2 מ"מ L-גלוטמין.
   4. בצע הערכת כדאיות תאים בשיטת אי הכללת טריפאן כחול (ערבב 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם 10 מיקרוליטר של 0.4% טריפן כחול, ספירה באמצעות המוציטומטר), תוך הבטחת כדאיות של >95% לפני שתמשיך.
   5. תאי צלחת בצלוחיות תרבית T75 בצפיפות של 1 × 10⁶ תאים לבקבוק ונשמרים בחממת תרבית תאים לחה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
   6. תאי מעבר כל 48 שעות כאשר מגיעים למפגש של 80-85% באמצעות הליכי טריפסיניזציה סטנדרטיים.
      הערה: שמור על מספרי קטעים עקביים (קטעים 3-8) כדי להבטיח תגובות דלקתיות הניתנות לשחזור. כל ניסויי תרבית התאים חזרו על עצמם באופן עצמאי לפחות שלוש פעמים, עם שלושה שכפולים טכניים לכל מצב כדי למזער את השונות.
2. הפעלת מיקרוגליה הנגרמת על ידי LPS
   1. תאי BV2 זרעים בצלחות של 6 בארות ב -2 × 10⁵ תאים לבאר ב -2 מ"ל של מדיום שלם 24 שעות לפני הטיפול.
   2. הכן תמיסת מלאי LPS ב-1 מ"ג/מ"ל ב-PBS סטרילי, עקר מסנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר ואחסן במכסות חד פעמיות ב-20 מעלות צלזיוס.
   3. אמת את פעילות LPS באמצעות בדיקת Limulus Amebocyte Lysate (LAL) כדי לאשר את ריכוז האנדוטוקסין לפני כל ניסוי²⁶.
   4. יש לדלל את מלאי ה-LPS לריכוז עבודה של 1 מיקרוגרם/מ"ל ב-DMEM נטול סרום מיד לפני השימוש.
   5. הסר את מדיום התרבות מבארות ושטוף תאים פעמיים עם PBS סטרילי.
   6. הוסף 2 מ"ל של מדיום המכיל LPS (ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל) לבארות טיפול ו-DMEM ללא סרום כדי לשלוט בבארות.
   7. דגירה של תאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ להפעלה דלקתית.
   8. כלול בארות בקרה חיוביות שטופלו ב-100 ננוגרם/מ"ל גורם נמק גידול (TNF)-α ובארות בקרה שליליות עם רכב בלבד (PBS) כדי לאמת את התגובה הדלקתית.
      הערה: הכן תמיסת LPS טרייה לכל ניסוי כדי לשמור על פעילות ביולוגית עקבית. אם התגובה הדלקתית חלשה (למשל, עלייה של פי < בציטוקינים), בדוק את יציבות המגיב או הארך את הדגירה ל-48 שעות.
3. ביטוי יתר ונוקדאון של Mettl3
   1. תכנן וסינתז רצפי RNA מפריעים קטנים (siRNA) המכוונים ל-Mettl3 ורצפי בקרה מקושקשים באמצעות פרוטוקולי סינתזה סטנדרטיים של אוליגונוקלאוטיד. בחר רצפי יעד מאזור הקידוד של Mettl3 mRNA (הצטרפות GenBank: NM_019721) עם אורך של 19-21 נוקלאוטיד, מה שמבטיח תכולת GC של 40-60%²⁷.
   2. אמת רצפי siRNA באמצעות ניתוח BLAST כדי לאשר את הספציפיות ולהימנע מהשפעות מחוץ למטרה (להבטיח הומולוגיה של <70% עם גנים שאינם מטרה).
   3. הכן וקטורי ביטוי יתר המכילים Mettl3 cDNA באורך מלא משובט לתוך וקטור pcDNA3.1 באמצעות אתרי הגבלה EcoRI ו-XhoI.
   4. תאי טרנספקט במפגש של 70-80% באמצעות מגיב טרנספקציה של שומנים קטיוניים:
      1. מערבבים 2 מיקרוליטר של מגיב העברת שומנים קטיוני עם 50 pmol siRNA או 2 מיקרוגרם של DNA פלסמיד ב-100 מיקרוליטר של מדיום Opti-MEM.
      2. דגירה על תערובת למשך 15 דקות ב- RT.
      3. הוסף את קומפלקס הטרנספקציה טיפתית לתאים ודגירה למשך 4-6 שעות לפני המעבר למדיום שלם טרי.
   5. דגירה של תאים שעברו טרנספטציה במשך 48 שעות לפני הטיפול ב-LPS כדי לאפשר שינויים נאותים בביטוי החלבון.
   6. אשר את יעילות הטרנספקציה באמצעות טרנספקציה משותפת של מדווח פלואורסצנטי (100 ננוגרם של pEGFP-C1 לבאר), תוך התמקדות ביעילות של >70% על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לפני שתמשיך.

