הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

איתות Neuregulin1-ErbB4 המעורב בדיקור שמקדם התחדשות מיאלין בעכברים עם פגיעות חוט השדרה

450 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69166

⸱

20 בפברואר 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency and Intensive Care Unit, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 2Department of Neurology, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 3Department of Emergency and Intensive Care Unit, First Affiliated Hospital, Kunming Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה נועד לחקור את השפעות האלקטרואקפונקטורה על התחדשות המיאלין במודל חולדה של SCI ולוודא האם מסלול האיתות Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4 משחק תפקיד בתהליך זה.

תקציר

פגיעה בחוט השדרה (SCI) גורמת לעיתים קרובות לתפקוד נוירולוגי חמור, ותיקון המיאלין הוא שלב קריטי בהתאוששות התפקוד הנוירולוגי. אלקטרואקפונקטורה (EA), שיטה טיפולית המשלבת דיקור מסורתי עם גירוי חשמלי, יושמה רבות בתחום תיקון העצבים. עם זאת, מסלולי האיתות הספציפיים המעורבים ב-EA טרם הוסברו במלואם. מחקר זה נועד לחקור את השפעות ה-EA על התחדשות המיאלין בעכברי SCI ולוודא האם מסלול האיתות Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4 משחק תפקיד בתהליך זה. חולדות SCI נגרמו על ידי פגיעת קליפ אנוריזמה במקטע עמוד השדרה T10. קטטר פוליאתילן (PE) הושתל בתעלת החוליות בין החללים הבין-חולייניים L5-6 והותקן תת-עורית להקמת מערכת אספקת תרופות לטווח ארוך. NRG1 החיצוני והאנטגוניסט שלו ניתנו דרך קטטר ה-PE כל יומיים, בנפח של 20 מיקרוליטר בכל הזרקה. טיפול EA בוצע בנקודות דיקור דאז'וי (GV14) ומינגמן (GV4) כל יומיים, כל מפגש נמשך 30 דקות במשך 4 שבועות רצופים. התוצאות הראו כי טיפול ב-EA קידם משמעותית את הביטוי של חלבון המיאלין הבסיסי (MBP) ברקמת חוט השדרה ושיפר את תפקוד המוטוריקה של הגפיים האחוריות בעכברים. יתרה מזאת, NRG1 אקסוגני יצר השפעות דומות לאלו של EA. לסיכום, מסלול האיתות NRG1-ErbB4 ממלא תפקיד חשוב בהתחדשות המיאלין המושרה על ידי EA בעכברי SCI.

מבוא

SCI הוא מצב טראומטי שמוביל לליקויים נוירולוגיים חמורים, המופיעים בדרך כלל בפגיעה מוטורית, אובדן חושים ותפקוד אוטונומי לקוי, עם שיעור שכיחות שנתי של כ-40-80 מקרים למיליון אנשים ברחבי העולם. לאחר הפציעה, קרע אקסונלי ואובדן מיאלין הם התכונות הפתולוגיות העיקריות שמפריעות להולכת אותות עצביים3. המיאלין מורכב מאוליגודנדרוציטים במערכת העצבים המרכזית (CNS) ותאי שוואן במערכת העצבים ההיקפית (PNS), ושלמותו חיונית להולכה מהירה של דחפים עצביים4. עם זאת, התגובה הדלקתית, לחץ חמצוני והיווצרות צלקת גליאלית בסביבה המיקרו-מקומית לאחר SCI מעכבים משמעותית את התחדשות המיאלין, מה שמוביל לתפקוד נוירולוגי כרוני5. במקביל, מוות האוליגודנדרוציטים (OLs) לאחר SCI מוביל לדמיאלינציה של אקסונים, תהליך המתפתח כרוני ומתמשך. מחקרים הראו כי דה-מיאלינציה אקסונלית במודלים אנושיים ובעלי חיים ניתנת לתקן ביעילות באמצעות התחדשות מיאלין6. לכן, חיפוש אסטרטגיות לקידום תיקון המיאלין הוא אחד הכיוונים המרכזיים בטיפול ב-SCI.

דיקור, כטכניקה רפואית מסורתית עתיקה, יושמה באופן נרחב בפרקטיקה קלינית במדינות רבות, כולל סין, קוריאהויפן. EA, שמשלבת דיקור מסורתי עם גירוי חשמלי, אומצה באופן נרחב בסביבות קליניות. עדויות הולכות וגדלות מראות של-EA יש השפעות טיפוליות על מחלות שונות, במיוחד בקידום התחדשות המיאלין לאחר פגיעה בחוט השדרה. בחירת נקודות הדיקור היא קריטית במהלך טיפול EA, כגון GV14 ו-GV49. GV14 ממוקם מתחת לתהליך הקוצני של החוליה הצווארית השביעית, סמוך לקו האמצע של עמוד השדרה, בעוד ש-GV4 ממוקם בין התהליכים הקוצניים של החוליותהמותניות ה-2וה-3. מחקרים קודמים הראו כי מסלולי איתות דלקתיים, לחץ חמצוני, גורמים נוירוטרופיים ואוטופגיה משחקים תפקיד בתיקון המיאלין המושרת על ידי EA 10,11,12. יתרה מזאת, ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך שנקודות דיקור מסוימות כמו GV14 ו-GV4 ממלאות תפקיד פעיל בקידום התחדשות המיאלין במהלך טיפול EA 13,14,15. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם EA מווסת את התחדשות המיאלין לאחר פגיעת חוט השדרה טרם הובארו במלואם.

