מאמר שיטה

שיטה חדשנית לבידוד אנדוזומים מרקמות לב של עכברים ותרבית משותפת עם קרדיומיוציטים

DOI:

10.3791/69146

⸱

10 באוקטובר 2025

 ,  ,  , 
1Pharmacological and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Houston

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנדוזומים הם אוסף של אברוני מיון תוך-תאיים, חלק ממסלול הובלת הממברנה האנדוציטית. הקמנו שיטה חדשה לבידוד אנדוזומים מרקמת הלב באמצעות ציוד ננו-סינון אוטומטי וחקרנו את הספיגה התאית של אנדוזומים על ידי תרבית משותפת שלהם עם קרדיומיוציטים ראשוניים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנדוזומים הם אברונים הקשורים לממברנה הממלאים תפקידים חיוניים בסחר תוך תאי, העברת אותות ומיחזור ממברנה. למרות שתפקידיהם בביולוגיה של הלב וכלי הדם זוכים להכרה, בידוד יעיל של אנדוזומים מרקמת הלב נותר אתגר טכני משמעותי. פיתחנו פרוטוקול מהיר ובעל תפוקה גבוהה לבידוד אנדוזומים מרקמת לב של עכבר על ידי שילוב של פיצול תת-תאי עם פלטפורמת בידוד ננו-סינון מהירה במיוחד. שיטה זו כוללת צנטריפוגה עוקבת, ננו-סינון ושליפה מבוססת ממברנה ננו-נקבובית של שלפוחיות. אנדוזומים מבודדים אופיינו על ידי כתמים מערביים, פיזור אור דינמי (DLS) וניתוח ציטומטריית ננו-זרימה (NanoFCM). כדי להעריך את הפעילות הביולוגית, אנדוזומים מטוהרים עברו תרבית משותפת עם קרדיומיוציטים ראשוניים של יילודים. הסמנים האנדוזומיים EEA1 ו-Rab7 הועשרו מאוד בשלפוחיות מבודדות. ניתוח DLS חשף קוטר שלפוחית ממוצע של 187.30 ±-23.42 ננומטר ופוטנציאל זטה של -26.60 ±-5.79 mV (n = 12). כימות NanoFCM הניב כ-1.07 ±-0.31 ×-1012 חלקיקים/מ"ל (n = 12) מ-100 מ"ג של רקמת לב. ספיגה תפקודית של אנדוזומים על ידי קרדיומיוציטים נצפתה בעקבות תרבית משותפת במבחנה , מה שמעיד על שימור שלמות השלפוחית ופעילותה. פלטפורמת בידוד משולבת זו מספקת שיטה הניתנת לשחזור ויעילה למיצוי אנדוזומים בטוהר גבוה מרקמות הלב. הפרוטוקול מקל על מחקרים ביוכימיים ותפקודיים במורד הזרם, ומציע כלי רב ערך לחקירת תפקידי האנדוזומים בפיזיולוגיה ומחלות לב וכלי דם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנדוזומים הם אברונים תוך-תאיים חיוניים המווסתים אנדוציטוזיס, מיון מטענים ומסלולי איתות 1,2. קולטני איתות מופעלים וחלבונים אחרים המווסתים ממוינים בתחילה לשלפוחיות תוך-לומנליות (ILVs) בתוך אנדוזומים מוקדמים (EEs), אשר לאחר מכן מבשילים לגופים רב-שלפוחיתיים (MVB) או שלפוחיות נשאות אנדוזומליות (ECVs). שלפוחיות אלו מתמזגות לאחר מכן עם אנדוזומים מאוחרים (LEs), המשמשים כמרכזי מיון משניים להפניית מטען לעבר פירוק ליזוזומלי או מסלולים חלופיים. ILVs עשויים להיות מופרשים גם כאקסוזומים לאחר איחוי אנדוזום עם קרום הפלזמה 3,4 . במקביל, מסלול האוטופגיה מספק חומר ציטוזולי ל-LEs באמצעות אוטופאגוזומים, שרוכשים יכולת פירוק עם היתוך עם תאים אנדוציטיים מאוחרים5. אנדוזומים מוכרים כיום כמווסתים קריטיים של מיחזור קולטנים6, לוקליזציה של תעלות יונים7, ביוגנזה אקסוזומית8 ותקשורת בין-תאית9 תהליכים הרלוונטיים במיוחד בתאים מיוחדים כגון נוירונים וקרדיומיוציטים.

עדויות מתפתחות הדגישו את התפקיד המרכזי של מסלולים אנדוזומיים בתפקוד הלב וכלי הדם. חלבון תחום הומולוגיה Eps15 3 (EHD3) מווסת את המיחזור האנדוזומי של מובילי יונים לבביים מרכזיים, כולל מחליף Na+/Ca2+ וערוצי Ca2+ מסוג L. מחסור ב-EHD3 בעכברים מוביל לברדיקרדיה, חריגות הולכה ושינוי בטיפול ב-Ca2+ 10. סחר תפקודי באנדוזום-ליזוזום בתאי שריר חלק בכלי הדם מונע הסתיידות מדיאלית הנגרמת על ידי פוספט, הרלוונטית למחלת כליות כרונית וטרשת עורקים11. עם זאת, התפקידים התפקודיים של אנדוזומים במחלות לב וכלי דם והפוטנציאל שלהם כמטרות טיפוליות נותרו לא מובנים לחלוטין, מה שמצדיק מחקר נוסף.

שיטות מרובות אפשרו בידוד ביוכימי של אנדוזומים שלמים מבחינה תפקודית. מארש ועמיתיו שילבו לראשונה צנטריפוגה בשיפוע צפיפות עם אלקטרופורזה בזרימה חופשית כדי לשחזר אנדוזומים מוקדמים ומאוחרים, תוך שמירה על החמצתם ושלמותם המבנית12. מתודולוגיות עדכניות, כגון גישת שיפוע סוכרוז, מציעות מסלול סטנדרטי להפרדת אוכלוסיות אנדוזומליות מוקדמות ומאוחרות, חיוני למחקרים פרוטאומיים וליפידומיים במורד הזרם13. ערכות מסחריות מבוססות עמודות ספין פותחו עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה.

