מאמר שיטה

הדמיה מולקולרית מרחבית של הגליקום באמצעות ספקטרומטריית מסה

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69154

⸱

28 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט את השלבים המרכזיים לאפשר מדידה קפדנית וניתנת לשחזור של גליקנים מקושרי גליקוגן ו-N באמצעות דימות ספקטרומטריית מסה.

תקציר

הארגון המרחבי של הגליקום בתוך הרקמות הוא מפתח לבסיס המולקולרי לתפקוד הפיזיולוגי. הגליקום המגוון והדינמי הוא קריטי לתהליכים תאי בסיסיים, כולל חילוף חומרים, איתות והיצמדות. חידושים בביולוגיה מרחבית הביאו לדרכים חדשות להדמיה מולקולרית מרחבית של סוגי גליקום מגוונים. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי להדמיה ביומולקולרית מרחבית של הגליקום בכבד עכבר קפוא טרי. תהליך העבודה כולל (1) קציר והקפאה מהירים, (2) חתך קריוסטט בעובי ומיקום מיטביים, (3) הכנת רקמות ועיכול אנזימי על רקמה באמצעות אנזימים פעילים בפחמימות, (4) יישום ואיסוף נתונים במטריצה באמצעות דימות ספקטרומטריית מסה בסיוע לייזר/יינון (MALDI-MSI), ו-(5) עיבוד והצגת נתונים למיקום הממצאים בהקשר ביולוגי. שימוש בגישה זו מאפשר רכישת מפות מרחביות מפורטות של גליקנים וגליקוגן מקושרים ל-N, החושפים תכונות פיזיולוגיות ותאיות מרכזיות. נתונים אלו מאפשרים להגדיר את ההטרוגניות הגליקומית המרחבית המרכזית הקשורה לתפקוד כבד ותפקוד לקויה. זרימת עבודה זו מאפשרת בדיקת גליקומיקה מרחבית רגישה וניתנת לשחזור גבוהה של כבד העכבר. בנוסף, הוא ניתן להסתגל בקלות לרקמות או מינים אחרים, ומאפשר תובנות מרחביות חדשות בביולוגיית גליקום בבריאות ומחלות.

מבוא

תחום הביולוגיה המרחבית מתרחב במהירות, ומספק תובנות קריטיות למורכבות הביומולקולרית הדינמית של אורגניזמים חיים. שיטות רבות מיושמות לחקר מולקולות ביולוגיות שונות בהקשר ביולוגי. בעוד שחלקן טכניקות מתמחות מאוד, ספקטרומטריית מסה (MS) הפכה לטכניקה כללית חשובה לכימות מגוון רחב של ביומולקולות בהקשר של תאים, רקמות או אורגניזמים.

דימות ספקטרומטריית מסה בלייזר בסיוע מטריצה (MALDI-MSI) הוא אחת הטכניקות הכלליות המתפתחות להדמיית ביומולקולות מרחבית רב-אומית. הוא נוסד במקור להמחשה של חלבונים ופפטידים בפרוסות רקמה1. מאז, הוא הורחב לדגימות ומולקולות ביולוגיות מגוונותרבות. הטכניקה ניתנת ליישום על דגימות תאיות3, אורגנואידים4, בעלי חיים מודלים5, ודגימות מטופלים 6,7. חלק מהקטגוריות המולקולריות ניתנות למדידה ישירה באמצעות גישות מבוססות MSI, כולל מטבוליטים וליפידים רבים, בעוד שסוגים אחרים של מולקולות ביולוגיות מורכבות יותר, כגון חלבונים וגליקנים, דורשים טיפול אנזימטי או כימי כדי שיתאימו לגילוי מבוסס MSI 2,8.

MALDI-MSI יושם גם לניתוח מרחבי של גליקנים וגליקוגן מקושרי N, תוך שימוש בזרימות עבודה הדורשות עיבוד אנזימטי ליצירת קטעי גליקן המתאימים לזיהוי MSI 9,10,11,12,13,14,15. N-גליקנים נחתכים משאריות אספרגין של חלבונים עם PNGase F, ושרשראות גלוקוז של גליקוגן נחתכות באיזואמילאז. היתרונות המרכזיים של ניתוח הגליקוגן של MALDI הם שהוא מספק הגדרה מרחבית של התפלגות הגליקוגן בדגימה הביולוגית, כימות יחסי ומידע על הסתעפות שרשראות הגלוקוז. מכיוון שגם תהליכי N-גליקן וגם גליקוגן דורשים עיבוד אנזימטי של הדגימה לניתוח MSI, הם שולבו לזרימת עבודה משולבת לניתוח גלייקום (איור 1A). תהליך זה דורש הכנה מדויקת של דגימות ביולוגיות ועיבוד ספציפי כדי לאפשר ניתוח טרשת נפוצה של הגליקום, ולאחר מכן איסוף ועיבוד נתונים. בעוד שתהליך העבודה דורש סדרת שלבים מיוחדים, הוא מייצר נתוני גליקום מרחביים עשירים ואיכותיים, ניתנים לשחזור גבוה וניתן להתאים לסוגים רבים ושונים של דגימות16. בנוסף, זרימת העבודה היא מודולרית, כך שניתן לבצע את שלבי עיבוד הדגימות במעבדות מחקר עצמאיות לפני הגשת הדגימות למתקנים מיוחדים המבצעים את השלבים המאוחרים של איסוף וניתוח נתוני MALDI-MSI.

פרוטוקול

מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת פלורידה. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. קצירת הכבד

  1. המתת חסד וניתוח בבעלי חיים
    1. לבצע פריקה וכריתת ראש צוואר הרחם כדי להמתים את העכבר (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
      הערה: בדוגמה זו, נעשה שימוש בעכבר בן 6 חודשים מסוג פראי C57BL/6J. בגיל זה, עכברים שוקלים ~25-33 גרם. מגוון רחב של גילאים, גדלים וזנים מתאימים היטב לניתוח זה.
    2. מניחים מיד את החיה על כרית תחתונה סופגת וחשפו את חלל הבטן באמצעות סכין סטרילית.
    3. באמצעות מלקחיים ומספריים סטריליים, בודדו את הכבד עם מינימום מניפולציה ונזק לרקמות.
      הערה: שינויים מטבוליים מתרחשים במהירות. הימנעו מהפרפוזיה או הרדמה אם אפשר, ודאגו שצעדי הניתוח מתבצעים במהירותהאפשרית.
  2. שטוף ונק במהירות את הטישו.
    1. טבלו בעדינות את הכבד ב-1x מלח עם בופר פוספט (PBS) כדי להסיר כל דם.
    2. טבלו את הרקמה במים דה-יוניים (DI) פעמיים.
    3. נגב מים עודפים על ידי נגיעה עדינה של הרקמה על מגב נקי.
      הערה: דגימות גדולות יותר ממה שיכול להיכנס למקופית מיקרוסקופ סטנדרטית יש לחתוך לחתיכות לפני ההקפאה.
  3. הקפאת דגימות
    1. הניחו את הכבד הנקי ישירות בסירת משקל פוליסטירן חד-פעמית מקוררת מראש הצפה על חנקן נוזלי.
    2. לאחר שהרקמה משנה צבע לאטום מבריק, כ-3 דקות, מניחים את הרקמה בתוך שקיות אלומיניום מוכנות מראש ומסומנות על קרח יבש.
    3. הניחו את שקיות האלומיניום עם הדגימות במקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחסון. ניתן לאחסן את הדגימות לטווח ארוך בטמפרטורה של -80°C.

