הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

CLCF1 פרוטוקול מיוקין המושרה על ידי פעילות גופנית לחקירת מנגנוני הגנת העצם של RANKL/OPG באוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר

595 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69172

⸱

7 בנובמבר 2025

 ,  , 
1Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף לחקירת גורם ציטוקין דמוי קרדיוטרופינים 1 (CLCF1) כמתווך המושרה על ידי פעילות גופנית של הגנת העצם באמצעות אפנון ציר RANKL/OPG באוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר.

תקציר

מחקרים אחרונים זיהו ציטוקין 1 דמוי קרדיוטרופינים (CLCF1) כ"מולקולת נעורים" הנגרמת על ידי פעילות גופנית המתווכת את היתרונות של השרירים והשלד, אך פוחתת עם הגיל. פרוטוקול זה מתאר גישה שיטתית לחקירת התפקיד הרגולטורי של CLCF1 בהגנה על העצם בתיווך פעילות גופנית באמצעות מנגנוני הצלבה בין מערכת החיסון לעצם. המתודולוגיה כוללת ניתוח דגימות קליניות, טכניקות אפיון מולקולרי ומבחנים פונקציונליים כדי להבהיר את השפעת CLCF1 על מפעיל הקולטן של ציר האיתות של הגורם הגרעיני-κB (RANKL)/osteoprotegerin (OPG). באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR), כתמים מערביים, עריכת גנים CRISPR/Cas9 ומערכות תרבית משותפת, פרוטוקול זה מדגים את פעולות ההגנה הכפולות על העצם של CLCF1 באמצעות עיכוב אוסטאוקלסט בתיווך STAT1 וקידום אוסטאובלסטים בתיווך STAT3. השיטות המתוארות מאפשרות הערכה מקיפה של דפוסי ביטוי CLCF1, ניתוחי מתאם עם פרמטרים של צפיפות מינרלים בעצם והערכה מכניסטית של התערבויות טיפול פוטנציאליות מחקות פעילות גופנית. בניגוד לטיפולים אנטי-ספיגה מסורתיים המכוונים בעיקר לאוסטאוקלסטים, התערבויות מבוססות CLCF1 עשויות להציע את היתרון הייחודי של קידום היווצרות עצם בו זמנית תוך עיכוב ספיגה. פרוטוקול זה מספק לחוקרים נהלים סטנדרטיים לחקירת ויסות חילוף החומרים בעצמות בתיווך ציטוקינים המושרה על ידי פעילות גופנית ומקל על פיתוח התערבויות טיפוליות ממוקדות להפרעות עצם הקשורות לגיל.

מבוא

אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר (PMOP) מייצג דוגמה פרדיגמטית לירידה בשרירים ושלד הקשורה לגיל שבה חוסר ויסות של מערכת החיסון מזרז אובדן עצם פתולוגי 1,2,3. למרות שפעילות גופנית מוכרת כהתערבות הלא תרופתית היעילה ביותר למניעת הידרדרות עצם הקשורה לגיל, המנגנונים המולקולריים המדויקים העומדים בבסיס הגנה על העצם הנגרמת על ידי פעילות גופנית נותרו חמקמקים עד לאחרונה4. ההבנה העכשווית של חילוף החומרים בעצמות התפתחה מעבר למסגרות אנדוקרינולוגיות מסורתיות כדי להקיף אינטראקציות אוסטאואימוניות מורכבות ומיוקינים המושרים על ידי פעילות גופנית השולטים בהומאוסטזיס השלד5.

הזיהוי האחרון של גורם ציטוקין דמוי קרדיוטרופין 1 (CLCF1) כגורם המושרה על ידי פעילות גופנית הנלחם בירידה בשרירים ושלד הקשורה לגיל מייצג שינוי פרדיגמה בהבנת דיבור צולב בין עצם לשריר6. תגלית פורצת דרך זו מסבירה את ההשפעות המבוססות היטב של פעילות גופנית המגנה על העצם באמצעות מנגנון מולקולרי שלא היה ידוע בעבר, וממקמת את CLCF1 כמתווך העיקרי של אוסטאואנבוליזם7 המושרה על ידי פעילות גופנית. עכברים טרנסגניים המבטאים יתר על המידה CLCF1 הדגימו היווצרות עצם משופרת, סבילות משופרת לגלוקוז וביצועים גופניים טובים יותר בהשוואה לקבוצת ביקורת מסוג פרא6, מה שמצביע על כך שתוסף CLCF1 עשוי לחקות יתרונות פעילות גופנית באוכלוסיות יושבניות או מוגבלות בניידות.

טיפול מחקה פעילות גופנית מוגדר כהתערבויות תרופתיות המשכפלות קינטיקה של CLCF1 הנגרמת על ידי פעילות גופנית, ומספקות יתרונות טיפוליים הדומים לפעילות גופנית באמצעות מסלולים מולקולריים8. גורם ציטוקין דמוי קרדיוטרופינים 1 (CLCF1), המוגדר לחלופין כנוירוטרופין-1 (NNT-1) או גורם גירוי תאי B-3 (BSF-3), שייך למשפחת הציטוקינים אינטרלוקין-6 (IL-6) ומציג פונקציות ביולוגיות פליאוטרופיות8. במקור אופיין בתכונותיו הנוירוטרופיות בהישרדות והתפתחות נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה, תפקידו של CLCF1 כמיוקין המושרה על ידי פעילות גופנית התגלה כתחום מחקר משמעותי. מחקרים קליניים אחרונים אימתו את CLCF1 כסמן ביולוגי למצב בריאות העצם, והראו כי רמות חלבון CLCF1 בתאים חד-גרעיניים בדם ההיקפיים יורדות באופן משמעותי בנשים לאחר גיל המעבר עם אוסטאופורוזיס בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה9. מחקרים אלה הראו מתאמים חיוביים בין ביטוי CLCF1 לצפיפות המינרלים בעצם באתרי שלד מרובים, מה שמספק אימות קליני המחזק את פוטנציאל התרגום של התערבויות טיפוליות ממוקדות CLCF1.