2. פיתוח מודלים של בעלי חיים ותכנון ניסויים

1. הכנת בעלי חיים ואקראיות
   1. השג עכברי C57BL/6J ממעבדת ויטל ריבר, תוך הבטחת יחס שווה בין זכר לנקבה, בגיל 8 שבועות, במשקל 19-26 גרם.
   2. חיות בית בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים (SPF) עם מחזור אור-חושך של 12:12 שעות, טמפרטורה מבוקרת (22 ± 2 מעלות צלזיוס) ולחות (50-60%).
   3. אפשר תקופת הסתגלות של 7 ימים עם גישה אד ליביטום לצ'או ומים סטנדרטיים.
   4. בצע הערכות התנהגותיות בסיסיות במהלך ההתאקלמות: בצע הערכות התנהגותיות מקיפות, כולל מבחן מיקום הגפיים הקדמיות (10 ניסויים לכל צד), הערכת רוטרוד מואצת (4-40 סל"ד במשך 5 דקות), וניתוח פעילות תנועה בשדה פתוח (מפגשים של 10 דקות במנגנון של 50 ס"מ × 50 ס"מ × 50 ס"מ)28,29,30.
   5. הקצה באופן אקראי בעלי חיים לקבוצות ניסוי (n = 6 לקבוצה) באמצעות אקראיות ממוחשבת כדי למזער הטיות: דמה, מודל, מודל+Nrf2-KD, מודל+oe-Nrf2.
   6. ליישם תכנון ניסוי עיוור שבו חוקרים המבצעים הערכות התנהגותיות אינם מודעים למטלות קבוצתיות.
2. מודל מחלת פרקינסון המושרה על ידי 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרה-הידרופירידין (MPTP)
   1. הכן תמיסת MPTP ב-30 מ"ג/ק"ג במי מלח סטריליים מיד לפני ההזרקה על ידי המסת 15 מ"ג של MPTP הידרוכלוריד ב-5 מ"ל של מי מלח סטריליים והתאמת נפח על סמך משקל החיה.
      זהירות: MPTP הוא נוירוטוקסיק מאוד. יש לטפל במכסה אדים כימי עם ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות כפולות וחלוק מעבדה.
   2. מתן MPTP באמצעות הזרקה תוך צפקית במשקל גוף של 30 מ"ג/ק"ג (נפח הזרקה 10 מ"ל/ק"ג) במשך שלושה ימים רצופים באותה שעה בכל יום (09:00 ± 30 דקות).
   3. להזריק לבעלי חיים מקבוצת דמה כמויות שוות של מי מלח סטריליים בהתאם ללוח זמנים זהה להזרקה.
   4. עקוב אחר בעלי חיים לאיתור סימני מצוקה, ירידה במשקל (>15% נחשבים לנקודת קצה), או תגובות שליליות מדי יום במהלך תקופת מתן MPTP באמצעות גיליונות ניקוד סטנדרטיים.
   5. שמור על בעלי חיים במשך 8 ימים לאחר ההזרקה הסופית כדי לאפשר התפתחות ניוון עצבי.
      הערה: ניתן לשכן בעלי חיים כרגיל במהלך תקופה זו עם ניטור מתמשך.
3. הזרקה ויראלית סטריאוטקטית
   1. הכן וקטורים נגיפיים AAV9 על ידי טרנספקציה משולשת של תאי HEK293T באמצעות פוליאתילנימין (PEI; יחס 1:3 DNA:PEI), קצור ב-72 שעות לאחר הטרנספקציה, טיהור באמצעות אולטרה-צנטריפוגה בשיפוע יודיקסנול (177,000 × גרם למשך שעתיים), וריכוז באמצעות התקני סינון צנטריפוגלי להשגת 1 ×^{10 12} עותקי גנום/מ"ל.
   2. אמת טיטר ויראלי באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית (PCR) באמצעות פריימרים המכוונים לאזורי ITR, וודא שהטיטרים יגיעו לעותקי גנום של 1 × 10¹² למ"ל עם ניתוח עקומה סטנדרטי.
   3. אמת טיטר ויראלי באמצעות PCR כמותי מבוסס SYBR Green עם פריימרים ספציפיים ל-ITR, ביצוע דילולים סדרתיים של תקנים ידועים וחישוב עותקי גנום באמצעות ניתוח עקומה סטנדרטית. אשר היעדר זיהום וירוס בעל יכולת שכפול באמצעות p24 ELISA.
   4. הרדמה של עכברים עם איזופלורן (3% אינדוקציה, 1.5-2% תחזוקה) המועברת בקצב זרימת חמצן של 0.8-1.0 ליטר לדקה דרך חרוט האף, ניטור קצב הנשימה (60-100 נשימות לדקה) ורפלקס צביטה בבוהן לאורך כל ההליך. אבטח את העכבר במסגרת הסטריאוטקטית ומרח משחה עיניים למניעת ייבוש הקרנית.
   5. אבטח את העכבר במסגרת הסטריאוטקטית ומרח משחה עיניים למניעת ייבוש הקרנית.
   6. בצע חתך בקו האמצע של 1.5 ס"מ בקרקפת באמצעות להב אזמל סטרילי וזהה את נקודת הציון של ברגמה באמצעות קואורדינטות סטריאוטקטיות בדיוק של 0.1 מ"מ.
   7. חשב קואורדינטות הזרקה לסטריאטום: קדמי-אחורי -0.5 מ"מ, מדיאלי-לרוחב ±2.0 מ"מ, גבי-גחון -3.0 מ"מ מברגמה.
   8. בצע הזרקות פיילוט עם עוקב פלואורסצנטי (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP]) כדי לאמת את דיוק המטרה, אישור >80% קו-לוקליזציה עם סמני מיקרוגליה (Iba1) באמצעות אימונוהיסטוכימיה לפני זריקות ניסיוניות.
   9. מחט הזרקה תחתונה (33-G) כדי לכוון לעומק בקצב של 1 מ"מ/דקה ולהזריק 2 מיקרוליטר של תרחיף ויראלי ב-0.2 מיקרוליטר לדקה באמצעות משאבת מיקרו-מזרק עם בקר אוטומטי. הורד את מחט ההזרקה לעומק המטרה והזריק 2 מיקרוליטר של תרחיף ויראלי בקצב של 0.2 מיקרוליטר לדקה באמצעות משאבת מיקרו-מזרק.
   10. שמור על מיקום המחט למשך 5 דקות לאחר ההזרקה כדי למנוע זרימה חוזרת.
   11. משוך לאט את המחט בקצב של 0.5 מ"מ לדקה, סגור את החתך עם 4-0 תפרי משי באמצעות דפוס מופרע, ואפשר התאוששות מהרדמה על כרית התאוששות מחוממת.
   12. יש לתת משככי כאבים לאחר הניתוח (קרפרופן 5 מ"ג/ק"ג תת עורי פעם ביום למשך 3 ימים) ולעקוב אחר ההתאוששות במשך 24 שעות עם דפי תצפית מפורטים.