בידוד אקסוזומים באמצעות מערכת הבידוד האולטרה-מהירה האוטומטית משתמש בטכנולוגיית ננו-סינון אולטרסאונד חדשנית, בעלת מערכת ננו-סינון כפולה המשולבת עם תנודות לחץ שלילי תקופתיות ותנודות הרמוניות כפולות כדי לאפשר בידוד של אקסוזומים בטוהר גבוה מביו-פלואידים14. כאן, שילבנו פיצול תת-תאי עם בידוד אנדוזום באמצעות מערכת הבידוד האולטרה-מהירה האוטומטית כדי להשיג שיטה חדשה לבידוד אנדוזום מהיר עם תפוקה גבוהה וטוהר גבוה מרקמת לב העכבר.

יתר על כן, תרבית משותפת של האנדוזומים שחולצו עם קרדיומיוציטים ראשוניים (CM) במבחנה ומצאנו שהאנדוזומים האקסוגניים נכנסו ל-CM בהצלחה. באמצעות מדווח אנדוזום, שבו החלבון המקומי באנדוזום Numb התמזג עם חלבון פלואורסצנטי אדום mCherry15,16, צפינו ב-mCherry fluorescence ממוקם בתוך CMs עם דפוס פונקטה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות על שימוש בחיות מעבדה ובאישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת יוסטון.

הערה: לפני תחילת הליך הבידוד, חיוני לוודא שכל המאגרים הנדרשים הוכנו טריים ומקוררים ל-4 מעלות צלזיוס. יש לסדר מכשירים מעוקרים, צלחות תרבית רקמות וצינורות מתאימים בתחנות עבודה ייעודיות, כאשר כל החומרים נשמרים על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, אלא אם צוין אחרת. יש לאזן מראש את הצנטריפוגות והרוטורים ל-4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שעות לפחות לפני השימוש. יש להכין את מאגר הפיצול לפני יום הניסוי ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולשמור על קרח במהלך הניסוי עד הצורך. אלא אם צוין אחרת, יש לבצע את כל שלבי הדגירה והצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

1. הכנת ליזאט לב

  1. חיטוי אזור הניתוח באמצעות אתנול 70%, ולאחר מכן הנחת כרית סופגת סטרילית על משטח העבודה, עליו מסודרים מכשירים כירורגיים מעוקרים.
  2. המתת חסד של עכברים (C57BL/6 זכרים, 8-12 שבועות, 20-25 גרם, ו-mCherry: זכרי NumbKI, 8-12 שבועות, 20-25 גרם) באמצעות שאיפת CO2 (10-30% CO2 למשך 3-5 דקות) או בשיטה חלופית שאושרה על ידי הוועדה המוסדית הרלוונטית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
    זהירות: אנא פעל בשטח פתוח וודא שצילינדר CO2 נסגר בזמן כדי למנוע דליפה. יש לעקוב אחר עכברים במהלך המתת חסד כדי לאשר אובדן הכרה והליך תקין. לאחר איבוד ההכרה, השתמש בשיטה משנית, כגון פריקת צוואר הרחם, כריתת בית החזה או אקסנגווינציה, כדי להבטיח מוות.
  3. מקם את העכבר במצב שכיבה ונקה את אזור בית החזה עם 70% אתנול.
    1. פתחו את חלל בית החזה במהירות כדי לקצור את הלב, והעבירו את הלב לתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) הקרה כקרח בצלחת 60 מ"מ המונחת על קרח.
    2. הסר את שאריות הדם בעדינות מחדרי הלב באמצעות פינצטה ושטוף את הלב היטב עד שלא יישאר יותר דם בתאים. שמור על הלב על הקרח לאורך כל העיבוד.
      הערה: שמור 50-100 מ"ג של רקמת לב לניתוח כתם מערבי (WB) כבקרה חיובית. ניתן להקפיא את הלב בחנקן נוזלי ולאחסן אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
  4. הוסף 8 מ"ל של מאגר פיצול (טבלה 1) לצינור של 50 מ"ל על קרח. העבירו 100-120 מ"ג של רקמת לב עכבר טרייה או קפואה לתוך צינור המכיל את מאגר הפיצול.
    הערה: ניתן להשתמש בכל חלק ברקמת הלב של העכבר לחילוץ אנדוזומים. נדרש מינימום של 100 מ"ג של רקמת לב כדי להניב מספיק אנדוזומים לניתוחים הבאים. כדי להבטיח עקביות בין קבוצות הניסוי, יש לשקול במדויק את הרקמה לפני ההוספה למאגר הפיצול.
    זהירות: ללבוש PPE מתאים בעת הפעלת מאגר הפיצול כדי למנוע כל מגע ישיר עם הגוף.
  5. טוחנים את הרקמה לכ -1 מ"מ3 חתיכות בעזרת מספריים מיקרו-כירורגיים במאגר פיצול על קרח כל הזמן.
  6. הומוגניזציה עם הומוגנייזר חשמלי במהירות בינונית, במחזור עצירה של 40 שניות עבודה של 30 שניות. הומוגניזציה במשך 5-7 מחזורים (איור 1A).
    הערה: תהליך הומוגניזציה יסודי הוא חיוני ויסייע להגדיל את הריכוז הסופי של האנדוזומים.
  7. סוניקציה של ליזאט הלב ההומוגני למשך 10 דקות באמבט מי קרח עם אמבט אולטרה-סאונד (איור 1A).

