ניתוח אופטימלי של חלבונים מביציות קסנופוס ועוברים על ידי Immunoblotting

הבנת מנגנונים תאיים מחייבת ניטור של מיני חלבונים ספציפיים. שאלות נפוצות כוללות כיצד הם משתנים בביטוי מרחבי וזמני, עם אילו חלבונים הם מתקשרים, ואם הם משתנים בתגובה לתנאים שונים. Immunoblotting, הידוע בכינוי "Western blotting", הוא מתודולוגיה מרכזית להתמודדות עם אתגרים אלה. ניסוי אימונו-בלוט מפריד חלבונים מדגימה מורכבת - למשל, ליזאט של תא שלם - ומזהה אותם באמצעות נוגדנים. באופן ספציפי, חלבונים עוברים דנטורציה ולאחר מכן מופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) לפי גודל. החלבונים המפוצלים בגודל מועברים לתמיכה מוצקה, כגון קרום ניטרוצלולוזה, והחלבון המעניין מזוהה באמצעות ריאגנטים של נוגדנים. אימונובלוטינג הפך לחלק סטנדרטי מארגז הכלים של הביולוג המולקולרי. הוא משמש בדרך כלל לניטור ביטוי חלבונים בהקשרים שונים או כנקודת קצה לניסויים כגון מבחני משקעים חיסוניים. למרות היתרונות הללו, ניתוח רמות חלבון במצב יציב עם אימונובלוטינג מוכיח את עצמו כמאתגר, מכיוון שהבדיקה חייבת להיות אופטימלית עבור כל שלב והקשר ניסוי (איור 1).

הקשר מאתגר אחד הוא ניתוח חומר מצפרדע הטפרים האפריקאית Xenopus laevis. X. laevis הוא אורגניזם חשוב לחקר אינטראקציות רנ"א-חלבון. למערכת זו יתרונות רבים, ובראשם העובדה ש-X. laevis מייצר מאות ביציות ובהמשך מתפתח באופן סינכרוני עוברים בכל פעם. לכל ביצית יש ~25 מיקרוגרם של חלבון^שאינו חלמון 1, המספק חומר בשפע לניסויים ביוכימיים. הגודל הגדול (~1250 מיקרומטר)¹ של ביציות ועוברים מקל גם על מיקרו-הזרקת mRNA לבטא באופן אקסוגני חלבונים מתויגים או מוטנטיים בקנה מידה². תכונות אלו מאפשרות ניסויים רבי עוצמה לבחון בקרה תרגומית ב-X. laevis, כגון בדיקת הפונקציה הקשירה, שבה ניתן להעריך את ההשפעה של חלבון רגולטורי תרגומי על mRNA ללא קשר ליכולתו של אותו חלבון לקשור RNA 3,4,5,6. עם זאת, אימונובלוטינג בביציות ובעוברים של קסנופוס מלווה בקשיים, כולל הפרעות ממסות גדולות של טסיות חלמון^בתאים מוקדמים אלה, אשר יטשטשו את התוצאות אם לא יוסרו.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי לאימונובלטינג יעיל ב-X. laevis, עם דגש על זיהוי חלבונים רגולטוריים תרגומיים. אנו מספקים הוראות כיצד לאסוף ולעבד ביציות ועוברים כדי לדמות את הכתם החיסוני הסופי. כלולות גם הוראות מפורטות להעמסה והדמיה אופטימלית של חלבון, כמו גם מניעת זיהום חלמון של הדגימה. בנוסף, אנו דנים בשינויים אפשריים בפרוטוקול ובאסטרטגיות למציאת נוגדנים התואמים לחלבוני קסנופוס . בכוונתנו לספק לחוקרים הדרכה לבצע ללא מאמץ אימונובלוטינג כחלק מהניסויים שלהם באורגניזם מודל זה שאינו מנוצל כראוי.

איור 1: זרימת עבודה עבור הכנת דגימת Xenopus וניתוח אימונובלוט לאחר מכן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כל העבודה עם בעלי חיים (X. laevis) המיוצגת בפרוטוקול זה היא בהתאם ואושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UW-Madison. פרטים על הציוד, הריאגנטים שבהם נעשה שימוש וריכוזי הנוגדנים המשמשים מפורטים בטבלת החומרים. ניתן לראות מבחר ציוד באיור 2, להלן.