הציטוקינים פועלים באמצעות קומפלקסים של קולטנים הטרומריים, כולל קולטני גורם נוירוטרופי ריסניים מסיסים (sCNTFR) וגורם דמוי קולטן ציטוקינים -1 (CRLF-1), כדי לתאם תגובות תאיות מגוונות10,11. מחקרים מכניסטיים אחרונים הבהירו את פרדיגמת האיתות הכפול לפיה CLCF1 מעכב בו זמנית את ספיגת העצם ומקדם היווצרות עצם 2,6,7,9. פעולה כפולה זו מתרחשת באמצעות מתמר אותות דיפרנציאלי ומפעיל הפעלת מסלול שעתוק (STAT): זרחון STAT1 מתווך דיכוי אוסטאוקלסט על ידי הפרעה למפעיל הקולטן של איתות גורם גרעיני-κB (RANKL) המושרה על ידי גורם גרעיני-κB (NF-κB), בעוד שהפעלת STAT3 באוסטאובלסטים מקדמת את הביטוי של סמני היווצרות עצם, כולל פוספטאז אלקליין ואוסטאוקלצין.

הבנת האופן שבו תגובות פעילות גופנית חריפות מתורגמות להסתגלות כרונית של העצמות נותרה קריטית להתפתחות טיפולית13. בעוד שעלייה חריפה ב-CLCF1 לאחר אימון בודד מספקת תובנות מכניסטיות, תגובות חריפות חוזרות ונשנות לאורך שבועות עד חודשים עשויות להוביל להשפעות מתמשכות להגנה על העצם באמצעות איתות מצטבר והתאמות תאיות14.

הרציונל לחקירת CLCF1 בפתופיזיולוגיה אוסטאואימונית נובע מתפקידו המבוסס בוויסות לימפוציטים B והכרה בכך שתאי B מהווים יצרנים משמעותיים הן של RANKL והן של אוסטאופרוטגרין (OPG)12,13. מפעיל הקולטן של ציר הגורם הגרעיני-κB ליגנד (RANKL)/osteoprotegerin (OPG) משמש כמנגנון הרגולציה המרכזי להתמיינות אוסטאוקלסטים וספיגת עצם14,15. בניגוד לבני משפחת IL-6 אחרים שהפגינו שליטה רגולטורית על הומאוסטזיס השלד באמצעות אפנון שיפוץ עצם, מנגנון ההגנה הכפול הייחודי של CLCF1 מציע פוטנציאל טיפולי מעולה 16,17,18.

היתרונות של פרוטוקול זה על פני המתודולוגיות הקיימות כוללים את הגישה המקיפה שלו להפעלת חקירה אוסטאואימונית, המשלבת הן ניתוח מתאם קליני והן מחקרים תאיים מכניסטיים כדי לספק תובנות תרגומיות לגבי ויסות חילוף החומרים בעצם בתיווך CLCF1. הרלוונטיות הקלינית של פרוטוקול זה משופרת עוד יותר על ידי ראיות מתפתחות לכך שניתן לווסת את רמות CLCF1 באמצעות התערבויות באורח חיים, מה שממצב אותו כיעד טיפולי מעשי להפרעות עצם הקשורות לגיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר המוסדי (פרוטוקול #2024-CHSD-0156) ודבק בעקרונות הצהרת הלסינקי. כל הנהלים בבעלי חיים עמדו בהנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (פרוטוקול #2024-037). כל המשתתפים נתנו הסכמה מדעת בכתב.

1. איסוף דגימות קליניות והערכת התערבות בפעילות גופנית

  1. גיוס משתתפים והערכת היסטוריית אימונים
    1. גייסו נשים לאחר גיל המעבר בגילאי 55-75 שנים עם משך מינימום של שנה לאחר גיל המעבר.
    2. העריכו היסטוריית פעילות גופנית מפורטת, כולל תדירות, עציפות, סוג ומשך הפעילות הגופנית במהלך 6 החודשים האחרונים באמצעות שאלוני פעילות גופנית סטנדרטיים.
    3. סווגו את המשתתפים לקבוצות בישיבה (< 150 דקות בשבוע), פעילות בינונית (150-300 דקות בשבוע) ופעילות מאוד (> 300 דקות בשבוע) על סמך הנחיות הפעילות הגופנית של ארגון הבריאות העולמי.
    4. בצע הערכה מקיפה של היסטוריה רפואית ובדיקה גופנית, כולל סקירת תרופות ובדיקת תחלואה נלווית.
    5. השג מדידות ספיגת קרני רנטגן באנרגיה כפולה (DXA) באמצעות מד צפיפות Hologic Discovery A עם תוכנת APEX v4.5. בצע כיול יומי עם פנטום עמוד השדרה. מקם את המטופל בשכיבה עם רגליים מורמות על בלוק מיקום בהתאם להנחיות האגודה הבינלאומית לצפיפות קלינית (ISCD).
    6. לסווג את המשתתפים לפי קריטריונים של ארגון הבריאות העולמי לאוסטאופורוזיס (T-score ≤ -2.5 SD).
    7. החל קריטריונים לאי-הכללה: טיפול אנטי-אוסטאופורוטי קודם תוך 12 חודשים, טיפולים מדכאי חיסון, מחלות עצם מטבוליות, אוסטאופורוזיס משני או התוויות נגד לבדיקות מאמץ.
  2. הערכת תגובת CLCF1 הנגרמת על ידי פעילות גופנית
    1. אסוף דגימות דם בסיסיות בין השעות 8:00-10:00 בבוקר לאחר 12 שעות צום לילה בצינורות EDTA.
    2. יישם פרוטוקול פעילות גופנית אקוטית סטנדרטי: 45 דקות הליכה בעצימות בינונית בקצב לב מקסימלי של 65-70%. חשב דופק מרבי באמצעות נוסחת Karvonen (גיל 220)19. בצע פעילות גופנית על הליכון ממונע עם ניטור דופק רציף באמצעות מוניטור רצועת חזה. שמור על מהירות הליכה של 3.5-4.5 קמ"ש עם התאמת דרגה להשגת דופק היעד.
    3. אסוף דגימות דם לאחר פעילות גופנית בנקודות זמן של שעה, 4 שעות ו-24 שעות כדי להעריך את קינטיקה של CLCF1, תוך שמירה על תנאי איסוף עקביים.
    4. יש לאחסן את כמות הסרום בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לכימות CLCF1 לאחר מכן. השתמש בערכת CLCF1 ELISA אנושית עם טווח זיהוי של 31.2-2000 pg/mL. דגימות מדוללות 1:2 בדיקה. הכן עקומה סטנדרטית של 7 נקודות באמצעות דילולים טוריים פי 2. הפעל דוגמאות כפולות. קרא לוחות ב-450 ננומטר עם תיקון אורך גל של 540 ננומטר. קבל מקדם שונות (CV) < 20% בין כפילויות.
  3. פרוטוקול התערבות פעילות גופנית אורכית
    1. תכננו תוכנית אימונים מתקדמת של 12 שבועות עם שלושה מפגשים בשבוע.
    2. אסוף דגימות דם בנקודת ההתחלה, 4, 8 ו-12 שבועות לניתוח מסלול CLCF1.
    3. העריכו את שיפורי הכושר באמצעות בדיקות VO2 max בנקודת ההתחלה ובנקודת הקצה.
    4. מתאם שינויים ב-CLCF1 עם שיפורים ב-BMD שנמדדו על ידי DXA לאחר 12 שבועות.
    5. תעד התאמות לאימונים, כולל סבילות לפעילות גופנית ודפוסי התאוששות.

