מאמר שיטה

הכנה ועיבוד עורקים מסויד עם מורפולוגיה ו-RNA משומרים לפרופילינג מרחבי דיגיטלי

DOI:

10.3791/69159

⸱

23 בינואר 2026

 ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Washington, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington, 3Division of Vascular Surgery, VA Puget Sound Health Care System

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה כולל תהליך עבודה שלב אחר שלב עבור דגימות וסקולריות מסוידות: טיפול ברקמות, דה-קלציפיקציה, אימות RNA, זיהוי רמות סיידון ואסטרטגיות בחירת אזור עניין ב-Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). המטרה היא להציג שיטה מקיפה לשימור מורפולוגיית רקמת כלי דם ו-RNA לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי אמין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרנסקריפטומיקה מרחבית ממפה פרופילי טרנסקריפטום שלמים ישירות לחלקי רקמה, ומתאם בין שכונות תאיות לביטוי גנים וכיצד פעילויות אלו מניעות בריאות ומחלות. למרות שהגישה שינתה את תחום האונקולוגיה, מדעי המוח, האימונולוגיה, מדעי ההתפתחות ותחומים רבים, היא הייתה פחות בשימוש נרחב בביולוגיה כלי דם, אף על פי שמחלות כלי דם נותרות גורם מוביל למוות ברחבי העולם. שני מכשולים בולטים: עורקים וורידים מספקים מעט שטח שטוח לחתך, ודגימות חולות, לעיתים טרשת עורקים, עם טעם דם, מלא פלאק או מסויד, דורשות טיפולים קשים כמו דה-קלציפיקציה המסכנים את המורפולוגיה ושלמות ה-RNA. ואולם, אותם כלי דם, עם מבני השכבות הקונצנטריים של אינטימה, מדיה ואדוונטיציה, אידיאליים לניתוח מרחבי כי כל שכבה מכילה סוגי תאים ותוכניות גנים שונות שמתקשרים על פני הקיר.

מעט פרוטוקולים מפורטים עוסקים בהכנת רקמות וסקולריות לטנסקריפטומיקה מרחבית. המחסור הזה מגביל את יכולתם של החוקרים לנצל את מלוא הפוטנציאל של הטכניקה. כדי לגשר על הפער, אנו מציגים תהליך עבודה שלב אחר שלב המותאם לעורקי טיביה אנושיים עם נגעים מתקדמים. הפרוטוקול עוסק בטיפול ברקמות, קיבוע ודקאלציפיקציה נכונה השומרת על המבנה ואיכות ה-RNA, ואחריה צביעה היסטולוגית עד דרגת חומרת ההסתיידות. אנו גם מתארים את בניית מיקרו-מערך רקמות (TMA) למניעת השפעות אצווה ואסטרטגיות בחירת אזור עניין (ROI) ב-NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP).

על ידי הפחתת מחסומים טכניים, פרוטוקול זה מאפשר לחוקרי כלי דם לייצר נתוני טרנסקריפטומיה מרחביים אמינים ולחקור פעילויות שעתוק ייחודיות לשכבה בכלי דם בריאים וחולים. אנו צופים כי הדבר יזרז את גילוי המנגנונים שמאחורי הסתיידות, דלקת, טרשת עורקים אינטימלית ופתולוגיות וסקולריות נוספות, ויעודד אימוץ רחב יותר של טרנסקריפטומיקה מרחבית בביולוגיה וסקולרית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעשור האחרון, ריצוף מהדור הבא ודימות ברזולוציה גבוהה התמזגו לקידום טרנסקריפטומיקה מרחבית, שיטה לכימות של טרנסקריפטום מלא תוך שמירה על המיקום המדויק של כל תמלול במקטעי רקמה 1,2. כאשר הם משולבים עם שדה ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) המתבגר במהירות, גישות מרחביות מספקות דרך יעילה לקישור חתימות גנים לסוגי תאים, מצבים ונישות ספציפיים בתוך רקמה או איבר, ומעשירים מאוד את הבנתנו את מנגנוני המחלה 3,4,5,6,7 . מפותחות פלטפורמות מסחריות רבות, כגון 10X Visium, NanoString GeoMx ו-CosMx, Slide-seq ו-DBiT-seq, שכל אחת מהן נתמכת בפרוטוקולים המותאמים לרקמות רכות ותאיות מאוד כמו גידולים ורקמת מוח. התחום חווה צמיחה מסחררת, כאשר PubMed דירג כ-150 פרסומים ב-2023, כמעט 300 ב-2024, ובדרך לעבור את 500 ב-2025. למרות העלייה הזו, הביולוגיה הווסקולרית נותרת מיוצגת פחות בהשוואה לסרטן, מדעי המוח והאימונולוגיה.