2. פיצול תת תאי

  1. הניחו מסננת תאים של 40 מיקרומטר מעל צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל וסננו את ליזט הלב ההומוגני דרך המסננת (איור 1A).
  2. עבור הגלולה הגרעינית: צנטריפוגה הלב ליזאט ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט והניחו אותו בשפופרת חדשה עם תווית.
    הערה: אסוף את הגלולה, שהיא החלק הגרעיני, והשהה מחדש את הגלולה הגרעינית במאגר ליזה של 200 מיקרוליטר WB אם השבר הגרעיני נחוץ עבור WB. פיפטה בעדינות את הגלולה הגרעינית עם מאגר רדיו אימונו-משקעים (RIPA) למעלה ולמטה 20 פעמים וסוניקט למשך 10 דקות. צנטריפוגה הליזאט הגרעיני ב-14,000 × גרם למשך 10 דקות. אוספים את הסופרנטנט ומאחסנים אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף. שלב 2.2 הוא אופציונלי; ניתן לדלג עליו אם נדרשות רק שלפוחיות.
  3. עבור החלק המיטוכונדריאלי: צנטריפוגה הסופרנטנט שוב ב-10,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הגלולה מכילה את החלק המיטוכונדריאלי. מעבירים את הסופרנטנט ומניחים אותו בצינור אולטרה-צנטריפוגה טרי.
    הערה: אם רצוי שבר מיטוכונדריאלי עבור WB, שמור את הגלולה כשלב 2.2 כמתואר בהערה הקודמת.
  4. אזנו בזהירות את הצינורות. שקלו כל צינור והוסיפו מאגר פיצול קר נוסף לצינור המצית כדי להבטיח משקל שווה. יש לקרר מראש את הרוטור והמתאמים האולטרה-צנטריפוגה למשך 2-3 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אולטרה-צנטריפוגה הסופרנטנט ב-160,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: במהלך שלב האולטרה-צנטריפוגה, חשוב לוודא שכל צינורות האולטרה-צנטריפוגה מאוזנים כראוי וממלאים במאגר עד כ-0.5-1 ס"מ מתחת לשפה. מילוי לא מספיק עלול לגרום לעיוות או קריסה של הצינור עקב הכוחות הצנטריפוגליים הגבוהים המופעלים.
  5. יש להוציא את החומר הנוזלי לתוך שפופרת חדשה. הסופרנטנט מכיל אנדוזומים. הגדר מזרק של 10 מ"ל המחובר למסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר על גבי צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל וסנן את הסופרנטנט לתוך הצינור. הוסף 5 מ"ל של מאגר PBS מעוקר כדי לדלל את התמיסה ולמנוע סתימת המסנן.
    הערה: שלב הסינון מבטיח שכל האנדוזומים בסופרנטנט הם <450 ננומטר בעת התחלת שלבי הבידוד.
  6. השעו מחדש את הגלולה עם 5 מ"ל של מאגר PBS מעוקר משלב 2.4 ופיפטה למעלה ולמטה לפחות 20 פעמים כדי לערבב היטב את הגלולה. הגלולה מכילה שלפוחיות תוך-תאיות אחרות. הגדר מזרק של 10 מ"ל המחובר למסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר על גבי צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל וסנן את תמיסת הגלולה לתוך הצינור. הוסף 5 מ"ל נוספים של מאגר PBS מעוקר כדי לדלל את התמיסה ולמנוע סתימת המסנן.
    הערה: שלב הסינון מבטיח שכל השלפוחיות מהגלולה יהיו <450 ננומטר בעת תחילת שלבי הבידוד.

3. תהליך בידוד של אנדוזומים ושלפוחיות תוך תאיות אחרות

  1. יש לדלל את הסופרנטנט המסונן משלב 2.5 ואת תמיסת הגלולה המסוננת משלב 2.6 עם מאגר PBS מעוקר לנפח סופי של 30 מ"ל בצינורות של 50 מ"ל, בהתאמה. אחסן את הדגימות ב-4 מעלות צלזיוס (איור 1A).
    הערה: ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. אם אין מספיק זמן לבצע את השלבים הבאים באותו יום, ניתן לאחסן אותם במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ואז לחכות ליום המחרת כדי להמשיך את הניסוי.
  2. הפעל את המכשיר והתחל את תוכנית הניקוי היומית, שאורכת בדרך כלל 20 דקות.
  3. בחר את התקן בידוד EXODUS בינוני (M EID) לבידוד. התקן מתאם צינור של 50 מ"ל והכנס את צינור ה-50 מ"ל עם הדגימה למצב הדגימה. הקש על EID על המסך וטען את M EID.
    הערה: ה-EID הבינוני מיועד לדגימה של 20-50 מ"ל, ממליץ על 30 מ"ל.
  4. הגדרת תוכנית:
    1. הזן את שם הדגימה ואת אמצעי האחסון לדוגמה.
    2. בחר סוג מדגם: פלזמה.
    3. בחר תוכנית: פלזמה. סטרונג-מא. א03.
    4. בחר צינור צנטריפוגה: 50 מ"ל.
    5. הפעל את מצב טוהר גבוה.
    6. בחר אפשרות תוכנית 3000.
    7. הקש על אישור כדי להתחיל.
      הערה: תהליך הבידוד כולו אורך 1-2 שעות. ריכוז גבוה יותר של דגימות ייקח זמן רב יותר.
  5. שחזור אנדוזומים ושלפוחיות תוך-תאיות אחרות:
    1. אחזר את ה-EID והבא אותו למכסה המנוע לשלבים הבאים.
    2. העבר 200 מיקרוליטר של מאגר PBS מעוקר לתוך ה-EID עם פיפטה של 200 מיקרוליטר. שוטפים את שני צידי הממברנה הננו-נקבובית 20 פעמים, בהתאמה.
    3. אסוף את האנדוזומים או שלפוחיות תוך-תאיות אחרות, השהה מחדש ב -200 מיקרוליטר בצינור של 1.5 מ"ל. אחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס אם משתמשים בו במשך 24-48 שעות, או בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
      הערה: האלואט מכיל את האנדוזומים או שלפוחיות תוך-תאיות אחרות ומשמש לניתוח נוסף ותרבית משותפת עם קרדיומיוציטים. דגימת האנדוזומים יציבה כאשר היא מאוחסנת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 5 חודשים, על סמך הנתונים שהתקבלו.
  6. סילוק אנדוזומים ושלפוחיות תוך-תאיות אחרות עבור WB:
    1. אחזר את ה-EID. העבר 80 מיקרוליטר של מאגר ליזה WB לתוך ה-EID. שוטפים את שני צידי הממברנה הננו-נקבובית 20 פעמים, בהתאמה.
    2. דגרו את ה-EID על קרח למשך 30 דקות כדי להבטיח מסיסות מלאה, מאגר פיפטה בתוך ה-EID כל 10 דקות. אסוף את האנדוזומים או שלפוחיות תוך-תאיות אחרות בצינורות של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 14,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס. אסוף ואחסן סופרנטנט בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. השלך את הגלולה אם נשאר כדור כלשהו בצינור.

