מאמר שיטה

שיטות מהדק דינמי לחקירת ריגוש עצבי לקוי הקשור לאוטיזם

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69155

⸱

17 באוקטובר 2025

 , 
1Department of Biology, Miami University

במאמר זה

סיכום

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק דינמי יכולה לבסס קשרים סיבתיים בין ליקויים בירי עצבי לתפקוד לקוי של תעלת יונים. אנו מתארים שיטות ופרוטוקולים של מהדק דינמי בנוירונים של פורקינג'ה במוח הקטן של העכבר, תוך ציון משאבים שימושיים ושיקולים טכניים. במחקר מייצג, אנו מוסיפים מוליכות נתרן מעוצבת לנוירונים Tsc1-/- Purkinje כדי להציל ירי חוזר.

תקציר

הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) נובעת ממגוון רחב של גורמים גנטיים וסביבתיים. בעוד שמוטציות רבות הקשורות לאוטיזם משבשות את התפתחות הסינפסות או הפלסטיות, הוכח כי מספר הולך וגדל משנה את הביטוי והתפקוד של תעלות יונים מגודרות מתח, וכתוצאה מכך ליקויים בריגוש הפנימי העצבי. ניתן להשתמש בהקלטות מהדק מתח של תא שלם כדי לאפיין כיצד מוטציות הקשורות ל-ASD משפיעות על תפקוד תעלת היונים. עם זאת, ניסויים אלה אינם מצליחים להעריך ישירות כיצד מוליכות יונית משתנה משפיעה על ירי פוטנציאלי של פעולה עצבית. אלקטרופיזיולוגיה של מהדק דינמי מגשרת על פער זה על ידי מתן אפשרות הזרקה בזמן אמת של מוליכות יונית המוגדרת על ידי המשתמש לנוירונים חיים. זה מאפשר בדיקה סיבתית של האופן שבו שינויים בתכונות תעלת היונים משפיעים על הפעילות החשמלית של סוג תא נתון. במאמר שיטות זה, אנו מתארים כיצד ליישם אלקטרופיזיולוגיה של מהדק דינמי בנוירונים של עכבר פורקינג'ה בוגר שתועדו בתנאים פיזיולוגיים בפרוסות מוח מוח מוכנות בצורה חריפה. נוירוני פורקינג'ה הם מודל רלוונטי במיוחד לעבודה זו מכיוון שיש להם יכולת מהותית לירות פוטנציאל פעולה חוזר ונשנה בתדר גבוה (20-100 הרץ) והם מעורבים באופן עקבי בתפקוד לקוי של מעגל המוח הקטן הקשור לאוטיזם. אנו מתמקדים ב-Tsc1, גן שמוטציות אובדן התפקוד שלו הן בין הגורמים המונוגניים השכיחים ביותר לאוטיזם. בתאי עצב של עכברים, מחיקת Tsc1 נקשרה גם לביטוי תעלת נתרן מגודרת מתח (Nav) מופחתת. אנו משתמשים במודלים של מצב קינטי מרקוב כדי לדמות ולשחזר תכונות מוליכות Nav של נוירון פורקינג'ה וממשיכים להשתמש במהדק דינמי כדי להעריך ישירות כיצד שינויים במוליכות ה-Nav משפיעים על הירי הפנימי של נוירונים שלמים של Purkinje במוח הקטן. אנו מספקים הוראות ומשאבים לשינוי וכוונון מודלים של מוליכות יונית. על ידי שילוב מודלים של מוליכות יונית, מהדק דינמי וטכניקות מהדק טלאי קונבנציונליות, גישה זו מספקת מסגרת רבת עוצמה וגמישה לקישור הפרעות גנטיות לתוצאות פיזיולוגיות בנוירונים הרלוונטיים לאוטיזם.

מבוא

מחקרים קודמים על המניעים המולקולריים והתאים של הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) הדגישו לעתים קרובות תפקוד לקוי של סינפטי כמרכזי לפתופיזיולוגיה של ההפרעה 1,2. מחקרים רבים הדגימו צפיפות סינפסה מעוררת מוגברת 2,3,4, פגיעה בגיזום סינפטי5 ושינויים בחלבוני צפיפות פוסט-סינפטית 6,7 במודלים של ASD. עם זאת, מחקרים אחרונים הראו כי שינויים בריגוש העצבי הפנימי הם גם מניעים לפתולוגיה של ASD. לדוגמה, מודלים של עכברים טרנסגניים של ASD וקווי תאים שמקורם בחולה חשפו פגיעה ביצירת פוטנציאל פעולה לקוי ב-Purkinje 8,9,10 ובקליפת המוח הנוירונים הפירמידליים11, כמו גם ריגוש דנדריטי מוחלש ואינטגרציה סינפטית בתת-מחלקות של נוירונים פירמידליים בקליפת המוח12. תעלות הכוללות מוטציות של אובדן תפקוד ב-SCN2A, המקודדות את תת-היחידה α היוצרת נקבוביות של תעלת הנתרן (Nav) Nav1.2, היא כיום גורם מונוגני ידוע ל-ASD13, והוכח כגורם לליקויים בריגוש הפנימי של סוגים שונים של נוירונים מרכזיים 14,15,16,17. ככל שחקירות מסוג זה מתקדמות, חשוב לבסס קשרים סיבתיים בין שינויים פתוגניים במוליכות יונית לבין ההשפעות של שינויים אלה על תפקוד הנוירונים והמעגלים. אלקטרופיזיולוגיה של מהדק דינמי מספקת גישה יעילה למשימה זו. Sharp et al. (1992 and 1993)18,19, יחד עם Robinson and Kawai (1993)20 תיארו בתחילה שיטות מהדק דינמיות שבהן מוליכות יונית לא ליניארית מדומה, עם או בלי תכונות תלויות מתח, מוזרקת/מתווספת לנוירונים חיים, מה שמאפשר לחוקרים להעריך בזמן אמת כיצד המאפיינים או השינויים המשוערים במוליכות יונית מגודרת מתח משפיעים על ירי עצבי21, 22.

היישום של ניסויי מהדק דינמי הוקל על ידי מספר מערכות תוכנה זמינות בחינם כגון RTXI23, QuB 24,25 ו-StdpC26; עם זאת, ההתקדמות האחרונה פשטה את מימוש המהדק הדינמי עם מערכות הכנס-הפעל מסחריות המאפשרות לפתח, לשנות וליישם מוליכות מודלים במחשב יחיד ובתוך חבילת תוכנה אחת. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע מהדק דינמי באמצעות מערכת Sutter dPatch27 ומספקים חקירה מדגמית בה אנו בודקים כיצד המחיקה הממוקדת של טרשת שחפת 1 (Tsc1)9, המהווה מוקד שכיח של מוטציות עבור ASD28, משפיעה על הירי הפנימי של נוירוני פורקינג'ה המוח הקטן כתוצאה משינויים בביטוי מוליכות הנתרן מגודרת המתח8.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מיאמי (פרוטוקול #1044). הניסויים השתמשו בעכברי C57BL/6J זכרים ונקבות וקווים טרנסגניים עם רקע זן C57BL/6J. עבור ניסויים אלקטרופיזיולוגיים, בעלי חיים היו בגיל 6-7 שבועות. כל ההקלטות נלקחו מנוירונים של פורקינג'ה באונות 5, 6 או 7 בוורמיס המוח הקטן.