NRG1 הוא חבר במשפחת גורמי הגדילה האפידרמליים, ועל פי אזור האמינו-טרמינלי שלו, ניתן לסווג אותו לשישה סוגים (I-VI)16. NRG1 ומשפחת הקולטנים שלו, ErbB (ErbB1/2/3/4), ממלאים תפקידים משמעותיים בהתפתחות ותיקון מערכת העצבים, כולל תהליכים כמו נדידת נוירונים, התמיינות, רמיאלינציה וסינפטוגנזה. במהלך התפתחות ה-PNS, תאי שוואן (SCs) מתרבים ונודדים לאורך האקסונים של הנוירונים ליצירת מיאלין, ומסלול האיתות NRG1-ErbB4 ממלא תפקיד מרכזי בבגרות תאי הקדם של PNS שוואן17,18. מחקרים קודמים הראו כי מסלול האיתות של NRG1 מעורב בהבדלת תאי גזע עצביים לתאי שוואן ומקדם תיקון מיאלין בתאי עצב לאחר SCI19. בנוסף, מחקר אחד הראה כי לאחר פגיעה בחוט השדרה, מסלול האיתות NRG1-ErbB4 מקדם את הטרנספורמציה של תאי אב האוליגודנדרוציטים (OPCs) לתאים דמויי שוואן עם פוטנציאל רמיאלינציה20. אלכס ועמיתיו בנו מערכת קו-קולטורה של נוירונים חושיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים שנגרמו על ידי אדם ותאי שוואן של חולדות, ומצאו שחסימת מסלול האיתות NRG1-ErbB באמצעות תרופות עיכבה משמעותית את המיאלינציה הנוירונלית, מה שמספק ראיות ישירות לתפקיד מסלול זה בקידום מיאלינציה של אקסון חושיאנושי 21. מחקר נוסף גם הראה שטיפול ב-EA יכול להעלות את הביטוי של NRG1 בחוט השדרה ולהקלעל כאב דלקתי.

המחקר על השפעת EA על מסלול האיתות NRG1-ErbB4 ב-SCI מוגבל, והמנגנונים הבסיסיים נותרו לא ברורים. מחקר זה נועד לבדוק האם גירוי EA בנקודות הדיקור GV14 ו-GV4 יכול לווסת את העברת האות NRG1-ErbB4 ולבחון את תפקידו הפוטנציאלי בקידום התחדשות המיאלין ושיקום תפקוד נוירולוגי בעכברי SCI. זהו המחקר הראשון שבוחן את הקשר בין מסלול האיתות NRG1-ErbB4 לבין התחדשות המיאלין המושרה על ידי EA בעכברי SCI, ומספק ראיות ניסיוניות לפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות ויעילות ל-SCI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההנחיות האתיות נשמרו במהלך הניסוי כדי למזער סבל בעלי חיים. פרוטוקול הניסוי והעיצוב אושרו על ידי ועדת הניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת קונמינג לרפואה (אישור מס' KMMU2021051) ומתבצעת בהתאם להנחיות מחקר בעלי החיים של האוניברסיטה. זכרים בוגרים של חולדות ספרג-דולי (בן 8 שבועות, משקל 250-270 גרם, n = 60) נאספו מאוניברסיטת קונמינג לרפואה (יונאן, סין).

הכנה לבעלי חיים

החיות הוחזקו בסביבה מבוקרת עם לחות קבועה, טמפרטורה מתונה ומחזור אור/חושך של 12 שעות. בעלי החיים חולקו באקראי ל-11 קבוצות: קבוצת ניתוח שמה (S, n = 6), קבוצת SCI (M, n = 6), SCI עם קבוצת טיפול EA (M + EA, n = 6), SCI עם קבוצת טיפול NRG-1β (M + NRG-1β, n = 6), SCI עם קבוצת ממס DMSO 5% (M + D, n = 6), SCI עם מעכב PD158780 וקבוצת טיפול NRG-1β (M + PD+NRG-1β, n = 6), SCI עם מעכב PD158780 וקבוצת טיפול EA (M + EA + PD, n = 6), SCI עם ממס וקבוצת טיפול EA (M + EA + D, n = 6), SCI עם shRNA וקבוצת טיפול EA (M + EA + shRNA, n = 6), SCI עם shRNA שאינו ממוקד בלנטי-וירוס וקבוצת טיפול EA (M + EA + NC, n = 6), SCI עם קבוצת טיפול shRNA (M + shRNA, n = 6). גודל המדגם הנוכחי נקבע על סמך הניסיון הקודם שלנו עם מודלים והתערבויות דומות, שהראו בעקביות השפעות משמעותיות עם מספר זה. יתרה מזאת, למרות גודל המדגם, ראינו הבדלים סטטיסטיים חזקים ומובהקים בתוצאות המרכזיות, מה שמחזק את האמון בממצאים המדווחים.