2: הכנת דגימה ביולוגית

  1. הכנה לקריוסקציה
    1. ודאו שהקריוסטט מופעל ומאוזן לטמפרטורה המתאימה לרקמה, בין -16 °C ל-20- °C. הטמפרטורה המדויקת תלויה בסוג הרקמה. יש לחלק את הכבד בטמפרטורה מעט חמה יותר, כ-16- מעלות צלזיוס עד מינוס 17 מעלות צלזיוס, כדי למנוע קרעים ברקמה, בעוד שיש לחלק רקמות אחרות בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס.
    2. ודא שיש לפחות שני צ'אקים, שתי מברשות צבע דקות, זוג פינצטה דקה, ותוספת זכוכית בקוטר 70 מ"מ בטמפרטורה של הקריוסטט. בנוסף, החלקו תווית בעיפרון לפני שמניחים אותם בקריוסטט כדי להסתגל.
    3. העבר את הרקמה ממקפיא בטמפרטורה של -80°C לקריוסטה על קרח יבש.
    4. אפשר לרקמות להסתגל לטמפרטורה בקריוסטט לפחות 30 דקות.
    5. ודאו שאין נזק לקצה הזכוכית ושהוא חלק במקום שבו הרקמה פוגשת את מדריך האנטי-רול על ידי העברת אצבע מכוסה בכפפה לאורך הקצה.
    6. הכניס את המכונה הזכוכית לתוך מדריך המניעה לגלגול.
    7. קחו להב פרופיל נמוך והחלקו אותו בזהירות לתוך מחזיק הלהב הפתוח, וסגרו אותו. הנח את מגן הלהב האדום מעל הלהב עד לחתיכה.
    8. התקן את הרקמה על הצ'אק באמצעות מדיום M1, התואם ל-MS. הנח את מדיום ההתקנה בטמפרטורת החדר M1 על הצ'אק בתוך הקריוסטט, תוך כיסוי לפחות שתי טבעות על הצ'אק כך שהרקמה תיתקע במקומה.
      הערה: תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) משמשת לעיתים קרובות בקריוסקציה; עם זאת, הוא גורם לדיכוי יונים ביישומי MS ויש להימנע ממנו. אם יש להשתמש ב-OCT, יש להשתמש בפרוטוקול רב-שלבי נוסף כדי למזער או להסיר את ה-OCT. בנוסף, חלק ממרכזי המשאבים של MS אינם מנתחים דגימות שהוטבעו ב-OCT.
    9. קח פינצטה מקוררת והוציא את הרקמה מנייר האלומיניום. השתמש בפינצטה כדי למקם את הרקמה על הצ'אק בכיוון הרצוי.
    10. הנח את הצ'אק בקריוסטט כדי לאפשר למדיה המתגברת לקפוא, בערך 2 דקות. ברגע שהוא מקפיא, הוא יתקשה וייראה אטום.
  2. קריוסקטציה של רקמת כבד
    1. הניחו את הצ'אק עם הרקמה המותקנת בתוך מחזיק הצ'אק. מקם את הצ'אק כך שהרקמה תחתוך בזווית של 90° ללהב.
    2. למשוך את מחזיק הצ'אק עד שהרקמה לא מגיעה עם הלהב. הכניסו לאט את הצ'אק עד שהרקמה צמודה ללהב כדי להתחיל בחתך.
    3. התחל בחתך עם פרוסת עובי של 30 מיקרון כדי להסיר רקמה לא רצויה.
    4. ודא שעומק לוח הגלגול יוצר חתך חלק ושהרקמה לא מתגלגלת מעל הפלטה. אם זה המצב, אז תרפה מעט את פלטת הגלגול. אם הרקמה מזיזה את פלטת הגלגול ופוגעת בה בפעם השנייה באיפוס הסיבוב, אז להדק את לוח הגלגול מעט.
    5. כאשר החתך הרצוי מתקרב, יש להקטין את עובי הפרוסה המיועד ל-10 מיקרון, או לעובי רצוי אחר המתאים ליישום הספציפי.
    6. השלים 10 סיבובים כדי שהאק יהיה בעובי הנכון כדי למנוע עיכובים וחלקים לא אחידים.
    7. השתמש במברשת צבע מקוררת כדי לפנות את הבמה כהכנה לחתיכה. סגור את פלטת הגלגול מעל הלהב ולקח לאט לאט חלק מהרקמה.
    8. הרם את פלטת הגליל והשתמש בשתי מברשות צבע דקות וקרות כדי להרחיק בעדינות את החלק מהלהב. משוך את החלק לצד הבמה כדי להקל על ההרכבה על הסלייד.
    9. קח סלייד מקורר מנושא שקופית בקריוסטט והניח אצבע מורה בצד הנגדי של המחסנית מהמקום שבו הרקמה תמוקם למשך 10 שניות.
    10. מניחים בעדינות את הסלייד על הרקמה והרימו אותה חזרה למעלה. אל תלחץ חזק למטה, כי זה יקרע את הרקמה. הרקמה אמורה להימס על המחסנית ולהפוך לשקופה.
    11. העבר במהירות את המחסניות למייבש יבש לייבוש. ייבשו את הסלייד במייבש למשך שעה.
    12. לאחר הייבוש, ניתן לעבד את הסליידס ישירות עבור MS או לאטום ואקום ולאחסן בטמפרטורה של -80°C.