2. בידוד ועיבוד משופר של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMC)

  1. בידוד PBMC ממוטב עבור ניתוח CLCF1
    1. אסוף 20 מ"ל של דגימות דם ורידי בצינורות המכילים EDTA (5 מ"ל EDTA לשפופרת) בתנאים סטריליים.
    2. עבד דגימות תוך שעתיים מהאיסוף לכדאיות תאים אופטימלית ושימור ביטוי CLCF1.
      1. יש לדלל דגימות דם ביחס של 1:1 עם מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) בטמפרטורת החדר. מערבבים 20 מ"ל דם עם 20 מ"ל PBS.
      2. שכבת דם מדולל על מדיום שיפוע צפיפות בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל. השתמש במדיום שיפוע צפיפות של 15 מ"ל לכל 20 מ"ל דם מדולל (יחס של 1:1.33).
    3. צנטריפוגה בחום של 400 × גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ללא בלם.
    4. שאפו בזהירות את שכבת ה-PBMC בממשק הפלזמה-פיקול באמצעות פיפטה פסטר סטרילית.
    5. שטפו את התאים פעמיים עם PBS המכיל 2% סרום בקר עוברי (FBS) על ידי צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות.
  2. הערכת כדאיות התאים ומדידת קו הבסיס של CLCF1
    1. קבע את כדאיות התא באמצעות שיטת אי הכללת טריפן כחול (יעד > כדאיות של 95%)20.
    2. הערכת ביטוי CLCF1 תוך תאי בסיסי מיד לאחר הבידוד.
    3. התאם את ריכוז התאים ל-1 ×-106 תאים/מ"ל במדיום המתאים.
    4. הקצה תאים ליישומים במורד הזרם או אחסן בחנקן נוזלי. הקפיאו PBMCs במדיום הקפאה המכיל 90% FBS + 10% DMSO. השתמש במיכל הקפאה בקצב מבוקר ב-1 מעלות צלזיוס לדקה עד -80 מעלות צלזיוס. יש לאחסן 1 מ"ל (5 × 106 תאים/בקבוקון) בקריוביאלים.

3. ניתוח כמותי מקיף של ביטוי גנים

  1. מיצוי וטיהור RNA עם שיקולים ספציפיים ל-CLCF1
    1. Lyse 1 × 106 PBMCs ב-1 מ"ל של מגיב ליזיס RNA תוך שעה אחת מהבידוד.
    2. מוסיפים 200 מיקרוליטר כלורופורם, מערבולת במרץ ודוגרים במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להשגת הפרדת פאזה.
    4. העבירו את השלב המימי לצינור טרי, הוסיפו נפח שווה של איזופרופנול.
    5. לזרז RNA על ידי צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    6. שוטפים את כדור ה-RNA עם 75% אתנול, מייבשים באוויר וממיסים במים נטולי נוקלאז.
    7. הערכת תקינות RNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז או ביואנלייזר (RIN מטרה >7.0).
  2. שעתוק הפוך ו-PCR כמותי עם ערכות פריימר מעודכנות
    1. כימות ריכוז RNA באמצעות ניתוח ספקטרופוטומטרי (יחס יעד A260/A280 1.8-2.2).
    2. בצע שעתוק הפוך באמצעות 1 מיקרוגרם של RNA כולל עם ערכת ריאגנט שעתוק הפוך.
    3. הכן תגובות qPCR: הכן 20 מיקרוליטר תגובות המכילות 10 מיקרוליטר של מאסטר מיקס, 0.8 מיקרוליטר מכל פריימר (מלאי 10 מיקרומטר, 400 ננומטר סופי), 2 מיקרוליטר של תבנית cDNA (50 ננוגרם), 6.4 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. הפעל משולש. השתמש במערכת PCR בזמן אמת.
    4. השתמש ברצפי פריימר מאומתים:
      1. CLCF1 קדימה: 5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3',
        גב: 5'-TGCCACCATGTTTTTTTCCT-3'
      2. CRLF1 קדימה: 5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3',
        גב: 5'-CAGCATCTCCTCCTTGATGC-3'
      3. STAT1 פורוורד: 5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3',
        גב: 5'-AAGGTCAGCGATCTCTTCAG-3'
      4. STAT3 פורוורד: 5'-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3',
        גב: 5'-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3'
    5. בצע פרוטוקול qPCR: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
    6. נתח תוצאות בשיטת 2(-ΔΔCt) עם נורמליזציה של β-אקטין21.
  3. ניתוח פאנל גנים של פעילות גופנית-תגובה
    1. כלול גנים המגיבים לפעילות גופנית: IL-6, TNF-α, IL-1β, BDNF, IGF-1 ומיוסטטין.
    2. השתמש ברצפי פריימר מאומתים:
      1. IL-6 קדימה: 5'-AGCCACTCACCTCTTCAGAAC-3',
        גב: 5'-GCCTCTTTGCTGCTCTCTCACAC-3';
      2. TNF-α פורוורד: 5'-CCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3',
        גב: 5'-ATGGGCTACAGGCTTCTCACT-3';
      3. IL-1β קדימה: 5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3',
        גב: 5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3';
      4. BDNF קדימה: 5'-TAACATGGCTGCGGTGTGT-3',
        גב: 5'-CGAGTGGGTCACAGCGGCAG-3';
      5. IGF-1 קדימה: 5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3',
        גב: 5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3';
      6. מיוסטטין פורוורד: 5'-AGTGACGGGCTCTTTGGAGA-3',
        גב: 5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'.
    3. מתאם שינויים הנגרמים על ידי פעילות גופנית ב-CLCF1 עם דפוסי ביטוי מיוקין אחרים.
    4. להעריך את יחסי הביטוי המשותף של CLCF1/CRLF1 כאינדיקטורים להיווצרות קומפלקס ציטוקינים פונקציונלי.