איור 2: תמצית עובר מעובד וציוד לאימונובלטינג. (A) תמצית ביציות צנטריפוגה X . laevis שלב VI. שומנים וחלבונים מסיסים בשומן עולים למעלה בעוד וויטלוגנין (חלמון) ופסולת פיגמנטית יוצרים גלולה. (B) ציוד ל-SDS-PAGE להפרדת חלבונים לפי משקל מולקולרי. (i) ספק כוח, (ii) מיכל אלקטרופורזה אנכי, (iii) מכסה מיכל אלקטרופורזה, (iv) מכלול אלקטרודות, (v) סכר חיץ, (vi) ג'ל אלקטרופורזה טרומית; שימו לב למסרק הירוק (למעלה) ולמדבקה הכחולה (למטה), שיש להסיר כל אחד מהם. (ג) ציוד להעברת ממברנה. מיכל האלקטרופורזה והמכסה האנכיים נמצאים בשימוש חוזר להעברה לאחר שטיפה יסודית. (i) רולר להסרת בועות, (ii) קליפ העברה, (iii) מוט ערבוב קטן, (iv) קרום ניטרוצלולוזה בין שני גיליונות נייר כחולים מגן, (v) נייר סינון כרומטוגרפיה תאית, (vi) כריות ספוג העברה, (vii) תבנית אפייה מזכוכית להרכבת העברה, (viii) חבילת קרח, (ix) ליבת העברה. (ד) ציוד אחר. (i) משחרר ג'ל (לחיתוך בארות ג'ל לפני העברה), (ii) ידית פתיחת קלטת ג'ל, (iii) מלקחיים (לטיפול בקרום), (iv) מיכל (להחזקת קרום), (v) מכסה מיכל. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

1. אוסף ביציות ועוברים של קסנופוס

1. הכנת ביציות
   1. השג ביציות X. laevis מפוזרות מספק מסחרי (Ecocyte Bio Science, אוסטין, טקסס) או בודד ודפוליקולציה כמתואר⁸.
   2. תרבית ביציות מבודדות בתמיסת בארת' שונה (MBS; 88 מ"מ NaCl, 1 מ"מ KCl, 0.4 מ"מ CaCl₂, 0.33 מ"מ Ca(NO₃)₂, 0.8 מ"מ MgSO₄, 5 מ"מ Tris-HCl, 2.4 מ"מ NaHCO₃, pH 7.4) עד לשימוש.
2. הכנת עוברים
   1. לבודד ביצי X. laevis ולהפרות אותן כמתואר ^9,10.
   2. עוברים מופרים בתרבית בתמיסת רינגר שונה של 0.25x מארק¹¹ (MMR) (1x MMR: 0.1 M NaCl, 2.0 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES).
   3. הכן תמיסה של 2% ציסטאין ב-0.1x MMR עם pH מותאם ל-8.2 באמצעות NaOH.
   4. הסר 0.25x MMR מהצלחת המשמשת להפריה וכסה את העוברים בתמיסת ציסטאין כדי להסיר את שכבת הג'לי¹². מערבבים את התמיסה בעדינות כך שהעוברים ייחשפו באופן שווה.
   5. עקוב אחר עוברים מקרוב עם סטריאומיקרוסקופ מהגדלה פי 2 עד פי 25. לאחר ששכבת הג'לי התמוססה (בדרך כלל 3-5 דקות), העוברים יתארזו זה בזה. יש להימנע מחשיפה ממושכת לציסטאין.
   6. הסר את תמיסת הציסטאין ושטוף את העוברים מספר פעמים עם 0.25x MMR.
   7. תרבית ב-0.25x MMR עד לשלב הגידול הרצוי.
3. אסוף את המספר הרצוי של עוברים או ביציות (מומלץ לפחות חמישה לכל דגימה) בצינור של 1.5 מ"ל.
4. הסר עודפי מדיה בעזרת פיפטטור, הימנע מפגיעה בתאים.
5. השתמש בדוגמאות מיד או אחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. ניתן לאחסן ביציות ועוברים במשך מספר שנים.