3. טכניקות ואימות בביולוגיה מולקולרית

1. מיצוי RNA ובקרת איכות
   1. קצירת תאים או דגימות רקמת מוח סטריאטלית מיד לאחר נקודות הסיום הניסיוניות על ידי המתת חסד של בעלי חיים באופן אנושי באמצעות שאיפת CO₂ ואחריה פריקת צוואר הרחם; לנתח רקמה על קרח, לטחון דק ולהתנתק אנזימטית עם 0.25% טריפסין למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס אם קוצרים תאים.
   2. חלץ RNA כולל באמצעות מגיב TRIzol (1 מ"ל לכל 1 10⁶ תאים או 100 מ"ג רקמה) עם הומוגניזציה מכנית (20-25 פעימות בהומוגנייזר דונג) והפרדת פאזה של כלורופורם (0.2 מ"ל כלורופורם לכל 1 מ"ל של TRIzol).
   3. הערך את איכות ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטריה (יחס A260/A280 1.8-2.0) ואלקטרופורזה של ג'ל (1% אגרוז) כדי לאשר רצועות ריבוזומליות 28S ו-18S.
   4. כימות ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
   5. אחסן דגימות RNA ב-80 מעלות צלזיוס במים נטולי נוקלאז ב-80 מעלות צלזיוס בתוספת מעכב RNase (40 יחידות/מיקרוליטר) עד לניתוח.
2. פיצול גרעיני-ציטופלזמי
   1. קצרו תאים (2 × 10⁶ מינימום) ושטפו פעמיים עם PBS קר כקרח (5 מ"ל לכביסה, צנטריפוגה של 5 דקות ב -300 × גרם).
   2. השתמש בערכת פיצול תאים מסחרית עם הפרוטוקול הבא.
      1. השעו מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר מיצוי ציטופלזמי עם מעכבי פרוטאז.
      2. דגירה על קרח למשך 10 דקות עם מערבולת כל 3 דקות.
      3. צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ואוספת סופרנטנט (מקטע ציטופלזמי).
      4. שטפו את הגלולה פעמיים עם מאגר מיצוי ציטופלזמי.
      5. השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר מיצוי גרעיני.
      6. דגירה על קרח למשך 40 דקות עם מערבולת כל 10 דקות.
      7. צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ואוספים את הסופרנטנט (החלק הגרעיני)
   3. אמת את יעילות הפיצול על ידי ניתוח התפלגות סמן גרעיני (U6) וסמן ציטופלזמי (GAPDH) באמצעות כתם מערבי.
   4. חלץ RNA משברים גרעיניים וציטופלזמיים בנפרד.
   5. נתח את רמות ה-mRNA של Nrf2 בכל שבר באמצעות RT-qPCR עם גני ייחוס ספציפיים לשבר.
3. PCR כמותי בזמן אמת (RT-qPCR)
   1. סנתז cDNA מ-1 מיקרוגרם של RNA כולל באמצעות ערכת ריאגנטים לשעתוק הפוך עם פריימרים אקראיים.
   2. בצע qPCR באמצעות ערכת Premix Ex Taq II עם פריימרים ספציפיים לגן במערכת PCR בזמן אמת.
   3. אמת את ספציפיות הפריימר באמצעות ניתוח עקומת התכה ואשר אמפליקון בודד על ידי אלקטרופורזה של ג'ל.
   4. השתמש בתנאי הרכיבה התרמית הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריה 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
   5. חשב את רמות ביטוי ה-mRNA היחסיות בשיטת ^2-ΔΔCt עם β-אקטין כהתייחסות פנימית.
   6. כלול בקרות ללא תבנית ואמת את יציבות גן הייחוס בתנאי ניסוי באמצעות ניתוח geNorm (ערך יציבות M < 0.5).
      הערה: ציוני שחזור: מקדם שונות תוך-מבחן (CV) <10% על פני שלוש ריצות בלתי תלויות.
4. MeRIP-qPCR לניתוח שינוי m6A
   1. חלץ את סך ה-RNA (מינימום 20 מיקרוגרם) ושבר ל-100-200 נוקלאוטידים באמצעות מגיב פיצול RNA (10 מ"מ ZnCl₂, 10 מ"מ Tris-HCl, pH 7.0) ב-70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   2. בצע משקעים חיסוניים באמצעות נוגדן ספציפי ל-m6A (2 מיקרוגרם לכל 20 מיקרוגרם RNA) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב (10 סל"ד) במאגר חיסוני (50 מ"מ Tris-HCl, pH 7.4, 750 מ"מ NaCl, 0.5% NP-40).
   3. אמת את ספציפיות הנוגדנים באמצעות בקרות RNA ידועות ששונו ולא השתנו ב-m6A.
   4. שטפו מתחמים עם משקעים חיסוניים חמש פעמים עם מאגר כביסה.
   5. הוצאת RNA קשור ותמלול הפוך באמצעות פריימרים אקראיים.
   6. תמלול הפוך של RNA באמצעות פריימרים אקראיים ובצע ניתוח qPCR באמצעות פריימרים ספציפיים ל-Nrf2 המכסים אתרי m6A פוטנציאליים.
   7. בצע ניתוח qPCR באמצעות פריימרים ספציפיים ל-Nrf2 וחשב העשרה ביחס ל-RNA הקלט.
      הערה: אם הזיהוי אינו עקבי, מטב את זמן הפיצול (4-6 דקות) כדי לשפר את יכולת השחזור; אמת מידה כמותית: יחס אות לרעש >15:1 בהשוואה לפקדי IgG.