4. ניתוח ביטוי חלבון משופר עם מיקוד מסלול STAT

  1. מיצוי וכימות חלבון לניתוח STAT
    1. Lyse PBMCs במאגר ליזה (150 מ"מ NaCl, 1% NP-40, 0.5% נתרן דאוקסיכולאט, 0.1% SDS, 50 מ"מ Tris-HCl pH 8.0) בתוספת קוקטיילים מעכבי פרוטאז ופוספטאז.
    2. הוסף כמה מעכבי פוספטאז ספציפיים: נתרן אורתוואנדאט (1 מ"מ) ונתרן פלואוריד (50 מ"מ) מיד לפני השימוש.
    3. דגירה על ליזטים על קרח למשך 30 דקות עם מערבולת תקופתית במהירות בינונית כל 10 דקות.
    4. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להסרת פסולת תאית.
    5. כימות ריכוז החלבון באמצעות מבחן ברדפורד או שיטת BCA22.
    6. התאם את ריכוזי החלבון ל-2 מיקרוגרם/מיקרוליטר במאגר דגימה ואחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף ליישומי Western Blotting.
  2. ניתוח מקיף של כתמים מערביים עם מיקוד איתות STAT
    1. הכינו 10 מ"ל של 10% ג'ל SDS-PAGE באמצעות תמיסות אקרילאמיד/ביסקרילאמיד סטנדרטיות.
    2. טען 20 מיקרוגרם חלבון לכל נתיב לצד סמני משקל מולקולרי מוכתמים מראש ופתור ב-120 וולט למשך 90 דקות.
    3. העברת חלבונים לממברנות PVDF ב-100 וולט למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות מאגר העברה (25 מ"מ טריס, 192 מ"מ גליצין, 20% מתנול).
    4. חסום ממברנות עם 50 מ"ל חלב יבש ללא שומן 5% בתמיסת מלח Tris-buffered עם 0.1% Tween-20 (TBST).
    5. דגירה עם נוגדנים ראשוניים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס: Anti-CLCF1 (1:1,000); אנטי-CRLF1 (1:1,000); אנטי-OPG (1:1,000); אנטי-רנקל (1:1,000); אנטי-JAK2 (1:1,000); אנטי-פוספו-JAK2 (Tyr1007/1008, 1:1,000); אנטי-סטטיסטיקה 1 (1:1,000); אנטי-פוספו-STAT1 (Tyr701, 1:1,000); אנטי-STAT3 (1:1,000); אנטי-פוספו-STAT3 (Tyr705, 1:1,000); אנטי-β-אקטין (1:1,000)
    6. שוטפים ממברנות 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחת עם 15 מ"ל TBST. דגירה עם נוגדנים משניים מתאימים למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    7. זיהוי רצועות חלבון באמצעות מצע כימילומינסנציה משופר. תמונה באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציה עם אופטימיזציה אוטומטית של חשיפה. כמת באמצעות ניתוח צפיפות עם כלי ניתוח ג'ל ImageJ v1.53.
  3. ניתוח מסלול כפול STAT1/STAT3
    1. חשב יחסי phospho-STAT1/סה"כ STAT1 ו-phospho-STAT3/סה"כ STAT3 באמצעות תוכנת ImageJ/Fiji גרסה 1.54f.
    2. הערך את מאזן ההפעלה של STAT1/STAT3 כאינדיקטור לפעילות תפקודית של CLCF1.
    3. מתאם דפוסי הפעלת STAT עם יחסי ביטוי RANKL/OPG.
    4. העריכו זרחון STAT1/STAT3 באמצעות כתם מערבי ב-0, 15, 30, 60, 120 ו-240 דקות לאחר הטיפול ב-CLCF1. לנרמל פוספו-חלבון לרמות חלבון כוללות באמצעות דנסיטומטריה.