רקמות קשות או מינרליות, כמו עצם, סחוס, שיניים, ועורקים או ורידים מלאי פלאק ומסוידים, התגלו כפחות גמישות. המכשולים הטכניים הם רב-ממדיים. ראשית, הרקמות עם מטריצות מינרליות צפופות דורשות כילציה או הסרה מבוססת חומצה, טיפולים אגרסיביים שעשויים לפרק את ה-RNA ולעוות את מורפולוגיית הרקמות. שנית, רקמות חולות, פגועות או פיברוטיות, לעיתים קרובות מכילות מעט תאים חיים המוטמעים במטריצה חוץ-תאית (ECM) רבה, מה שמפחית את תפוקת התמלול ומסבך את נרמול הנתונים. בנוסף, לרקמות כלי דם יש ארכיטקטורה דקה וקונצנטרית (אינטימה, מדיה, אדוונטיציה) העוטפת לומן חלול. עובי דפנות מוגבל, במיוחד האינטימה בשכבת תא יחידה, גורם לכך שאזורי הלכידה עשויים להכיל רקמות מועטות, וחתכים עלולים להיקרע או להיפרד במהלך שלבי צביעה והיברידיזציה של שעות רבות. כתוצאה מכך, מחקרים טרנסקריפטומיים מרחביים של רקמת כלי דם נותרו נדירים, אף על פי שמחלות לב וכלי דם מדורגות בעקביות בין הגורמים המובילים למוות ולתחלואה חמורה ברחבי העולם. מאמרי פרוטוקול קיימים מדגישים בעיקר עיבוד נתונים, ויזואליזציה או פלטפורמות אחרות מלבד NanoString GeoMx 8,9,10,11,12,13. מבין המאמרים הללו, מעטים מתארים שיטות ברמת ספסל לעיבוד עורקי טיביה חולים, כלי דם קליני רלוונטי במחלת עורקים היקפיים (PAD), במיוחד עבור חולי סוכרת המהווים חלק הולך וגדל מהאוכלוסייה הנפגעת.

כדי להתמודד עם הפער הזה, אנו מציגים תהליך עבודה מקיף לעורקי טיביה אנושיים מסוידים, שהושג מחולי PAD שעברו קטיעה. הפרוטוקול כולל: (1) גזירת רקמות וניתוח מיד לאחר שליפה בחדר הניתוח; (2) קיבוע נכון של הרקמה ודקלציפיקציה השומרים על שלמות מורפולוגיית הרקמות וה-RNA; (3) בניית מיקרו-מערכי רקמה חסכוניים (TMAs) למזעור השפעות אצווה; (4) היברידיזציה RNAscope במקום וצביעה היסטולוגית של סידן לבקרת איכות; ו-(5) אסטרטגיית בחירת אזור עניין (ROI) שנועדה במיוחד לעורקי שוק מסויד בפלטפורמת GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). שלבים אלו כוללים את כל ההליכים לפני איסוף הדגימות במכשיר ה-DSP, הכנת הספרייה, ריצוף וניתוח נתונים.