1. התקנה והכנת רקמות לניסויי מהדק טלאי נוירון פורקינג'ה

  1. הכן 1 ליטר של נוזל עמוד שדרה מוחי מלאכותי (ACSF) המכיל: 125 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 1.25 מ"מ NaH2PO4, 25 מ"מ NaHCO3, 2 מ"מ CaCl2, 1 מ"מ MgCl2 ו-25 מ"מ דקסטרוז ב-pH 7.4 (~300 mOsM/L). הכינו גם 250 מ"ל של 'תמיסת חיתוך' המכילה: 240 מ"מ סוכרוז, 2.5 מ"מ KCl, 1.25 מ"מ NaH2PO4, 0.5 מ"מ CaCl2 ו-7 מ"מ MgCl2. זרזיף (בועה) ACSF ותמיסות חיתוך עם גז קרבוגן (95% O2/5% CO2) למשך 20 דקות לפחות לפני השימוש וברציפות לאורך כל הניסויים.
  2. הכן תא אחיזה של פרוסת מוח מלא ב-ACSF לשימוש מאוחר יותר. ודא שפרוסות המוח הקטן (לאחר הוספתן לתא הפרוסות) שקועות כששני צידי פרוסות המוח הקטן חשופות ל-ACSF. השג זאת על ידי הנחת פרוסות שקועות על רשת ניילון מתוחה היטב שגם היא שקועה.
  3. הכן את עמדת הניתוח. הכינו ארבע פיסות סרט שישמשו להצמדת החיה המורדמת. בדלי או בתבנית קרח מלאים בקרח, הניחו את החצי התחתון של צלחת פטרי לתוך הקרח כשהקירות פונים כלפי מטה ותחתית צלחת הפטרי כלפי מעלה. מניחים נייר סינון (≥3 ס"מ) על תחתית צלחת הפטרי ורווים ב 2-3 מ"ל של תמיסת חיתוך.
    הערה: עבור הניסויים המתוארים, ויברטום דחיסה משמש לפרוסת 350 מיקרומטר של המוח הקטן הפרסגיטלי. עם הדחיסה, רקמה לחיתוך מודבקת לצינור דגימה מפלסטיק שנכנס דרך צינור מתכת דק שמסביב. במהלך החיתוך, צינור הדגימה נדחף דרך צינור המתכת, שנשאר קבוע. לאחר הדבקת הרקמה לצינור הדגימה, הרקמה מוטמעת באגרוז מחומם של 2%. להב הדחיסה מודבק על מחזיק קבוע, המחובר לזרוע הוויברטום. סוגים אחרים של ויברטומות אינם דורשים הטמעת רקמה באגרוז מחוממת, אך אמורים לעבוד באופן דומה עבור הניסויים המתוארים.
  4. כמו כן, בקרח, הניחו סכין גילוח חד פיפיות וכוס קטנה (10 מ"ל) מלאה בתמיסת חיתוך. שמור על בלוק צינון, המשמש לקירור מהיר של האגרוז המחומם לאחר הוספתו לצינור הדגימה, כמו גם מזרק של 30 מ"ל מלא בתמיסת חיתוך מקורר על הקרח. ודא שהמזרק של 30 מ"ל מחובר לקטע של 30-60 ס"מ של צינור תוך ורידי (IV) (באמצעות מתחדד זכר Luer lock) המחובר (בקצה המסיים) למחט (≥ 26 G) עם בסיס נקבה של Luer lock.
  5. הכניסו את תמיסת החיתוך הנותרת למקפיא של -80 מעלות צלזיוס. לאחר שתמיסת חיתוך זו הופכת לעקביות קרח (20-25 דקות), הוציאו מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס והניחו על קרח.
  6. יש להרדים עכבר בוגר בן 5-8 שבועות עם זריקה תוך-צפקית של 1 מ"ל/ק"ג משקל בעלי חיים של קוקטייל קטמין (10 מ"ג/מ"ל)/קסילזין (0.25 מ"ג/מ"ל).
  7. הכינו תמיסת אגרוז של 2% על ידי המסת 0.5 גרם אגרוז ב -25 מ"ל תמיסת חיתוך. לאחר הרדמת החיה (אינה מגיבה לצביטה בבוהן), מחממים את תמיסת האגרוז 2% (~30 שניות במיקרוגל) ומעבירים את תמיסת האגרוז המחוממת לאמבט מים של 40 מעלות צלזיוס.
    הערה: יש להשלים בדחיפות את השלבים הממוספרים 1.8-1.18 ולפני שהאגרוז המחומם מתמצק.
  8. הצמד את איברי החיה לשולחן הניתוחים בעזרת סרט. בעזרת מספריים, פתח את חלל בית החזה של החיה, וודא שהריאות ואיברי הבטן לא נחתכים. השתמש במלקחיים נעילה או המוסטטים כדי להחזיק את כלוב הצלעות פתוח, ולחשוף את הלב. כדי להשיג זאת, נעלו את המלקחיים על עצם החזה והניחו אותם בזהירות לכיוון החלק הקדמי של החיה (עם חורי אצבעות הכלי ליד ראש החיה).
  9. הכנס את המחט המחוברת למזרק 30 מ"ל לחדר השמאלי והשתמש במלקחיים כדי לדחוס את הרקמה סביב המחט, תוך החזקת המחט בתוך החדר התוך חדרי השמאלי. בעזרת מספריים כירורגיים, בצע חתך קטן באטריום הימני והחדיר במהירות את החיה עם 25 מ"ל של תמיסת חיתוך צוננת.
    הערה: ודא שהפרפוזה נכנסת לחדר השמאלי ויוצאת מהפרוזדור הימני, ומנקה דם ממערכת הדם של החיה.
  10. בסיום הזלוף, ערפו במהירות את ראשו של בעל החיים וחתכו את הקרקפת לאורך קו האמצע של הראש לכיוון הברגמה כדי לחשוף את פני הגולגולת.
  11. בעזרת מספריים, הסר רקמת חיבור מההיבט האחורי של הגולגולת, והסר רקמת חוט שדרה עודפת, וודא שחוט השדרה אינו בולט מהנקב מגנום.
  12. הנח להב מספריים אחד בפורמן מגנום וחתך לאורך היקף הגולגולת בשני ההיבטים הטמפורליים לכיוון ברגמה, והשאיר מעט רקמת גולגולת במקומה בברגמה.
  13. הנח להב מספריים או חצי מלקחיים עדינים לתוך הנקב מגנום והרם בצורה עליונה, תוך הפרדת הגולגולת מהמוח. היזהר לא לדחוף את להב המספריים או המלקאי לתוך המוח בזמן הרמת הגולגולת.
  14. השתמש בכלי כירורגי מרית כדי לגרוף מתחת למוח (מהחלק הקדמי) והסר בזהירות את המוח לתוך של 10 מ"ל המכילה תמיסת חיתוך מקוררת, תוך הקפדה על הגנה על המוח הקטן בזמן העברת המוח. החלף לכפפות נקיות בשלב זה.
  15. הוציאו בזהירות את המוח מהכוס (באמצעות כלי המרית) והניחו אותו על נייר הסינון (על צלחת פטרי). השתמש בלהב בעל פיפיות כדי לחתוך לאורך הציר הפרסגיטלי כמה מילימטרים מקו האמצע. השליכו את הרקמה הקטנה יותר של חתך פרסגיטלי. בצע חתך קורונלי שני באמצע המוח הקדמי (קדמי למוח הקטן). השליכו את הרקמה החתוכה בעטרה שקדמית למוח הקטן.
  16. החלק את הלהב בעל הקצה היחיד מתחת לחלק הקדמי של המוח הקדמי והרם על מנת לסובב את הרקמה הנותרת כך שהצד של החיתוך הפרסגיטלי הראשוני פונה כלפי מטה (על נייר המסנן) וחצי הכדור המוחי הלא חתוך פונה כלפי מעלה.
  17. הנח את צינור הדגימה זקוף בקרח והוסף שכבה דקה של דבק-על (דבק ציאנואקרילט) על משטח הצינור. בעזרת כלי מרית עם כיפוף של 90 מעלות, העבירו בזהירות את רקמת המוח מנייר הסינון אל פני צינור הדגימה, תוך שמירה על כיוון הרקמה. ודא שחצי הכדור המוחי הלא חתוך ממשיך להיות פונה כלפי מעלה. לאחר שהרקמה מונחת/מודבקת על צינור הדגימה, החלק את צינור המתכת כלפי מעלה כך שהוא יקיף את רקמת המוח.
  18. בעזרת פיפטה ממונעת של 10 מ"ל, מלאו את צינור הדגימה באגרוז המחומם (הטמעת רקמת המוח). יש לקרר במהירות את הרקמה (המוטמעת כעת באגרוז מחומם) על ידי הידוק גוש הקירור סביב צינור המתכת למשך ~30 שניות.
  19. הנח את צינור הדגימה בתא האמבטיה של הוויברטום ומלא את האמבטיה בתמיסת החיתוך השפוכה. יש לזרוק ברציפות את תמיסת החיתוך במהלך חיתוך רקמת המוח, אך אל תחשוף ישירות את פרוסות המוח הקטן לבועות גז.
  20. חותכים פרוסות פרסגיטליות של 300-350 מיקרומטר, ומעבירים מיד כל פרוסה לתא החזקת הפרוסות, מלא ב-ACSF בטמפרטורת החדר. לאחר שכל הפרוסות נמצאות בתא הפרוסות, דגרו את תא הפרוסות באמבט מים של 33 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות.
  21. לאחר 25 דקות באמבט המים, הנח את תא הפרוסות (שוב) בטמפרטורת החדר, המתן לפחות 35 דקות נוספות לפני שתנסה להקליט טלאים מכל אחת מפרוסות המוח הקטן.

2. הגדרת מודל מוליכות מבוסס מרקוב במהדק דינמי

הערה: מהדק דינמי הוא יישום בזמן אמת של מוליכות מעוצבת על תא חי. מתח הממברנה נרשם/נדגם באמצעות אלקטרודה חדה או טלאי, והאות הדיגיטלי נשלח לתוכנת מהדק דינמי, המחשבת, באמצעות מודל/י המוליכות היונית המיושמים, את הזרקת זרם המהדק הדינמי המתאים למתח הדגימה. אות הזרקת זרם המהדק הדינמי המחושב נשלח למגבר ולדרגת הראש להזרקה (באמצעות אלקטרודה) לתא. כדי שמוליכות מעוצבת תתווסף כראוי לתא שיורה פוטנציאל פעולה, המניע שינויים חולפים מהירים במתח הממברנה, תדר דגימת המתח חייב להיות גבוה מספיק, והעיכוב בין דגימת המתח להזרקת זרם המהדק הדינמי (המכונה לפעמים חביון) צריך להיות מינימלי וקבוע29.