3. הכנת שקופיות ל-MSI של גליקומיקה

  1. הכנת אנזימים
    הערה: ניתן לרכוש ולהשתמש ישיר בליופילי PNGase F דל מלח, מוכן לטרשת טרשת נפוצה.
    1. איזואמילז דורש דיאליזה להסרת עודפי מלח ליישומים של טרשת נפוצה. הכינו דיאליזה אחת או יותר על ידי הנחתן במי HPLC למשך 15 דקות.
    2. דיאליזציה של 200 מיקרוליטר איזואמילז מקורי באמצעות דיאליזה של 500 מיקרוליטר ב-14.3 מ"ל מים של HPLC למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ללא ערבוב. החלף את 14.3 מ"ל מי HPLC במי HPLC טריים ודיאליזציה ל-16 שעות נוספות (לילה) בטמפרטורה של 4°C. החלף את 14.3 מ"ל מי HPLC במי HPLC טריים ודיאליזציה ל-8 שעות נוספות בטמפרטורה של 4°C.
    3. הסר בעדינות את האיזואמילז מהכוס עם פיפטה ומניח אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5. מדדו את הנפח הכולל של תמיסת איזואמילז לאחר דיאליזה (במיקרוליטר). מהפעילות ההתחלתית של המלאי, בדרך כלל 200 יחידות/מ"ל, והנפח הסופי, חשב את הנפח הכולל הנדרש ל-3 יחידות איזואמילאז.
    4. אליקוטים של 3 יחידות איזואמילז לצינורות PCR דקים בדופן. צינורות הקפאה בחנקן נוזלי. אחסן בטמפרטורה של -80°C. ניתן להשתמש בשפופרת אחת של תמיסת איזואמילז דיאליזציה לכל פרוטוקול ריסוס, וזה מספיק לארבעה שקופיות. הימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה כדי לשמור על פעילות האנזימים.
  2. קיבוע ושטיפת טישו
    1. הניחו את המחסניות במחזיק שקופיות וטבלו במיכל זכוכית מלא ב-10% Neutral Buffered Formalin (NBF) למשך שעה.
    2. הסר את השקופיות מה-NBF. טבלו את המגלשות ב-70% אתנול למשך 2 שעות.
    3. הכינו ארבעה צנצנות קופלין המכילות 70%, 80%, 90% ו-100% אתנול. תייגו כל צנצנת בבירור כדי למנוע בלבול במהלך הכביסה הרציפה.
    4. העבירו ברצף שקופיות כדלקמן: 70% אתנול ל-5 דקות, 80% אתנול ל-5 דקות, 90% אתנול ל-5 דקות, 100% אתנול ל-5 דקות.
    5. העבירו את השקופיות לצלחת פטרי מזכוכית מלאה בקסילן טרי 100%. ודא שהמגלשות שקועות לחלוטין. דגרו את הסליידים על שייקר במהירות של 70 סל"ד למשך שעה אחת, בהתאם לתכולת השומנים ברקמה. חזור על שלב זה פעמיים נוספות עם קסילן טרי בכל שטיפה.
      הערה: פרוטוקול זה נועד לאפשר דליפידציה מקסימלית, שכן ידוע כי ליפידים גורמים לדיכוי יונים, ולכן למקסימום שחזוריות. עם זאת, הדבר גורם לדלוקליזציה של האותות, ובכך מפחית את הרזולוציה שניתן להשיג. הפחתת שלבי השטיפה, הגבלת זמן העיבוד ושליטה קפדנית בלחות עלולים להפחית את הדלוקליזציה ובכך להוביל לשיפור רזולוציית הנתונים.
    6. הנח את הסליידקים במייבש יבש למשך הלילה לייבוש.
    7. הניחו מחסניות ב-70% אתנול למשך דקה אחת כדי להתחדש בנוזלים. שים מגלשות במי DI למשך 3 דקות. חזור על שטיפת המים עם מי DI טריים.
    8. ייבשו את המחסניות במייבש למשך 10 דקות, או עד שיתייבשו לחלוטין.
  3. הכנת שקופיות ליישום אנזימים
    1. הכינו תא לחות HTX לדגירה על ידי הנחת מגבת נייר ספוגה במי DI מתחת למתקן המתכת. הנח את התא באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
    2. הכינו מכשיר אידוי מזון על ידי מילוי מאגר המים עד למעלה במי ברז. הגדר את הטיימר ל-60 דקות כדי להפעיל את היחידה.
    3. הכינו בופר ציטראקוני על ידי הוספת 50 מ"ל מים בדרגת HPLC, 25 מיקרוליטר אנידריקון ציטרקוני, ו-2 מיקרוליטר של 12 מ' HCl לצינור פלקון בנפח 50 מ"ל. מערבב את הפתרון ל-10 שניות כדי לערבב היטב. כל צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל של בופר ציטרקוני מספיק לארבעה שקופיות. ודאו שה-pH של התמיסה הוא 3.0 (טווח מקובל: 2.5-3.5).
    4. מלאו כל מייל בבופר ציטרקוני מוכן. הניחו את המחסנית כשהרקמה פונה פנימה כדי למנוע מהרקמה לגעת בצדדים ולאפשר שליפת אנטיגנים יעילה. ניתן להשתמש בשתי שקופיות לכל מיילר, תוך שימוש בשני מיקומי הקצוות כאשר לשני השקופיות יש רקמות הפונות פנימה.
    5. בדוק שהקיטור נפלט מהמאדים של המזון. הנח את השרירים באידוי האוכל ודוגר במשך 30 דקות.
    6. להעביר את הפוסטים לאמבט מים של DI למשך 5 דקות. מחליף חצי מהבופר הציטראקוני בדואר במים DI ותן לו לעמוד עוד 5 דקות. חזור על הדילול הזה עוד פעמיים.
    7. הסר את כל הממס ושטוף את המחסניות על ידי הוספת מים של 100% DI למיילר המגלשה ואז הסרת מי ה-DI. באמצעות מגבון מעבדה, יש לייבש באזורים שבהם אין רקמה.
    8. צייר עיגול ומשולש בגב כל שקף כדי לסמן מיקומים פנימיים סטנדרטיים. מרחו 1 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל פרוקסידאז חזרת (HRP; עיגול) ו-1 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל גליקוגן כבד ארנב (משולש) על חזית הסלייד.
    9. הניחו את המחסניות במייבש למשך 15 דקות לייבוש מלא.
  4. ריסוס אנזימים ועיכול
    1. הסר שפופרת אחת של PNGase F ליופיליזציה של 100 מיקרוגרם (500 יחידות/מיקרוגרם) ושפופרת אחת עם איזואמילז של 3 יחידות ותן להפשרה למשך 10 דקות. צינורות סיבוב ב-~2000 x g למשך 5 שניות בצינור מיקרוצנטריפוגה. זה מספיק אנזים כדי לרסס 4 שקופיות.
    2. פיפט 50 מיקרוליטר מים DI לכל צינור F ליופיליזציה של PNGase, מערבולת עדינה במשך 10 שניות, וסיבוב במיקרופוג בטמפרטורה ~2000 x גרם למשך 5 שניות. פיפט את תמיסת 50 מיקרו-ליטר PNGase F ישירות לצינור האיזואמילז. הוסיפו מים של HPLC לנפח הסופי של 1 מ"ל.
    3. מערבוב את צינור המיקרוצנטריפוגה הדו-אנזימי 10 שניות וסובב במהירות ~2000 x g למשך 5 שניות.
    4. הפעל את מרסס HTX M5 ופתח את תוכנת HTX M5. ודא שסוג המגש מוגדר ל-Ambient תחת לשונית המערכת .