מודל חולדת SCI

קליפס אנוריזמה Yasargil (טיטניום, כוח סגירה סטנדרטי של 70 גרם) שימש להקמת מודל חולדה של SCI באמצעות טכניקת קלמפ (איור 1A). העכברים הורדמו עם 2% נתרן פנטוברביטל (30 מ"ג/ק"ג, תוך-פריטוני) והונחו על שולחן ניתוחים. בוצע חתך באורך 3-4 ס"מ בעור האחורי, ואחריו בוצע חיתוך שכבה אחר שכבה של הרקמה התת-עורית והשריר, כדי לחשוף את תהליכי הקוץ והקשות החוליותיות של T9-11. קליפס וסקולרי שימש להסרת הזבל הקוצני והקשת החוליתית של T10, וחשף לחלוטין את חוט השדרה. קליפס האנוריזמה של יסרג'יל הוצב אנכית על כל מקטע T10 ושוחרר במהירות לאחר זמן שהייה של 60 שניות. המודל נחשב למוצלח אם נצפו שניים או יותר מהסימנים הבאים: (1) רעד ספזמודי בגוף, (2) רפלקס של נענוע זנב, ו-(3) סימני צביטה שחורים נראים על חוט השדרה. לאחר שווידא שיש המיסטזיס מספק, החתך חוטא ונתפר. בקבוצת הניתוח המדומה, אותו הליך בוצע, למעט שעמוד השדרה לא היה מהודק. לאחר הניתוח, העכברים קיבלו תמיסת מלח רגילה (3 מ"ל, תוך-פריטוני) לצורך החזרת נוזלים ופניצילין (100,000 יחידות, תוך-פריטוניה) פעם בבוקר ופעם בערב במשך שלושה ימים רצופים למניעת זיהום. ניתן סיוע ידני במתן שתן עד שהשתנה הספונטנית שוחזרה (פעמיים ביום).

צינור תוך-אתקלי בעכברים והעברת תרופות

בהמשך לשיטת סטורקסון ואח' 23, הושתל קטטר במרחב התת-עכבישי בעכברים שבוע לפני השראת מודל SCI. לאחר ההרדמה, העכברים הוקצו על שולחן הניתוחים, והחלל הבין-חולייתי L5-6 נחשף. מחט 19G שימשה לחדירה אנכית לדורה מאטר ולממברנת הארכנואיד. המחט התקדמה כ-1-2 מ"מ, ולאחר שפרצה את ממברנת הארכנואיד, הורגשה תחושת מרחב, ואחריה זרימה ברורה של נוזל מוח-שדרה, מה שמעיד על דקירה מוצלחת. קטטר PE-10 (פוליאתילן, קוטר פנימי 0.38 מ"מ, קוטר חיצוני 1.09 מ"מ) הוכנס למרחב התת-עכבישי לאורך מחט הדקירה. הקטטר הוקדם לאורך של כ-3 ס"מ, כאשר קצה הקטטר ממוקם סמוך לגוף החוליה L3. במהלך ההכנסה, נצפו תנועות זנב ועוויתות של הגפה האחורית אצל העכברים, ונוזל מוח-שדרתי זרם החוצה דרך הקטטר, מה שאישר את מיקום הקטטר במרחב התת-עכבישי.

גם NRG-1β וגם PD158780 הומסו בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) ולאחר מכן דוללו בנוזל מוח-שדרה מלאכותי (ACSF), מה שהבטיח שריכוז ה-DMSO הסופי יישאר מתחת ל-0.5%. ריכוזי העבודה הסופיים היו 20 ננומטר ל-NRG-1β ו-20 מיקרומום עבור PD15878024. ביום השני לאחר ה-SCI, חולדות בקבוצת M + NRG-1β קיבלו זריקות תוך-ראשיות של 20 מיקרוליטר NRG-1β כל יומיים. חולדות בקבוצת M + EA + PD קיבלו 20 מיקרוליטר PD158780 תוך-ראשי25, 2 שעות לפני טיפול EA.

טיפול EA

ביום השלישי לאחר הניתוח, החולדות הוקצו על שולחן הטיפול לטיפול אלקטרואקפונקטורה (EA) בנקודות הדיקור GV14 ו-GV4 (איור 1B). שתי מחטי דיקור (0.25 מ"מ x 13 מ"מ) הוכנסו לנקודות אלו לעומק של 3-4 מ"מ. טיפול EA בוצע באמצעות מכשיר אלקטרואקפונקטורה עם דפוס גל דליל (גל דליל ב-2 הרץ וגל צפוף ב-10 הרץ, עם יחס תדר של 1:5). עוצמת הפלט הוגדרה ל-5 (כ-0.5 מיליאמפר) למשך 30 דקות, כל יומיים.

הערכת התנהגות

תפקוד התנועה הוערך באמצעות סולם27 של באסו, בייטי וברסנהאן, שמעריך תנועות גפיים, הליכה, קואורדינציה ומיקום כפות רגליים בנקודות הזמן הבאות: 0, 3, 7, 14, 21 ו-28 ימים לאחר הניתוח ( איור 2D). סולם BBB נע בין 0 (מייצג שיתוק מוחלט) ל-21 (מציין הליכה תקינה). כל ההערכות בוצעו באופן עצמאי על ידי שני חוקרים שהיו עיוורים לשיבוצים בקבוצות הניסוי.