2. הכנת תמצית קסנופוס

1. להפשיר דגימות על קרח אם הן קפואות.
2. הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר ליזה של תאים 10x צונן מדולל ל-1x עם מים נטולי יונים כפולים (ראה טבלת חומרים) לכל עובר/ביצית והומוגניזציה של דגימות עם מיקרו-עלי על קרח.
3. סובב דגימות ב-5000 גרם ב-4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה ספסל למשך 10 דקות לפסולת גלולה, כולל חלמון ופיגמנטים בלתי מסיסים.
4. הוציאו את הסופרנטנט לצינור נפרד של 1.5 מ"ל, והקפידו להימנע מהכדור (איור 2A).
5. הוסף נפח שווה של 2x מאגר דגימת Laemmli בתוספת 5% w/v 2-mercaptoethanol לסופרנטנט והרתיח במשך 10 דקות ב-95-100 מעלות צלזיוס כדי לנטרל חלבוני דגימה.
6. השתמש בדגימות מיד או אחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך חודשים עד שנים.

3. דף SDS

1. הכן מאגר ריצה SDS: 1x מאגר Tris-MOPS-SDS (6.06 גרם בסיס Tris, 10.46 גרם 3- (N-morpholino) חומצה פרופנסולפונית [MOPS], 1.0 גרם SDS, 0.3 גרם חומצה אתילנדיאמינטטראצטית [EDTA], מים נטולי יונים כפולים עד 1000 מ"ל).
2. הסר מהאריזה ג'ל טרומי 4-12% ביס-טריס SDS. הסר את המדבקה בתחתית הג'ל.
3. הכנס את הג'ל למכלול האלקטרודות מול סכר חיץ. הנח את מכלול האלקטרודה לתוך מיכל האלקטרופורזה האנכי (איור 2B).
4. מלאו את מכלול האלקטרודה ואת החלק התחתון של מיכל האלקטרופורזה במאגר ריצה 1x Tris-MOPS-SDS.
5. הסר בעדינות את מסרק הג'ל ממאגר הג'ל והפיפטה הזורם לתוך הבארות כדי להסיר בועות ולאזן את המאגר.
6. טען בזהירות 5 מיקרוליטר של תקני חלבון צבועים מראש לבאר הראשונה ו-10 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות הנוספות.
7. (אופציונלי) טען את הבארות הנותרות עם 10 מיקרוליטר של מאגר דגימת Laemmli 1x כדי לגרום לג'ל לפעול בצורה אחידה יותר.
8. הנח את המכסה על מיכל האלקטרופורזה וחבר אותו לאספקת חשמל. החל 200 וולט.
9. עצור אלקטרופורזה כאשר חזית צבע המאגר של הדגימה יוצאת מהג'ל.