למרות שהשיטה מודגמת בפלטפורמת ה-DSP המוזכרת, העקרונות יכולים להנחות הכנת רקמות ל-10X Visium או פלטפורמות אחרות, והמתודולוגיה ניתנת להתאמה בקלות למיטות וסקולריות נוספות או למודלים של בעלי חיים. פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם לביובנק ולרקמות לאחר המוות, אך הצלחתו תלויה באופן קריטי בשימור, קיבוע ותנאי אגירת הרקמה. יש לתקן את הרקמות מיד לאחר הקציר כדי למזער את זמן האיסכמיה (רצוי תוך שעה). מומלץ ל-10% פורמלין נייטרלי עם בופר סטנדרטי (NBF) לפחות 16 שעות בטמפרטורת החדר (RT). יש להטמיע את הרקמות מיד לאחר הקיבוע ולא לאחסן באתנול יותר מ-3 ימים. בלוקי פרפין משובצים בפורמלין קבוע (FFPE) המעובדים ומאוחסנים בתנאים מומלצים נשארים מתאימים לפרופילינג מרחבי במשך כ-3 שנים, אם כי איכות ה-RNA יורדת עם גיל הבלוק. בהתאם לכך, מומלץ להעריך איכות RNA עבור דגימות תאיות נמוכות, בלוקים המאוחסנים במשך 6 חודשים, דגימות ביובנק ורקמות לאחר המוות. איכות ה-RNA המינימלית המקובלת תלויה בבחירת הבדיקה הנבחרת, בחירת ROI, רזולוציה רצויה והמלצות למתקן המרכזי. בפועל, מומלץ בדרך כלל כ-50-100 גרעינים בכל מקטע לתוצאות עמידות. פלטפורמת ה-DSP תומכת גם ב-FFPE וגם ברישומות קפואות טריות. בפרוטוקול זה, אנו מתמקדים ברקמות FFPE.

בעוד שמחקר זה מתמקד בטרנסקריפטומיקה מרחבית, הוא משולב בקלות עם scRNA-seq. באמצעות מערכי נתונים של scRNA-seq שפורסמו ודקונבולוציה מרחבית חישובית, ניתן להעריך פרופורציות מסוג תא עבור כל נקודה מרחבית, ומצבי תא המוגדרים על ידי scRNA ניתן להקרין על ארכיטקטורת הרקמה. על ידי שמירה על שלמות המבנה וה-RNA, הפרוטוקול שלנו מאפשר אימות של תא יחיד או מולקולה בודדת במורד הזרם, וממקסם תובנות ביולוגיות מדגימות כלי דם יקרות ערך ואימוץ רחב יותר של טרנסקריפטומיקה מרחבית במחקר ביולוגיה וסקולרית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים לאיסוף דגימות עורקים אנושיים אושרו על ידי מועצת הסקירה המוסדית של מחלקת נבדקים אנושיים של אוניברסיטת וושינגטון (IRB) ועל ידי ה-IRB של מערכת הבריאות של VA Puget Sound Health Care System (סיאטל, וושינגטון). התקבלו הסכמות כתובות מדעת מהמטופלים לפני איסוף הרקמות. החומרים והציוד ששימשו למחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. גזירת רקמות ותיקון

  1. גזירת רקמות
    1. הכינו את תיק ההובלה באמצעות אריזה רב-שכבתית, הכוללת צינור פנימי, מיכל משני, מיכל משלוח חיצוני ותיק דגימה ביוסיכון. מלאו את צינור הצנטריפוגה הפנימי בנפח 50 מ"ל ב-30 מ"ל אחסון של מדיום Modified Eagle's Medium (DMEM) של Dulbecco המכיל 1% של 4-[2-הידרוקסיאתיל]-1-פיפראזין אתןסולפוניק חומצה (HEPES) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S).
    2. הניחו את העורקים הקדמיים הקדמיים (AT), השוקה האחורית (PT) והפרונאליים (PR) שנקטפו (רצוי > 5 ס"מ) בנפרד בתוך צינורות הצנטריפוגה בקוטר 50 מ"ל. העבר את המיכלים על הקרח מחדר הניתוח לחדר תרבית הרקמות.
      הערה: מומלץ שאורך הדגימה שנקטף יהיה לפחות 5 ס"מ כדי לאפשר שכפולים וכמות מספקת של רקמה לאחסון קריולוגי להערכות או אימות נוספים.
    3. העבר כל עורק לצלחת פטרי 100 מ"מ עם המדיה. הסר רקמות חיבור פריוסקולריות מיותרות באמצעות מספריים ומלקחיים, והשאירו רק את דופן העורק (Adventitia פנימה).
      הערה: לטפל ולגזום את הרקמות בארון בטיחות ביולוגית שננקב בתמיסת השבתה של RNase כדי למנוע זיהום RNA. השתמש בסכינים סטריליים ומלקחיים; בין הדגימות, שטוף אותן במים סטריליים וללא נוקלאז כדי להסיר שאריות ומנגב היטב עם 70% אתנול.
    4. שטפו בקצרה את העורק הקצוץ עם מלח פסיפט בופר (PBS) של דולבקו בצלחת פטרי חדשה. הניחו קרש חיתוך סטרילי בתוך צלחת טרייה והעבירו את העורק אליה.
    5. חתוך את העורק בחתך רוחבי למקטעים של 1 ס"מ עם להב ניתוח.
  2. קיבוע ואחסון רקמות
    1. הקפיאו שני מקטעים בצינורות קריו לשימור חנקן נוזלי (LN2) ואחסנו אותם לעבודה עתידית עם חלבון/RNA.
    2. הניחו את שאר המקטעים בצינורות של 15 מ"ל המכילים 10% NBF וקבע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24-48 שעות עבור מקטעי עורקים באורך 1 ס"מ.
      הערה: מומלץ להשתמש ב-10% NBF. אם משתמשים ב-4% פאראפורמלדהיד (PFA), יש להכין אותו טרי או לבדוק pH ניטרלי לפני השימוש כדי למזער נזק ל-RNA.