    5. כבה את משאבת Knauer על ידי לחיצה על כפתור העצירה בצד ימין הקדמי. הפעל את משאבת המזרק החיצונית באמצעות המתג בלוח האחורי שלה.
    6. בתוכנת HTX, תחת לשונית שיטות , בחרו את השיטה המתאימה לריסוס אנזימיים כפול. הפרמטרים חייבים להיות מוגדרים לטמפרטורת הפיה של 45 מעלות צלזיוס, 15 מעברים, קצב זרימה של 0.025 מ"ל לדקה, מהירות של 1200 מ"מ לדקה, מרווח מסילה של 3 מ"מ, תבנית CC, לחץ מוגדר ל-10 psi, קצב זרימת גז של 3 ליטר לדקה, וגובה הפיה של 40 מ"מ.
    7. עברו ללשונית הטמפרטורה וקבעו את טמפרטורת פיית הריסוס ל-45 מעלות צלזיוס. השתמש במפתח כדי להזיז את קו המרסס למחבר העליון.
    8. פתח את שסתום גז החנקן בעל טוהר מאוד וודא שלחץ המרסס הוא 10 psi. במשאבת המזרק, הגדר את קצב הזרימה ל-95 מיקרוליטר/דקה.
    9. בעזרת מזרק ומחט טריים, מלא במים של 4 מ"ל HPLC. הסר את כל הבועות. העבר 2 מ"ל מים דרך קטע בקוטר ~6 אינץ' של קו המרסס לתוך בקבוק פסולת.
    10. חבר את המזרק לקו המרסס וזרם מים דרך משאבת המזרק על ידי התחלה והפעלה ב-95 מיקרוליטר לדקה למשך 5 דקות.
    11. בעת שטיפת משאבת המזרק, הדביקים את הסליידס לפינה השמאלית התחתונה של המגש המחומם באמצעות מדריך יישור מתכתי כדי לוודא שהרקמה נמצאת בתוך אזור הריסוס. תחת לשונית הדגימה , הגדר את פרמטרי X ו-Y לאזור הריסוס, מה שמאפשר ריסוס יתר קל כדי להבטיח כיסוי מלא של הסלייד.
    12. אחרי 5 דקות, עצור את המשאבה, נתק את המזרק, שואב אליה אוויר, ואז דוחף אוויר דרך קו המרסס כדי לנקות את שאריות המים. חזור על זה לפי הצורך.
    13. טענו את תמיסת האנזים הכפולה למזרק חדש וחברו למשאבה, כדי לוודא שלא יישארו בועות.
    14. חבר את המזרק לקו המרסס. במשאבת המזרק, כוון את קצב הזרימה ל-25 מיקרוליטר לדקה.
    15. כאשר פיית הריסוס מגיעה ל-45 מעלות צלזיוס, לחץ על Start מתחת ללשונית Cycle . לחץ על לא כאשר מתבקש להפעיל את משאבת קנאואר. לחץ על 'התחל' במשאבת המזרק כדי להתחיל את הריסוס.
    16. הנח סלייד ריק מתחת לפיה כדי לאשר שקיעת תרסיס אנזימים נראית לעין. לאחר התצפית, לחץ על המשך בתוכנה, הנח את כיסוי הזכוכית על המרסס, ונטר את התרסיס ליישום אחיד, כפי שמצוין על ידי הרטבה אחידה.
    17. כשמחזור הריסוס מסתיים, לחץ על עצירה במשאבה, כבה את גז החנקן ולחץ על אישור עומס השסתום. נקה את הקו והשלב של המרסס וכבה את המרסס, כדי לוודא שהמשאבה של קנאואר פועלת שוב.
    18. דגרו את הסליידס בתא הלחות HTX בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ומניחים את המחסניות פונות כלפי מעלה. לאחר הסיום, הניחו את השקופיות במייבש למשך 15 דקות. ניתן להשאיר שקופיות במייבש למשך הלילה, או להמשיך את הפרוטוקול.
  5. הכנת ויישום מטריצת MALDI
    1. לפני יישום המטריצה, יש לצלם תמונה אופטית של השקופית באמצעות סורק.
    2. שקול 40 מ"ג של CHCA מוצק לתוך צינור קוני של 15 מ"ל. המיס את אבקת ה-CHCA בתמיסה של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית ו-50% אצטוניטריל (ACN) בריכוז של 7 מ"ג/מ"ל.
    3. סוניקט את פתרון המטריקס ל-10 דקות באמצעות מחזורים של 90 שניות דלוק ו-30 שניות כבוי. חזור על שלבים אלו 5 פעמים כדי להבטיח התמוססות מלאה והומוגניות.
    4. הפעל את מרסס HTX M5 ופתח את תוכנת HTX M5. פתח את שסתום גז החנקן וקבע את לחץ המערכת ל-10 psi.
    5. בתוכנת HTX, תחת לשונית שיטות , בחר את השיטה המתאימה לריסוס מטריצת CHCA. הפרמטרים מוגדרים לטמפרטורת הפיה של 79 מעלות צלזיוס, 10 מעברים, קצב זרימה של 0.1 מ"ל לדקה, מהירות של 1300 מ"מ לדקה, מרווח מסילה של 3 מ"מ, דפוס CC, לחץ מוגדר ל-10 psi, קצב זרימת גז של 3 ליטר לדקה, וגובה הפיה של 40 מ"מ.
    6. עבור ללשונית הטמפרטורה , כוון את טמפרטורת פיית הריסוס ל-79 מעלות צלזיוס. מתחת ללשונית המשאבה , כוון את קצב הזרימה ל-100 מיקרוליטר/דקה.
    7. הדביקו את הסליידס לפינה השמאלית התחתונה של המגש המחומם באמצעות מדריך מתכת כדי להבטיח יישור נכון באזור הריסוס. תחת לשונית הדגימה , הגדר את פרמטרי X ו-Y לאזור הריסוס, מה שמאפשר ריסוס יתר קל כדי להבטיח כיסוי מלא של הסלייד.
    8. השתמש במזרק חד-פעמי ובמחט כדי למשוך 5.5 מ"ל של 50% ACN (להסיר בועות).
    9. הגדר את המרסס למצב טעינה . הכנס את מזרק ה-ACN והזריק את ה-ACN. הסר את מזרק ה-ACN והחלף אותו מיד במזרק חדש המכיל 5.5 מ"ל של תמיסת CHCA מסוננת, תוך הזרקה כדי למנוע בועות. כוון את המרסס למצב ריסוס .
    10. כאשר פיית הריסוס מגיעה ל-79 מעלות צלזיוס, לחץ על Start מתחת ללשונית Cycle . לחץ על כן כשאתה מתבקש.
    11. השתמש במחסנית בדיקה ריקה והניח אותה מתחת לפיה של המרסס. כדי לאשר הצטברות מטריצה נראית לעין, תימצא הצטברות מטריצה צהובה על השקופית. לאחר התצפית, לחץ על המשך, הנח את מכסה הזכוכית על הכלי, ונטר את התזת הרסס לאחידות. ריסוס עקבי ייצור סלייד עם אטימות אחידה.
    12. כשמחזור הריסוס מסתיים, הגדר את המרסס למצב LOAD ולחץ על אישור עומס שסתום.
    13. נקה את המרסס על ידי כוונון המשאבה ל-300 psi והורדת הטמפרטורה ל-30 מעלות צלזיוס. ספיג ודחף דרך הקו 5 מ"ל 50% אצטוניטריל פעמיים ו-5 מ"ל 50% מתנול פעמיים. נגב את הבמה ב-100% מתנול. כאשר הטמפרטורה מגיעה ל-30 מעלות צלזיוס, יש לעבור ל-LOAD, לכבות את הגז, לכבות את המרסס, ולוודא שהמשאבה של קנאואר מופעלת מחדש.
    14. הניחו את הסליידקים במייבש למשך 15 דקות עד שהמטריצה מתייבשת לחלוטין. יש להפעיל את המחסניות בהקדם האפשרי לאחר הריסוס, תוך 14 ימים לכל היותר, כדי להבטיח איסוף נתונים אמין עם אות לרעש מתאים.