4. כימות חלבון אנדוזום ואפיון שלפוחית

  1. ניתוח כתמים מערביים
    1. שמור 5 מיקרוליטר מכל דגימה כדי לכמת את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA).
    2. מדללים דגימות ב-4× מאגר דגימת Laemmli ומערבבים היטב על ידי מערבולת. מחממים את הדגימות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לנטרל חלבונים.
    3. צנטריפוגה את הדגימות המפורקות ב-14,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ואוספת את הסופרנטנט שנוצר לניתוח.
    4. הרכיבו ג'לים פוליאקרילאמיד במנגנון האלקטרופורזה ומלאו את החדר במאגר ריצה של נתרן דודציל סולפט (SDS).
    5. טען סמן משקל מולקולרי ואת דגימות החלבון המוכנות על הג'ל, ובחר אחוז אקרילאמיד מתאים על סמך המשקל המולקולרי של חלבוני המטרה.
      הערה: בדרך כלל, 20 מיקרוגרם חלבון נטען לבאר הן עבור ליזטים של רקמת הלב והן עבור ליזטים אנדוזומים.
    6. הפעל את הג'ל ב-6 וולט למשך כ-120 דקות או עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל.
    7. העברת חלבונים מהג'ל לקרום פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) באמצעות מערכת העברת כתמים מערבית.
      הערה: גם שיטת ההעברה הרטובה עובדת היטב.
    8. שטפו את קרום ה-PVDF לזמן קצר עם מי מלח עם Tris-buffered המכיל 0.05% Tween-20 (TBST).
    9. חסום את הממברנה עם TBST בתוספת אלבומין סרום בקר 1% (BSA) למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    10. דגרו את הממברנה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדן ראשוני (טבלת חומרים) ספציפי לסמן האנדוזומי שנבחר, באמצעות נדנוד עדין.
    11. למחרת יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST, כל שטיפה נמשכת 10 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה.
      הערה: כביסה נכונה חיונית להפחתת רקע לא ספציפי; ודא שהממברנה תישאר לחות מלאה לאורך כל התהליך.
    12. דגרו את הממברנה עם הנוגדן המשני המתאים (טבלת החומרים) למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    13. שוטפים את הממברנה שלוש פעמים עם TBST, כל שטיפה נמשכת 10 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר.
    14. מרחו מצע כימילומינסנט על הממברנה לזיהוי חלבונים הקשורים לנוגדנים.
    15. שימוש במערכת הדמיית ג'ל כדי לחשוף את הממברנה ולצלם תמונות של החלבונים.
  2. ניתוח פיזור אור דינמי (DLS)
    1. גודל החלקיקים ופוטנציאל הזטה של אנדוזומים נמדדים באמצעות טכניקת פיזור אור דינמי (DLS)17. באמצעות Litesizer 500 (Anton Paar) המצויד בתוכנת Kalliope גרסה 2.10.4. מדידות DLS מבוצעות בשלוש עותקים באמצעות לייזר 658 ננומטר עם זווית זיהוי של 90 מעלות ב-25 מעלות צלזיוס.
    2. בצע דילול של "ננו-ספירות סטנדרטיות בגודל" במים טהורים במיוחד, הוסף נפח של 1 מ"ל בקובטה החד פעמית והנח אותה בתא.
      הערה: השתמש בננו-ספירות סטנדרטיות (קטנות או גדולות) בהתאם לגודל הצפוי של הדגימה הלא ידועה.
    3. פתח את תוכנת DLS ולחץ על לשונית המדידה החדשה . בחר גודל חלקיקים ממצב המדידה. תן שם לקובץ בשדה ללא כותרת ושים את פרמטרי הקלט (ממס, טמפרטורה וכו'), ולחץ על התחל. לאחר קביעת גודל החלקיקים הסטנדרטיים, הוציאו את הקובט מהחדר.
    4. בצע דילול של "חומר ייחוס פוטנציאלי זטה" במים טהורים במיוחד, הנח אותו בקובט אומגה פוטנציאלי זטה והנח אותו בתא הקובטה. לחץ על לשונית המדידה החדשה בתוכנה. בחר פוטנציאל זטה ממצב המדידה. תן שם לקובץ בשדה ללא כותרת ושים את פרמטרי הקלט (ממס, טמפרטורה וכו'), ולחץ על התחל.
    5. לקביעת גודל החלקיקים ופוטנציאל הזטה של אנדוזומים, יש לדלל את דגימת האנדוזום במים טהורים במיוחד, להכניס אותה לקובטות המתאימות ולהניח אותן בתא הקובטה. בצע מדידות באותו אופן כמתואר עבור התקנים.
      הערה: בצע דילול של הדגימות הלא ידועות בהתאם לריכוז הדגימות במים טהורים במיוחד.
  3. ניתוח NanoFCM
    הערה: ריכוזי חלקיקי האנדוזום נקבעים באמצעות NanoFCM Flow NanoAnalyzer עם תוכנת Professional Suite V2.318. קליטת אותות חלקיקים מתבצעת למשך 2 דקות באמצעות לייזר כחול 488 ננומטר המוגדר ל- 20 mW עם דעיכת SS של 0.2% ו/או לייזר אדום של 638 ננומטר המוגדר ל- mW 8 עם דעיכת SS של 10%, בלחץ דגימה של kPa 1.0 מאופנן ומתוחזק על ידי מודול לחץ מבוסס אוויר. הדגימה ממוקדת ב-1.4 מיקרומטר באמצעות מים אולטרה-פורים כנוזל המעטפת באמצעות הזנת כוח הכבידה. יישור הלייזר האופטימלי נבדק ומכויל באמצעות חרוזי QC קוקטייל סיליקה ננוספרה (S16M-Exo). מדידות כיול הגודל מבוצעות לפני הניתוח באמצעות חרוזים סטנדרטיים בגודל S16M-Exo (קוקטייל ננו-חלקיקי סיליקה המכיל קוטר 68, 91, 113 ו-155 ננומטר של חלקיקים בריכוז ידוע 2.17 × 1010/מ"ל).