4. העברה רטובה של חלבונים על קרום

1. בזמן שהדגימות עוברות אלקטרופוריזציה, הכינו 1 ליטר של מאגר העברה (3.0 גרם בסיס טריס, 4.08 גרם ביצין, 900 מ"ל מים נטולי יונים כפולים, 100 מ"ל מתנול). מצננים מראש את מאגר ההעברה ב-4 מעלות צלזיוס.
   זהירות: יש לטפל במלאי מתנול מרוכז במכסה אדים ולהימנע ממגע עם העור. ניתן להחליף מתנול באתנול.
2. לפני השלמת האלקטרופורזה, התחילו להרכיב את "כריך" ההעברה בקליפ ההעברה (איור 2C).
   1. ממלאים תבנית אפייה מזכוכית במאגר העברה צונן. בשלבי הרכבת הכריכים הבאים, ודא שהחומרים שקועים במאגר זה.
   2. מניחים את קליפ ההעברה בצלחת כשהחצי השחור מונח על תחתית המנה, החצי הלבן פתוח ומכוון כלפי מעלה, וקליפ ההעברה פתוח שמאלה.
   3. הנח ספוג סיבים אחד או שניים שטוחים על החצי השחור של קליפ ההעברה.
   4. חותכים שני ניירות כרומטוגרפיה תאית 0.35 מ"מ (ניירות פילטר) לגודל ומניחים אחד על גבי הספוגים.
3. לאחר השלמת האלקטרופורזה, הסר את הג'ל ממיכל האלקטרופורזה.
4. חטפו בזהירות את צלחות הג'ל בעזרת ידית פתיחת קלטת הג'ל, וודאו שהג'ל נשאר מחובר לאחת הלוחות (איור 2D). חתוך את הבארות מהחלק העליון של הג'ל בעזרת משחרר הג'ל.
5. הניחו את הג'ל, שעדיין מחובר למחצית קלטת הפלסטיק, על נייר הסינון. הסר את חצי הקסטה כך שהג'ל יישאר על נייר המסנן.
6. חותכים ריבוע של קרום ניטרוצלולוזה של 0.45 מיקרומטר כך שיתאים למידות הג'ל. הסר את הממברנה מנייר המגן, הרטיב אותה לזמן קצר במאגר ההעברה והניח אותה על הג'ל.
   הערה: טפל בממברנה בזהירות בפינות עם כפפות או מלקחיים כדי למנוע זיהום חלבון לא רצוי של הממברנה.
7. הניחו נייר סינון שני על גבי קרום הניטרוצלולוזה. הסר בעדינות אך בחוזקה את כל הבועות באמצעות רולר על גבי נייר המסנן.
8. ערמו עוד ספוג סיבים אחד עד שניים על גבי נייר הסינון.
9. סגור את קלטת ההעברה וסגור אותה היטב, והשלים את ה'כריך'.
10. הכנס את כריך ההעברה לליבת ההעברה כאשר תפס ההעברה פונה כלפי מעלה והצד השחור של קליפ ההעברה פונה לצד השחור של הליבה.
11. הנח את ליבת ההעברה למיכל האלקטרופורזה. הוסף למיכל שקית קרח ומוט ערבוב כך שמוט הערבוב יוכל להסתובב בחופשיות.
    הערה: בנוסף או במקומה של שקית קרח, ניתן להפעיל את ההעברה בחדר קר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בשלב 4.13.
12. מלאו את המיכל במאגר העברה צונן. אבטח את המכסה היטב מלמעלה.
13. חבר את מכשיר ההעברה לאספקת החשמל, הקפד ליישר את צבעי האלקטרודות. הפעל את ההעברה למשך שעה, 100 וולט, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, כשמוט הערבוב מסתובב.

5. עיבוד ממברנה לאחר העברה

1. הכן 10x Tri-Buffered מלח (100 מ"מ בסיס Tris; 1.5 מ' NaCl). התאימו את ה-pH ל-8 וסננו לעקר.
2. הכן 1x תמיסת מלח Tris-Buffered עם Tween-20 (TBSTw) על ידי דילול תמיסת 10x TBS 1:10 ב-500 מ"ל מים נטולי יונים כפולים והוספת 500 מיקרוליטר Tween-20.
3. הכן מאגר חוסם (500 מ"ל TBSTw, 25 גרם אבקת חלב ללא שומן).
   הערה: ניתן להחליף חלב דל שומן באלבומין סרום בקר (BSA) של 2-5% במאגר החסימה. יש להשתמש ב-BSA אם היישום הניסיוני כולל הדמיה של חלבונים ביוטיניים, שכן חלב מכיל ביוטין.
4. לאחר השלמת ההעברה, הסר ופרק בזהירות את הכריך והסר את קרום הניטרוצלולוזה. סמן איזה צד של הממברנה בא במגע עם הג'ל, ושמור על צד זה עם הפנים כלפי מעלה בשלבים הבאים.
5. הכינו 50 מ"ל של כתם פונסו (0.5% Ponceau S, 1% חומצה אצטית), כתם הפיך להדמיית חלבון.
   זהירות: כתם פונסו הוא מאכל. יש להימנע ממגע עם העור.
6. הנח את הממברנה במיכל קטן (כפי שמוצג באיור 2D) כך שהיא תשכב צמודה לתחתית המיכל. מכסים את הממברנה בכתם פונסו לטבילה ומתנדנדים בעדינות על נדנדה למשך 5-10 דקות.
7. יוצקים את כתם הפונסו.
   הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בכתם פונסו מספר פעמים.
8. שוטפים את הממברנה בשטיפות חוזרות ונשנות של מים דו-יונים עד להסרת עודפי פונסו ורצועות החלבון בנתיבים מתחילות להיפתר.
9. אשר את יעילות ההעברה על ידי נוכחות נתיבים ישרים ואחידים עם רצועות שנפתרו בבירור.
10. שפכו את כל הנוזל שנותר וטבלו את הכתם במאגר חוסם כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים לממברנה בשלבים במורד הזרם.
11. מתנדנדים בעדינות על נדנדה למשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר.