4. ניתוח ואימות חלבונים

1. מיצוי וכימות חלבונים
   1. תאי ליז (1 × 10^{6 תאים} ) או הומוגניזציה של דגימות רקמה (100 מ"ג של רקמה סטריאטלית) ב-200 מיקרוליטר של מאגר בדיקת רדיו-אימונו-משקעים (RIPA) המכיל מעכבי פרוטאז (1 מ"מ פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF), 1 מיקרוגרם/מ"ל לאופפטין, 1 מיקרוגרם/מ"ל פפסטין A) ומעכבי פוספטאז (1 מ"מ נתרן אורתוואנדאט, 5 מ"מ נתרן פלואוריד).
   2. דגירה על ליזטים על קרח למשך 30 דקות עם מערבולת תקופתית (כל 10 דקות למשך 10 שניות).
   3. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להסרת פסולת תאית ואיסוף סופרנטנט.
   4. כמת את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) עם תקני אלבומין בסרום בקר (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 מיקרוגרם/מ"ל) במדידות משולשות.
   5. אמת את שלמות החלבון על ידי ניתוח רמות חלבון משק הבית (GAPDH, MW צפוי: 36 kDa) על פני כל הדגימות באמצעות Western Blot.
2. ניתוח כתמים מערביים
   1. הכינו דגימות חלבון עם עומס שווה (30-50 מיקרוגרם) במאגר העמסה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) (ריכוזים סופיים: 62.5 מ"מ Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% גליצרול, 5% β-מרקפטואתנול, 0.003% ברומופנול כחול) ודנטציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   2. הפרד חלבונים על ידי SDS-PAGE באמצעות ג'ל פוליאקרילאמיד 10%, הפועל ב-80 וולט למשך 30 דקות ואחריו 120 וולט למשך 90 דקות במאגר טריס-גליצין-SDS.
   3. העברת חלבונים לממברנות פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) באמצעות מערכת העברה חצי יבשה (400 mA למשך 90 דקות) במאגר העברה (25 מ"מ טריס, 192 מ"מ גליצין, 20% מתנול).
   4. אשר את יעילות ההעברה באמצעות צביעת חלבון הפיכה (Ponceau S: 0.1% ב-5% חומצה אצטית למשך 5 דקות) לפני שתמשיך לדגירת נוגדנים.
   5. חסום ממברנות עם 5% חלב ללא שומן ב-TBST (TBS + 0.1% Tween-20) למשך שעה אחת ב-RT עם תסיסה עדינה.
   6. דגירה עם נוגדנים ראשוניים מדוללים 1:1000 במאגר חוסם לילה ב-4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
   7. שטפו את הממברנות שלוש פעמים עם TBST (10 דקות כל אחת) ודגרו עם נוגדנים משניים מצומדים ל-HRP (דילול של 1:5000) למשך שעה אחת ב-RT.
   8. זיהוי רצועות חלבון באמצעות כימילומינסנציה משופרת וכימות באמצעות צפיפות.
   9. לנרמל את ביטוי חלבון המטרה לבקרת העמסה (GAPDH) ולאמת את ספציפיות הנוגדנים באמצעות בקרות מתאימות (חסימת פפטידים לנוגדנים ראשוניים, בקרות משניות בלבד).