5. נוקאאוט גן מתקדם בתיווך CRISPR/Cas9 עם אימות

  1. בניית וקטור לנטי-ויראלי משופרת
    1. תכנן RNA מדריך יחיד (sgRNA) המכוון לרצף הגנים CLCF1:
      TTGAAGTCTCTCTCGTTGAA-3'.
    2. כלול רצפי sgRNA נוספים לשיפור יעילות הנוק-אאוט:
      GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3'.
    3. שיבוט sgRNAs לווקטור לנטי-ויראלי באמצעות טכניקות שיבוט מולקולאריות סטנדרטיות.
    4. אמת את שלמות המבנה באמצעות ניתוח ריצוף DNA.
    5. העריכו את יעילות חיתוך sgRNA באמצעות מבחן T7 endonuclease I23.
    6. כלול אימות ספציפיות מסלול באמצעות מעכבים: AG490 (JAK2, 50 מיקרומטר), פלודארבין (STAT1, 10 מיקרומטר) וסטטי (STAT3, 5 מיקרומטר).
    7. בצע ניסויי הצלה באמצעות מבני STAT פעילים באופן מכונן כדי לאמת את נחיצות המסלול.
  2. פרוטוקול התמרה לנטי-ויראלי אופטימלי
    1. תרבית תאי ראג'י במדיום RPMI-1640 (500 מ"ל) בתוספת 10% FBS. שמור על כל תרביות התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO2. יש לאזן מראש את מדיית התרבות למשך 30 דקות לפחות לפני השימוש.
    2. טפל בתאים מקדימים עם פוליברן (8 מיקרוגרם/מ"ל) כדי לשפר את יעילות ההתמרה.
    3. לייצר לנטי-וירוס באמצעות תאי HEK293T עם אריזה ומעטפת פלסמידים באמצעות העברת סידן פוספט. קבע טיטר לפי p24 ELISA (נדרש > 108 TU/mL). עקוב אחר נהלי הבלימה של BSL-223.
    4. להמיר תאים עם lentivirus בריבוי זיהום (MOI) של 100. החלף מדיה 24 שעות לאחר ההעברה. בחר תאים מותמרים באמצעות פורומיצין (4 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 7 ימים, ולאחר מכן הגביר אזור של 500 bp המשתרע על אתר היעד באמצעות תנאי ה-PCR הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואחריה 35 מחזורי דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, חישול ב-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, עם הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לבדיקת אנדונוקלאז T7, דנטורציה וחישול מחדש של תוצרי ה-PCR, עיכול עם אנדונוקלאז T7E1 למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן ניתוח המוצרים על ג'ל אגרוז 2%.
    5. אמת את יעילות הנוקאאוט של הגן באמצעות הכתמה מערבית וריצוף סנגר24,25.
    6. בצע ניתוח מחוץ למטרה באמצעות GUIDE-seq או מתודולוגיה דומה26.
      הערה: עדויות עדכניות מראות כי יעילות הפרשת CLCF1 דורשת ביטוי משותף עם חלבון צ'פרון CRLF1. שקול גישות נוקאאוט כפולות לאבלציה פונקציונלית מלאה27.

6. מערכת קו-תרבית מקיפה עם חיקוי פעילות גופנית

הערה: לאימות תרגומי, הסתגל למודלים של עכברים עם שחלות על ידי מתן rhCLCF1 ב-10 מיקרוגרם/ק"ג i.p. מדי יום למשך 4 שבועות, הערכת BMD באמצעות מיקרו-CT.

  1. מערך מתקדם של תרבית משותפת Raji-MG-63
    1. זרעים MG-63 תאים דמויי אוסטאובלסטים בתאים תחתונים של 24 בארות בצפיפות של 2 × 104 תאים לבאר באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ו-95% לחות. אזנו מראש את המדיה בחממה למשך 30 דקות לפני השימוש. לתרגום משופר, החלף באוסטאובלסטים אנושיים ראשוניים (צפיפות 1 × 104 לבאר) ממקורות מסחריים.
    2. הנח תוספות ממברנה בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר בבארות המכילות תאי MG-63.
    3. תאי ראג'י זרעים (מסוג בר, CLCF1-knockout, או CLCF1-ביטוי יתר) בחדרים העליונים בצפיפות של 1 × 105 תאים/באר.
    4. שמור על תרביות משותפות במדיום RPMI-1640 שלם (2 מ"ל בתא התחתון, 1.5 מ"ל בתא העליון) לתקופות ניסוי מוגדרות (7, 14, 21 ימים) ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    5. כלול קבוצות טיפול רקומביננטיות CLCF1 (5-10 ננוגרם/מ"ל) כדי להעריך קשרי מינון-תגובה.
  2. פרוטוקול טיפול CLCF1 מחקה פעילות גופנית
    1. לטפל במערכות תרבית משותפת עם ריכוזים פיזיולוגיים של CLCF1 רקומביננטי (5-10 ננוגרם/מ"ל) בהתבסס על רמות הנגרמות על ידי פעילות גופנית.
    2. החל משטר טיפול פועם CLCF1: יש למרוח CLCF1 למשך פולסים של שעתיים ב-0, 8 ו-16 שעות ביום הראשון, ולאחר מכן חשיפה רציפה למשך 24 שעות, ולאחר מכן לחזור על המחזור. משך הטיפול הכולל: 7 ימים עם 9 פולסים בסך הכל.
    3. הערכת השפעות תלויות זמן לאחר שעה, 4 שעות, 24 שעות ו-7 ימים לאחר הטיפול.
    4. עקוב אחר קינטיקה של זרחון STAT1/STAT3 בשתי אוכלוסיות התאים באמצעות כתם מערבי ב-0, 15, 30, 60 דקות. תאי ליז במאגר (500 מיקרוליטר) עם מעכבים, מנרמל לסך STAT1/3 ו-β-אקטין.
  3. הערכת התמיינות אוסטאוגנית משופרת
    1. לגרום להתמיינות אוסטאוגנית באמצעות מדיום אוסטאוגני סטנדרטי המכיל חומצה אסקורבית (50 מיקרוגרם/מ"ל), β-גליצרופוספט (10 מ"מ) ודקסמתזון (10 ננומטר). החלף מדיום אוסטאוגני כל 3 ימים (תא תחתון 2 מ"ל, תא עליון 1.5 מ"ל). הכן תמיסת חומצה אסקורבית טרייה לכל שינוי; β-גליצרופוספט ודקסמתזון נשארים יציבים.
    2. העריכו את פעילות הפוספטאז האלקליין (ALP) באמצעות בדיקת אנזים קולורימטרי בימים 7, 14 ו-2128. השתמש בנפח מיצוי של 500 מיקרוליטר. קרא ב-405 ננומטר. מנרמל לתכולת החלבון הכוללת. טווח צבעים צפוי: צהוב בהיר (נמוך) עד צהוב כהה (גבוה).
    3. הערך את שקיעת הסידן באמצעות צביעה וכימות של Alizarin Red S ביום 21. תמצית עם 500 מיקרוליטר של צטילפירידיניום כלוריד, נקרא ב-540 ננומטר, טווח צבעים צפוי: ורוד בהיר (מינרליזציה נמוכה) עד אדום כהה (מינרליזציה גבוהה).
    4. כימות מינרליזציה על ידי מדידת ספיגה ב-540 ננומטר לאחר מיצוי צטילפירידיניום כלוריד.
    5. ניתוח ביטוי גנים אוסטאוגני: RUNX2, ALP, COL1A1, OCN ו-OPGבאמצעות פרוטוקולי qPCR המתוארים בשלב 3.2.
    6. להעריך סמנים הקשורים לאוסטאוקלסטים: TRAP, קטפסין K ו-RANKL בתאי MG-63.