2. דהאלציפיקציה, עיבוד רקמות וחתך

  1. הכינו את תמיסת הדקלציפיקציה: המיס אתילן-דיאמין-טטראצטית מוצקה (EDTA) ל-10% (ללא וירט) בתמיסת ייצוב RNA (RSS). סינון אינו נדרש. כוונו את ה-pH ל-9.2 עם כדורי נתרן הידרוקסיד (NaOH) כדי להמיס את ה-EDTA במלואו, ואז להוריד ל-5.2 עם 10 M HCl, שהוא ה-pH הטיפוסי של RSS ועוזר לשמור על שלמות ה-RNA.
  2. שטוף בקצרה את הרקמות הקבועות ב-PBS ידנית. העבר כל דגימה לצינור של 15 מ"ל המכיל את תמיסת הדקלציפיקציה וערבב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
  3. כאשר הדקאלציפיקציה מסתיימת, שטפו את הדגימות ב-PBS (2 × 5 דקות). הנח רקמות בתוך קלטות וטעין אותן למעבד רקמות באמצעות תוכנית עיבוד של 4 שעות.
  4. הטמעת מספר מקטעי עורק בכל חסימת רקמה. סמן את אזור הרקמה המוגבל בגב ההחלקה וודא שכל החלקים נמצאים באזור זה.
  5. גזם את הפרפין העודף. חתך את הבלוקים ב-5 מיקרון עם מיקרוטום ולהבים נמוכים, והתקן את חלקי הרקמה בתוך אזור הסלייד המסומן.
    הערה: השליכו את החלקים הראשונים לאחר הפנייה ואספו את חתכי הרקמה הבאים. השתמש במברשות ללא RNase ונקה את אמבט המים בין אצוות.
  6. הכינו לפחות ארבעה קטעים סדרתיים לכל בלוק לצביעות שונות ולניסוי הפרופיל המרחבי הדיגיטלי (DSP). אחסן את הסליידס ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש (רצוי < 6 חודשים).