5. הערכה התנהגותית וניתוח תפקודי

1. מבחן מיקום הגפיים הקדמיות
   1. אפשר לעכבר להתאקלם בסביבת הבדיקה (חדר שקט, 22 מעלות צלזיוס, תאורה עמומה) למשך 30 דקות לפני ההערכה.
   2. אחוז בעכבר בעדינות בעור הגב, תלה את כל ארבעת הגפיים כ-0.5 ס"מ מעל קצה השולחן תוך הקפדה שהעכבר לא יכול לראות את משטח השולחן.
   3. צחצחו ויבריסה מכל צד כנגד קצה השולחן כדי להפעיל את רפלקס ההצבה ולתעד מיקום מוצלח של הגפיים הקדמיות תוך 2 שניות.
   4. בצע 10 ניסיונות לכל צד עם מרווחים של 30 שניות בין הניסיונות, לסירוגין בצד שמאל וימין.
   5. בצע בדיקות בתנאי תאורה עקביים (50-100 לוקס) ובשעה ביום (13:00-17:00) כדי למזער את ההשפעות הצירקדיות.
   6. חשב את שיעור ההצלחה כאחוז מהמיקומים המוצלחים: (מיקומים מוצלחים/סה"כ ניסיונות) × 100.
2. האצת מבחן הרוטרוד
   1. הגדר את מנגנון הרוטארוד למהירות התחלתית של 4 סל"ד עם תאוצה ליניארית ל-40 סל"ד במשך 5 דקות.
   2. אמן עכברים על הרוטרוד במשך 3 ימים רצופים (3 ניסויים ביום, מרווחים של 15 דקות) לפני הבדיקה כדי למזער את השפעות הלמידה.
   3. תקנן את תנאי הבדיקה, כולל RT (22 ± 2 מעלות צלזיוס), תאורה (100 לוקס) ורמות רעשי רקע (<50 dB).
   4. הנח את העכבר על המוט המסתובב עם הפנים קדימה והתחל מיד את פרוטוקול ההאצה.
   5. רשום חביון לנפילה (זמן מההתחלה ועד נפילת עכבר או השלמת ניסוי של 5 דקות) עבור כל ניסוי, בדיקה 5 פעמים לכל בעל חיים עם מרווחי מנוחה של 15 דקות.
   6. חשב את ההשהיה הממוצעת משלושת הניסויים הארוכים ביותר כדי למזער את השונות עקב גורמי מוטיבציה.
3. בדיקת שדה פתוח
   1. השתמש במנגנון שדה פתוח (50 ס"מ × 50 ס"מ × קופסת אקריליק שקופה 50 ס"מ) עם מערכת מעקב וידאו הממוקמת 1 מ' מעל הזירה.
   2. נקו מכשירים עם 70% אתנול בין בעלי חיים (ריסוס וניגוב, ייבוש באוויר למשך 5 דקות) כדי למנוע רמזי ריח.
   3. הנח את העכבר במרכז המכשיר והקלט פעילות למשך 10 דקות בתאורה עקבית (200 לוקס) עם צילום וידאו ב-30 פריימים לשנייה.
   4. נתח פרמטרים מרובים באמצעות תוכנת מעקב אוטומטית:
      מרחק נסיעה כולל (ס"מ)
      זמן אזור מרכז (מוגדר כ-10 ס"מ מהקירות, מדווח ב-s)
      מהירות תנועה (ס"מ לשנייה)
      זמן בילוי באזורי פריפריה לעומת מרכז
4. הגדירו את האזור המרכזי כ-10 ס"מ מהקירות וכמתו את זמן השהות והמרחק במרכז לעומת אזורי הפריפריה.