6. דגירה של נוגדנים

1. יש לדלל את הנוגדן העיקרי ב-10 מ"ל של מאגר חוסם טרי לריכוז הרצוי.
   הערה: הריכוז האופטימלי יצטרך להיקבע באופן אמפירי עבור כל נוגדן חדש. נקודת התחלה טיפוסית היא 1:1000, אחרת פעל לפי המלצות היצרן.
2. הסר את המאגר החוסם והחלף אותו בתערובת הנוגדנים. לדגור, להתנדנד בעדינות, למשך הלילה (~16 שעות) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
3. יוצקים את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושוטפים את הממברנה עם TBSTw על ידי טבילתה בתמיסה ושפכתה במהירות.
   הערה: ניתן לשמור את רוב תערובות הנוגדנים ולעשות בהן שימוש חוזר פעמיים עד שלוש. יש לקבוע זאת באופן אמפירי עבור כל נוגדן.
4. שוטפים את הממברנה על ידי טבילתה ב-TBSTw ונדנוד עדין בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בצע שלוש כביסות בסך הכל של 5 דקות.
5. לדלל את הנוגדן המשני ב-30 מ"ל TBSTw לריכוז הרצוי.
   הערה: הריכוז יצטרך להיקבע באופן אמפירי עבור כל נוגדן. אנחנו משתמשים בדרך כלל ב-1:30,000.
6. יוצקים את תמיסת הכביסה TBSTw ומחליפים אותה בתערובת הנוגדנים המשנית. דגירה, נדנדה עדינה, למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
7. שטפו במהירות את הממברנה פעם אחת עם TBSTw ואחריה שלוש שטיפות TBSTw של 5 דקות.

7. הדמיית הממברנה על מפתח סרטים

1. בחדר חושך, הפעל את מפתח הסרטים ואפשר לו להתחמם.
2. חותכים שני ריבועי ניילון נצמד גדולים מספיק כדי להקיף את הממברנה. בעזרת מלקחיים, הניחו את קרום הניטרוצלולוזה 'עם הפנים כלפי מעלה' על הריבוע הראשון של הניילון.
3. בשפופרת של 1.5 מ"ל, מערבבים כמויות שוות של ריאגנטים כימילומינסנציה משופרת (ECL) Luminol ו-Enhancer. שימוש ב -1 מ"ל של התמיסה המעורבת אמור לכסות את רוב הממברנות.
4. יש להניח את מגיב ה-ECL על הממברנה ולתפעל את הממברנה בעדינות באמצעות הניילון כדי להבטיח כיסוי מלא. דגירה למשך דקה.
5. הסר עודף מגיב ECL על ידי אחיזת הממברנה במלקחיים וניעור עדין של נוזל או נידוף נוזל על ידי נגיעה בפינת הממברנה במגבת נייר.
6. הניחו את הממברנה עם הפנים כלפי מעלה על הריבוע השני של הניילון ומקפלים את הניילון מעל הממברנה עד שהיא אטומה באופן רופף. הדביקו היטב את הממברנה העטופה לקלטת אוטורדיוגרפיה.
7. בחדר החושך, הניחו סרט בתוך הקסטה, המכסה את הממברנה המודבקת. סגור את הקסטה היטב וחשוף את הסרט לקרום למשך דקה אחת.
8. הסר בזהירות את הסרט, היזהר לא לגרור את הסרט החשוף לאורך הממברנה. הזינו אותו למפתח הסרטים.
9. לאחר הערכת הסרט שפותח, התאם את זמן החשיפה עם הסרטים הבאים עד להשגת הדמיית החלבון הרצויה. אם הדמיית החלבון מספקת אות חלש, חזור על שלב הדגירה של מגיב ECL עם מגיב ECL רגיש יותר והדמיה מחדש.
10. יישר את הסרט שפותח עם סמני הזוהר בחושך והשתמש בהתייחסות זו כדי לסמן את המיקום של תקני החלבון המוכתמים מראש על הממברנה על הסרט.
11. לאחר השלמת ההדמיה, הסר בזהירות את הממברנה מהניילון וטבול אותה ב-TBSTw כדי לשטוף את מגיב ה-ECL שנותר.