    1. רכישת תקן ריכוז:
      1. הפעל ואתחל את הנוזלים של nanoFCM. מדללים את חרוזי ה-QC (1:100) במים טהורים מסוננים בממברנה של 0.22 מיקרומטר, מוסיפים לצינור של 0.5 מ"ל ומניחים בתא הטעינה. בחר QC FL SiNPs מהתפריט הנפתח Sample Inf והזן את גורם הדילול של דגימת חרוזי QC.
      2. מהתפריט הנפתח זרימת דגימה , בחר הגברה כדי להציג את דגימת ה-QC במהירות גבוהה ולהסיר את תמיסת הניקוי מהמערכת למשך 45 שניות. במהלך הדחיפה, הגדר את עוצמת הלייזר ל-20/50 mV עבור הלייזר הכחול של 488 ננומטר ו-20/100 mW עבור הלייזר האדום של 638 ננומטר, עם דעיכת SS של 0.2%.
      3. בחר דגימה מהתפריט הנפתח זרימת דגימה ובצע התאמת סף עבור האות הגדול. במהלך הדגימה, כוונן את יישור עדשת עיבוי האות באופן ידני ואת יישור עדשת מיקוד הלייזר מהתוכנה, במידת הצורך. התאמת סף אוטומטית עבור אות גדול חייבת להישאר בין 50-120 עבור ערוץ הפיזור הצדדי ופחות מ-75 עבור שני ערוצי הקרינה.
      4. לחץ על זמן כדי להקליט כדי להשיג את הנתונים למשך 120 שניות. ודא שאזור העניין (ROI) הוא בין 1500-15000 בעת רכישת הנתונים. שמור את קובץ התוצאה בתיקיה הקופצת עם הסיומת "nfa" ופרק את צינור הדגימה.
        הערה: לאחר כל הפעלת דגימה, השתמש בתמיסת ניקוי (1x) כדי להסיר את הדגימה המעובדת מהצינור על ידי הגברתה למשך 45 שניות. לאחר מכן, טבלו את קצה הנימים במים אולטרפוריים כדי להסיר שאריות תמיסת ניקוי מהחלק החיצוני של הנימים לפני טעינת הדגימה הבאה.
    2. רכישת תקן גודל:
      1. מדללים את "החרוזים הסטנדרטיים בגודל" (1:100) במים מסוננים של 0.22 מיקרומטר ומניחים בתא הטעינה. בחר 68-155 S16M-Exo מהתפריט הנפתח Sample Inf והזן את גורם הדילול של דגימת החרוזים הסטנדרטית לגודל.
      2. מהתפריט הנפתח זרימת דגימה , בחר קידום כדי להציג את החרוזים הסטנדרטיים בגודל ולהסיר את תמיסת הניקוי מהמערכת למשך 45 שניות. תוך כדי חיזוק, הגדר את עוצמת הלייזר ל-8/50 mV עבור הלייזר הכחול 488 ננומטר ו-20/100 mW עבור הלייזר האדום 638 ננומטר, עם דעיכת SS של 10%.
      3. בחר דגימה מהתפריט הנפתח זרימת דגימה ובצע התאמת סף עבור אות קטן. ארבע פסגות נפרדות (68 ננומטר, 91 ננומטר, 113 ננומטר, 155 ננומטר) צריכות להיות גלויות בחלון. לחץ על זמן כדי להקליט כדי להשיג את הנתונים למשך 120 שניות. שמור את קובץ התוצאה בתיקיה הקופצת עם סיומת "nfa" ופרק את צינור הדגימה.
    3. רכישה סטנדרטית ריקה:
      1. השתמש במים טהורים במיוחד או (מאגר/מדלל של הדגימה) כדי לבצע את המדידה באותו תהליך כמתואר לעיל, שמור את file עם השם "ריק" בתיקייה עם סיומת "nfa", ופרוק את צינור הדגימה.
    4. קביעת ריכוז החלקיקים של אנדוזומים
      1. מדללים את דגימת האנדוזום במים טהורים במיוחד ומניחים אותה בתא הטעינה.
      2. לאחר קידום הדגימה ודגימתה, לחצו על 'זמן להקלטה ' כדי להתחיל במדידות. אם הסף אינו בטווח של 50-120 עבור ערוץ הפיזור הצדדי, או שההחזר על ההשקעה הוא יותר מ-15,000, שקול לדלל את הדגימה.
    5. ניתוח נתונים:
      1. עבור מהכרטיסייה רכישה לכרטיסייה ניתוח בתוכנה ופתח את קבצי ה-"nfa" השמורים. הגדר את תקן הריכוז על ידי פתיחת הקובץ השמור של תוצאות QC date__QC-FL SnNPs.nfa, הגדר את הסף על אות גדול על ידי לחיצה על כלי הסף שנקבע.
      2. בחר את ריכוז החלקיקים באמצעות כלי שער המעגל. לחץ על ספירת STD ובדוק את ריכוז חרוזי ה-QC (2.17 × 1010/מ"ל) לפני סגירת החלון.
      3. כדי להגדיר את תקן הגודל, פתח את date_68-155 S16M-Exo.nfa file. לחץ על גודל כלי כדי לפתוח את חלון יצירת העקומה הסטנדרטית ולהגדיר את הסף עבור האות הקטן על ידי לחיצה על כלי הסף המוגדר.
      4. בחר S16 exo 68-155 ננומטר מהתפריט הנפתח מוגדר על-ידי המשתמש . לחץ על Find Peaks כדי לזהות את עוצמות השיא של SS של אוכלוסיות בגדלים של ארבע.
      5. בחר את הקובץ הריק ולחץ על הגדר ריק כדי לזהות את מספר התוצאות החיוביות השגויות להסרת הדגימה. כדי לנתח את ריכוז האנדוזום, בחר תחילה את הדגימה והגדר את הסף על אות קטן על ידי לחיצה על כלי הסף שנקבע. הצג את הנתונים הכמותיים כדוח גודל (ננומטר) וריכוז (חלקיקים/מ"ל).