6. מיקרוסקופיה והדמיה מתקדמת

1. צביעת DHE לזיהוי ROS
   1. הכן תמיסת דיהידרואתידיום (DHE) טרייה ב-10 מיקרומטר ב-PBS מיד לפני השימוש (הגן מפני אור).
   2. בצע צביעה קו-אימונופלואורסצנטית בשילוב DHE עם נוגדן טריפטופן הידרוקסילאז 2 (TPH2) (דילול 1:500) כדי לזהות באופן ספציפי נוירונים של סרוטונין.
      הערה: גישה זו של תיוג כפול מאפשרת להבחין בין ייצור ROS בתוך גופי תאי עצב חיוביים ל-TPH2 לבין עקה חמצונית בתאי גליה שמסביב, בהתבסס על העיקרון ש-DHE, לאחר חמצון על ידי סופראוקסיד, יוצר תוצרים פלואורסצנטיים בעלי משמעות ממברנה שנשארים מקומיים בתוך תא המקור.
   3. דגירה של קטעי רקמה (עובי 20 מיקרומטר) עם תמיסת DHE למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס בתנאי חושך בתא לח.
   4. כלול בקרות שליליות (ללא DHE) ובקרות חיוביות (טיפול ב-100 מיקרומטר H₂O₂ למשך 30 דקות) כדי לאמת את ספציפיות זיהוי ה-ROS.
   5. שטפו חלקים שלוש פעמים עם PBS והרכיבו עם מדיום הרכבה נגד דהייה.
   6. תמונה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (DHE: עירור 518 ננומטר/פליטת 605 ננומטר, TPH2: עירור 488 ננומטר/פליטה של 525 ננומטר) עם הגדרות חשיפה עקביות (200 אלפיות השנייה) על פני דגימות; מערכות הדמיה כוילו מדי שבוע באמצעות חרוזי פלואורסצנטיות סטנדרטיים (יחס אות לרעש > 20:1).
   7. כמת את עוצמת הקרינה בתאים חיוביים ל-TPH2 רק באמצעות תוכנת ImageJ עם פרוטוקולי ניתוח סטנדרטיים (סף: 50-255, גודל חלקיקים: 10-∞ פיקסלים²). קבע גבולות החזר ROI המבוססים על תגובתיות חיסונית TPH2 כדי להבטיח מדידה של מתח חמצוני במיוחד בתוך נוירונים סרוטונרגיים תוך אי הכללת אות ממיקרוגליה, אסטרוציטים או סוגי תאים אחרים. עבור כל בעל חיים, נתח לפחות 50 נוירונים חיוביים ל-TPH2 על פני מקטעי רקמה מרובים.
2. אימונוהיסטוכימיה
   1. תקן קטעי רקמה ב-4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
   2. התייבשו באמצעות סדרת אתנול מדורגת (70%, 80%, 90%, 95%, 100% × 2, שעה כל אחד) והטמיעו בפרפין באמצעות מעבד אוטומטי.
   3. חותכים קטעים של 5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום והרכבה על שקופיות זכוכית טעונות, תוך הבטחת 3-4 חלקים לכל שקופית.
   4. הפחיתו חלקים באמצעות קסילן (2 × 10 דקות) והחזירו לחות דרך אתנול מדורג למים.
   5. בצע אחזור אנטיגן באמצעות מאגר ציטראט (10 מ"מ נתרן ציטראט, pH 6.0) במיקרוגל (750 וואט למשך 10 דקות עם מרווחי קירור של 2 דקות).
   6. אמת את ספציפיות הנוגדנים באמצעות בקרות שליליות מתאימות (ללא נוגדן ראשוני) ורקמות בקרה חיוביות (קטעי מוח הידועים כמבטאים חלבוני מטרה).
   7. חסום פעילות פרוקסידאז אנדוגנית עם 3% מי חמצן במתנול למשך 10 דקות ב-RT.
   8. יש למרוח נוגדנים ראשוניים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתא לח.
   9. זיהוי באמצעות נוגדנים משניים מצומדים HRP (דילול של 1:500, שעה ב-RT) וכרומוגן DAB (דגירה עד להתפתחות צבע חום, בדרך כלל 2-5 דקות).
   10. כתם נגד עם המטוקסילין (30 שניות), לייבש, לנקות ולהרכיב עם אמצעי הרכבה קבוע.
   11. כימות תאים חיוביים בשיטות סטריאולוגיות עם דגימה אקראית שיטתית (כל סעיף 5, 3 ספירת פריימים למקטע, הגדלה של 40×).

7. ניתוח סטטיסטי ואימות נתונים

1. תכנון וניתוח סטטיסטי
   1. בצע ניתוח כוח כדי לקבוע גדלי מדגם נאותים לזיהוי הבדלים בעלי משמעות ביולוגית (גודל אפקט ≥ 0.8, הספק ≥ 0.80, α = 0.05) באמצעות תוכנת G*Power 3.1.9.7.
   2. לאמת את נורמליות הנתונים באמצעות מבחן שפירו-וילק ולהעריך הומוגניות של שונות באמצעות מבחן לוין לפני ניתוח פרמטרי.
   3. לנתח נתונים באמצעות תוכנה סטטיסטית עם מבחנים סטטיסטיים מתאימים המבוססים על תכנון ניסוי והפצת נתונים.
   4. ליישם ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) עבור השוואות חד-גורמיות ו-ANOVA דו-כיווני עבור עיצובים פקטוריאליים (למשל, אינטראקציות זמן × טיפול).
   5. השתמש במבחן הפוסט הוק של Tukey להשוואות מרובות כאשר ANOVA מראה מובהקות (p < 0.05), תוך החלת תיקון Bonferroni במידת הצורך.
   6. הגדר סף מובהקות סטטיסטית ב-p < 0.05 עבור כל הניתוחים עם סימון נוסף עבור p < 0.01 ו-p < 0.001.
   7. דווח על גדלי אפקט (d או η² של כהן) ורווחי סמך של 95% לצד ערכי p כדי לספק פרשנות סטטיסטית מקיפה.
   8. הצג נתונים כממוצע ± SEM ממינימום של שלושה ניסויים בלתי תלויים, עם נקודות נתונים בודדות המוצגות כאשר n ≤ 10.
      הערה: יש לחזור על כל ניסויי תרבית התאים באופן עצמאי לפחות שלוש פעמים, כאשר כל ניסוי כולל בקרות מתאימות ושכפולים טכניים מרובים, והשונות הנצפית (למשל, CV <15% לנתונים התנהגותיים) ממוזערת באמצעות עיוורון ותזמון סטנדרטי.