8. (אופציונלי) דגירות נוגדנים נוספות

הערה: הפשטת כתם חיסוני מתייחסת להסרת הנוגדנים הראשוניים והמשניים הראשוניים עם תמיסת דנטורינג (מאגר הפשטה) כך שניתן יהיה לחקור מחדש את הכתם עם נוגדן אחר. בדיקה חוזרת מאפשרת לנתח את אותו כתם חיסוני לביטוי של מטרות חלבון שונות ולהשוות חלבונים לא ידועים לחלבונים מאופיינים היטב המתפקדים כסטנדרטים. בדוק תחילה עם הנוגדן שמייצר את האות החלש ביותר יחסית. פעולה זו מונעת חפצים הנגרמים על ידי נוגדנים שהופשטו באופן לא מלא בחשיפות הבאות וממזערת את ההשפעה של אובדן חלבון מהפשטה חוזרת של כתם.

1. הפשיטו את הנוגדנים הקשורים על ידי טבילת הממברנה במאגר הפשטה ונדנוד עדין למשך 5-10 דקות.
2. הסר את הממברנה ממאגר ההפשטה ושטוף קצרות ב-TBSTw כדי להסיר שאריות של תמיסת הפשטה.
3. טבלו את הממברנה במאגר חוסם ונענעו בעדינות למשך 30 דקות.
4. הכינו תמיסה חדשה של נוגדן ראשוני בחסימת מאגר בריכוז הרצוי.
5. הוסיפו את דילול הנוגדנים הראשוני החדש לממברנה ודגרו על נדנוד עדין למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. המשך משלב 6.3 ואילך. ניתן להפשיט את הממברנה ולחקור אותה מחדש עד שלוש פעמים נוספות.

כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול החיסון שלנו, ניתחנו חלבוני בקרה תרגומיים מתויגים ואנדוגניים בשלושה סוגים של דגימות X. laevis: ביציות שלב VI, עוברים שלב 7 (בלסטולה) ועוברים שלב 10.5 (גסטרולה). שלבים אלה נבחרו מכיוון שהם משתרעים על פני מעבר אמצע הבלסטולה (שלב 8.5), המסמן את תחילתו של שעתוק זיגוטי חזק13,14. מכיוון שהתפתחות לפני המעבר לאמצע הבלסטולה מתרחשת בהיעדר שעתוק, עוברים פרה-זיגוטיים (כלומר, נשלטים על ידי האם) מסתמכים במידה רבה על מנגנוני בקרה תרגומיים כדי לבטא חלבוני גורל תאים ברזולוציה הזמנית והמרחבית הנכונה15. לכן, המעבר באמצע הבלסטולה הוא הקשר חיוני לחקר אינטראקציות RNA-חלבון.

כדי לנתח את ביטוי החלבון באמצעות אימונובלוטינג, הוזרקו ביציות ועוברים של X. laevis עם 500 pg של mRNA המקודד את המחצית הטרמינלית C של X. laevis Bicaudal-C (Bicc1) שהתמזגה ל-3x תגי זיקה של המגלוטינין (HA). בחרנו לנתח את Bicc1 בשל הרלוונטיות שלו לביולוגיה של Xenopus ולאינטראקציות חלבון-RNA. Bicc1 הוא חלבון קושר mRNA ומדכא תרגומי המנחה את החלטות גורל התא בעובר המוקדם 16,17,18. מאוחר יותר בהתפתחות, הוא משפיע על דפוס שמאל-ימין 19,20,21 ועל תפקוד האיברים, כולל הכליות 22,23,24,25. Bicc1 מכיל אזור המכוון דיכוי תרגומי5 ותחומי הומולוגיה של hnRNP K (KH) המתווכים קשירה ל-mRNAs ספציפיים 5,26,27,28.