איסוף דגימות

לאחר סיום הניסוי, חולדות מורדמות הוצבו על פלטפורמת דיסקציה לאיסוף רקמות. חלל הבטן נפתח כדי לחשוף במלואו את הסרעפת, אשר נחתכה בקפידה במספריים של הקשתית כדי למנוע פגיעה כלי דם. לאחר מכן נחתך כלוב הצלעות לאורך שני השוליים הצלעיים כדי לחשוף את הלב, ולאחר מכן הוכנס מחט לחדר השמאלי בקודקוד וכ-300-400 מ"ל של PBS מקורר מראש הוזנח במהירות לניקוי דם מערכתי עד שנוזל צלול זרם מהעלייה הימנית. לצורך ניתוח חלבון מולקולרי, הופסקה הפרפוזיה בשלב זה, ועמוד השדרה נותח. לאחר הסרת הצלעות והשרירים הסמוכים לחשיפת החוליות, אותר מקטע T10, וקטע חוט שדרה באורך של כ-1 ס"מ רוסטרלי וזנב עד T10 נאסף באמצעות מספריים של קשתית, ואז הוקפא בחנקן נוזלי ואוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. לבדיקה מורפולוגית, הפרפוזיה הועברה ל-4% פרפורמלדהיד לאחר PBS, כאשר קיבוע מוצלח הצביע על ידי התכווצות השריר וקשיחות הגוף. אותו מקטע עמוד שדרה נותח בקפידה לשימור ארכיטקטורת הרקמה והוכנס לאחר מכן ב-4% פאראפורמלדהיד בטמפרטורה של 4°C למשך 48 שעות.

צביעת המטוקסילין ואאוזין

מקטעי הפרפין בחוט השדרה הוכנסו לתנור בטמפרטורה של 60°C לחימום מוקדם למשך 30 דקות. הסרת שעווה: Xylene I למשך 15 דקות ואחריו Xylene II למשך 15 דקות. הידרציה: מטופלים ב-100% אתנול למשך 2 דקות, לאחר מכן 95% אתנול למשך 2 דקות, לאחר מכן 80% אתנול למשך 2 דקות, ואחריהם 70% אתנול למשך 2 דקות. ולבסוף מים מזוקקים ל-5 דקות. צביעת המטוקסילין נעשתה במשך 7 דקות, ולאחר מכן שטפה במים מזוקקים להסרת שאריות תמיסת הכתמה. התמיינות באלכוהול חומצה הידרוכלורית 1% בוצעה במשך 3 שניות, ולאחר מכן שטיפה במים מזוקקים להסרת תמיסת צביעה שנותרה. בוצעה בלוינג עם 5% מים עם אמוניה במשך 2 דקות, ואחר כך שטפתי את תמיסת הכחול שנותרה. בוצעה צביעת אאוסין למשך 30 שניות, ואחריה שטיפה במים מזוקקים להסרת תמיסת הכתמים שנותרה. ייבוש החלקים נעשה עם 70% אתנול במשך 10 שניות, אחר כך 80% אתנול במשך 10 שניות, ולבסוף עם 100% אתנול למשך 30 שניות. הניקוי נעשה על ידי טיפול בקסילן למשך 5 דקות. לאחר ההרכבה, המגלשות יובשו באוויר, ותמונות צולמו לאחר הייבוש.

צביעת לוקסול מהירה בכחול

החלקים עברו שעוווה פעמיים עם קסילן למשך 10 דקות כל אחד, ואז צובעו בתמיסת צביעת מיאלין LFB, ודגרו במשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ביום הבא, תמיסת צביעה עודפת הוסרה באמצעות 90% אתנול. החתכים הופרדו בתמיסת דיפרנציאציה לוקסול למשך 10 שניות (C0631S), ולאחר מכן טבילה באתנול של 75% למשך 30 שניות עד שהחומר האפור נראה נקי. לבסוף, החלקים צובעו עם תמיסת צביעת אאוזין למשך דקה אחת.

בלוט מערבי

דגימות חלבון הובשלו במים במשך 5 דקות. סך הכל 5 מיקרוליטר של סמן חלבון הוטענו תחילה בג'ל האלקטרופורזה, ולאחר מכן בוצעה טעינה רציפה של דגימות החלבון שנבדקו. האלקטרופורזה החלה ב-80 וולט עד שהפסי הסימון הופרדו בבירור, ולאחר מכן המתח הוגדל ל-130 וולט ונשמר עד להשלמת האלקטרופורזה. ממברנות PVDF שנחתכו מראש הופעלו במתנול למשך דקה, ואז הונחו על נייר סינון, והונחו עם הג'ל המוכן. העברת החלבון בוצעה בזרם קבוע של 300 mA, כאשר זמן ההעברה מותאם לפי משקל מולקולרי (± 10 דקות). לאחר ההעברה, ממברנת ה-PVDF הונחה בקופסת דגירה, נשטפה עם בופר TBST למשך 5 דקות, ואז נחסמה בחלב רזה של 5% בטמפרטורת החדר על שייקר למשך שעתיים. הממברנה נשטפה לאחר מכן 3 פעמים עם בופר TBST למשך 5 דקות כל אחת לפני הדגירה עם נוגדנים ראשוניים, כולל GAPDH (1:2000), טובולין (1:2000), NRG1 (1:1000), ErbB4 (1:1000) ו-MBP (1:1000), במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם ניעור עדין. ביום הבא, הממברנה נשטפה 3 פעמים עם בופר TBST למשך 5 דקות כל אחת, ואז דגרה בנוגדן משני, אנטי-ארנב עז (1:4000), בטמפרטורת החדר על שייקר למשך שעתיים. לאחר שטיפה עם TBST, רצועות חלבון הוצגו באמצעות כימילומינסנציה. ייבא את תמונת WB לתוכנת ImageJ ובצע חיסור רקע באמצעות רדיוס כדור מתגלגל של 50 פיקסלים. לרצועות מוטות, השתמשו בכלי Segmented Line ליישור הרצועות. השתמש בכלי Rectangle כדי לבחור את רצועות היעד וליצור פרופיל צפיפות על ידי בחירת Plot Lanes כדי להמחיש את ערכי הגווני האפור של הרצועות. השתמשו בכלי Magic Wand כדי לחלק את השיאים ולחלץ את ערכי הגווני האפור. לאחר שמירת הנתונים, השתמשו בתוכנת GraphPad Prism ליצירת גרפי עמודות.