7. ניתוח סטטיסטי מתקדם ופרשנות נתונים

  1. מתודולוגיה סטטיסטית מקיפה
    1. בצע בדיקת נורמליות באמצעות מבחן שפירו-וילק עבור כל המשתנים הרציפים29. השתמש במבחנים לא פרמטריים כאשר הנחות הנורמליות מופרות (p < 0.05).
    2. החל את מבחן Mann-Whitney U להשוואות לא פרמטריות בין קבוצות30.
    3. ביצוע ניתוח מתאם ספירמן למחקרי קשר בין רמות CLCF1 לפרמטרים קליניים31.
    4. בצע ניתוח רגרסיה מרובה כדי להעריך מנבאים בלתי תלויים של BMD.
    5. השתמש במדידות חוזרות ANOVA לניתוח זמן התערבות בפעילות גופנית32.
    6. החל תיקון Bonferroni עבור השוואות מרובות33.
    7. הגדר סף מובהקות סטטיסטית ב-p <-0.05 עבור כל הניתוחים.
  2. הצגה וניתוח נתונים משופרים
    1. הצג נתונים רציפים כממוצע ± סטיית תקן או חציון עם טווח בין-רבעוני.
    2. צור עלילות מתאם לביטוי CLCF1 לעומת BMD, ספירת לימפוציטים ופרמטרים של פעילות גופנית באמצעות GraphPad Prism v9 לסטטיסטיקה, ImageJ v1.53 לצפיפות. אין צורך בקבצי Script מותאמים אישית. צור ROC באמצעות הכלי המובנה של פריזמה; קורלציות באמצעות ספירמן בפריזמה.
    3. צור תרשימי מהלך זמן עבור קינטיקה של תגובת CLCF1 הנגרמת על ידי פעילות גופנית.
    4. לפתח עקומות מאפיין הפעלה של מקלט (ROC) עבור CLCF1 כסמן ביולוגי לאוסטאופורוזיס.
      הערה: תמונות כתם מערביות מייצגות נוצרו באמצעות ניתוח צפיפות כמותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יישום פרוטוקול זה מדגים בהצלחה את תפקידו הרגולטורי של CLCF1 במטבוליזם של עצמות בתיווך חיסוני באמצעות גישות ניסיוניות מרובות. מחקרי התיקוף הקליניים מראים ירידה משמעותית בביטוי CLCF1 במטופלות PMOP בהשוואה לבקרות בריאות, כפי שמודגם באיור 1A, ניתוח PCR כמותי של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי הראה כי רמות ה-mRNA היחסיות של CLCF1 ירדו באופן ניכר בקבוצת PMOP (n = 109) בהשוואה לבקרות בריאות לאחר גיל המעבר (n = 94), עם ירידה של כ-40% בביט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מספק מסגרת מתודולוגית מקיפה לחקירת תפקידו של CLCF1 כמתווך המושרה על ידי פעילות גופנית של הגנת העצם באמצעות ניתוח שיטתי של ציר RANKL/OPG. מחקר פורץ דרך שנערך לאחרונה זיהה את CLCF1 כגורם המושרה על ידי פעילות גופנית הנלחם בירידה בשרירים ושלד הקשורה לגיל, וממקם אותו כמתווך מרכזי להגנה על העצם הנגרמת על ידי פעילות גופנית 34,35,36. פרוטוקול משופר זה מטפל בפער ידע קריטי באוסטאימונו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