הפרוטוקול מדגים בהצלחה כי ביטוי Mettl3 יורד בתאי מיקרוגליאה שטופלו ב-LPS (איור 1), כפי שמעידים ירידה ברמת ה-mRNA ורמת החלבון בהשוואה לקבוצות הביקורת (איור 1B,C). ניתוח ELISA מאשר הפעלה דלקתית מוצלחת בתיווך LPS באמצעות רמות גבוהות של IL-6 ו-TNF-α בתרבית סופרנטנטים (איור 1A).

ניתוח MeRIP-qPCR מגלה כי ביטוי יתר של Mettl3 משפר מתילציה של Nrf2 mRNA m6A, מה שבאופן פרדוקסלי מגביר את יציבות החלבון וביטויו במקום לקדם פירוק, בהתאם לראיות המתפתחות לכך ששינויים ב-m6A יכולים לשפר את יעילות התרגום בהקשרים תאיים ספציפיים (איור 2A,B). ניסויי פיצול גרעיני-ציטופלזמי מדגימים כי בעוד שהתפלגות ה-mRNA של Nrf2 נשארת ללא שינוי בין תאים תאיים, רמות החלבון מווסתות באופן משמעותי על ידי מצב ביטוי Mettl3 (איור 2C,D).

ניסויים in vivo המשתמשים במודלים של PD המושרים על ידי MPTP מראים כי ליקויים התנהגותיים קשורים לשינויים מולקולריים בציר Mettl3/Nrf2. כל דגימות הרקמה התקבלו מהאזור הסטריאטלי (קואורדינטות: +0.5 עד -0.5 מ"מ מברגמה, ±1.5 עד ±2.5 מ"מ לרוחב, -2.5 עד -3.5 מ"מ גחון). עכברים בקבוצת המודל מציגים דיוק מופחת במיקום הגפיים הקדמיות, ירידה בביצועי הרוטרוד ופעילות שדה פתוח מופחתת בהשוואה לבקרות דמה (איור 3A). נוקדאון Nrf2 מחמיר את הליקויים הללו, בעוד שביטוי יתר של Nrf2 מספק הגנה חלקית. ניתוח אימונוהיסטוכימי חושף ירידה באוכלוסיות המיקרוגליה (תאים חיוביים ל-Iba1) באזורים סטריאטליים של מודלים של מחלת פרקינסון, כאשר אפנון Nrf2 משפיע על הישרדות המיקרוגליה בהתאם (איור 3B).

רמות ציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-1β, IL-18, TNF-α) עולות באופן משמעותי במודלים של מחלה כצפוי, כאשר קבוצת המודל הראתה רמות גבוהות בהשוואה לבקרות Sham, וביטוי יתר של Nrf2 מספק השפעות אנטי דלקתיות (איור 3C). ניתוח מולקולרי מדגים סמני פירופטוזיס מוגברים, כולל GSDMD-N, cleaved-caspase-1 ו-NLRP3 בבעלי חיים שטופלו ב-MPTP, עם תוצאות כתם מערבי מתוקנות המציגות סמני משקל מולקולרי תקינים (איור 3D). מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מאשר היווצרות מוגברת של גוף פירופטוטי בבעלי חיים חולים, כאשר אפנון Nrf2 משפיע על היקף המוות של תאים פירופטוטיים (איור 3E).

צביעת DHE בשילוב עם אימונופלואורסצנציה TPH2 חושפת רמות ROS גבוהות במיוחד בתאי עצב סרוטונין של מודלים של מחלת פרקינסון (איור 4A). הלוקליזציה המשותפת של תוצרי חמצון DHE בתוך גופי תאים חיוביים ל-TPH2 מצביעה על יצירת סופראוקסיד אנדוגני בתאי עצב אלה, העולה בקנה אחד עם תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הנגרמת על ידי ציטוקינים דלקתיים והגנות נוגדות חמצון לקויות. ההתפלגות המרחבית של אות ה-DHE תואמת את המורפולוגיה העצבית ולא את חמצון הרקמות המפוזר, ותומכת במתח חמצוני ספציפי לסוג התא. אימונוהיסטוכימיה מראה ירידה בביטוי של סמני נוירוני סרוטונין TPH2 ו-SLC6A4 בקבוצות מודל ומודל+Nrf2-KD, עם השפעות הגנה שנצפו בקבוצת Model+oe-Nrf2 (איור 4B). ממצאים אלה מצביעים על כך שפירופטוזיס מיקרוגליאלי מוביל למתח חמצוני ולנזק לתאי עצב סרוטונין לאחר מכן.