  1. לפני כל ניסוי מהדק דינמי, פתח או השג את המודל המתמטי עבור המוליכות היונית שישמשו בניסוי המהדק הדינמי. מודלים אלה יכולים להיות בצורה של מודל מצב קינטי מרקוב, מודל הודג'קין-האקסלי (HH) או מוליכות פסיבית (ליניארית). ודא שמודל המוליכות הנבחר משחזר במדויק את המאפיינים הקינטיים ותלויי המתח של המוליכות היונית המיועדת.
    הערה: נסיינים עשויים לאשר את המאפיינים של מוליכות יונית מודלית, לפני השימוש בניסויי מהדק דינמי, על ידי בדיקת המוליכות המודלית (בסיליקו) במחקרי סימולציה של מהדק מתח. מאפיינים ושיקולים חשובים של מודלים של מצב קינטי מרקוב ומוליכות HH מתוארים בסעיף הדיון. השלבים שלהלן מתארים הגדרת מודל מוליכות מרקוב בתוכנת מהדק דינמי.
  2. צור או השג דיאגרמת מעבר מצב מרקוב עבור מודל המוליכות שישמש בניסויי מהדק דינמי. השתמש בתרשים זה כדי להרכיב במדויק את מודל המוליכות של מרקוב בתוך תוכנת המהדק הדינמי (המתואר להלן).
    הערה: SutterPatch היא תוכנת רכישת הנתונים של dPatch ampliifier. ניתן לבצע ניסויי מהדק דינמי בתוך התוכנה, המאפשרים הרכבה ויישום של מוליכות מודלים באמצעות הזרקת זרם במהלך פרוטוקולי מהדק זרם. דיאגרמת מעבר מצב מרקוב עבור מוליכות נתרן מגודרת מתח מודל, המבוססת על מדידות זרם ניווט מנוירונים של עכבר, מוצגת באיור 1A. מודל זה פותח על ידי Ransdell et al., 202230 ושימש לחקירת תפקידם של רכיבי זרם הנתרן המתמידים והמתחדשים בירי נוירון פורקינג'ה31. מצבי השער (C, IC, IF, IS ו-O) קשורים זה בזה על ידי קבועי קצב מעבר, המסומנים על ידי משתנים (כלומר, S0, S3, S1, S4). מודל זה משמש בניסויי המהדק הדינמי המייצגים, והוא זמין להורדה ב-GitHub: https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa.
  3. בתוכנת רכישת הנתונים, פתח את חלון Dynamic Clamp Editor מהכרטיסייה SutterPatch > Dynamic Clamp Editor או על ידי לחיצה על הסמל המתאים בחלון לוח המחוונים . חלקים מהדינמי clamp חלון עורך מוצגים באיור 1B.
    הערה: Dynamic Clamp חלון עורך מכיל את כל ההגדרות הדרושות להחלת המוליכות המעוצבת במהלך זרם-clamp פרוטוקול הקלטה. ממשק מאגר המוליכות (איור 1B, משמאל למעלה) מאפשר למשתמשים לארגן ולטעון בו זמנית קבוצות של מוליכות מודל.
  4. בממשק מאגר המוליכות (איור 1B, משמאל למעלה), צור מאגר על ידי לחיצה על חדש ומתן שם לו כרצונך. לאחר בחירת מאגר מוליכות, בצד ימין של החלון בממשק בורר Headstage (איור 1B, משמאל למטה), בחר את סוג הדגם עבור מאגר המוליכות המתאים (דגם- מרקוב, הודג'קין-האקסלי, מוליכות משתנה וכו') ומתי יש ליישם את מוליכות המודל, כגון במהלך שגרה/פרוטוקול (מצב פעיל). ממשק בורר ה-Headstage מאפשר גם בחירה של הדינמי clamp קצב עדכון (בקילו-הרץ) וכרךtagמקור אות (ראה איור 1B, מימין). עבור מקור אות מתח, בחר את ה-headstage שמקליט את אות המתח.
  5. בלוח בורר Headstage, עבור הדוגמה מודל מרקוב מוליכות ניווט (איור 1A), בחר דגם מרקוב עבור דגם, במהלך טאטאות עבור מצב פעיל, 200 קילו-הרץ עבור קצב עדכון, ו-Headstage 1 עבור מקור אות מתח. בדוק את אות היישום והפקודה ל- AuxOUT1 כדי ליזום חישובי מודל בתגובה לאות המתח ולהוסיף הזרקת זרם מהדק דינמי לכל פרוטוקול מהדק זרם, בהתאמה (איור 1B, משמאל למטה).
  6. מתחת ללוחות הראשיים של Dynamic Clamp Editor נמצאת מטריצת המצב (איור 1C, למטה). ערוך את מטריצת המצב על ידי לחיצה תחילה על ערוך פרמטרים של מודל בממשק בורר Headstage (איור 1B, משמאל למטה). חלון חדש יופיע לצד העורך בשם Dynamic Clamp Markov Model Parameters. בפאנל זה, הזן את משוואות מטריצת המצב המייצגות את מוליכות מודל מרקוב.
  7. בחלונית הגדרות ערוץ (איור 1B, מימין למעלה), בחר אילו דגמי מוליכות שמורים יש להחיל (ב-clamp דינמי). לחלופין, בחר ערוץ ריק והתחל ליצור מוליכות מודל חדשה. בצד ימין של לוח זה, הזן את היפוך V (פוטנציאל היפוך יוני מוליכות מעוצב). עבור המחקר שלנו המשתמש במוליכות נתרן, הזן 55.0 mV כדי לשקף את פוטנציאל ההיפוך של נתרן בהתבסס על ה-ACSF והתמיסה הפנימית של התיקון-אלקטרודה.
  8. גם בחלונית הגדרות ערוץ , ספק את מספר המצבים הקינטיים של המוליכות שנבחרה (ראה איור 1B, מימין למעלה, תיבה אדומה). כאן, הזן 9 כדי לשקף את 9 המצבים הקינטיים של המוליכות המעוצבת (ראה איור 1A).
  9. מתחת לחלונית 'הגדרות ערוץ ' נמצאת החלונית 'משוואות מצב' . מקם את משוואות קבועות קצב המעבר של המצב כראוי במטריצת מצב השער כדי לשקף את הסידור הטופולוגי של מודל מרקוב. הזן את המשוואות לתוך לוח משוואות המצב וספק מזהה, החל מ- "S0" (איור 1B, באמצע).
    הערה: הסדר שבו משוואות אלה מוזנות אינו חשוב, כל עוד משתנים אלה מאוכלסים כראוי במטריצת מצב השער כדי לשקף את הטופולוגיה של מודל מרקוב.
  10. כדי לאכלס את מטריצת מצב השער במשתני קבועי הקצב המוגדרים כעת, לחץ על עריכת מטריצת מצב בצד ימין של לוח משוואות המצב (איור 1B, באמצע). לכל מצב קינטי ניתן מספר, המתחיל ב-0. לדוגמה, עבור מודל מצב דו-קינטי, המכיל את המצבים X ו-Y, מצבים אלה ייקראו "0" ו-"1" ויכללו שני קבועי קצב מעבר a1 ו-b1, כאשר a1 עובר מ-0 ל-1, ו-b1 עובר מ-1 ל-0.
  11. כדי לחבר כראוי משוואות אלה באמצעות עורך מטריצת המצב (איור 1B, למטה), הזן את קבועי הקצב לטבלה המכילה שורות ועמודות ממוספרות, שתיהן מתחילות ב- 0 (ראה דוגמה באיור 1C).
    הערה: התנועה ממצב אחד למשנהו נקבעת לפי מיקומם בטבלה זו בצורה "שורה לעמודה". לדוגמה, בדוגמה של מודל שני מצבים בשלב 2.1, המעבר ממצב 0 למצב 1 מסתמך על קבוע הקצב "a1" שממוקם לאחר מכן בשורה 0, עמודה 1. קבוע קצב המעבר "b1" מניע מעברים ממצב 1 למצב 0, ולכן יש למקם את קבוע הקצב בשורה 1, עמודה 0. באיור 1C, למטריצת מצב השער לדוגמה יש קבועי קצב המשקפים את הטופולוגיה של מודל מוליכות ה-Nav המוצגת באיור 1A. לדוגמה, "S0" הוא קבוע הקצב המגדיר מעברים מה-IC1 למצב הקינטי IC2; לפיכך, "S0" ממוקם בשורה 0, עמודה 1 של מטריצת מצב שער (איור 1C). משוואות קבועות קצב המעבר המגדירות את המשתנה של כל קבוע קצב מאכלסות לאחר מכן מטריצת מצב מלא (איור 1C, למטה).
  12. כאשר משוואות קבועי הקצב מחוברות דרך פאנל עורך מטריצת המצבים, החיבורים (השורה והעמודה המתאימות) יאכלסו את לוח החיבורים ליד המשוואה (איור 1B, ימין אמצעי). שימו לב למצב הפתוח/מוליך במודל מוליכות הנתרן המייצג (איור 1A), שנוסף לשורה ולעמודה 7 באיור 1C (למעלה, תיבות אדומות), שהוא חשוב לשלב הבא.
  13. באיור 1B (למטה מימין), השתמש בפאנל משוואות מוליכות (nS) כדי להגדיר את משרעת מוליכות המודל שתושם במהלך מהדק דינמי. בחר את המצבים הפתוחים/מוליכים במודל מרקוב וספק ערך מוליכות (איור 1B, תיבה אדומה תחתונה).
  14. עבור ניסוי זה, הזן "400 nS" לתיבה "G7", המוסיפה ערכי זרם ניווט שיא הדומים לשיא זרמי הניווט הנמדדים במחקרי מהדק מתח על נוירוני פורקינג'ה של עכברים.
  15. לאחר השלמת השלבים לעיל, לחץ על טען כדי להכין את המודל ליישום מהדק דינמי לאחר הפעלת שגרת מהדק זרם.
  16. השתמש בתהליך דומה כדי לסדר דגמי HH; עם זאת, הוסף משוואות להגדרת מצבי שער בלתי תלויים ( במשוואות שער) ומוליכות תחת מקסימום G.
  17. כדי להחיל מוליכות מהדק דינמית, צור תחילה שגרת מהדק זרם באמצעות עורך השגרה (לחץ על הכרטיסייה SutterPatch > עורך השגרה) (איור 1D). ליצירת שגרת הידוק זרם, בחר בערוץ פלט אב (שהוא StimOut1 בדוגמה זו). פעולה זו תפתח פאנל המאפשר למשתמש להגדיר את פלט הפקודה הנוכחית במהלך השגרה. ודא שמצב הקלטה מוגדר ל-CC_Mode בעורך השגרות.
    הערה: בניסויים המייצגים, מכיוון שפרוטוקול זה עובד עם תאים יורים באופן ספונטני, נעשה שימוש בשגרה/פרוטוקול מהדק זרם נטול פערים עם הזרקת זרם אפס.
  18. בערוצי הקלט של עורך השגרה (איור 1D, מימין למעלה), הגדר אותות קלט, אשר, במהלך הניסויים, יאכלסו את חלונות ההיקף המוקלט. כניסות אלו חייבות לכלול אות מתח, ולכלול גם את הזרקת זרם הפקודה של השגרה, כמו גם את הזרקת זרם המהדק הדינמי, הנקראת Current1 ו-AuxIN1, בהתאמה (איור 1D, משמאל למטה).
  19. עבור שגרות מהדק זרם הכוללות פקודות הזרקת זרם חיובי ו/או שלילי, אות הזרקת זרם הפקודה ישולב אוטומטית עם אות זרם המהדק הדינמי. צור חלון היקף וירטואלי כדי להחסיר את אות זרם הפקודה כך שיהיה תיעוד של הזרקת זרם המהדק הדינמי המבודד. כדי ליצור את חלון ההיקף הווירטואלי החדש, בחר תחילה ערוץ קלט נוסף על-ידי בחירה בתיבת הסימון וירטואלי1.
  20. בתוך עורך השגרה, תחת סוג מתמטי, בחר משוואה ובחר (תחת ערוץ מקור) את אות קלט הפקודה של שגרת מהדק הנוכחי, שבדוגמה זו הוא Current1. הזן משוואה בשדה הפתוח כדי להחסיר את אות הפקודה של מהדק הזרם מאות הזרקת זרם המהדק הדינמי.
    הערה: בניסוי לדוגמה זה, זה נעשה עם המשוואה t[3]-t[2]. חלון ההיקף של Virtual1 מציג כעת את הזרקת זרם המהדק הדינמי (מבודד מאותות הפקודה הנוכחית). למשתמשים יש את היכולת להתאים אישית את התוויות של ערוצי קלט או פלט על ידי לחיצה כפולה תחת תווית.