אימונופלואורסצנציה

קטעי הפרפין עברו הסרת שעווה פעמיים עם קסילן למשך 10 דקות כל אחד, והודרו מחדש באמצעות סדרת אתנול מדורגת. שליפת אנטיגנים בוצעה על ידי הרחת החלקים בתמיסת חומצה ציטרית של 5% למשך 15 דקות, ולאחר מכן חסימה עם סרום עז של 10% למשך שעתיים. החתכים נדגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם הנוגדנים העיקריים הבאים: NRG-1 מונוקלונלי לעכברים (1:200), ErbB4 מונוקלונלי ארנבי (1:300), ו-MBP מונוקלונלי אנושי (1:300). לאחר שלוש שטיפות עם תמיסת מלח מפושט פוספט המכילה 0.1% Triton X-100 (PBST) למשך 10 דקות כל אחת, הקטעים הוגברו במשך שעה בחושך עם הנוגדנים המשניים הבאים: IgG אנטי-עכבר לעז מסומן על ידי FITC (1:500), IgG אנטי-ארנב של עזים מסומן ב-FITC (1:500), ו-IgG אנטי-אנושי של עזים מסומן על ידי FITC (1:500). החלקים נשטפו 3 פעמים עם PBST למשך 10 דקות כל אחד, ואז הותקנו והותקנו עם תגובת אנטי-פייד לשימור אותות פלואורסצנטיים. המגלשות אוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר מיקום תאי היעד תחת עדשה אובייקטיבית של 10x באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה, עברו לעדשה 40x כדי ללכוד את תמונת הפלואורסצנציה.

תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR)

פריימרים ל-ErbB4 ולגן הייחוס GAPDH עוצבו באמצעות אתר NCBI. רצפי הפריימרים היו כדלקמן: פריימר קדמי ErbB4 : ACAGCCCTCCTCCTGCCTAC; פריימר הפוך ErbB4 : ATCTCAGCCGTTGCACCCT; פריימר קדמי של GAPDH : CCCAGCTTAGGTTCATCATCAGGT; פריימר הפוך של GAPDH : TACGCCAAATCCGTTCACA. רקמת חוט השדרה בגודל של סויה הוכנסה לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, והוספה 600 מיקרוליטר של תגובת חילוץ RNA כוללת. הרקמה הומוגנית לחלוטין ודגרה על קרח במשך 5 דקות, ולאחר מכן בוצעה צנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט הועבר לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל, ונוסף 400 מיקרוליטר כלורופורם. התערובת עורבבה היטב וצנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט הועבר שוב לצינור חדש, ונוסף 400 מיקרוליטר איזופרופנול. התמיסה דוגרה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ואחריה צנטריפוגה בעוצמה של 12,000 x גרם למשך 10 דקות. הסופרנטנט נזרק, וכדור ה-RNA נשטף ב-400 מיקרוליטר של 75% אתנול. לאחר צנטריפוגה בעוצמה של 7,500 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, הסופרנטנט הושלך, והצינור הופך לייבוש באוויר על משטח נקי. כדור ה-RNA הומס ב-60 מיקרוליטר מים ללא RNA, ערבב היטב, ונמדד ריכוז ה-RNA. טוהר וריכוז ה-RNA נרשמו על ידי מדידת ספיגה ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר, מה שהבטיח שהיחס של 260/280 הוא סביב 2.0. לצורך סינתזת cDNA, תגובה 1 (שכללה מחק gDNA וכו') ותגובה 2 (שכללה טרנסקריפטאז הפוך וכו') התערבבו היטב, והתערובת דוגרה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. מערכת תגובת ה-PCR הפלואורסצנציונית הוכנה בהתאם להוראות ערכת הסינתזה של cDNA. דגימה של 2 מיקרוליטר נוספה ל-23 מיקרוליטר של תערובת תגובת PCR, ובוצעה הגברה בהתאם לפרוטוקול ערכת PCR הכמותית הפלואורסצנטית. טמפרטורת האנילינג נקבעה ל-60 מעלות צלזיוס, ותנאי ההגברה היו כדלקמן: קדם-דהנאטורציה: 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, מחזור אחד; תגובת PCR: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 שניות, 60 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, 40 מחזורים; ניתוח עקומת הדיסוציאציה בוצע כך: 95 מעלות צלזיוס ל-5 שניות, 60 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, ואחריה עלייה הדרגתית מ-60 מעלות צלזיוס ל-95 מעלות צלזיוס עם קליטת אות פלואורסצנציה רציפה. ערכי Ct נמדדו וחושבו באמצעות תוכנת המחשב Bio-Rad, ורמות mRNA יחסיות נקבעו באמצעות שיטת 2-ΔΔCt .

הנחיות בטיחות וטיפול

פאראפורמלדהיד קיבוע: השתמש בפרפורמלדהיד אך ורק במכסה אדים מאוורר היטב. תמיד יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל מסכה, כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן. אחסן את תמיסת הפרפורמלדהיד במיכל אטום היטב, הרחק מאור שמש ומקורות חום ישירים. השלכת פסולת פאראפורמלדהיד בהתאם להנחיות הבטיחות של אוניברסיטת קונמינג הרפואית על ידי הנחתה במיכל פסולת מסוכנת.