תמציות הוכנו מחמש ביציות או עוברים שהוזרקו על ידי HA-Bicc1, יחד עם דגימות תואמות שלא הוזרקו כבקרות שליליות. עשירית מכל תמצית עברה אלקטרופורזה על ג'ל ביס-טריס בשיפוע של 4-12% והועברה רטובה על קרום ניטרוצלולוזה. צביעת פונסו של הממברנה כדי לזהות את החלבון הכולל אישרה העברה מוצלחת (איור 3A). כחלק מהמחקרים שלנו, יצרנו נוגדן בארנבים שמזהה את המחצית הטרמינלית C של חלבון Bicc1 האנושי. הנוגדן הזה שימש לאיתור חלבון Xl-Bicc1 אנדוגני ואקסוגני (איור 3B). עבודות קודמות הראו כי חלבון Bicc1 נעדר מביציות X. laevis , אך מתבטא בעוברים טרום-MBT, לפני שהגנום הזיגוטי פעיל16. זה מצביע על כך שבעוד ש-Bicc1 mRNA מצטבר במהלך הביציות, הוא מדוכא בתרגום. בהסכמה עם עבודה קודמת זו, Bicc1 אנדוגני לא זוהה בביציות. לעומת זאת, הנוגדן זיהה Bicc1 אנדוגני (~MW 107 kDa) בעוברים בשלב 7 ו-10.5. יחד, התוצאות האלה מאמתות שהנוגדן מזהה את החלבון האנדוגני Bicc1 (איור 3B, פאנל עליון, ראש חץ אדום). נוגדן Bicc1 זיהה חלבון קטן יותר של כ-70 kDa בתמציות שהוכנו מדגימות שהוזרקו על ידי mRNA (איור 3B, פאנל עליון, ראש חץ שחור, השווה נתיבים 2, 4 ו-6 עם נתיבים 1, 3 ו-5). כבקרה על הספציפיות של נוגדן Bicc1, הממברנה הופשטה ונבדקה מחדש עם נוגדן כנגד תג הזיקה של HA. נוגדן ה-HA זיהה את החלבון 70 kDa בדגימות שהוזרקו, אך לא זיהה את ה-Bicc1 האנדוגני (איור 3B, פאנל שני, ראש חץ שחור). זיהוי ה-HA-Bicc1 C-term משתנה בעוצמתו בין השלבים עקב הבדלים בביטוי החלבון מה-mRNA המוזרק בסוגי התאים השונים.

לאחר מכן, הרחבנו את התוצאות על ידי בדיקת הביטוי של חלבונים רגולטוריים תרגומיים אנדוגניים המקיימים אינטראקציה עם Bicc1. ראשית, ניתחנו את הביטוי של Ccr4-Not Transcription Complex Subunit 1 (Cnot1), חלבון פיגום גדול וחלק מקומפלקס Ccr4-Not deadenylase (CNOT). קומפלקס CNOT מרובה תת-יחידות הוא אחד הדדנילאזים האיקריוטיים העיקריים וידוע בעיקר בגיזום זנב הפולי (A) בקצה ה-mRNA השליח כהקדמה לפירוקם. עם זאת, לקומפלקס זה יש תפקידים מגוונים בבקרת תרגום המשתרעים מעבר לדדנילציה29. היינו מעוניינים לבחון את ביטוי Cnot1 בשל חשיבותו של קומפלקס CNOT לוויסות mRNA ותצפיות קודמות ש-Cnot1 מקיים אינטראקציה עם Bicc120,30. כדי לנתח את ביטוי Cnot1, השתמשנו בנוגדנים המזהה את החלבון האנדוגני Cnot1. הוא זיהה שני חלבונים ב-250 kDa ו-270 kDa בכל דגימה, הגודל החזוי של Cnot1 (איור 3B, פאנל שלישי). לפיכך, פרוטוקול זה מאפשר לנו לזהות בקלות מרכיב קריטי של קומפלקס רגולטורי. בנוסף, נתונים אלה תומכים ביכולתו של הפרוטוקול לזהות בהצלחה חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה.

כדי לבחון עוד יותר את יכולת ההכללה של תוצאות אלה, ניתחנו לאחר מכן דגימות לנוכחות של הליקאז בולט DEAD-box המעורב בדיכוי תרגומי, הליקאז 6 (Ddx6, שנודע בעבר כ-xp54 ב-Xenopus ו-me31b בדרוזופילה). Ddx6 הוא מרכיב חשוב בגרגירי ריבונוקלאופרוטאין, מעורב באחסון mRNA ומקיים אינטראקציה עם Bicc1 ו-Cnot1 6,31,32. נוגדן שזיהה את ה-Ddx6 האנדוגני זיהה חלבון של כ-54 kDa בכל דגימה (איור 3B, פאנל רביעי). הביטוי הופחת בעוברים זיגוטיים (איור 3B, השווה נתיבים 5 ו-6 ל-1-4), כפי שדווח קודם לכן33.