4. איסוף נתוני גליקומיקה של MALDI-MSI

  1. הכנה לאיסוף נתונים
    1. אבטח את הסלייד למחזיק הדגימה של כלי ה-MALDI באמצעות מתאם הסלייד. הכנס את מחזיק הדגימה לתוך ה-MS וודא שהוא ממוקם כראוי להדמיה.
    2. פתח את תוכנת flexImaging וייבא את תמונת השקופית האופטית שהוקלטה קודם, ראה שלב 3.4.1. במידת הצורך, כיול את יישור התמונה עם שלב המכשיר כך שחלקי הרקמה והנקודות הסטנדרטיות יהיו ממוקמים נכון לבחירת אזור.
    3. הגדר את אזורי ההדמיה של חתכי הרקמה, תקן HRP, תקן גליקוגן, וריבוע מטריצת הבקרה בתוכנה. מתאר כל אחד כאזור נפרד.
    4. הגדר את גודל צעד הרסטר ל-50 מיקרון, מה שמניב רזולוציית פיקסל של 50 × 50 מיקרון.
    5. בתוכנת בקרת המכשירים, בחר במצב MS יוני חיובי והגדר את טווח הסריקה ל-m/z 500 - 4000 עם חיתוך מסה נמוכה של 700.00 m/z.
    6. טען את ערכת פרמטר הכוונון המותאמת מראש של MALDI בתוכנת בקרת הכלים (או הזן את הערכים ידנית במידת הצורך). ודאו שמתחי המקור והיונים אופטיים מוגדרים לערכים שנקבעו: הסטת לוח MALDI 50.0 V; סטייה 1 דלתא 70.0 V; משפך 1 RF 500.0 Vpp; משפך 2 RF 500.0 Vpp; RF רב-קוטבי 500.0 Vpp; אנרגיית יונים 5.0 eV. אשר את תא ההתנגשות והגדרות תזמון TOF: אנרגיית התנגשות 10.0 eV; התנגשות RF 4000.0 Vpp; זמן העברה 180.0 מיקרושניות; אחסון טרום פולס 25.0 מיקרושניות.
    7. אשר את הגדרות הלייזר תחת לשונית הלייזר. בחר בהדמיה 50 מיקרון כברירת מחדל של היישום.
    8. כיילן את ספקטרומטר המסה באמצעות תערובת כיול חיצונית כמו תערובת טיון. הכניסו את הכיול והריצו את שגרת הכיול של הכלי. כוון את הכיול כך ששגיאת דיוק המסה תהיה בטווח של 0.001% וציון דיוק הכיול יהיה 100%.
    9. הגדר את הרכישה לביצוע פיצוץ של 320 יריות לייזר בתדר 10,000 הרץ. יש לכוון את החלשת הלייזר ל-37% כדי לשמור על עוצמת האות בטווח הדינמי האופטימלי. כוון את יריות הלייזר וההחלשה לפי הצורך.
    10. השתמש בפונקציית יישור הקרן האוטומטית של המכשיר, בכוונון פרופיל המטרה ובכוונון המיקוד כדי להבטיח שהלייזר ממוקד כראוי על הדגימה. באזור מחוץ לרקמה, בצע את Auto Beam Adjust מתחת ללשונית הלייזר בתוכנת הבקרה כדי ליישר את הלייזר עם האופטיקה היונית. זה יבטיח שהלייזר והשלב מותאמים לאיסוף נתונים מיטבי. לבסוף, בצע התאמות יצירת פרופיל יעד וכוונון פוקוס בלשונית נושא הדגימה.
    11. אשר כי נקודות התקן הפנימיות מייצרות את שיאי היונים הצפויים, מה שמעיד על מוכנות לאיסוף נתונים. ה-HRP אמור להיות בשיא גליקן בולט של 1211.42. הגליקוגן אמור היה להיות בעל מרווחים קבועים של פסגות בולטות, כאשר השיאים בעוצמה הגבוהה ביותר היו 1013.32, 1175.37 ו-1337.43.
      הערה: אם יש בעיות שמזוהות בעוצמה, חזרו לבדוק את תצורת הלייזר. אם יש בעיות שמזוהות עם דיוק המסה, חזרו לכיול.
  2. איסוף נתוני MALDI-MSI
    1. התחל ברכישת הדמיה של MALDI-MS עבור האזורים שהוגדרו על ידי לחיצה על כפתור Start בתוכנת ההדמיה. המכשיר יבצע ריסטר אוטומטי של הלייזר על כל אזור מוגדר במרווחי 50 מיקרון, ויקבל ספקטרום MS1 של יון חיובי (m/z 500-4000) בכל פיקסל. זמן איסוף הנתונים הטיפוסי לניתוח כבד ברזולוציה זו הוא 135 דקות.
      הערה: לאחר ההרצה, המכשיר ישמור אוטומטית את הספקטרום עבור כל פיקסל שנרכש, וייצור תיקיית .d עם הנתונים הגולמיים.