המסלול המכניסטי הכולל מסוכם באיור 5, הממחיש כיצד שינוי m6A בתיווך Mettl3 של Nrf2 מדכא פירופטוזיס מיקרוגליאלי ומגן על נוירוני סרוטונין.

ניסויים מוצלחים מראים בדרך כלל קשרי מינון-תגובה ברורים בין רמות הביטוי של Mettl3/Nrf2 לבין סמנים דלקתיים במורד הזרם. תוצאות לא אופטימליות עלולות להתרחש עקב התמרה ויראלית לא מלאה, הפעלת LPS לא מספקת או בעיות טכניות במהלך עיבוד הרקמות. ניסויי בקרה מדגימים באופן עקבי ספציפיות נוגדנים תקינה והיעדר קשירה לא ספציפית בניתוחים אימונוהיסטוכימיים. יעילות הזיהום הנגיפי בסטריאטום אומתה באמצעות לוקליזציה משותפת עם סמני Iba1 ו-NeuN, המאשרים מיקוד מיקרוגליאלי דומיננטי.

איור 1: תת-ביטוי של Mettl3 בתאי מיקרוגליאה המושרים על ידי LPS. (A) מדידת ELISA של רמות IL-6 ו-TNF-α בתאי מיקרוגליאה שטופלו ב-LPS. (B) מדידת RT-qPCR של רמות mRNA Mettl3 בתאי מיקרוגליה שטופלו ב-LPS. (C) מדידת כתם מערבי של רמות חלבון Mettl3 בתאי מיקרוגליה שטופלו ב-LPS המראה Mettl3 ב-64 kDa ו-GAPDH ב-36 kDa. **הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM, n = 6 לקבוצה. *p < 0.05, p < 0.01 לעומת קבוצת הביקורת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: Mettl3 משפיע על תרגום Nrf2 באמצעות שינוי m6A בתאי מיקרוגליאה המושרים על ידי LPS. (A) מדידת RT-qPCR של רמות mRNA Nrf2 בקבוצות oe-NC ו-oe-Mettl3. (B) מדידת MeRIP-qPCR של רמות מתילציה של Nrf2 בקבוצות oe-NC ו-oe-Mettl3. (C) מדידת RT-qPCR של רמות mRNA Nrf2 בגרעין ובציטופלזמה של קבוצות ניסוי. (D) מדידת כתם מערבי של רמות חלבון Nrf2 בקבוצות ניסוי המציגה Nrf2 ב-110 kDa ו-GAPDH ב-36 kDa. **הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM, n = 6 לקבוצה. *p < 0.05, p < 0.01 לעומת קבוצת הביקורת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הדגמה in vivo של ציר Mettl3/Nrf2 המפעיל פירופטוזיס מיקרוגליאלי באמצעות דלקת NLRP3. (A) הערכות התנהגותיות כולל מיקום הגפיים הקדמיות, רוטרוד ומבחני שדה פתוח. (B) זיהוי אימונוהיסטוכימי של ביטוי חלבון Iba ברקמת המוח (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). (C) זיהוי ELISA של ציטוקינים דלקתיים ברקמת המוח המראה עלייה צפויה בקבוצות המודל עם ירידה בביטוי יתר של Nrf2. (D) זיהוי כתמים מערביים של סמני פירופטוזיס עם הערות משקל מולקולרי: NLRP3 ב-110 kDa, cleaved-Caspase-1 ב-22 kDa, GSDMD-N ב-31 kDa ו-GAPDH ב-36 kDa. (E) זיהוי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של גופים פירופטוטיים (מסומן על ידי חיצים לבנים שמראים שלפוחיות אופייניות של 1-5 מיקרומטר הקשורות לממברנה). כימות מבוסס על 5 שדות בכל חתך, n = 6 בעלי חיים/קבוצה. **הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM, n = 6 לקבוצה. *עמ' < 0.05, עמ' < 0.01 מול קבוצת שאם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: פירופטוזיס מיקרוגליאלי גורם לנזק למיטוכונדריה ומקדם אפופטוזיס של נוירונים 5-HT. (A) צביעת DHE בשילוב עם אימונופלואורסצנציה TPH2 עבור זיהוי ROS במיוחד בתאי עצב 5-HT (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). גישת הקו-לוקליזציה מאפשרת הבחנה של מתח חמצוני בתוך גופי תאי עצב חיוביים ל-TPH2 מתאי הגליה שמסביב. (B) זיהוי אימונוהיסטוכימי של ביטוי חלבונים TPH2 ו-SLC6A4 בתאי עצב 5-HT (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). **הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM, n = 6 לקבוצה. *עמ' < 0.05, עמ' < 0.01 מול קבוצת שאם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ייצוג סכמטי של דיכוי בתיווך Mettl3 של התקדמות מחלת פרקינסון באמצעות שינוי m6A של Nrf2 ועיכוב מוות עצבי 5-HT. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי אינטרסים הקשורים לעבודה זו. לאף מחבר אין כל קשר פיננסי עם חברות שמוצריהן מוזכרים במאמר זה.