פתרון DMSO: DMSO יכול להיספג דרך העור ולהיכנס לגוף. לבשו ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות ומשקפי מגן, במהלך הטיפול. אחסן את ה-DMSO במיכל אטום בטמפרטורת החדר, הרחק מסוכנים מחמצנים חזקים. השלכת פסולת DMSO בהתאם להנחיות הבטיחות של אוניברסיטת קונמינג הרפואית על ידי הנחתה במיכל פסולת מסוכנת.

הרדמה פנטוברביטלית: פנטוברביטל הוא חומר מבוקר ויש לטפל בו רק על ידי אנשים מורשים. הימנעו מחשיפה מקרית במהלך הטיפול וודאו אוורור תקין בזמן השימוש. לבש ציוד מגן מתאים. אחסן פנטוברביטל בארון נעול בטמפרטורת החדר, תחת פיקוח של צוות מורשה. סילוק פסולת פנטוברביטל בהתאם להנחיות אוניברסיטת קונמינג לרפואה לחומרים מבוקרים, תוך הבטחת הרשאת שימוש נכונה ונהלי סילוק פסולת.

סילוק פסולת כללי: כל הכימיקלים והתגובות המסוכנות חייבות להיפטר בהתאם להנחיות ניהול המעבדה של אוניברסיטת קונמינג לרפואה. ודאו שכל חומרי הפסולת מסומנים כראוי ומונחים במיכלים מתאימים להשלכה בטוחה.

ניתוח סטטיסטי

כל הניסויים נערכו בשלושה עותקים או יותר. ערכי צפיפות הרצועה של חלבוני המטרה נורמל לאלו של קבוצת הביקורת כדי להקל על השוואות בין הקבוצות. הנתונים מוצגים כחציוני (טווח בין-רבעוני) או כסטיית תקן ממוצעת ±, כאשר n מייצג את מספר העכברים. עבור נתונים שמפוזרים באופן תקין, הוערכו הבדלים משמעותיים בין קבוצות באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA). עבור נתונים שאינם מבוזרים נורמלית, מבחן Kruskal-Wallis H הוחל להשוואת קבוצות. המובהקות הסטטיסטית נקבעה כ-p < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

צביעת H&E וניקוד BBB מדגימים את ההשפעות המגנות של EA על חולדות SCI

צביעת H&E שימשה לבחינת המורפולוגיה והמבנה של תאי הקרניים האחוריים של חוט השדרה (איור 2D). תוצאות H&E חשפו שבקבוצת S, תאי הקרניים האחוריים היו מסודרים בקפידה, עם קווי מתאר של תאים מוגדרים היטב וגרעינים ממוקמים במרכז. לעומת זאת, מספר תאי הקרניים האחוריים הופחת בקבוצה M, עם סידור תאים לא מסודר, והיווצרות ואקואולות, היפרפלזיה של תאי גליה וחללי חוט השדר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מראה שטיפול ב-EA מקל על הקוויטציה והדה-מיאלינציה של חוט השדרה לאחר SCI, ומקדם רמיאלינציה באמצעות הגברת ביטוי חלבון MBP, ובכך משפר את תפקוד המוטוריקה של הגפיים האחוריות בעכברים. יתרה מזאת, זיהינו את מסלול האיתות NRG-1/ErbB4 כמתווך קריטי לרמיאלינציה נוירונית וכמנגנון טיפולי פוטנציאלי שבאמצעותו EA מקדם רמיאלינציה והתאוששות של תפקוד מוטורי של הגפה האחורית בעכברי SCI.

הולכה עצבית ב-SCI מופרעת על ידי גורמים שונים, מה שמוביל לתפקוד נוירולוגי לקוי באתר הפציעה<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

אנו מודים למחברים על תרומתם למחקר זה. מחקר זה נתמך כלכלית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC 81960817, 82260387) ותוכנית המחקר הבסיסי המיוחדת של תוכנית המדע והטכנולוגיה של מחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז יונאן (202301AS070020). פרויקט המחקר והפיתוח המדעי של המכללה הרפואית של צפון סצ'ואן (CBY22-QNA20)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת זיהוי חלבון BCA  ביוטכנולוגיה ביוטייםP0012Sניתוח חלבונים כמותי
מכשיר אלקטרואקופונקטורהמכשיר Huatuo Electroacupuncture, SDZ-V, סוז'ואו—ציוד טיפולי
IgG המסומן על ידי FITC כאנטי-אנושיביוטייםA0556נוגדן משני פלואורסצנטי
IgG נגד עכבר עם תווית FITCביוטייםA0568נוגדן משני פלואורסצנטי
IgG אנטי-ארנב שמסומן על ידי FITCביוטייםA0562נוגדן משני פלואורסצנטי
מיקרוסקופ פלואורסצנציהאולימפוס——
MBP מונוקלונלי אנושיאבקאםab209328נוגדן ספציפי
תמיסת צביעת המיאלין LFBסולרביולוגיהG3240כתמי מעטפת המיאלין
מיליפור ECLמיליפורWBKLS0100מגבי גילוי
NRG-1 מונוקלונלי לעכבר  סנטה קרוזSC-57384נוגדן ספציפי
ננודרופ ND-1000LabTech—
בטא NRG1-1חברת נובופרוטאין טכנולוגיהC753בטא של NRG1-1 האנושי רקומביננטי
PD158780טכנולוגיית GlpBioGC15925מעכב פטור הגדילה האפידרמלי (EGFR) טירוזין קינאז
צינור PE-10בקטון, דיקינסון ושות'427401הזרקה תוך-ראשית
פניצילין נתרן להזרקהחברת הביוטכנולוגיה של הרבין ג'ונגג'ינג80451182טיפול נגד זיהומים לאחר ניתוח
ארנב חד-שבטי ErbB4אבקאםAB109273נוגדן ספציפי
ערכת RNAiso Plusטקארה9109מגני RT-PCR
ערכת ריאגנט RTטקארהRR037Aמגני RT-PCR
נוגדן משניביוטכנולוגיה ביוטיים—נוגדן ספציפי
נתרן פנטוברביטלסיגמא-אלדריץ'69020100הרדמה לבעלי חיים
קליפ אנוריזמה של יסרג'ילרבסטוק אינסטרומנטס GmbH—בניית מודל פגיעת חוט השדרה בעכברוש