5. ניתוח נתוני MALDI-MSI

  1. ייבוא וייצוא נתונים
    1. ייבא את מערך הנתונים ל-SCiLS Lab, או לתוכנת ניתוח MSI מקבילה, כדי להמחיש מפות עוצמת יונים של הגליקום על פני חלקי הרקמה.
    2. מעבדת SCiLS פתוחה. בחר חדש. בחר את קובץ .mis מתוך הרצת MALDI.
    3. ברגע שקובץ .mis נפתח ב-SCiLS, לחץ על הבא. בחר טווח אוטומטי עבור טווח m/z. בחר את הציר האוטומטי עבור פרמטרי הציר. בחר בגודל אבסולוטי של מיכל. לחצו על הבא ואז על ייבוא. בחר את התיקייה שבה יישמר הקובץ.
    4. לאחר סיום הייבוא, פתח את קובץ .slx החדש.
    5. לחץ על קובץ, ייבא, ובחר את רשימת התכונות מתוך אפשרות הקובץ. ייבוא הערות glycome ויצירת תמונות יוניות על ידי כניסה לחלונית רשימת הפיצ'רים, בחירת הרשימה הנכונה ולחיצה על כפתור יצירת תמונות יונים.
      הערה: רשימות תכונות חזקות זמינות עבור N-גליקנים16,18,19 וגליקוגן13.
    6. נרמל את הנתונים, לפי הצורך. ספירת היונים הכוללת (TIC) היא הנורמליזציה הנפוצה ביותר.
    7. לאחר שתמונות היונים נטענו, עברו על רשימת התכונות וודאו אינטגרציה נכונה של שיא השיג, תוך כוונון ידני לתכונות שבהן השיא לא משולב במלואו. כדי להתאים, לחץ שמאלי על השיא תוך כדי לחיצה על shift (shift לוחץ). ברגע שהפיק משולב, לחץ על מקש השליטה ורווח במקלדת. זה ייצור תמונת יוני חדשה עבור השיא המותאם.
    8. לאחר חזרה על שאר רשימת התכונות, בתוך לוח התמונה היון, בחר את רשימת התכונות שמור (Save features), שם לרשימה ולחץ על שמירה.
    9. גש לקובץ, לטבלת הפיצ'רים, ופתח את טבלת רשימות התכונות שנשמרה זה עתה. מיין לפי m/z. התכונות המותאמות יופיעו עם תא ריק בעמודת השם. שנו את שמות השיאים המותאמים על ידי העתקת והדבקת השם והסרת השיא המקורי על ידי בחירת כפתור הסרת השורה הנבחרת מרשימת התכונות הממוקם במרכז העליון של טבלת התכונות.
    10. לאחר שינוי כל השמות, מתקבלת רשימת שיא סופית עם הערות. לחץ על כפתור הוספת עוצמה הממוקם ליד כפתור המחיקה. מכאן, בחר את הדגימות המעניינות לייצא את העוצמה הממוצעת של התכונות המוערכות עבור כל אזור שצולם בתמונה.
    11. ודא שבחרת את מצב עיבוד מרווחי אזור השיא ואת ספירת היונים הכוללת עבור הנרמול. לחץ על אישור. עמודות חדשות יופיעו עם הנתונים המתאימים. כדי לייצא את הנתונים, בחר את החץ המצביע החוצה ושמור כ-.csv.

תוצאות

עיבוד זהיר של כבד מעכבר מסוג פראי, כולל חיתוך חתך רוחבי מלא (איור 1A), אפשר להגדיר את הגליקום באמצעות MALDI-MSI, עם אוליגוסכרידים מגוונים שמקורם בגליקוגן וגליקנים מקושרים ב-N בטווח של m/z (איור 1B). הגליקוגן היה ממוקם באופן כללי ברחבי ההפטוציטים של הכבד וחסר כלי דם ורקמת חיבור במסלולי הפורטל, כפי שציפו (איור 1C,D). חשוב לציין כי נתוני MALDI-MSI אפשרו מדידה הן של התפלגות מרחבית של גליקוגן והן של התפלגות אורך השרשרת, תכונה מרכזית של גליקוגן במטבוליזם תקין ובמצבי מחלה (איור 1D). בנוסף, גליקנים מקושרים ל-N מגוונים מציגים ארגונים מגוונים. ההתפלגות המרחבית הנצפית נעה בין תפוצה רחבה בכבדים (איור 1E) למוקדים אזוריים, בהתאם לארגון הסינוסואידלי של הכבד (איור 1F), ועד לתיוג ספציפי של אלמנטים במסלול הפורטלי (איור 1G-I).

figure-results-1
איור 1: ניתוח גליקום MALDI-MSI של כבד עכבר. (א) סכמטיקה לשיטות קריטיות בהכנת דגימות, רכישת נתונים וניתוח. (B) ספקטרום מסה לדוגמה שנגזר מהגישה. חצים באדום מדגימים את האוליגוסכרידים המרווחים באופן קבוע שמקורם בגליקוגן, השונים במונוסכריד גלוקוז אחד. חצים בכחול מסמנים N-גליקנים, הנמצאים המפוזרים ברחבי הספקטרום. בכבד, שיאי הגליקוגן בדרך כלל בולטים יותר, במיוחד בערכי m/z גבוהים. (ג) התפלגות מרחבית של המלטוהקסאזאוס (DP6) שמקורו בגליקוגן בכבד. (D) התפלגות אורכי שרשראות הגליקוגן בכבד. (E-G) התפלגות המרחבית של מיני גליקן מקושרים ל-N בכבד. (H) צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) לאזור מרכזי ממוקד, יחד עם הערות אנטומיות. (I) שקע ממוקד תואם המראה את המיקום המרחבי של גליקן N-קשור נוסף (Hex5dHex1HexNAc5) באלמנטים במסלול הפורטלי. פסי קנה מידה: 500 מיקרון. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של האיור.

דיון

MALDI-MSI הוא כלי מתפתח לביולוגיה מרחבית של גליקום. חשוב לציין שבעוד שפרוטוקול זה מתמקד באיסוף נתונים באמצעות חומרה מסוימת, ניתן להתאים אותו בקלות לפלטפורמות MALDI-MSI ממספר ספקים13. עיבוד הדגימות זהה עד לשיטה 4, אם כי חלק מהספקים עשויים לדרוש שימוש בשקופיות ייעודיות. שינויים באיסוף הנתונים, תוך שימוש בפרמטרים ספציפיים לפלטפורמת MALDI-MSI, מאפשרים התאמה מהירה של פרוטוקול זה. ניתן להשתמש בתוכנות ספציפיות לספקים לעיבוד נתונים, כפי שמפורט בשלב 5, או, לחלופין, ניתן להשתמש בפלטפורמות לעיבוד נתונים קפדני וניתן לשחזור של MALDI-MSI19.