3. רכישת הקלטות מהדק זרם מנוירונים של עכבר Purkinje בפרוסות מוח מוחי פרסגיטלי

  1. ציידו את מתקן האלקטרופיזיולוגיה בתא פרוסות רקמה (כוח הכבידה) המשולב ב-ACSF המחומם לטמפרטורה קרובה לפיזיולוגית (34-36 מעלות צלזיוס). הנח בזהירות פרוסת מוח קטן פרסגיטלי לתוך תא הפרוסות והשתמש בנבל פרוסה כדי לשמור על פרוסת המוח הקטן במצב שקוע וקבוע. ודא כי אלקטרודה קרקעית כלורידית ובדיקת טמפרטורה שקועים ויציבים גם בתוך תא פרוסות המוח הקטן.
  2. אתר את שכבת הנוירונים של פורקינג'ה באמצעות עדשת אובייקט טבילה פי 40. נוירוני פורקינג'ה גדולים וצורת דמעה. קרום הפלזמה של תאי פורקינג'ה בריאים נראה בדרך כלל חלק, והגרעין אינו נראה.
  3. לאחר זיהוי נוירון פורקינג'ה בריא וממוקד להקלטת מהדק טלאי, כוונן את עדשת המטרה של המיקרוסקופ כלפי מעלה. מקם והתמקד בקצה של מיקרו-אלקטרודה מזכוכית המחוברת למחזיק אלקטרודה ולבמת הראש. שלוט ב-headstage/microelectrode על ידי מיקרומניפולטור רובוטי בעל 3 צירים.
    הערה: עבור ניסויים אלה, ודא שלמיקרואלקטרודות יש ערכי התנגדות של 2-4 MΩ והן מלאות בתמיסה פנימית מתאימה של זרם-clamp. התמיסה הפנימית המשמשת בניסויים מייצגים מכילה: 144 מ"מ K-גלוקונאט, 0.2 מ"מ EGTA, 3 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ HEPES, 8 מ"מ NaCl, 4 מ"מ Mg-ATP ו-0.5 מ"מ Na-GTP.
  4. לפני התקרבות לנוירון המטרה Purkinje, הוסף 2-3 מ"ל של לחץ אוויר חיובי ליציאת הלחץ של מחזיק האלקטרודה.
  5. עבור למצב VC במגבר לוח הבקרה והחל פיצוי אלקטרודה ופונקציות היסט מתח אלקטרודה. בדוגמה כאן, עשה זאת על ידי לחיצה על אוטומטי לצד אפשרויות פיצוי האלקטרודה והיסט המתח.
  6. התחל פרוטוקול בדיקת איטום ממברנה רציף (לחץ על בדיקת ממברנה). הגדר את פרמטרי בדיקת הממברנה ב-5 אלפיות השנייה (או קרוב לכך) עם צעד של 5 mV או 10 mV. הגדר את פוטנציאל ההחזקה (החזקת V) ל-0 mV.
  7. הזז את המיקרו-אלקטרודה לכיוון תא המטרה, והתאם את מישור המוקד כדי לשמור על מיקוד בקצה האלקטרודה או מעט מתחתיו. מקם את האלקטרודה מעט מעל קרום הפלזמה של התא הממוקד. השתמש במיקרומניפולטור ובלחץ חיובי מקצה האלקטרודה כדי לדחוף פסולת חוץ-תאית מסומת תא המטרה, 'לנקות' את קרום פני השטח.
  8. לאחר שתא המטרה נקי מפסולת חוץ-תאית, מקם לאט את האלקטרודה ליד פני הממברנה בקצה הרחב של סומת הנוירון פורקינג'ה, שממנה משתרע האקסון מגוף התא. כאשר קצה האלקטרודה מוריד לממברנה, סביר להניח שגומה תיראה על פני הממברנה (בגלל הלחץ החיובי של האלקטרודה). בשלב זה, שחרר את הלחץ החיובי והשתמש ביניקת פה כדי להפעיל כמות קטנה של לחץ שלילי.
  9. בלוח הבקרה של Amplifier , שנה את פוטנציאל החזקת ה-V ל-80 mV (מ-0 mV). ניטור בדיקת איטום הממברנה, כאשר התנגדות הפיפטה משיגה ≥ 1 GΩ, הגדל את הלחץ השלילי ולחץ על פונקציית Zap בלוח בדיקת איטום הממברנה כדי לקרוע את הממברנה ולהשיג תצורת מהדק תיקון של תא שלם.
  10. השתמש בפרוטוקול קצר של מהדק מתח כדי למדוד מאפיינים פסיביים של הממברנה (ערכי קיבול והתנגדות כניסה) לפני המעבר, דרך המגבר לוח הבקרה לזרם-clamp מצב.
  11. לאחר המעבר למצב מהדק זרם, החל פיצוי איזון גשר עד ≥ 70%.
  12. לפני החלת מוליכות מהדק דינמית עם אלקטרודת תיקון, תקן את שגיאת פוטנציאל הצומת (המחושבת על סמך הרכב האלקטרודה הפנימית ותמיסות ACSF). עבור הפתרונות בניסויים המייצגים, החל תיקון פוטנציאל צומת של 17.5 mV. במחקרי מהדק דינמי, תיקון פוטנציאל צומת מדויק הוא קריטי כך שאות מתח מדויק משמש על ידי מודל/ים מוליכות לחישוב הזרקות זרם מהדק דינמיות.

4. יישום מוליכות המהדק הדינמית

  1. מכיוון שתאי העצב של פורקינג'ה יורים פוטנציאל פעולה חוזר ונשנה באופן ספונטני, רשמו את תכונות הירי לפני הוספה (או חיסור) מוליכות יונית מעוצבת כדי לבחון את בריאות התא ולמדוד את המאפיינים הבסיסיים של ריגוש הממברנה. החל את המוליכות המעוצבת על ידי לחיצה על טען ב-Dynamic Clamp חלון הגדרות. תווית DynC קטנה תהיה גלויה כעת בבקר dPatch, עם כיסוי CC (ראה איור 1D, תיבות אדומות).
  2. לאחר הפעלה/טעינה של המהדק הדינמי, מוליכות המהדק הדינמית מוחלת אוטומטית בזמן ששגרה/פרוטוקול מהדק זרם פעיל. View הזרקת זרם המהדק הדינמי בחלון ההיקף המתאים לאות הכניסה שנבחר ב-AuxIN1 .
    הערה: הקלטות מתחלפות של ירי ספונטני עם ובלי יישום של מוליכות דינמיות בתיווך מהדק חשובות לקביעת האופן שבו מוליכות המודל המיושמת משפיעה על הריגוש, וכדי לקבוע אם רמות הריגוש הבסיסיות יציבות/עקביות לאורך כל הניסוי.