5. תרבית קרדיומיוציטים ראשונית

הערה: בודד קרדיומיוציטים באמצעות ערכת בידוד קרדיומיוציטים ראשונית, המספקת ריאגנטים מספיקים לבידוד קרדיומיוציטים מעד 50 לבבות עכברים או חולדות יילודים. הערכה כוללת גם רכיבים המתאימים לתמיכה בתרבית קרדיומיוציטים ראשונית. יש להסיר את כל המדיה והמאגרים בזהירות כדי למנוע תאים מפריעים. מומלץ לבצע פיפטינג ידני באמצעות קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר, יש להימנע משאיבת ואקום. יש לקרר מראש את תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ל-4 מעלות צלזיוס לפני תחילת ההליך.

  1. להרכיב מחדש את אנזים בידוד קרדיומיוציטים 1 (המכיל פפאין), הזמין בערכה, על ידי הוספת 2. מ"ל של HBSS צונן לבקבוקון אחד. יש לערבב בעדינות במשך כ-5 דקות או עד שהאנזים נמס במלואו. שמור את תמיסת האנזים על קרח לאורך כל ההליך.
    הערה: בקבוקון יחיד של אנזים 1 משוחזר מספיק לבידוד קרדיומיוציטים מ-10 לבבות יילודים. ניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים והוא יציב לשני מחזורי הקפאה-הפשרה. אם מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, יש להשתמש בתמיסה תוך שבוע כדי להבטיח פעילות אנזימטית.
  2. הנח לבבות יילודים שזה עתה נותחו לתוך סטרילי בודד 1. צינורות מיקרו-צנטריפוגה מ"ל ולהוסיף מיד 500 מיקרוליטר של HBSS קר כקרח לכל צינור.
    הערה: מומלץ לעבד לב אחד לכל שפופרת כדי למקסם את התפוקה ויכולת השחזור.
  3. טוחנים רקמת לב לשברים של 1 מ"מ³ בעזרת מספריים לדיסקציה סטרילית. שטפו כל דגימה פעמיים עם 500 מיקרוליטר HBSS קר כקרח כדי להסיר שאריות דם.
  4. לכל צינור, הוסף 200 מיקרוליטר של אנזים בידוד קרדיומיוציטים משוחזר 1 (פפאין) ו-10 מיקרוליטר של אנזים בידוד קרדיומיוציטים 2 (המכיל תרמוליזין), הזמין בערכה. מערבבים בעדינות ומדגרים את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-35 דקות.
    הערה: אנזים בידוד קרדיומיוציטים 2 מסופק כתרחיף ב-HBSS ויש להפשיר אותו על קרח לפני השימוש. הומוגניזציה של האנזים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי להבטיח תרחיף אחיד לפני הוספתו לדגימות.
  5. לאחר עיכול אנזימטי, שאפו בזהירות את תמיסת האנזים ושטפו כל דגימה פעמיים עם 500 מיקרוליטר HBSS קר כקרח.
  6. הוסף מ"ל של DMEM מלא לבידוד תאים ראשוני לכל צינור. טריטו בעדינות את הרקמה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 25-30 פעמים באמצעות קצה פיפטה סטרילי של 1.0 מ"ל. צמצם את היווצרות בועות האוויר בשלב זה.
    הערה: שיבוש רקמות על ידי פיפטינג משפר את תפוקת התאים. עם זאת, פיפטינג מוגזם עלול להוביל לנזק לתאים.
  7. צנטריפוגה הסופרנטנט ב -300 × גרם למשך 5 דקות.
  8. הסר את ה-DMEM השלם בזהירות בעזרת פיפטה. הוסף 1 מ"ל DMEM טרי מלא לצינור ופיפטה למעלה ולמטה 25-30 פעמים באמצעות קצה פיפטה סטרילי של 1.0 מ"ל. הימנע מבועות אוויר בעת פיפטינג.
  9. לאחר שהרקמה היא בעיקר תרחיף של תא בודד, הוסף 0.5 מ"ל של DMEM מלא לבידוד תאים ראשוני לכל צינור כדי להביא את הנפח הכולל ל-1.5 מ"ל. שלב תרחיפי תאים בודדים לקביעת ריכוז התאים וכדאיות התא.