המחברים מודים למשתתפים שהתנדבו למחקר זה ולצוות הקליני בבית החולים המרכזי המסונף לאוניברסיטה הרפואית הראשונה של שאנדונג על עזרתם בגיוס מטופלים ואיסוף דגימות. אנו מודים לטכנאי המעבדה על תמיכתם בניסויים בתרבית תאים ובביולוגיה מולקולרית. ח.ז. הגה ועיצב את המחקר, ביצע את הניסויים, ניתח את הנתונים וכתב את כתב היד. ה.ל. תרם לתכנון ניסויים, איסוף נתונים ותיקון כתבי יד. י.ש. פיקח על הפרויקט, סיפק משוב ביקורתי וערך את כתב היד. כל המחברים בדקו ואישרו את כתב היד הסופי להגשה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Cell Culture Media & ריאגנטים
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אלדריץ'D2650Purpose_Application:  רכיב המדיה לשימור קריופרטי
Specifications_Comments: דרגת ביולוגיה מולקולרית, מסונן סטרילי
מדיום DMEMתרמו פישר סיינטיפיק11965092Purpose_Application:  תרבית אוסטאובלסטר MG-63 מדיום
Specifications_Comments: נוסחה גבוהה לגלוקוז עם L-גלוטמין
סרום בקר עוברי (FBS)תרמו פישר סיינטיפיק16000044Purpose_Application:  תוסף תרבית תאים (מושבת חום)
Specifications_Comments: מושבת בחום ב-56Â ° C ל-30 דקות
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק15140122Purpose_Application:  תוסף אנטיביוטיקה לתרבות סטרילית
Specifications_Comments: מלאי פי 100, ריכוז סופי 1%
פוליברן (הקסדימטרין ברומיד)ביוטכנולוגיה של סנטה קרוזSC-134220Purpose_Application:  משפר הטרנסדוקציה לנטיויראלי
Specifications_Comments: 8 & Icirc; ¼ ריכוז עבודה של g/mL
פורומיצין דיהידרוכלורידInvivoGenאנט-PR-1Purpose_Application:  אנטיביוטיקת ברירה לתאים מומרת
Specifications_Comments: 4 & Icirc; ¼ ריכוז ברירה של g/mL למשך 7 ימים
RPMI-1640 בינוניתרמו פישר סיינטיפיק11875093Purpose_Application:  תרבית לימפוציטים של רג'י B-B
Specifications_Comments: עם L-גלוטמין, ללא פנול אדום מועדף
פתרון כחול טרייפןתרמו פישר סיינטיפיק15250061Purpose_Application:  הערכת קיום התאים
Specifications_Comments: פתרון של 0.4% לבדיקת הדרה
מיכל הקפאה בקצב מבוקרתרמו פישר סיינטיפיק5100-0001Purpose_Application:  הקפאת תאים בקצב מבוקר (-1Â ° C/min)
Specifications_Comments: מר פרוסטי או מקביל ל-1Â ° קירור C/min
צינורות איסוף דם של EDTABD ביוסיינסס366643Purpose_Application:  איסוף דם ורידי עם נוגדי קרישה
Specifications_Comments: קיבולת של 10-20 מ"ל, צינורות עליונים סגולים
גרדיאנט צפיפות Ficoll-Paque PLUSציטיבה (GE Healthcare)17144003Purpose_Application:  בידוד PBMC באמצעות צנטריפוגציה בצפיפות
Specifications_Comments: סטרילי, נבדק על ידי אנדוטוקסין להפרדת תאים
מלח זרחן (PBS)תרמו פישר סיינטיפיק14190144Purpose_Application:  בופר שטיפת תאים ודילול
Specifications_Comments: סטרילי, דרגת תרבית תאים
<חזק> RNA וחילוץ qPCR
כלורופורם (דרגת ACS)סיגמא-אלדריץ'C2432Purpose_Application:  הפרדת פאזה בהפקת RNA
Specifications_Comments: דרגת תגובת ACS, ו-acirc; ‰ ¥ 99% טוהר
אתנול (75%, דרגה מולקולרית)סיגמא-אלדריץ'E7023Purpose_Application:  שטיפת כדורי RNA
Specifications_Comments: דרגת ביולוגיה מולקולרית, הכינו טרי
איזופרופנול (דרגה מולקולרית)סיגמא-אלדריץ'I9516Purpose_Application:  משקעת RNA
Specifications_Comments: דרגת ביולוגיה מולקולרית, ו-acirc; ‰ ¥ טוהר של 99.5%
מים ללא נוקלאזתרמו פישר סיינטיפיקAM9930Purpose_Application:  הכנת תגובה ל-PCR
Specifications_Comments: ללא DNase/RNase, נבדק ליישומי PCR
סרט דבק אופטיתרמו פישר סיינטיפיק4311971Purpose_Application:  איטום אופטי לפלטות qPCR
Specifications_Comments: איכות אופטית ליישומי qPCR
לוחות PCR (96-באר)תרמו פישר סיינטיפיקN8010560Purpose_Application:  פורמט 96 בארות ל-qPCR
Specifications_Comments בתפוקה גבוהה: לבן, תחתית שקופה לזיהוי אופטי
רצועות צינורות PCRתרמו פישר סיינטיפיקAB0451Purpose_Application:  תגובות PCR בנפח קטן
Specifications_Comments: רצועות 8 צינורות עם קבלים בודדים
ערכת ריאגנט PrimeScript RTביוגרפיה של טקרהRR037APurpose_Application:  שעתוק הפוך של RNA ל-cDNA
Specifications_Comments: עם מחק gDNA להסרת DNA גנומי
SYBR Green Master Mixמערכות ביולוגיות יישומיות4309155Purpose_Application:  הגברה וזיהוי PCR בזמן אמת
Specifications_Comments: עם צבע ייחוס ROX לנירמול
תגובת טריזול (ניתוק RNA)תרמו פישר סיינטיפיק15596026Purpose_Application:  ניתוק תאים וחילוץ RNA
Specifications_Comments: אחסון ב-4Â ° C, להשתמש בתוך 6 חודשים
<ניתוח חזק>חלבון - Western Blot
אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (29:1)ביו-ראד1610146Purpose_Application:  פולימריזציה ג'ל SDS-PAGE
Specifications_Comments: תמיסת מלאי אקרילאמיד 30%
ערכת בדיקת חלבון BCAתרמו פישר סיינטיפיק23225Purpose_Application:  כימות ריכוזי חלבון
Specifications_Comments: תואם לצמצום לכימות מדויק
מצע Chemiluminescence משופר (ECL)תרמו פישר סיינטיפיק32106Purpose_Application:  זיהוי חלבונים כימילומינסנטיים