תוצאות

בניסויים שהוצגו, אנו מיישמים, באמצעות מהדק דינמי, מוליכות נתרן מגודרת מתח (Nav) על נוירונים של עכבר בוגרים (בני 6-7 שבועות) המבודדים באופן חריף בהכנת פרוסת מוח מוחי פרסגיטלית. המחקרים מבוצעים על עכברים מסוג בר (ביקורת) ועכברים טרנסגניים, בהם נעשה שימוש ברקומבינציה של Cre-loxP למחיקה סלקטיבית של טרשת שחפת 1 (Tsc1) מנוירונים של Purkinje המוחי. קומפלקס טרשת שחפת (TSC) היא הפרעה רב-מערכתית הנגרמת על ידי מוטציות של אובדן תפקוד ב-TSC1 או TSC2 32,28,33. אנשים עם TSC מאובחנים בדרך כלל עם הפרעות אפילפסיה, ליקוי קוגניטיבי והפרעת הספקטרום האוטיסטי34,35. עכברים עם מחיקת Tsc1 ספציפית לנוירונים של Purkinje, המכונה כאן Tsc1 mut/mut, מציגים מספר פנוטיפים התנהגותיים הקשורים לאוטיזם, כולל ליקויים בתפקוד המוטורי, התנהגות אינטראקציה חברתית וקולות, כמו גם התנהגויות חוזרות ונשנות מוגזמות 9,36. Tsc1mut/mut הוכח גם כי לנוירונים של פורקינג'ה יש ירי פוטנציאלי פעולה מוחלש (איור 2A,B), המקושר להפחתה משמעותית באמפליטודות זרם הניווט (איור 2C) ולביטוי ערוץ Nav במקטעים הראשוניים של האקסון של נוירוני PurkinjeTsc1 mut/mut 8. לזרמי ניווט בנוירוני פורקינג'הTsc1 mut/mut יש תכונות קינטיות ותלויות מתח דומות לנוירוני פורקינג'ה מסוג פרא8. במודל עכבר טרנסגני זה שלTsc1 mut/mut, השתמשנו במהדק דינמי כדי לבדוק אם הוספת מוליכות Nav לנוירוני Tsc1mut/mut Purkinje יכולה להציל ירי חוזר. אנו ממשיכים לבדוק אם הפחתת מוליכות Nav בתאי עצב מסוג Purkinje מסוג פרא גורמת להנחתה דומה בירי נוירוני Purkinje כפי שנמדד בתאי עצב Tsc1mut/mut Purkinje (איור 2B). כדי להפחית את מוליכות הניווט המבוטאת באופן מקורי, יישמנו את מוליכות הניווט באמצעות מהדק דינמי; עם זאת, הקוטביות של המוליכות הפוכה.

מודל המצב הקינטי של מרקוב (איור 1A) המשמש להדמיית מוליכות ניווט של נוירון פורקינג'ה מכיל תשעה מצבים קינטיים, שמונה מהם לא-מוליכים, המסומנים כסגורים (C1, C2 ו-C3), לא פעילים-סגורים (IC1 ו-IC2), מנוטרלים במהירות (IF1 ו-IF2) ומושבתים לאט (IS). יש מצב קינטי פתוח/מוליך אחד (O)30,31. קבועי קצב המעבר, המוצגים בין המצבים הקינטיים המסומנים (איור 1A) קובעים את שיעור הערוצים/מוליכות המדומים התופסים כל מצב קינטי. מתח הממברנה משפיע על כל אחד מקבועי הקצב של הדגם. זרמי ניווט מדומים המיוצרים על ידי מודל זה (בסיליקו) בניסויי מהדק מתח מדומים מוצגים (באדום) מימין לזרמי ניווט שנמדדו מנוירוני פורקינג'ה מבודדים באופן חריף, המוצגים בשחור (איור 1A, למטה). פקודת המתח המעוררת את זרמי הניווט המדומים (אדומים) והנוירון פורקינג'ה (שחור) מוצגת מעל עקבות הזרם בשחור. שימו לב, בפקודת המתח, שלב דה-פולריזציה ראשוני (עד 0 mV) מביא לזרם נתרן פנימי חולף במהירות, אשר, בעקבות המדומה, משקף ערוצים העוברים מהמצבים הסגורים הלא-מוליכים למצב הקינטי הפתוח, ומאפשר זרם קצר פנימה לפני שתעלות מצב פתוח מצטברות למצבים קינטיים מושבתים במהירות (IF1 ו-IF2). שלב מתח דה-פולריזציה זה הוא קצר (5 ms) ופוטנציאל הממברנה מועבר לאחר מכן למתח ביניים מקוטב מחדש של -45 mV, שבו הפוטנציאל מוחזק למשך 80 ms (איור 1A, למטה). במהלך שלב מתח רפולריזציה זה, ראוי לציין כי יש התעוררות מחודשת של זרם נתרן פנימה, רכיב זרם המכונה זרם הנתרן המתעורר מחדש (INaR). במהלך צעד זה של 80 אלפיות השנייה ל- -45 mV, INaR מציג דעיכה איטית (בהשוואה ל- INaT) במשרעת, ובסופו של דבר מגיע למצב יציב של זרם פנימה, שהוא רכיב זרם הניווט המתמשך (INaP). הפעלה של מודל INaR (איור 1A, תחתון, אדום) במהלך רפולריזציה של הממברנה משקפת ערוצים מדומים המתאוששים מהמצבים הקינטיים המושבתים במהירות (IF1 + IF2) למצב פתוח/מוליך. עם הזמן (מחזיקים ב-45 mV), חלק מהערוצים המדומים התופסים את המצב הפתוח מצטברים למצב קינטי איטי-מושבת (IS) סופג, המשתקף עם דעיכת INaR, וחלק מהערוצים הללו נשארים במצב פתוח/מוליך, המשתקף כרכיב זרם INaP במצב יציב30,31.

בניסויים/תוצאות המייצגים, מודל המוליכות Nav Markov (איור 1A) נוסף לתאי עצב פורקינג'ה בוגרים בפרוסות מוח מבודדות באופן חריף. תיאור מצויר של מערך ניסיוני זה מוצג באיור 3A. כדי ליישם את מוליכות ה-Nav המעוצבת באמצעות הזרקת זרם מהדק דינמי, השתמשנו במערכת המגבר dPatch (מוצגת באיור 3B), בעלת המרה משולבת במלואה של אנלוגי-לדיגיטלי (A/D) ודיגיטלי-לאנלוגי (D/A). מערכת זו מטפלת גם בטרנספורמציות אותות באמצעות מעבדי ליבת ARM משולבים (חיצוניים למחשב) ויש לה מעגל FPGA משולב (מערך ניתן-לתכנות בשטח) המאפשר עיבוד כמעט מיידי של אותות קלט ומשוב (שליחת אותות פלט) לאלקטרודה הזרקתזרם 27. הניסויים כאן כללו יישום (במהדק דינמי) של מודל מוליכות מרקוב מורכב, אותו הצלחנו ליישם עם קצבי עדכון הזרקה נוכחיים של עד 500 קילו-הרץ.

הוספת מוליכות ה-Nav המדומה (400 nS) לנוירוני Purkinjeשל Tsc1 mut/mut במהלך הקלטות מהדק זרם ללא מרווחים הביאה לעלייה ברורה בתדרי הירי החוזרים ונשנים של התאים (איור 3C1, D1), מה שמצביע על כך שתוספת מוליכות Nav בתאים אלה עשויה להספיק כדי להציל ליקויים בריגוש נוירוני פורקינג'ה Tsc1 mut/mut, אם כי לא בדקנו את הרפרטואר המלא של הליקויים שדווחו ב-Tsc1 mut/mut ריגוש נוירון פורקינג'ה8. כפי שניתן לראות מהעקבות המייצגות המוצגות באיור 3C2 (עליון), לנוירונים מסוג Purkinje מסוג בר יש יכולת מהותית לירות פוטנציאל פעולה חוזר בתדרים גבוהים. באמצעות מהדק דינמי, החסרנו את מוליכות ה-Nav המעוצבת מנוירוני פורקינג'ה מסוג פרא על ידי יישום מוליכות ה-Nav המעוצבת עם קוטביות הפוכה (שלילית) (-400 nS). הפחתת מוליכות ה-Nav המעוצבת הביאה להפחתה מיידית וברורה בירי חוזר ונשנה (איור 3C2, למטה), מה שעולה בקנה אחד עם ההשערה שזרמי Nav מופחתים שנמדדו בנוירוני PurkinjeTsc1 mut/mut תורמים לתכונות הירי המוחלשות שנמדדו בתאים אלה8. על פני מספר נוירוני פורקינג'ה מסוג Tsc1mut/mut או מסוג פראי, ניסויי ההידוק הדינמיים הללו, שבהם נוספה או הופחתה מוליכות ה-Nav, בהתאמה, הביאו להשפעות עקביות על תדירות הירי. התוספת של מוליכות Nav באופן משמעותי (P = 0.029) הגדילה את תדירות הירי של נוירוני פורקינג'ה Tsc1mut/mut (איור 3D1), ובתאי עצב מסוג Purkinje מסוג בר, הפחתת מוליכות ה-Nav באופן משמעותי (P = 0.031) הפחיתה את תדירות הירי (איור 3D2) (מבחן t מזווג של סטודנט).