6. אנדוזום תרבית משותפת עם קרדיומיוציטים

  1. זרעו את הקרדיומיוציטים בצלחת של 60 מ"מ והוסיפו DMEM מלא לנפח הכולל.
    הערה: כל לב של עכבר יילוד צפוי להיות זרוע בצלחת אחת, והנפח הכולל של כל באר צפוי להיות 5 מ"ל (איור 1B).
  2. דגרו את צלחת ה-60 מ"מ ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO2 למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, החלף את המדיום בנפח שווה ערך של DMEM מלא טרי לבידוד תאים ראשוני המכיל תוסף גדילה קרדיומיוציטים מדולל פי 1000.
  3. העבירו את פליטת האנדוזום שנוצרה בשלב 3 מ-80 מעלות צלזיוס ל-20 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, הניחו את האנדוזומים על קרח והפשירו אותם בהדרגה.
    הערה: הפשרה הדרגתית על קרח יכולה להפוך את קרום האנדוזומים לשלם יותר ולהפחית את הפירוק.
  4. לאחר 48 שעות, מערבבים כל 100 מיקרוליטר של אנדוזום עם 5 מ"ל של DMEM מלא טרי ומחליפים את המדיום הישן בכל מנה. אנדוזומים בתרבית משותפת עם קרדיומיוציטים למשך 24 שעות.
  5. שוטפים את הקרדיומיוציטים עם 2 מ"ל PBS סטרילי קר. הוסף מאגר ליזה קר כקרח לכל מנה עם מאגר ליזה של 80-100 מיקרוליטר. מגרדים את התאים באמצעות מגרד תאי פלסטיק קר ואוספים את התאים בצינורות של 1.5 מ"ל.
  6. בצע את פרוטוקול WB המתואר בשלב 4.1.
  7. עבור צביעה חיסונית (IF) בצע את השלבים המתוארים להלן.
    1. קרדיומיוציטים זרעים במגלשה תאית בת 8 בארות. לדלל את המתלה החד-תאי עם DMEM שהושלם מ-1.5 מ"ל ל-3 מ"ל.
    2. זרע 300 מיקרוליטר מהתרחיף לכל תא. חזור על שלבים 6.2-6.4.
    3. תקן את הקרדיומיוציטים עם 200 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ושטוף עם 200 מיקרוליטר PBS סטרילי שלוש פעמים. המגלשה הקאמרית בת 8 הבארות מוכנה ל-IF.
      זהירות: בעת טיפול ב-4% PFA, נא ללבוש PPE מתאים. יש להשליך 4% PFA למיכל מתאים לאחר השימוש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בחנו את רמות הביטוי של סמנים עבור אנדוזומים מוקדמים, אנדוזומים מאוחרים, ליזוזומים ואוטופאגוזומים בקרב חמש קבוצות: ליזאט של רקמת לב, מקטע גרעיני, מקטע מיטוכונדריאלי, שלפוחיות תוך-תאיות אחרות משלב 2.6 ושלב 3.6, ואנדוזומים משלב 2.5 ושלב 3.6. תוצאת הכתם המערבי הראתה של-EEA1 (Early Endosome Antigen 1) הייתה רמת הביטוי הגבוהה ביותר באנדוזומים וכמעט ולא באה לידי ביטוי בקבוצות אחרות (איור 2A,B). Rab7 התבטא גם ברמה הגבוהה ביותר באנדוזומים (איור 2A,C),

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מציגים שיטה מהירה וניתנת לשחזור לבידוד אנדוזומים בטוהר גבוה מרקמות לב של עכברים על ידי שילוב של פיצול תת-תאי עם פלטפורמת בידוד מהירהבמיוחד 14. גישות מסורתיות לבידוד אנדוזומים, כגון צנטריפוגה בשיפוע צפיפות12 או בידוד חיסוני, הן לרוב עתירות זמן ועבודה ודורשות כמויות גדולות של רקמות או נוגדנים מיוחדים. על ידי שילוב פרוטוקול הומוגניזציה מכני עם טכנולוגיית הננו-סינון, ייעלנו משמעותית את תהליך הבידוד תוך שמירה על השלמות הפיזיקוכימית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים: מענק המכון הלאומי ללב, ריאות ודם 2R01HL121700-06A1 ו-R01HL172834-01 ל-M.W., מענק איגוד הלב האמריקאי 24TPA1303770 ו-25EIA1422015 ל-MW US EPA84045701 ל-X.L.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
µ-שקופית 8 גבוהה היטבאיבידי80806-90
צינור מיקרוצנטריפוגה מדורג 1.5 מ"לארה"ב סיינטיפיק1615-5500
10x Tris/Glycine Bufferביו ראד1610734
4x מאגר מדגם Laemmliביו ראד1610747
צנטריפוגה ספסלאפנדורףצנטריפוגה אפנדורף 5810R
אלבומין סרום בקר סיגמאא9418
מסננת תאיםקורנינגCLS431750גודל נקבוביות 40  μ M, סטרילי
מנות תרבית רקמות CELLSTARVWR82050-546פוליסטירן, סטרילי, 60 מ"מ וחריף; 15 מ"מ
מערכת הדמיה ChemiDocביו ראדChemiDoc XRS+
פתרון ניקויננו-פ.ק.מ17159
DMEM עבור ערכות בידוד תאים ראשוניות של פירספישר סיינטיפיקPI88287
DTTפישר סיינטיפיקBP172
דולבקו s מי מלח חוצץ פוספט (PBS)תרמו סיינטיפיק10010023
מגיב לזיהוי כתמים מערביים ECLביו ראד1705061
EDTAסיגמאE4884
EEA1איתות סלולריתקופה 3288WB (1:1000)
א.ג.ט.א.סיגמאE-4378-25
עידאקסודוסעיד MA03
ERp72איתות סלולרישמות 5033WB (1:1000)
אתנולחנות מחקר UH200 הוכחה, 5 ליטר
אקסודוס H-600אקסודוסH-600
GAPDHפרוטאינטק10494-1-APWB (1:5000)
האנק' תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)תרמו סיינטיפיק14175095
הפססיגמאH3375
הומוגנייזרפישר סיינטיפיק15340167
KClסיגמאעמ' 3911
מנורה1אבקםab320851WB (1:2000)
LC3איתות סלולרישניות 2775WB (1:1000)
לייזר 500 אנטון פארלייזר 500ציוד אחר כגון Zetasizer (Malvern) או DLS  (Wyatt) ניתן להשתמש
מ. צ'ריביורביטכדור66657WB (1:500)
מ"ג 2פישר סיינטיפיקBP214-500
NaClסיגמאS7653
ננו-פ.ק.מננו-פ.ק.מננו-אנלייזר זרימה
תקני גודל ננוספרותתרמו סיינטיפיק3020א
מיקרוסקופ קונפוקלי AXR של ניקוןניקוןאקסר
תמיסת פרפורמלדהיד 4% ב-PBSסנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-281692
בדיקות תיוג פלואידיןInvitrogenא22284אם (1:500)
ערכות בדיקת חלבון BCA של פירסתרמו סיינטיפיק23227
ערכת בידוד קרדיומיוציטים ראשונית של פירסתרמו סיינטיפיק88028
מסנן מזרק פוליאתרסולפוןמיליפורSLHPR33RSגודל נקבוביות 0.45  μ M, סטרילי
ג'ל חלבון מוכן מראשביו ראד4561093
חרוזי QCננו-פ.ק.מQS2503
ראב7איתות סלולריתאורת 9367SWB (1:1000)
מאגר ליזה ומיצוי RIPAתרמו סיינטיפיק89900
רוש פוססטופ (קוקטייל PI)רוש4906837001
ננו-ספירות סיליקהננו-פ.ק.מS16M-אקסו
סוכרוזסיגמא84097
רוטור דלי מתנדנדבקמן קולטרSW55Ti
מערכת העברת טורבו טרנס-בלוט ערכות העברת RTAביו ראד1704270
טווין 20ביו ראד1662404
אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטראופטימה XE-90
צינורות אולטרה-צנטריפוגה בקמן קולטר326819
אמבט ניקוי אולטרסאונדברנסון אולטרסאונדCPX952238R
צינור VWR סנט 50 מ"לVWR89039-656
צנטריפוגת צינור VWR 15 מ"לVWR89039-666
חומר ייחוס פוטנציאלי של Zetaאנטון פאר175108