מקורות

  1. McDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
  2. Mohammadi, E., Villeneuve, L. M., Smith, Z. A. Spinal Cord Injury: The Global Incidence, Prevalence, and Disability From the Global Burden of Disease Study 2019. Spine. 48 (24), 1767(2023).
  3. Anjum, A., et al. Spinal Cord Injury: Pathophysiology, Multimolecular Interactions, and Underlying Recovery Mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 7533(2020).
  4. Fang, M., Chen, L., Tang, T., Qiu, M., Xu, X. The committed oligodendrocyte precursor cell, a newly-defined intermediate progenitor cell type in oligodendroglial lineage. Glia. 71 (11), 2499-2510 (2023).
  5. Hellenbrand, D. J., et al. Inflammation after spinal cord injury: a review of the critical timeline of signaling cues and cellular infiltration. J Neuroinflammation. 18 (1), 284(2021).
  6. Pukos, N., et al. Chronic demyelination and myelin repair after spinal cord injury in mice: A potential link for glutamatergic axon activity. Glia. 71 (9), 2096-2116 (2023).
  7. Birch, S., Robinson, N. Acupuncture as a post-stroke treatment option: A narrative review of clinical guideline recommendations. Phytomedicine. 104, 154297(2022).
  8. Jiang, K., Sun, Y., Chen, X. Mechanism Underlying Acupuncture Therapy in Spinal Cord Injury: A Narrative Overview of Preclinical Studies. Front Pharmacol. 13, 875103(2022).
  9. Wang, X., et al. Electroacupuncture at Dazhui (GV14) and Mingmen (GV4) protects against spinal cord injury: the role of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Neural Regen Res. 11 (12), 2004-2011 (2016).
  10. Li, S. S., et al. Electroacupuncture treatment improves motor function and neurological outcomes after cerebral ischemia/reperfusion injury. Neural regen res. 17 (7), 1545-1555 (2022).
  11. Liu, C., et al. Electroacupuncture promotes oligodendrocyte differentiation and myelin repair in a rat model of vascular dementia: Investigation of the mechanism from NF-κB-mediated inflammation. Neuroscience. 572, 21-34 (2025).
  12. Tong, T., et al. Electroacupuncture ameliorates chronic unpredictable mild stress-induced depression-like behavior and cognitive impairment through suppressing oxidative stress and neuroinflammation in rats. Brain Res Bull. 206, 110838(2024).
  13. Ahn, S. M., et al. Electroacupuncture ameliorates memory impairments by enhancing oligodendrocyte regeneration in a mouse model of prolonged cerebral hypoperfusion. Sci Rep. 6, 28646(2016).
  14. Kong, Y., Yang, J., Fan, Y. Q., Wang, W. S., Zhang, Y. T. "Huayu Tongluo" moxibustion improves learning-memory ability and promotes myelin regeneration by regulating Sonic Hedgehog signaling pathway in vascular dementia rats. Zhen Ci Yan Jiu. 48 (6), 578-584 (2023).
  15. Chen, W. C., et al. Influence of electroacupuncture of Dazhui (EX-B2) and Mingmen (GV4) on NR2B expression in anterior horns of spinal cord in rats with acute spinal cord injury. Zhen Ci Yan Jiu. 44 (2), 95-101 (2019).
  16. Mei, L., Nave, K. A. Neuregulin-ERBB signaling in the nervous system and neuropsychiatric diseases. Neuron. 83 (1), 27-49 (2014).
  17. Birchmeier, C., Bennett, D. L. Neuregulin/ErbB Signaling in Developmental Myelin Formation and Nerve Repair. Curr Top Dev Biol. 116, 45-64 (2016).
  18. Chen, S., et al. Neuregulin 1-erbB signaling is necessary for normal myelination and sensory function. J Neurosci. 26 (12), 3079-3086 (2006).
  19. Bartus, K., et al. ErbB receptor signaling directly controls oligodendrocyte progenitor cell transformation and spontaneous remyelination after spinal cord injury. Glia. 67 (6), 1036-1046 (2019).
  20. Tao, F., et al. Role of neuregulin-1/ErbB signaling in stem cell therapy for spinal cord injury-induced chronic neuropathic pain. Stem cells. 31 (1), 83-91 (2013).
  21. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
  22. Wan, C., et al. Neuregulin1-ErbB4 Signaling in Spinal Cord Participates in Electroacupuncture Analgesia in Inflammatory Pain. Front Neurosci. 15, 636348(2021).
  23. Tseropoulos, G., et al. Immobilized NRG1 Accelerates Neural Crest like Cell Differentiation Toward Functional Schwann Cells Through Sustained Erk1/2 Activation and YAP/TAZ Nuclear Translocation. Adv Sci (Weinh). 11 (33), e2402607(2024).
  24. Luo, M., et al. Neuronal activity-dependent myelin repair promotes motor function recovery after contusion spinal cord injury. Brain Res Bull. 166, 73-81 (2021).
  25. Hesp, Z. C., Goldstein, E. Z., Miranda, C. J., Kaspar, B. K., McTigue, D. M. Chronic oligodendrogenesis and remyelination after spinal cord injury in mice and rats. J Neurosci. 35 (3), 1274-1290 (2015).