MALDI-MSI הוא כלי שימושי במיוחד להבנת הביולוגיה, שכן לאיברים, רקמות ותאים שונים יש דפוסים שונים של גליקום. כבד מתאים מאוד לניתוח גליקום בכך שיש בו רמות גבוהות של גליקוגן ומגוון גליקנים מקושרים ל-N. איברים אחרים מכילים רמות גבוהות יותר ומגוון של גליקנים מקושרים ל-N ורמות נמוכות יותר של גליקוגן13. חשוב לציין שהגליקום משתנה באיברים שונים בהתאם למצב המטבולי והמחלה של האורגניזם, ולכן הגליקום מספק מקור עשיר למידע ביולוגי 5,14,15,20. פיתוח מתמשך של אנזימים ייחודיים פעילים בפחמימות לניתוח MALDI-MSI מבטיח להרחיב את ניתוח הגליקום לביומולקולות אורתוגונליות נוספות בגליקום.

למרות יתרונות רבים, MALDI-MSI מוגבל כיום ברזולוציה בהשוואה לכלים אחרים המשמשים בביולוגיה מרחבית. פרוטוקול זה השתמש באיסוף נתונים ברזולוציה של 50 מיקרון. למרות שנתונים מצוינים לניתוח פיזיולוגי, נתונים ברזולוציה של תא יחיד יקדמו משמעותית את התחום21. במיוחד, דה-לוקליזציה יכולה להיות מחסום משמעותי לשיפור הרזולוציה בשיטות המשתמשות בריסוס אנזימים ובדגירה בתנאים לחים. התקדמות אחרונה בחומרת עיבוד דגימות, שיטות טיפול בדגימות, חומרת רכישת נתונים, שימוש בתיוג סלקטיבי ועיבוד נתונים מאפשרים לאיסוף נתונים ב-MALDI-MSI להגיע לרזולוציהסלולרית 22,23. עם זאת, קיימים פשרות בין רזולוציה לבין אות לרעש ומגבלות מובנות המבוססות על שיטות הכנת דגימות קיימות עבור MALDI שיש לקחת בחשבון. יישומים מאוד ספציפיים כבר משיגים את היעד של MALDI-MSI חד-תאי באמצעות חידושים הן בעיבוד דגימות24 והן באלגוריתמים חדשניים, מה שמרמז על פתרונות כלליים לבעיות אלו בהישג יד, 25,26,27.

לאחר איסוף הנתונים, ניתן לצבוע את השקופית באמצעות H&E לצורך הערות היסטולוגיות. עם זאת, נזק תאים ורקמות קשור לאיסוף נתוני MALDI-MSI, ולכן אסטרטגיה זו מגבילה את היקף האנוטציה התאית. לחילופין, ניתן להשתמש בפרוסות רקמה רציפות לטיפול ב-H&E. אסטרטגיה זו מספקת נתונים באיכות גבוהה, אך דורשת יישור ואינטגרציה של חיתוכי דגימות בדידים.

ראוי לציין כי רקמות פרפין מקובעות בפורמלין (FFPE) מתאימות מאוד לניתוח גליקום על ידי MALDI-MSI עם שינויים קטנים בפרוטוקול להכנת דגימה13. עם זאת, רקמת FFPE אינה יכולה לשמש ביעילות למטבולומיקה ולניתוחים דומים, ולכן דגימות מוקפאות טריות, כפי שמפורט כאן, מועדפות לגישות מולטיאומיות28. הכנת דגימות היא מרכיב קריטי בכל צינור MSI לביומולקולות גמישות, מה שדורש גישות מיוחדות לאיסוף וטיפול בדגימות 17,29,30.

שיטות להרחבת הכלליות והשימוש הנרחב בגישות מבוססות MALDI-MSI מתקדמות במהירות עם שיפורים דרמטיים בחומרהובתוכנה. בנוסף, גישות מולטי-אומיות28 ומולטימודליות21 מתקדמות בשילוב עם למידת מכונה ובינה מלאכותית מבטיחות במיוחד לטיפול במערכי נתונים מורכבים אלו31.

גילויים

R.C.S., M.S.G. ו-C.W.V.K. הם מנהלים משותפים של המרכז למחקר ביומולקולות מרחבי מתקדם (CASBR) באוניברסיטת פלורידה והם ממייסדי Sugar3 LLC. R.C.S. קיבלה תמיכה מחקרית ו/או דמי ייעוץ מ-Maze Therapeutics. M.S.G. קיבלה תמיכה מחקרית, תרכובות מחקר או דמי ייעוץ מ-Maze Therapeutics, Valerion Therapeutics, Ionis Pharmaceuticals, PTC Therapeutics ו-Aro Biotherapeutics. M.S.G. הוא חבר במועצה המייעצת המדעית של קרן Hope, Glut1-Deficiency Syndrome של צ'לסי, וקרן מחלות גוף פוליגלוקוזן למבוגרים.

תודות

אנו מודים לחברי מעבדות ונדר קוי, סאן וג'נטרי על דיונים פורים. מחקר זה נתמך על ידי מענקי המכון הלאומי לבריאות (NIH) למתקן המשאבים המשותפים לרכש דגימות ביולוגיות ופתולוגיה תרגומית של מרכז הסרטן מרקי של אוניברסיטת קנטקי, P30CA177558 ל-D.B.A., R01AG066653, R01CA266004, R01AG078702, R01CA288696, RM1NS133593 ל-R.C.S., R35NS116824 ל-M.S.G., R01DC019054 ל-C.W.V.K. ולמכללת הרפואה של אוניברסיטת פלורידה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רפידת תחתית סופגתדנוויל סיינטיפיקB1623
אצטוניטריל (ACN)סיגמא-אלדריץ'34851-4X4L
נייר אלומיניוםפישר סיינטיפיק  15078292
אנידריקון ציטראקוניסיגמא-אלדריץ'125318
צינור קוני (15 מ"ל)אלקלי סיינטיCW5600
צנצנות קופליןDWK מדעי החיים900570
Cryostat לייקהCM1860
צ'אק קריוסטאטלייקה14041926491
דסיקטורבל ארטF424004131
דיאליזהתרמו פישר88400
אתנולפישר סיינטיפיק  22032601
מאדים למזוןRival CKRVSTLM21   
תוספת זכוכית (70 מ"מ)חברת ג'לLGI50
גליקוגןסיגמא-אלדריץ'G8876סטנדרט
פרוקסידאז חזרת (HRP)סיגמא-אלדריץ'P8125סטנדרט
מים ב-HPLCסיגמא-אלדריץ'270733-4X4L
מרסס HTXHTX טכנולוגיותM5
חומצה הידרוכלוריתפישר סיינטיפיק  A144-500
איזואמילאזמגאזייםאי-איסמי
משאבת קנאוארקנאוארP 4.1 S
להב פרופיל נמוךמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים63059-01
מדיום הרכבה M1אפרדיה1310
ספקטרומטר מסהברוקר דלטוניקסtimsTOF fleX
צינור מיקרופוג' (1.5 מ"ל)אלקלי סיינטיCN3016
מחטBD305109
פורמלין נייטרלי עם בופר NBFמיליפור סיגמאHT501128-4L
גז חנקןאיירגזNIUHP300
PBSפישר סיינטיפיק  SH30256. FS
צינורות PCRשותפי MedSupply62-1091-1
PNGase F PRIME-LY ULTRA ביוגרפיה של בולדוגNZPULT10LY
מעבדת SCiLSברוקר דלטוניקס1889000
שייקרתרמו-סיינטיפיק88882007
Slide   מדעי מיקרוסקופ אלקטרוני71873-02
שקופית דוארמוצרי RPI212620A
סוניקטור (ביורופטור פיקו)דיאגנודB01080010
מלקחיים סטרילייםDR InstrumentsS08098
סכין סטריליתWPIWPI-500240
מספריים סטרילייםכלי המדע המדויק14084-08
מזרק    גריינג'ר19G342
משאבת מזרקעידן חדשNE-300
קלטתפישר סיינטיפיק  15-901-R
מברשת צבע דקהאנזוס#00
חומצה טריפלואורואצטיתסיגמא-אלדריץ'T6508-1L
מיקס טיון, ESI ריכוז נמוךאג'ילנטG1969-85000
סירות משקולתסיגמא-אלדריץ'HS120882
קסילןסיגמא-אלדריץ'534056
α-ציאנו-4-חומצה הידרוקסיצינמית (CHCA)חברת קיימן כימיקלים15254