3. היברידיזציה במקום RNAscope (ISH) וצביעה היסטולוגית

  1. RNAscope ISH
    1. אפו שקופיות בתנור יבש בטמפרטורה של 60°C במהלך הלילה כדי לשפר את ההידבקות של הרקמה לסלייד.
    2. דה-פרפיניזציה: טבילה של סלידים בקסילן (3 × 5 דקות), ואחריה 100% אתנול (2 × 3 דקות). החלקות יבשות ב-60 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
    3. בצע את בדיקת RNAscope 2.5 HD Red ISH בהתאם לפרוטוקול היצרן. חסום פרוקסידאז אנדוגני עם 3% H2O 2 למשך 10 דקות ב-RT; שטוף במים מזוקקים (DI).
    4. יש לדוג מעליות בבופר שליפה מחומם מראש בטמפרטורה של 100°C (מדולל ב-1:10 במי DI) למשך 15 דקות (השתמש ב-200 מ"ל של בופר שליפה למדף של עד 24 שקופיות באדים), טבול ב-100% אתנול 5 פעמים, ומגלשות יבשות בטמפרטורה של 60°C למשך 7 דקות. צרו מחסום הידרופובי לתמיסות סביב הרקמה באמצעות עט PAP עם מחסום הידרופובי.
    5. הניחו את השקופיות במתקן תנור היברידיזציה, הוסיפו 200 מיקרוליטר של תוסף אנזימי עיכול (מדולל מראש על ידי הספק בבקבוקי טפטפת) לכל שקופה, ודגרו בטמפרטורה של 40°C למשך 15 דקות. שטוף את הסליידס פעמיים במי DI.
    6. מרחים את ה-Ppib האנושי בבקרה חיובית על המגלשות ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס. שטוף את המחסניות פעמיים בבופר שטיפה.
    7. לבצע הגברה רציפה: AMP1 ב-40 °C למשך 30 דקות; AMP2 ב-40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות; AMP3 ב-40°C למשך 30 דקות; AMP4 ב-40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות; AMP5 ב-RT למשך 30 דקות; ו-AMP6 ב-RT למשך 15 דקות. שטוף 2 פעמים 2 דקות באמצע.
    8. הוסף תמיסה עובדת של Fast Red, דגרה ב-RT למשך 10 דקות. רוקן, טבול את המשטחים במי DI, ואז טבול 5 פעמים במי DI טריים. ודאו שנקודות השליטה החיוביות של Ppib מופיעות כנקודות אדומות נפרדות ומנוקדות.
    9. צבע נגד עם המטוקסילין 1 של גיל, טבול 5 פעמים ב-2 החלפות של מי DI, כחול ב-0.02% הידרוקסיד אמוניום, וטבול 5 פעמים ב-2 החלפות של מי DI. וודא שהגרעינים צובעים בכחול ומורפולוגיית הרקמות נשמרה. תן למגלשות להתייבש בלילה ולבצע כיסוי עם מדיום התקנה.
  2. צביעת אליזרין רד S
    1. לחלקים סדרתיים נוספים, חזרו על דה-פרפיניזציה והידרציה בשלבים 3.1.2.
    2. אשר שה-pH של פתרון העבודה של Alizarin Red S הוא 4.1-4.3.
    3. טבלו את הסליידס ב-Alizarin Red S למשך 30-60 שניות, או עד שמשקעי הסידן יקבלו צבע כתום-אדום.
    4. נער את צבעי הכתמים המופרזים. התייבש עם 20 טבילה מהירה באצטון 100%, ואז 20 טבילה באצטון:קסילן (1:1).
    5. פנו את המגלשות בשני אמבטיות טריות של קסילן, 3 דקות כל אחת. כיסוי עם מדיום הרכבה.