  26. Levy, G., et al. Gtf2i-encoded transcription factor Tfii-i regulates myelination via Sox10 and Mbp regulatory elements. Nat Commun. 16 (1), 8518(2025).
  27. Cescon, M., et al. Gut microbiota depletion delays somatic peripheral nerve development and impairs neuromuscular junction maturation. Gut Microbes. 16 (1), 2363015(2024).
  28. Ayar, Z., et al. The effect of low-level laser therapy on pathophysiology and locomotor recovery after traumatic spinal cord injuries: a systematic review and meta-analysis. Laser Med Sci. 37 (1), 61-75 (2022).
  29. Ghane, N., Beigi, M. H., Labbaf, S., Nasr-Esfahani, M. H., Kiani, A. Design of hydrogel-based scaffolds for the treatment of spinal cord injuries. J Mater Chem B. 8 (47), 10712-10738 (2020).
  30. Laskin, J. J., Waheed, Z., Thorogood, N. P., Nightingale, T. E., Noonan, V. K. Spinal Cord Stimulation Research in the Restoration of Motor, Sensory, and Autonomic Function for Individuals Living With Spinal Cord Injuries: A Scoping Review. Arch Phys Med Rehabil. 103 (7), 1387-1397 (2022).
  31. Li, G., et al. Epidural Spinal Cord Stimulation Promotes Motor Functional Recovery by Enhancing Oligodendrocyte Survival and Differentiation and by Protecting Myelin after Spinal Cord Injury in Rats. Neurosci Bull. 36 (4), 372-384 (2020).
  32. Csomó, K. B., et al. A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats. J Vis Exp. (181), e63534(2022).
  33. Li, J. J., et al. Animal Models for Treating Spinal Cord Injury Using Biomaterials-Based Tissue Engineering Strategies. Tissue eng part b-re. 28 (1), 79-100 (2022).
  34. Coman, I., Barbin, G., Charles, P., Zalc, B., Lubetzki, C. Axonal signals in central nervous system myelination, demyelination and remyelination. J Neurol Sci. 233 (1-2), 67-71 (2005).
  35. Inouye, H., Kirschner, D. A. Evolution of myelin ultrastructure and the major structural myelin proteins. Brain Res. 1641 (Pt A), 43-63 (2016).
  36. Chen, X., Li, H. Neuronal reprogramming in treating spinal cord injury. Neural Regen Res. 17 (7), 1440-1445 (2022).
  37. Huang, S., et al. Protective Effect of Electroacupuncture on Neural Myelin Sheaths is Mediated via Promotion of Oligodendrocyte Proliferation and Inhibition of Oligodendrocyte Death After Compressed Spinal Cord Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1870-1881 (2015).
  38. Kang, Z., et al. Electroacupuncture promotes regeneration and repair of myelin sheath of corpus callosum in demyelination mice. Zhen Ci Yan Jiu. 45 (1), 1-7 (2020).
  39. Zhu, K., et al. Electroacupuncture Promotes Remyelination after Cuprizone Treatment by Enhancing Myelin Debris Clearance. Front Neurosci. 10, 613(2017).
  40. Lu, J. Y., et al. Effects of electroacupuncture at different acupoints on the histomorphology of neurogenic bladder and the expression of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels in interstitial cells of Cajal in a rat model of suprasacral spinal cord injury. Ann Palliat Med. 9 (6), 3830-3838 (2020).
  41. Tu, W. Z., et al. The regulatory effect of electro-acupuncture on the expression of NMDA receptors in a SCI rat model. Life Sci. 177, 8-14 (2017).
  42. Ding, Z., et al. Neuregulin-1 converts reactive astrocytes toward oligodendrocyte lineage cells via upregulating the PI3K-AKT-mTOR pathway to repair spinal cord injury. Biomed Pharmacother. 134, 111168(2021).
  43. Kataria, H., et al. Neuregulin-1 promotes remyelination and fosters a pro-regenerative inflammatory response in focal demyelinating lesions of the spinal cord. Glia. 66 (3), 538-561 (2018).
  44. Schmitd, L. B., et al. Deletion of murine Sarm1 results in a microenvironment that delays peripheral nerve regeneration after injury. Sci Transl Med. 17 (819), eadp9155(2025).
  45. Hu, X., et al. Pan-ErbB inhibition impairs cognition via disrupting myelination and aerobic glycolysis in oligodendrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (45), e2405152121(2024).
  46. Størkson, R. V., Kjørsvik, A., Tjølsen, A., Hole, K. Lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space in the rat. J Neurosci Methods. 65 (2), 167-172 (1996).
  47. Rahimi-Movaghar, V., Jazayeri, S. B. When do we start Basso, Beattie, and Bresnahan assessment after experimental spinal cord injury. Acta Med Iran. 51 (8), 5183(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

טיפול באלקטרו-דיקורשיקום עצביחלבון בסיסי של מיאליןתפקוד הגפיים האחוריותנקודות דיקורNRG1 אקסוגנינתיב איתות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.