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 679-696 (2018).
  2. Gould, G. W., Lippincott-Schwartz, J. New roles for endosomes: from vesicular carriers to multi-purpose platforms. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (4), 287-292 (2009).
  3. Bissig, C., Gruenberg, J. Lipid sorting and multivesicular endosome biogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (10), a016816(2013).
  4. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
  5. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: origins unknown, biogenesis complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 759-774 (2013).
  6. Singh, J., et al. Endosome transcriptomics reveal trafficking of Cajal bodies into multivesicular bodies. bioRxiv. , (2025).
  7. Scott, C. C., Gruenberg, J. Ion flux and the function of endosomes and lysosomes: pH is just the start: the flux of ions across endosomal membranes influences endosome function not only through regulation of the luminal pH. Bioessays. 33 (2), 103-110 (2011).
  8. Lopez-Verrilli, M. A. Exosomes: mediators of communication in eukaryotes. Biol Res. 46 (1), 5-11 (2013).
  9. Corbeil, D., et al. Uptake and fate of extracellular membrane vesicles: nucleoplasmic reticulum-associated late endosomes as a new gate to intercellular communication. Cells. 9 (9), 1931(1931).
  10. Curran, J., et al. EHD3-dependent endosome pathway regulates cardiac membrane excitability and physiology. Circ Res. 115 (1), 68-78 (2014).
  11. Kapustin, A. N., et al. Vascular smooth muscle cell calcification is mediated by regulated exosome secretion. Circ Res. 116 (8), 1312-1323 (2015).
  12. Marsh, M., et al. Rapid analytical and preparative isolation of functional endosomes by free flow electrophoresis. J Cell Biol. 104 (4), 875-886 (1987).
  13. de Araújo, M. E., Lamberti, G., Huber, L. A. Isolation of early and late endosomes by density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (11), 1013-1016 (2015).
  14. Chen, Y., et al. Exosome detection via the ultrafast-isolation system: EXODUS. Nat Methods. 18 (2), 212-218 (2021).
  15. Miao, L., et al. Cardiomyocyte orientation modulated by the Numb family proteins-N-cadherin axis is essential for ventricular wall morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (31), 15560-15569 (2019).
  16. Miao, L., et al. The spatiotemporal expression of Notch1 and Numb and their functional interaction during cardiac morphogenesis. Cells. 10 (9), 2192(2021).
  17. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-what they are and what they are not. J Control Release. 235, 337-351 (2016).
  18. Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Rev Rep. 18 (3), 1067-1077 (2022).
  19. Wilson, J. M., et al. EEA1, a tethering protein of the early sorting endosome, shows a polarized distribution in hippocampal neurons, epithelial cells, and fibroblasts. Mol Biol Cell. 11 (8), 2657-2671 (2000).
  20. Dumas, J. J., et al. Multivalent endosome targeting by homodimeric EEA1. Mol Cell. 8 (5), 947-958 (2001).
  21. Bucci, C., et al. Rab7: a key to lysosome biogenesis. Mol Biol Cell. 11 (2), 467-480 (2000).
  22. Langemeyer, L., Fröhlich, F., Ungermann, C. Rab GTPase function in endosome and lysosome biogenesis. Trends Cell Biol. 28 (11), 957-970 (2018).
  23. Wang, C., et al. Investigation of endosome and lysosome biology by ultra pH-sensitive nanoprobes. Adv Drug Deliv Rev. 113, 87-96 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Nano Flow Cytometry

מאמרים קשורים