4. הכנת שקופיות DSP של GeoMx ובחירת ROI

  1. לפני ההתחלה, נקו את כל הציוד והמיכלים בתמיסת מבטלת RNAse וייבשו או שטפו במים שטופלו ב-DEPC כדי למנוע זיהום RNA. עקבו אחרי ההוראות של מבחן פרופיל RNA מרחבי.
  2. אפו שקופיות בתנור יבש בטמפרטורה של 60°C במהלך הלילה כדי לשפר את ההידבקות של הרקמה לסלייד.
  3. דה-פרפיניזציה והחזרת מים: טבלו את הסליידס בקסילן (3 × 5 דקות), לאחר מכן 100% אתנול (2 × 5 דקות), ו-95% אתנול מדולל במים שטופלו ב-DEPC למשך 5 דקות. העבר את השקופיות ל-1× PBS למשך דקה.
  4. דגרו את הסליידס בבופר שאיבת אנטיגן 9.0 מחוממים מראש, בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס, טריס/EDTA pH 9.0 למשך 20 דקות, והעבירו את הסליידס ל-1× PBS למשך 5 דקות ב-RT.
  5. דגירה ב-1.0 מיקרוגרם/מ"ל פרוטינאז K מחומם מראש למשך 15 דקות ושוטפת ב-1× PBS למשך 5 דקות ב-RT.
  6. הפוסט-פיקס את השקופיות ב-10% NBF (200 מיקרוליטר לכל שקופית) למשך 5 דקות ב-RT, ושטוף ב-PBS ל-5 דקות.
  7. הסר את השקופיות מ-PBS, טפח על מגבת נייר, נגב נוזלים עודפים שמסביב לרקמה עם Kimwipe, ומניח במתקן הצביעה של ההיברידיזציה.
  8. הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת היברידיזציה (מדוללת ביחס 1:10 ב-Buffer W) לכל שקופית והחלו משטח היברידיזציה. סגור את תא ההיברידיזציה, הכניס אותו לתנור ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  9. החלקות טבילה בבופר ציטראט מלח-נתרן (SSC, 2×), ומאפשרת להחלקות ההיברידיזציה להחליק מעצמן תוך 5 דקות.
  10. שטפו את המחסניות בבופר שטיפה קפדני המורכב מחלקים שווים של 4× SSC ופורמיד דה-יונייז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 25 דקות לכל שטיפה. שטוף את המחסניות ב-2× בופר SSC, 2 דקות לכל שטיפה.
  11. חסום את המחסניות עם Buffer W ב-RT למשך 30 דקות.
  12. כסו את הרקמה בתמיסת נוגדנים ראשונית (Rabbit anti-CD45) למשך שעה בתיבת הסלייד של תא הלחות ב-RT, שטפו עם 2× SSC buffer 3x.
  13. מרח תמיסת נוגדנים משנית (Goat Anti-Rabbit IgG-AF647) למשך שעה ושוטף ב-2× בופר SSC.
  14. כיסו את הרקמה בנוגדן מסומן (Mouse anti-SMA-AF488) למשך שעה אחת בקופסת הסלייד של תא הלחות ב-RT. שטפו ב-2× בופר SSC.
  15. צבעו את השקופיות למשך 10 דקות בסמן גרעיני של 2 מיקרומום Syto83 מדולל ב-Buffer W למשך 10 דקות.
  16. סרקו את השקופיות עם מכשיר פרופיל RNA כדי להמחיש את צביעת הסמן המורפולוגי. בחרו פגיעות ROI פרוקסימליות ורחוקות עד מסוידות בכל רקמת עורק, תוך ציון מיקום ייחודי לשכבה של כל ROI.
    הערה: יש להיזהר כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בעת יישום החלפת ההיברידיזציה על חלקי הרקמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מנחה את החוקרים מקבלת עורקי טיביה ועד ליצירת שקופיות TMA השומרות הן על מורפולוגיה והן שלמות RNA לניתוח טרנסקריפטומיקה מרחבית. הוא גם מפרט שיטות היסטולוגיות להמחשת משקעי סידן בעורקים, צביעת סמנים מורפולוגיים ואסטרטגיות לבחירת ROI.

באיור 1, העורקים קבועים ב-10% NBF (שלב 2). NBF חודר לרקמות במהירות, ומפחית את התדרדרות ה-RNA, ובופר הפוספט שלו (pH 7.0) מנטרל חומצה פורמית שנוצרת במהלך הקיבוע, ומונע מה-pH לרדת מתחת ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט את השלבים הנדרשים להכנת עורקי טיביה אנושיים מסוידים לפרופיל טרנסקריפטומי מרחבי ב-NanoString GeoMx DSP. העורקים השוקיים, כמו כל כלי הדם, מכילים שכבות קונצנטריות של אינטימה, מדיה ואדוונטיציה, שכל אחת מהן מכילה אוכלוסיות תאים מובחנות שמארגנות פציעה ותיקון. שמירה על הארכיטקטורה של השכבות הללו חיונית לניתוחים טרנסקריפטומיים בפתרון שכבות, אך מספר שלבי הכנה שלעיתים מתעלמים מהם עלולים לפגוע במטרה זו.