figure-results-1
איור 1: הגדרת מודל מרקוב בתוכנת מהדק דינמי. (A) דיאגרמת מעבר מצב מרקוב מוצגת עבור מודל המשחזר תכונות מוליכות Nav שנמדדו בתאי עצב Purkinje של המוח הקטן של עכבר30. מודל זה כולל תשעה מצבים קינטיים. מתוכם, 8 הם מצבים לא מוליכים: שלושה סגורים (C), שניים לא מוכים-סגורים (IC), שניים לא פעילים במהירות (IF) ואחד איטי (IS). המודל כולל מצב קינטי פתוח (O) אחד, שהוא מוליך. בין מצבים קינטיים סמוכים, חיבורים/תפוסת מצב העוברים לאורך זמן מוגדרים על ידי קבועי קצב מעבר, המוצגים כ-S0-S15. שימו לב שלכל מצב קינטי מוקצה גם ערך מספרי (אדום), המאפשר למשתמשים להגדיר את מודל מרקוב ואת טופולוגיית המצב הקינטי שלו במטריצת מצב שער (מוצגת בפאנל C, המתואר להלן). (B) מוצגים פאנלים/ממשקים גרפיים שמשתמשים עובדים איתם ב-SutterPatch Dynamic Clamp Editor. שים לב, הסידור של חלוניות Dynamic Clamp Editor אלה אינו תואם את הסידור כפי שהוא מופיע בתוכנת המהדק הדינמי. בנוסף, לא כל החלוניות המשויכות ל-Dynamic Clamp Editor מוצגות. (C) (פאנל עליון) דוגמה למטריצת מצב שער מוצגת עם משתנים שהוזנו התואמים את הטופולוגיה של דיאגרמת מעבר המצב המוצגת בלוח A. תיבות אדומות במטריצת מצב השער מדגישות את השורה ואת העמודה 7, התואמות את המצב הקינטי הפתוח (O) של המודל. בתוך עמודה 7 מפורטים כל קבועי הקצב המגדירים מעברים למצב הקינטי הפתוח (O), ובתוך שורה 7 מפורטים כל קבועי הקצב המגדירים מעברים היוצאים מהמצב הקינטי הפתוח (O). עם ארגון זה, מטריצת מצב השער מתארת את מספר המצבים הקינטיים, משתני קבועי הקצב והטופולוגיה (קשרי גומלין בין מצבים קינטיים) של המודל. מוצגים ב-(D) לוחות SutterPatch/ממשקי משתמש הקשורים לטעינת מודלים של מוליכות מהדק דינמי, יחד עם הממשקים המעורבים ביצירת שגרות מהדק נוכחיות. אינטראקציות משתמש עם מודלים אלה מתוארות בשלבים 2.17-2.20 של פרוטוקול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: לנוירוני Purkinjeשל Tsc1 mut/mut יש ריגוש ממברנה מוחלש בהשוואה לבקרות מסוג בר. (A) הקלטות מהדק זרם של תא שלם מנוירוני Purkinje מסוג בר (עליון, שחור) ו-Tsc1mut/mut (תחתון, כחול) חושפות ירי מוחלש בתא המוטנטי Tsc1. (B) תדירות ירי מופחתת בתאי עצב Tsc1 mut/mut Purkinje, בהשוואה לבקרות מסוג בר, עקבית בין תאים. תדירות הירי הספונטנית הממוצעת (±± SEM) של נוירוני פורקינג'ה Tsc1mut/mutנמוכה משמעותית (P < 0.0001) בהשוואה לתאים מסוג בר (מבחן t לא מזווג של וולץ'; בקרה N = 13, n = 32; Tsc1mut/mut N = 6, n = 21). (C) מדידות מהדק מתח של זרמי Nav בתאי עצב פורקינג'ה בוגרים מגלות כי שיא זרם הניווט המהיר הממוצע (±±SEM) מופחת משמעותית בתאי מוט/מוט Tsc1, בהשוואה לבקרות מסוג בר. (P = 0.007, RM ANOVA דו-כיווני; בקרת סוג פראי: N = 6, n = 22, שחור; Tsc1mut/mut: N = 6, n = 16, ריבועים כחולים). דוגמה I רשומותNaT, המעוררות על ידי שלב דה-פולריזציה של -35 mV, מוצגות כפאנל מובנס מימין לפאנל C. נתונים שפורסמו בעבר ב-Brown et al.8. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: שימוש במהדק דינמי כדי לקבוע את ההשפעות של מוליכות יונית על ריגוש נוירוני Purkinje. מהדק דינמי כולל דגימת מתח הממברנה (באמצעות אלקטרודת הקלטה) וחישוב, על סמך המתח שנדגם, את תפוקת הזרם של מוליכות מודל. לאחר מכן מופעל הזרם המחושב על תא ביולוגי באמצעות אלקטרודה הזרקת זרם. לוח (A) מתאר סידור ניסיוני זה. אם דגימת מתח מתבצעת בתדר מספיק, ויש עיכוב מינימלי (חביון) בין דגימת מתח להפעלת הזרם המחושב, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להעריך כיצד הוספה או חיסור של מוליכות מעוצבת משפיעה על ירי עצבי וריגוש הממברנה. (B) בניסויים מייצגים, הקלטות מהדק דינמי נרכשו באמצעות תוכנת SutterPatch ומערכת מגבר dPatch. dPatch הוא מגבר מהדק תיקון בעל מעבדי אותות חיצוניים ודיגיטייזר משולב במלואו, מה שהופך אותו למתאים היטב להקלטות מהדק דינמי (ראה דיון). (C) רשומות מהדק זרם מייצגות של ירי ספונטני של נוירוני פורקינג'ה, לפני ואחרי שימוש במהדק דינמי כדי להוסיף או להחסיר 400 nS ממוליכות הניווט המעוצבת (מוצג באיור 1A). ב-C1 (משמאל), הרשומות הן מנוירון פורקינג'ה Tsc1 mut/mut עם ירי מוחלש. התוספת של מוליכות ניווט של 400 nS מביאה לעלייה ברורה בתדירות הירי של תא זה. לחלופין, ב-C2, הרשומות הן מתא עצב פורקינג'ה מסוג פראי. בניסוי זה, מוליכות ה-Nav המעוצבת מיושמת בקוטביות הפוכה (-400 nS), וכתוצאה מכך חיסור מוליכות Nav, והפחתה ברורה בתדירות הירי החוזרת. דינמי clamp רשומות הזרקת זרם, המוצגות באפור, מוצגות מתחת לרשומות הירי של פוטנציאל הפעולה (כרךtagה), המוצגות בשחור. (D) תוצאות מניסויי ההידוק הדינמיים האלה, המוצגות כשינויים בתדירות הירי הספונטנית לאחר הוספת מוליכות Nav לנוירוני PurkinjeTsc1 mut/mut (D1, n = 3) או הפחתת מוליכות Nav מתאי עצב מסוג Purkinje מסוג בר (D2, n = 3), מגלות השפעות עקביות ומשמעותיות של הוספה או חיסור של מוליכות זו על פניTsc1 mut/mut (P = 0.029) וסוג פרא (P = 0.031) תאים, בהתאמה (מבחן t של סטודנט מזווג). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

מעגלי המוח הקטן מתפקדים בפרופריוספציה ובשליטה מוטורית37,38 אך הם קריטיים גם להתנהגויות מורכבות כגון אינטראקציות חברתיות ועיבוד רגשי 39,40,41. פתולוגיה במבנה ובתפקוד המוח הקטן קשורה לעתים קרובות ל- ASD 42,43,44,45,46. הארכיטקטורה הפשוטה של מעגלי המוח הקטן47 והתפקיד הברור של המוח הקטן בפתולוגיה של ASD הופכים אותו לאזור אטרקטיבי במוח לחקור את המניעים המולקולריים והתאים של ליקויים התנהגותיים של ASD, כמו גם טיפולים פוטנציאליים. אלקטרופיזיולוגיה של מהדק דינמי מציעה כלי חשוב לחקירות אלה, ומאפשרת לחוקרים לבדוק ישירות את הקשרים הסיבתיים בין שינויים הקשורים לאוטיזם בתכונות תעלות יונים/מוליכות יונית לבין ירי של נוירונים במוח הקטן. בעוד ששיטות מהדק דינמי מתאימות במיוחד לחקירות של שינויים הקשורים לאוטיזם בריגוש עצבי, טכניקה זו רלוונטית לחקירת מגוון מנגנונים פתולוגיים המשפיעים על תאים עם ממברנות מעוררות. בנוסף, מהדק דינמי נותר כלי מצוין לניתוח התהליכים המורכבים שבאמצעותם נוירונים ותאי שריר מווסתים ושומרים על ירי פוטנציאל פעולה מתאים.

ביצוע מדויק של ניסויי מהדק דינמיים דורש שליטה קפדנית בפרמטרים טכניים. באופן ספציפי, על הנסיינים לדעת ולהבין את ההשלכות של השונות הפוטנציאלית בעיכוב בין דגימת מתח להזרקת זרם, המכונה לעתים קרובות ריצוד29, כמו גם תכונות פסיביות של אלקטרודות, מגבלות מהדק חלל והנאמנות הפיזיולוגית של ההכנה הניסויית הנחקרת. Bettencourt et al. (2008)48 ו-Butera et al. (2001)29 הראו בעבר כי השגת שיעורי דגימה גבוהים של לפחות 50 קילו-הרץ היא קריטית ללכידה מדויקת של מוליכות יוניות מהירות, עם חביון משוב שנשמר באופן אידיאלי מתחת ל-25% (≤ 5 מיקרון) ממרווח הדגימה. שיעורי הדגימה הנומינליים המדווחים על ידי מערכות מסחריות, במיוחד פלטפורמות מבוססות Windows, עלולים להטעות; לפיכך, לעתים קרובות יש צורך באימות ביצועים עצמאי, אשר נדון ביתר פירוט על ידי Milescu et al. (2008)25 ו-Clausen et al. (2012)49. יש לקחת בחשבון גם אילוצי מהדק חלל, במיוחד כאשר עובדים עם נוירונים שלמים בעלי מורפולוגיות מורכבות ותכונות ממברנה לא איזופוטנציאליות. לדוגמה, ניסיון ליישם (או לחסר) מוליכות עם אלקטרודה דיסטלית לאתר האינטגרציה, כגון ה-AIS, יביא לתיאור לא מדויק של השפעות המוליכות המיושמת. התנגדות אלקטרודה ירודה (גבוהה), פיצוי קיבוליות לא מספק ו/או אי תיקון שגיאת פוטנציאל צומת עלולים גם לגרום לייצוג שגוי של מדידות מתח (אות כניסה), וכתוצאה מכך, יישום שגוי של מוליכות יוניות מעוצבות50,51.

אלפי מודלים של מרקוב ו-HH זמינים בחינם לחוקרים במאגרי מידע מקוונים כמו ModelDB52 ו-Channelpedia53, הנתמכים על ידי פרויקט המוח האנושי והמעבדה למיקרו-מעגלים עצביים, בהתאמה. מאגרי מידע אלה כוללים מודלים למוליכות סינפטית, מוליכות תעלות יונים ומודלים של נוירונים מבוססי מוליכות, שנכתבים בעיקר ב-NEURON, MATLAB או Python. קבצי מסד נתונים מספקים בדרך כלל את משוואות המודל הדרושות, כמו גם כל מידע שונה על סוגי התאים והניסויים שסיפקו מידע למודל.