לבסוף, כדי להבטיח שההבדלים שראינו בין הדגימות נובעים מהבדלים בביטוי, הפשטנו וחקרנו מחדש את הכתם החיסוני עם נוגדן המזהה את האנזים גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (Gapdh). Gapdh משמש כ"בקרת העמסה" המתבטאת בכל מקום. רמות שוות ערך של ביטוי Gapdh מאשרות את צביעת פונסו: כמות שווה של חלבון כולל מנותחת על פני דגימות (איור 3B, פאנל חמישי).

יחד, תוצאות אלו מאשרות את יעילותה של שיטת אימונו-בלוט זו. הצלחנו לזהות Bicc1 אקסוגני ואנדוגני על פני שלבי התפתחות מרובים של X. laevis הרלוונטיים לחקר אינטראקציות RNA-חלבון: ביציות ועוברים טרום-MBT, המכילים רק mRNA שהושקעו על ידי האם, ועוברים לאחר MBT, הכוללים גם mRNA משועתקים זיגוטית. הצלחנו להכליל את התוצאות הללו על ידי ניתוח הביטוי של חלבוני בקרה תרגומיים מרובים במגוון משקלים מולקולריים (Bicc1, Cnot1 ו-Ddx6) ובקרת העמסה (Gapdh). אנו גם מראים שפרוטוקול זה יכול לשמש עבור עוברי X. tropicalis עם שינוי כדי להגדיל את כמות החומר המשמשת כדי להסביר את גודלם הקטן יותר (איור משלים 1).

איור 3: זיהוי רמות של חלבונים רגולטוריים תרגומיים באמצעות אימונובלוטינג ב- X. laevis. (A) צביעת Ponceau של הכתם החיסוני לזיהוי חלבון כולל מביציות X. laevis שלב VI, עוברים בשלב 7 ועוברים בשלב 10.5. כל נתיב מייצג 10% מהחלבון המוכן מתמצית (0.5 ביצית או עובר). (B) ניתוח אימונובלוט של חלבונים רגולטוריים תרגומיים נבחרים של X. laevis בביציות שלב VI, עוברים בשלב 7 ועוברים בשלב 10.5. נתיבים 2, 4 ו-6 תואמים לדגימות שהוזרקו עם מיקרו-RNA HA-Bicc1 לפני הניתוח, בעוד שנתיבים 1, 3 ו-5 משמשים כבקרות שליליות (לא מוזרקות). נוגדן α-Bicc1 שימש לבדיקת ביטוי של Bicc1 אנדוגני על פני שלבים (פאנל עליון). לאחר מכן הכתם הופשט ונבדק מחדש עם נוגדן לתג הזיקה HA כבקרה על ספציפיות נוגדנים α-Bicc1 (פאנל שני). כתמים הופשטו ונבדקו מחדש עבור חלבונים רגולטוריים נוספים באמצעות α-Cnot1 (פאנל שלישי) ו-α-Ddx6 (פאנל רביעי). α-Gapdh (הפאנל התחתון) שימש כבקרה להעמסת חלבון שווה. ראשי חץ אדומים מסמנים את המיקום של Bicc1 אנדוגני, בעוד ראשי חץ שחורים מסמנים את המיקום של HA-Bicc1 C-term המתבטא באופן אקסוגני. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: ניתוח אימונובלוט של חלבון Bicc1 ב-Xenopus laevis לעומת Xenopus tropicalis. נוגדן α-Bicc1 שימש לבדיקת ביטוי של Bicc1 אנדוגני ואקסוגני על פני כמויות שונות של תמצית עובר X. laevis ו-X. tropicalis . נתיב 1: 0.5 עובר X . laevis לא מוזרק. נתיב 2: 0.5 HA-Bicc1 הוזרק לעובר X. laevis . נתיב 3: 3 עוברי X. tropicalis לא מוזרקים. נתיב 4: 1 עובר X. tropicalis לא מוזרק. נתיב 5: 0.5 עובר X. tropicalis לא מוזרק. נעשה שימוש בשני נוגדנים המזהים את Bicc1 האנדוגני: האחד מורם כנגד Bicc1 אנושי (פאנל עליון) והשני מורם כנגד X. laevis Bicc1 (פאנל אמצעי). α-Gapdh (פאנל תחתון) שימש לבקרה על עומס חלבון שווה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.