לאחר קבלת רקמות העורקים, יש להסיר את רקמת השומן הפר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענק זרע מ-VA Puget Sound, פרס ההצטיינות של VA I01 BX004975-02, ומשאבים ושימוש במתקנים במרכז הבריאות של VA Puget Sound.  היצירה היא של המחברים ואינה משקפת בהכרח את עמדת או מדיניות משרד ענייני הוותיקים או ממשלת ארצות הברית.  ברצוננו להודות לשירות ההדמיה שמספק ליבת ההיסטולוגיה וההדמיה (HIC) באוניברסיטת וושינגטון.  ברצוננו להודות לד"ר שריראם אקילש על הנחייתו בניסויי DSP באוניברסיטת וושינגטון ולקבוצתו במעבדות MANTIS: ליבת הביולוגיה המרחבית של אוניברסיטת וושינגטון.  נרצה גם להודות לנישי איבנוב ממרכז המחקר לסוכרת באוניברסיטת וושינגטון על צביעת היסטולוגיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM), גלוקוז גבוה, פירובט ו-nbsp;תרמו פישר סיינטיפיק11995065
תמיסת בופר 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזינאתןסולפוניק חומצה (HEPES), 1 מטרתרמו פישר סיינטיפיק15630080
פניצילין-סטרפטומיצין (P/S), 10,000 U/mLתרמו פישר סיינטיפיק15140122
10% פורמלין נייטרלי עם בופר (NBF)מיליפור סיגמא65346-M
אתילן-דיאמין-חומצה טטראצטית (EDTA)מיליפור סיגמא3620
פתרון ייצוב RNAlaterתרמו פישר סיינטיפיקAM7024פתרון ייצוב RNA (RSS)
מי חמצן (H2O2)Advanced Cell Diagnostics, Inc.322335
פתרון שחזור מטרותAdvanced Cell Diagnostics, Inc.322001
פרוטאז פלוסAdvanced Cell Diagnostics, Inc.322331תוסף אנזימי עיכול
DapB (שליטה שלילית)Advanced Cell Diagnostics, Inc.310043
בופר שטיפה RNAscope (ערכת בדיקה RNAscope 2.5 HD Red ISH)Advanced Cell Diagnostics, Inc.320058
AMP1Advanced Cell Diagnostics, Inc.324511
AMP2Advanced Cell Diagnostics, Inc.324512
AMP3Advanced Cell Diagnostics, Inc.324513
AMP4Advanced Cell Diagnostics, Inc.324514
AMP5 אדוםAdvanced Cell Diagnostics, Inc.324515
AMP6 אדוםAdvanced Cell Diagnostics, Inc.324516
אדום מהיר AAdvanced Cell Diagnostics, Inc.324517
Ppib אנושיAdvanced Cell Diagnostics, Inc.313901
גיל' s המטוקסיליןמיליפור סיגמאGHS132
שליפת אנטיגן, טריס/EDTA pH 9תרמו פישר סיינטיפיק00-4956-58
פרוטאנאז Kתרמו פישר סיינטיפיקAM2546
פתרון היברידיזציה - Hs WTAננו-מיתרים121401102
היבריסליפהחלקה של היברידיזציה
פתרון היברידיזציה - בופר Rננו-מיתרים121300313
ארנב נגד CD45 איתות סלולרי1317
בופר Wננו-מיתרים121300313
עז נגד ארנב IgG-AF647Jackson Immunoresearch111-605-144
עכבר נגד SMA-AF488 תרמו פישר סיינטיפיק53-9760
Syto83 תרמו פישר סיינטיפיקS11364
להב ניתוחיBD ביוסיינסס371110
סופרפרוסט  פלוס שקופיות מיקרוסקופתרמו פישר סיינטיפיק1255015
עט ImmEdge
להבי מיקרוטוםתרמו פישר סיינטיפיק22-500-125
RNase AWAYפתרון שגורם לביטול RNase
<חזק>ציוד
תנור היברידיזציה HybEZ  Advanced Cell Diagnostics, Inc.321710
פרופיילר מרחבי דיגיטלי של GeoMxNanostring מודל: GeoMx DSP
פלטפורמת גישה לנתונים: מרכז הבקרה GeoMx DSP (גרסה 3.1.2.12)		הגדרת סריקת ערוצים: עבור FITC, זמן הפיצוץ הוא 300 מילישניות, ופלואורופור הוא AlexaFluro 488; עבור ערוץ Cy3, זמן החשיפה הוא 50 מילישניות, והפלואורופור הוא Syto83; ובערוץ Cy5, זמן החשיפה הוא 300 מילישניות, והפלואורופור הוא AlexaFluor 647.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, A., Barkley, D., França, G. S., Yanai, I. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  2. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  3. Schmitd, L. B., et al. Spatial and transcriptomic analysis of perineural invasion in oral cancer. Clin Cancer Res. 28 (16), 3557-3572 (2022).
  4. Bassiouni, R., et al. Spatial transcriptomic analysis of a diverse patient cohort reveals a conserved architecture in triple-negative breast cancer. Cancer Res. 83 (1), 34-48 (2023).
  5. Hirz, T., et al. Dissecting the immune suppressive human prostate tumor microenvironment via integrated single-cell and spatial transcriptomic analyses. Nat Commun. 14 (1), 663(2023).