מקורות

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights. Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).
  3. Ouedraogo, R., Daumas, A., Capo, C., Mege, J. L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry is an accurate and rapid method to analyze different modes of macrophage activation. J Vis Exp. 82, e50926(2013).
  4. Khalil, S. M., Cappuccio, G., Li, F., Maletic-Savatic, M. Molecular imaging of human brain organoids using mass spectrometry. J Vis Exp. 211, e66997(2024).
  5. Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metab. 33 (7), 1404-1417 (2021).
  6. Aichler, M., Walch, A. Maldi imaging mass spectrometry: Current frontiers and perspectives in pathology research and practice. Lab Invest. 95 (4), 422-431 (2015).
  7. Conroy, L. R., et al. High-dimensionality reduction clustering of complex carbohydrates to study lung cancer metabolic heterogeneity. Adv Cancer Res. 154, 227-251 (2022).
  8. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
  9. Powers, T. W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry workflow for spatial profiling analysis of N-linked glycan expression in tissues. Anal Chem. 85 (20), 9799-9806 (2013).
  10. Drake, R. R., Powers, T. W., Norris-Caneda, K., Mehta, A. S., Angel, P. M. In situ imaging of N-glycans by MALDI imaging mass spectrometry of fresh or formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Curr Protoc Protein Sci. 94 (1), e68(2018).
  11. Stanback, A. E., et al. Regional n-glycan and lipid analysis from tissues using MALDI-MS imaging. STAR Protoc. 2 (1), 100304(2021).
  12. Hawkinson, T. R., Sun, R. C. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging of glycogen in situ. Methods Mol Biol. 2437, 215-228 (2022).
  13. Young, L. E. A., et al. In situ mass spectrometry imaging reveals heterogeneous glycogen stores in human normal and cancerous tissues. EMBO Mol Med. 14 (11), e16029(2022).
  14. Conroy, L. R., et al. Spatial metabolomics reveals glycogen as an actionable target for pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 2759(2023).
  15. Clarke, H. A., et al. Glycogen drives tumor initiation and progression in lung adenocarcinoma. Nat Metab. 7 (5), 952-965 (2025).
  16. Wallace, E. N., et al. An N-glycome tissue atlas of 15 human normal and cancer tissue types determined by MALDI imaging mass spectrometry. Sci Rep. 14 (1), 489(2024).
  17. Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. J Vis Exp. 166, e62008(2020).
  18. Mcdowell, C. T., et al. Imaging mass spectrometry and lectin analysis of N-linked glycans in carbohydrate antigen-defined pancreatic cancer tissues. Mol Cell Proteomics. 20, 100012(2021).
  19. Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nat Methods. 14 (1), 57-60 (2017).
  20. Colpaert, M., et al. Neurological glycogen storage diseases and emerging therapeutics. Neurotherapeutics. 21 (5), e00446(2024).
  21. Taylor, M. J., Lukowski, J. K., Anderton, C. R. Spatially resolved mass spectrometry at the single cell: Recent innovations in proteomics and metabolomics. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 872-894 (2021).
  22. Chan, Y. H., et al. Gel-assisted mass spectrometry imaging enables sub-micrometer spatial lipidomics. Nat Commun. 15 (1), 5036(2024).
  23. Lim, M. J., et al. Maldi Hiplex-IC: Multiomic and multimodal imaging of targeted intact proteins in tissues. Front Chem. 11, 1182404(2023).
  24. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J Am Soc Mass Spectrom. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  25. Rappez, L., et al. Spacem reveals metabolic states of single cells. Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  26. Grgic, A., Cuypers, E., Dubois, L. J., Ellis, S. R., Heeren, R. M. A. Maldi MSI protocol for spatial bottom-up proteomics at single-cell resolution. J Proteome Res. 23 (12), 5372-5379 (2024).
  27. Dressman, J. W., Bayram, M. F., Angel, P. M., Drake, R. R., Mehta, A. S. Single-cell multiomic MALDI-MSI analysis of lipids and N-glycans through affinity array capture. Anal Chem. 97 (24), 12493-12502 (2025).
  28. Clarke, H. A., et al. Spatial mapping of the brain metabolome, lipidome, and glycome. Nat Commun. 16 (1), 4373(2025).
  29. Juras, J. A., et al. In situ microwave fixation provides an instantaneous snapshot of the brain metabolome. Cell Rep Methods. 3 (4), 100455(2023).
  30. Cantrell, A. R., et al. Protocol for high-power, brain-focused microwave fixation to define rodent metabolism. STAR Protoc. 6 (2), 103794(2025).
  31. Ma, X., et al. An AI-driven framework to map the brain metabolome in three dimensions. Nat Metab. 7 (4), 842-853 (2025).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מיפוי גליקוםדימוי באמצעות ספקטרומטריית מסותMALDI MSIגליקנים מקושרים ל-Nלוקליזציה של גליקוגןעיכול אנזימטי של רקמהגליקומיקה של כבד עכבראנזימים פעילים על פחמימותהטרוגניות גליקומיקה מרחבית
הדמיה מולקולרית מרחבית של הגליקום באמצעות ספקטרומטריית מסה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.