גם דגמי מוליכות מרקוב וגם HH מכילים מצבים/משתנים מוליכים (הדמיית ערוצים פתוחים/מופעלים) ולא מוליכים (ערוצים מדומים סגורים). עם זאת, סוגי מודלים אלה נבדלים באופן שבו מחושב ערך המוליכות בכל מתח שנדגם, כאשר מודלים של מרקוב דורשים יותר כוח חישובי אך מספקים פירוט רב יותר במאפייני השער של ערוצים מדומים. לדוגמה, במודלים של HH, המצבים המוליכים והלא מוליכים הם משתנים בלתי תלויים, שכל אחד מהם נקבע על ידי קינטיקה של כניסת מתח ושער של המצב המתאים54,55. בניגוד למודלים של מרקוב, דגמי HH אינם מדמים או מגבילים את המעברים בין מצבי שער, כגון מעבר של ערוצים מדומים מהמצב הקינטי המופעל/פתוח ישירות למצב הקינטי המנוטרל במהירות במודל מוליכות נתרן מגודרמתח 25. זה הופך את מודלי HH לפחות מורכבים מבחינה חישובית54,55 ומאפשר לחוקרים להוסיף מספר מודלים של HH מוליכות מהירה בו זמנית, תוך שמירה על שיעורי דגימה ועדכון גבוהים.

מודלים של מצב קינטי מרקוב מורכבים ממצבים קינטיים בדידים, שעשויים להיות מוליכים או לא מוליכים, ומצבים אלה קשורים זה בזה בטופולוגיה קבועה. בסימולציות מודל מרקוב, המוליכות מחושבת בכל מתח שנדגם על ידי שיעור הערוצים המדומים התופסים את המצבים הקינטיים המוליכים. שיעור הערוצים המדומים התופסים כל מצב קינטי (לאורך זמן) נקבע על ידי קבועי קצב, שהם פרמטרים השולטים בקצב שבו תפוסת המצב עוברת ממצב קינטי אחד למשנהו. לקבועי קצב יש יחידות של שניות הפוכות (s-1), המייצגות הסתברות מעבר ליחידת זמן. בהתאם לדגם, ערכי קבוע הקצב עשויים להיות תלויים בגורמים דינמיים כגון מתח או טמפרטורה.

במודלים של מרקוב, משוואות דיפרנציאליות רגילות משמשות לתיאור התפוסה התלויה בזמן של כל מצב קינטי. משוואות אלה קובעות כיצד ההסתברות להיות בכל מצב מתפתחת לאורך זמן, בהתבסס על קבועי קצב המעבר. זה מיוצג על ידי מטריצת קצב Q: figure-discussion-156. כפי שנדון לעיל, קבועי קצב המעבר (r), הקובעים את התנועה בין מצבים, עשויים להיות מושפעים ממתח הכניסה (V) ומהפרמטרים α ו-β, המשקפים את הקינטיקה של המוליכות על פני מתחים. ניתן לתאר משוואות אלה כ: figure-discussion-2, וניתן לייצג אותן באופן חזותי בצורה של גרפים הכוללים קשרים (קבועי קצב מעבר) לתוך ומחוץ לכל מצב קינטי של המודל 56,57,58. דיון מועיל על התפתחות מודלים של מרקוב והטופולוגיה שלהם ניתן למצוא ב-Schoening and Silva (2024)56.

מאז תחילתו של מהדק דינמי בצורתו הנוכחית, שבו מוליכות יוניות לא ליניאריות מעוצבות ומיושמות (באמצעות אלקטרודה הזרקת זרם) על תאים חיים בזמן אמת19,59, השיטות והמשאבים לטכניקה זו התפתחו, והם נגישים וחסכוניים יותר ויותר עקב חידושים כגון מערכות מבוססות מיקרו-בקר בעלות נמוכה60 ותוכנה חינמית בקוד פתוח23, 25,26. מערכות מסחריות, כגון dPatch של Sutter Instrument או Cybercyte של Cytocybernetics, מקלות עוד יותר על יישום מהיר של ניסויי מהדק דינמי באמצעות פתרונות חומרה ותוכנה משולבים 27,61.

הרבגוניות של מהדק דינמי מאפשרת יישומים מגוונים, כולל יצירת סינפסות כימיות וחשמליות וירטואליות, הטמעת נוירונים אמיתיים ברשתות מלאכותיות (או להיפך), והוספת תעלות יונים וירטואליות62. חשוב לציין, ניתן לכוונן במהירות את התלות במתח, התכונות הקינטיות והמשרעות של מוליכות מיושמת, מה שמאפשר לחוקרים לבדוק ישירות כיצד קנה מידה של פרמטר אחד או יותר משפיע על ירי פוטנציאל הפעולה וריגוש הממברנה31. המערכות של היום מציעות שיעורי דגימה גבוהים, המאפשרים יישום מדויק של מוליכות חולפת מהירה וניתן לשלב אותן בקלות עם ציוד אלקטרופיזיולוגי קונבנציונאלי60,63, מה שממצק את המהדק הדינמי כשיטה אידיאלית לקידום ההבנה שלנו לגבי תפקוד עצבי ותפקוד לקוי.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים.

תודות

ברצוננו להודות לטלי גליאטסטוס וג'וש סטנפורד מ-Sutter Instrument על עזרתם בבירורים טכניים. אנו גם מודים ליאן דולצר על עזרתו בהתחלת מחקרי מהדק דינמי של dPatch.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
CaCl2פישר כימיקלC79-500 מגיב
צינור זכוכית קפילרי בורוסיליקט דופן סטנדרטי OD 1.5 מ"מ מזהה 0.86 מ"מ אורך 10 ס"מוורנר אינסטרומנטס64-0793ציוד
CleanBenchTMC63-9090Eציוד
Compresstome VF-500-Z ויברטום  כלים פרסישיונייםhttps://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/ציוד
Dell OptiPlex 7080דלhttps://www.dell.com/en-us/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-and-small-form-factor/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffusציוד
דקסטרוזפישר כימיקלD16-500 מגיב
מערכת מגברי dPatchסאטר אינסטרומנטFG-DPATCHציוד
EGTAEMD מיליפור324626-25GMמגיב
HEPESפישר כימיקל7365-45-9מגיב
מחמם בקווורנר אינסטרומנטס64-0102ציוד
KClפישר כימיקלP330-500 מגיב
קטמיןמוצרי הווטרינריה של דקרה193.40620.3 מגיב
K-גלוקונאטTCI ChemicalsG0040מגיב
תוכנת LinLabסיינטיפיקהhttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2ציוד
אמבט מים LSE 6Lקורנינג6783ציוד
Mg-ATPסיגמא-אלדריץ'74804-12-9מגיב
MgCl2פישר כימיקל012288.A9מגיב
מודל P-1000 מושך פיפטסאטר אינסטרומנטFG-P1000ציוד
NaClפישר כימיקלS271-500 מגיב
Na-GTPביומדיקל MP56001-37-7מגיב
NaH2PO4ג'יי.טי. בייקר02-004-220 מגיב
NaHCO3פישר כימיקלS233-500 מגיב
תוכנת Ocularדיגיטל אופטיקס בע"מhttps://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-softwareציוד
להב סכין גילוחפרסונה60-0139-CTNציוד
נבל סלייסוורנר אינסטרומנטס64-0255ציוד
SliceScope Pro 3000סיינטיפיקהhttps://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000ציוד
דבק עללוקטיט8040-00-142-9193ציוד
תוכנת SutterPatchסאטר אינסטרומנטhttps://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatchציוד
בקר טמפרטורהוורנר אינסטרומנטס64-2400ציוד
זילזיןביומדיקל MP158307מגיב