  6. Wang, F., et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 9 (24), eadf5464(2023).
  7. Eyers, M., et al. Digital spatial profiling of the microenvironment of muscle invasive bladder cancer. Commun Biol. 7 (1), 737(2024).
  8. Del Rossi, N., Chen, J. G., Yuan, G. C., Dries, R. Analyzing spatial transcriptomics data using giotto. Curr Protoc. 2 (4), e405(2022).
  9. Sona, S., Bradley, M., Ting, A. H. Protocols for single-cell RNA-seq and spatial gene expression integration and interactive visualization. STAR Protoc. 4 (1), 102047(2023).
  10. Ibarra-Lopez, V., et al. Spatial profiling of protein and rna expression in tissue: An approach to fine-tune virtual microdissection. J Vis Exp. (185), e62651(2022).
  11. Mancinelli, L., Schoedel, K. E., Weiss, K. R., Intini, G. Methods to enable spatial transcriptomics of bone tissues. J Vis Exp. (207), e66850(2024).
  12. Sun, P., Li, M., Ye, K. Protocol to decipher complex spatial transcriptomics data using stminer. STAR Protoc. 6 (2), 103838(2025).
  13. Luo, Z., Schmitz, R. J. Protocol for preparing fresh frozen soybean tissues for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 6 (2), 103790(2025).
  14. Li, B., et al. Spatial gene expression of human coronary arteries revealed the molecular features of diffuse intimal thickening in explanted hearts. Int J Mol Sci. 26 (5), 1949(2025).
  15. Pelisek, J., et al. Swiss vascular biobank: Evaluation of optimal extraction method and admission solution for preserving RNA from human vascular tissue. J Clin Med. 12 (15), 5109(2023).
  16. Nam, S. K., et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 48 (1), 36(2014).
  17. Juwayria,, et al. Microarray integrated spatial transcriptomics (MIST) for affordable and robust digital pathology. NPJ Syst Biol Appl. 10 (1), 142(2024).
  18. Wang, H., et al. Systematic benchmarking of imaging spatial transcriptomics platforms in ffpe tissues. bioRxiv. , (2023).
  19. Smith, K. D., et al. Rigor and reproducibility of spatial transcriptomics performed on clinically sourced human tissues. Lab Invest. 104190, (2025).
  20. Amancherla, K., et al. Dynamic responses to rejection in the transplanted human heart revealed through spatial transcriptomics. bioRxiv. , (2025).
  21. Bolen, M., Xue, Q. -S., Tansey, M. G. Ffpe tissue microarray protocol. , (2024).
  22. Wisner, L., Larsen, B., Maguire, A. Manual construction of a tissue microarray using the tape method and a handheld microarrayer. J Vis Exp. (184), e63086(2022).
  23. Zhao, P., et al. Single-cell RNA-seq reveals a critical role of novel pro-inflammatory endothelial cells in mediating adverse remodeling in coronary artery-on-a-chip. Sci Adv. 7 (34), eabg1694(2021).
  24. Fu, M., et al. Single-cell RNA sequencing of coronary perivascular adipose tissue from end-stage heart failure patients identifies SPP1+ macrophage subpopulation as a target for alleviating fibrosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (11), 2143-2164 (2023).
  25. Mao, A., et al. Single-cell RNA-seq reveals coronary heterogeneity and identifies CD133+ TRPV4high endothelial subpopulation in regulating flow-induced vascular tone in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (3), 653-665 (2024).
  26. Li, C., et al. Single-cell RNA sequencing of the carotid artery and femoral artery of rats exposed to hindlimb unloading. Cell Mol Life Sci. 82 (1), 50(2025).
  27. Deroo, E., et al. A vein wall cell atlas of murine venous thrombosis determined by single-cell RNA sequencing. Commun Biol. 6 (1), 130(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNARNAscopeAlizarin Red

מאמרים קשורים