מקורות

  1. Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), a009886-a009886 (2012).
  2. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nat Commun. 5 (1), 4742(2014).
  3. Connor, S. A., et al. Altered cortical dynamics and cognitive function upon haploinsufficiency of the autism-linked excitatory synaptic suppressor MDGA2. Neuron. 91 (5), 1052-1068 (2016).
  4. Pagani, M., et al. mTOR-related synaptic pathology causes autism spectrum disorder-associated functional hyperconnectivity. Nat Commun. 12 (1), 6084(2021).
  5. Tang, G., et al. Loss of mTOR-dependent macroautophagy causes autistic-like synaptic pruning deficits. Neuron. 83 (5), 1131-1143 (2014).
  6. Fatemi, S. H., Eschenlauer, A., Aman, J., Folsom, T. D., Chekouo, T. Quantitative proteomics of dorsolateral prefrontal cortex reveals an early pattern of synaptic dysmaturation in children with idiopathic autism. Cereb Cortex. 34 (13), 161-171 (2024).
  7. Deneault, E., et al. Complete disruption of autism-susceptibility genes by gene editing predominantly reduces functional connectivity of isogenic human neurons. Stem Cell Rep. 11 (5), 1211-1225 (2018).
  8. Brown, S. P., Jena, A. K., Osko, J. J., Ransdell, J. L. Tsc1 deletion in Purkinje neurons disrupts the axon initial segment, impairing excitability and cerebellar function. Neurobiol Dis. 207, 106856(2025).
  9. Tsai, P. T., et al. Autistic-like behaviour and cerebellar dysfunction in Purkinje cell Tsc1 mutant mice. Nature. 488, 647-651 (2012).
  10. Sundberg, M., et al. Purkinje cells derived from TSC patients display hypoexcitability and synaptic deficits associated with reduced FMRP levels and reversed by rapamycin. Mol Psychiatry. 23, 2167-2183 (2018).
  11. Brumback, A., Sohal, V. Intrinsic excitability defects in specific subtypes of medial prefrontal cortex pyramidal neurons in a mouse model of autism. Neurology. 82 (10), I4-1.010(2014).
  12. Mitchell, D. E., Miranda-Rottmann, S., Blanchard, M., Araya, R. Altered integration of excitatory inputs onto the basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons in a mouse model of Fragile X syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (2), e2208963120(2023).
  13. Sanders, S. J., et al. De novo mutations revealed by whole-exome sequencing are strongly associated with autism. Nature. 485, 237-241 (2012).
  14. Ben-Shalom, R., Keeshen, C. M., Berrios, K. N., An, J. Y., Sanders, S. J., Bender, K. J. Opposing effects on NaV1.2 function underlie differences between SCN2A variants observed in individuals with autism spectrum disorder or infantile seizures. Biol Psychiatry. 82 (3), 224-232 (2017).
  15. Spratt, P. W. E., et al. The autism-associated gene Scn2a contributes to dendritic excitability and synaptic function in the prefrontal cortex. Neuron. 103 (4), 673-685.e5 (2019).
  16. Nelson, A. D., et al. Physical and functional convergence of the autism risk genes Scn2a and Ank2 in neocortical pyramidal cell dendrites. Neuron. 112 (7), 1133-1149.e6 (2024).
  17. Zhang, J., et al. Severe deficiency of the voltage-gated sodium channel NaV1.2 elevates neuronal excitability in adult mice. Cell Rep. 36 (5), 100858(2021).
  18. Sharp, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. Artificial electrical synapses in oscillatory networks. J Neurophysiol. 67 (6), 1691-1694 (1992).
  19. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16 (10), 389-394 (1993).
  20. Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49 (3), 157-165 (1993).
  21. Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27 (4), 218-224 (2004).
  22. Muñiz, C., Arganda, S., Rodríguez, F. B., De Polavieja, G. G. Realistic stimulation through advanced dynamic-clamp protocols. Computational Methods in Neural Modeling. Mira, J., Álvarez, J. R. , Springer. Berlin. 95-105 (2005).
  23. Ortega, F. A., Butera, R. J., Christini, D. J., White, J. A., Dorval, A. D. Dynamic clamp in cardiac and neuronal systems using RTXI. Methods Mol Biol. 1183, 327-354 (2014).
  24. Milescu, L. S., Tabak, J. Dynamic clamp on a Windows PC. Methods Mol Biol. 2188, 157-177 (2021).
  25. Milescu, L. S., Yamanishi, T., Ptak, K., Mogri, M. Z., Smith, J. C. Real-time kinetic modeling of voltage-gated ion channels using dynamic clamp. Biophys J. 95 (1), 66-87 (2008).
  26. Kemenes, I., et al. Dynamic clamp with StdpC software. Nat Protoc. 6 (3), 405-417 (2011).
  27. Dolzer, J. Patch clamp technology in the twenty-first century. Methods Mol Biol. 2188, 21-49 (2021).
  28. Crino, P. B., Henske, E. P. New developments in the neurobiology of the tuberous sclerosis complex. Neurology. 53 (7), 1384-1390 (1999).
  29. Butera, R. J., Wilson, C. G., DelNegro, C. A., Smith, J. C. A methodology for achieving high-speed rates for artificial conductance injection in electrically excitable biological cells. IEEE Trans Biomed Eng. 48 (12), 1460-1470 (2001).
  30. Ransdell, J. L., Moreno, J. D., Bhagavan, D., Silva, J. R., Nerbonne, J. M. Intrinsic mechanisms in the gating of resurgent Na+ currents. eLife. 11, e70173(2022).
  31. Brown, S. P., Lawson, R. J., Moreno, J. D., Ransdell, J. L. A reinterpretation of the relationship between persistent and resurgent sodium currents. J Neurosci. 44 (29), e2396232024(2024).
  32. European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium. Identification and characterization of the tuberous sclerosis gene on chromosome 16. Cell. 75 (7), 1305-1315 (1993).
  33. Henske, E. P., Jóźwiak, S., Kingswood, J. C., Sampson, J. R., Thiele, E. A. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 2 (1), 16036(2016).
  34. Wiznitzer, M. Autism and tuberous sclerosis. J Child Neurol. 19 (9), 675-679 (2004).
  35. Jeste, S. S., Sahin, M., Bolton, P., Ploubidis, G. B., Humphrey, A. Characterization of autism in young children with tuberous sclerosis complex. J Child Neurol. 23 (5), 520-525 (2008).
  36. Lawson, R. J., et al. Selective deletion of Tsc1 from mouse cerebellar Purkinje neurons drives sex-specific behavioral impairments linked to autism. Front Behav Neurosci. 18, 1474066(2024).
  37. Sherrington, C. S. The Integrative Action of the Nervous System. , Yale University Press. New Haven. (1911).
  38. Russell, J. S. R., Horsley, V. A. H. II Experimental researches into the functions of the cerebellum. Proc R Soc Lond. 55, 57-60 (1894).
  39. Rudolph, S., et al. Cognitive-affective functions of the cerebellum. J Neurosci. 43 (45), 7554-7564 (2023).
  40. Schmahmann, J. D. The cerebellum and cognition. Neurosci Lett. 688, 62-75 (2019).
  41. Beuriat, P. -A., Cristofori, I., Gordon, B., Grafman, J. The shifting role of the cerebellum in executive, emotional and social processing across the lifespan. Behav Brain Funct. 18 (1), 6(2022).
  42. Stoodley, C. J. Distinct regions of the cerebellum show gray matter decreases in autism, ADHD, and developmental dyslexia. Front Syst Neurosci. 8, 92(2014).
  43. Bruchhage, M. M. K., Bucci, M. -P., Becker, E. B. E. Cerebellar involvement in autism and ADHD. Handb Clin Neurol. 155, 61-72 (2018).
  44. Mosconi, M. W., Wang, Z., Schmitt, L. M., Tsai, P., Sweeney, J. A. The role of cerebellar circuitry alterations in the pathophysiology of autism spectrum disorders. Front Neurosci. 9, 296(2015).
  45. Weber, A. M., Egelhoff, J. C., McKellop, J. M., Franz, D. N. Autism and the cerebellum: evidence from tuberous sclerosis. J Autism Dev Disord. 30 (6), 511-517 (2000).
  46. Wang, S. S. -H., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83 (3), 518-532 (2014).
  47. Ransdell, J. L., Nerbonne, J. M. Voltage-gated sodium currents in cerebellar Purkinje neurons: functional and molecular diversity. Cell Mol Life Sci. 75 (19), 3495-3505 (2018).
  48. Bettencourt, J. C., Lillis, K. P., Stupin, L. R., White, J. A. Effects of imperfect dynamic clamp: computational and experimental results. J Neurosci Methods. 169 (2), 282-289 (2008).
  49. Clausen, C., Valiunas, V., Brink, P. R., Cohen, I. S. MATLAB implementation of a dynamic clamp with bandwidth of >125 kHz capable of generating INa at 37°C. Pflugers Arch. 465 (4), 497-507 (2013).
  50. Preyer, A. J., Butera, R. J. The effect of residual electrode resistance and sampling delay on transient instability in the dynamic clamp system. Annu Int Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2007, 430-433 (2007).
  51. Preyer, A. J., Butera, R. J. Causes of transient instabilities in the dynamic clamp. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17 (2), 190-198 (2009).
  52. McDougal, R. A., et al. Twenty years of ModelDB and beyond: building essential modeling tools for the future of neuroscience. J Comput Neurosci. 42 (1), 1-10 (2017).
  53. Ranjan, R., et al. Channelpedia: an integrative and interactive database for ion channels. Front Neuroinform. 5, 36(2011).
  54. Carbonell-Pascual, B., Godoy, E., Ferrer, A., Romero, L., Ferrero, J. M. Comparison between Hodgkin-Huxley and Markov formulations of cardiac ion channels. J Theor Biol. 399, 92-102 (2016).
  55. Andreozzi, E., Carannante, I., D'Addio, G., Cesarelli, M., Balbi, P. Phenomenological models of NaV1.5. A side by side, procedural, hands-on comparison between Hodgkin-Huxley and kinetic formalisms. Sci Rep. 9 (1), 17493(2019).
  56. Schoening, M. E., Silva, J. R. Creating Computational Models of Ion Channel Dynamics. Potassium Channels: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2024).
  57. Mangold, K. E., et al. Identification of structures for ion channel kinetic models. PLoS Comput Biol. 17 (8), e1008932(2021).
  58. Silva, J. R., Cooper, P., Nichols, C. G. Modeling KATP-dependent excitability in pancreatic islets. Biophys J. 107 (9), 2016-2026 (2014).
  59. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69 (3), 992-995 (1993).
  60. Desai, N. S., Gray, R., Johnston, D. A dynamic clamp on every rig. eNeuro. 4 (5), (2017).
  61. Han, L., et al. Reconciling computer models and stem cell models of human cardiac repolarization: reply. Cardiovasc Res. 106 (1), 6-7 (2015).
  62. Wilders, R. Dynamic clamp: a powerful tool in cardiac electrophysiology. J Physiol. 576 (2), 349-359 (2006).
  63. Kullmann, P. H. M., Wheeler, D. W., Beacom, J., Horn, J. P. Implementation of a fast 16-bit dynamic clamp using LabVIEW-RT. J Neurophysiol. 91 (1), 542-554 (2004).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

שיטות מהדק דינמי לחקירת ריגוש עצבי לקוי הקשור לאוטיזם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.