Specifications_Comments: זיהוי רגישות בפמטוגרם
חלב יבש דל שומןמעבדה מדעית170-6404Purpose_Application:  חומר חוסם כתם מערבי
Specifications_Comments: דרגת חסימה, רקע נמוך
קוקטייל מעכב פוספטאזרוש יישומיי סיינס4906845001Purpose_Application:  מניעת דפוספורילציה של חלבון
Specifications_Comments: כולל חומצה אוקדאית וקאליקולין A
סולם חלבון מודבקביו-ראד1610394Purpose_Application:  תקני התייחסות למשקל מולקולרי
Specifications_Comments: טווח של 10-250 קילו-דאלון עם 11 רצועות
קוקטייל מעכב פרוטאזרוש יישומיי סיינס11697498001Purpose_Application:  מניעת פירוק חלבון במהלך ליזיס
Specifications_Comments: ללא EDTA עבור פוספטזות תלויי מתכת
ממברנות PVDF (0.45 & Icirc; ¼ m)מיליפור סיגמאIPVH00010Purpose_Application:  ממברנת העברת חלבון (0.45 & Icirc; ¼ m נקבובית)
Specifications_Comments: רקע פלואורסצנציה נמוכה
RIPA Lysis Bufferטכנולוגיית איתות סלולרי9806SPurpose_Application:  חילוץ חלבון תאי שלם
Specifications_Comments: בופר ליזיס מוכן לשימוש עם חומרי ניקוי
בופר טעינה לדוגמה (4X)ביו-ראד1610747Purpose_Application:  הכנת דגימת חלבון ל-SDS-PAGE
Specifications_Comments: טעינת צבע ב-Iccirc; ²-מרקפטואנול
מאגר ריצה SDS-PAGEביו-ראד1610732Purpose_Application:  אלקטרופורזה חלבונים
Specifications_Comments: מערכת בופר טריס-גליצין-SDS
פלואוריד נתרןסיגמא-אלדריץ'201154Purpose_Application:  עיכוב נוסף של פוספטאז
Specifications_Comments: ריכוז עבודה של 50 מ"מ
נתרן אורתובנאדטסיגמא-אלדריץ'S6508Purpose_Application:  שימור פוספורילציה JAK2/STAT
Specifications_Comments: ריכוז עבודה של 1 מ"מ, הכנה טרייה
ריכוז בופר העברהביו-ראד1704156Purpose_Application:  העברת חלבון חצי-יבש
Specifications_Comments: מרוכז 10X, מדלל לפני השימוש
טריס-בופר סליין עם טווין-20 (TBST)טכנולוגיית איתות סלולרי9997SPurpose_Application:  שטיפת ממברנה ודילול נוגדנים
Specifications_Comments: 0.1% גיל 20, pH 7.6
<חזק>קריספר/עריכת גנים
ערכת טרנספקציה לפוספט סידןפרומגהE1200Purpose_Application:  העברת DNA לתאי אריזה
Specifications_Comments: יעילות העברה גבוהה לייצור לנטיווירוס
ערכת חילוץ ג'ל DNAקיאגן28706Purpose_Application:  טיהור מוצרי PCR לריצוף
Specifications_Comments: מערכת טיהור מבוססת עמודות
וקטור לנטיוויראלי GV371GeneChem Co., LtdGV371Purpose_Application:  ביטוי CRISPR/Cas9 ל-gene knockout
Specifications_Comments: מערכת לנטיוויראלית מוכנה לשימוש של CRISPR/Cas9
HEK293T קו תאיםATCCCRL-3216Purpose_Application:  קו תאי אריזת לנטיויראלי
Specifications_Comments: קו תאי אריזה הניתנים לטרנספקציה גבוהה
שירות ריצוף סנגרMacrogen Inc.מנהגPurpose_Application:  אימות נוקאאוט וניתוח לא מטרה
Specifications_Comments: רצף סטנדרטי עם פריימרים מותאמים אישית
אנדונוקלאז T7 Iניו אינגלנד ביולאבסM0302SPurpose_Application:  אימות יעילות חיתוך CRISPR
Specifications_Comments: אנדונוקלאז ספציפי לאי-התאמה לאימות CRISPR
<חזק>אליסה & בדיקות חיסוניות
לוחות ELISA (96 בארות, תחתית שטוחה)קורנינג3590Purpose_Application:  תגובת מצע ELISA
Specifications_Comments: קשירה גבוהה, תחתית שטוחה עבור ELISA
Human CLCF1 DuoSet ELISAR& D SystemsDY1234Purpose_Application:  כימות חלבון CLCF1 (31.2-2000 pg/mL)
Specifications_Comments: טווח גילוי: 31.2-2000 pg/mL, CV & 10%
p24 ערכת ELISA (מדד לננטיויראלי)חברת זפטומטריקס801111Purpose_Application:  קביעת טיטר לנטיויראלי
Specifications_Comments: לקביעת טיטר לנטיוויראלי (>10â ¸ TU/mL)
<בדיקות חזקות>פונקציונליות
ערכת צביעה אדומה S של Alizarinסיגמא-אלדריץ'A5533Purpose_Application:  הדמיית הפקדת סידן
Specifications_Comments: תמיסה של 2% במים מזוקקים, pH 4.1-4.3
ערכת פעילות לפוספטאז אלקליניאבקאםab83369Purpose_Application:  מדידת פעילות אנזימטית של ALP
Specifications_Comments: מבחן קולורימטר, נקרא ב-405 ננומטר
חומצה אסקורבית (L-חומצה אסקורבית)סיגמא-אלדריץ'A4544Purpose_Application:  רכיב הביניים האוסטוגני
Specifications_Comments: 50 & Icirc; ¼ ריכוז סופי של g/mL
צטילפירידיניום כלורידסיגמא-אלדריץ'C9002Purpose_Application:  מיצוי Alizarin Red S לכימות
Specifications_Comments: תמיסה של 10% למיצוי צבע
דקסמתזוןסיגמא-אלדריץ'D4902Purpose_Application:  רכיב מדיום אוסטאוגני
Specifications_Comments: ריכוז סופי של 10 ננומטר
Î ²-גליצרופוספטסיגמא-אלדריץ'G9422Purpose_Application:  רכיב מדיום אוסטאוגני
Specifications_Comments: ריכוז סופי של 10 מ"מ
מדיום התמיינות אוסטאוגניפרומוסלC-28010Purpose_Application:  אינדוקציה של התמיינות אוסטאובלסט
Specifications_Comments: מדיום אוסטאוגני מלא מוכן לשימוש
תוספות תרבית תאים בטרנסוול (0.4 & Icirc; ¼ m)קורנינג3470Purpose_Application:  מערכת קו-קולטורה עם 0.4 ו-Icirc; ¼ הפרדה m
Specifications_Comments: ממברנת פוליאתילן טרפתלט, סטרילית
<חזק>ציוד - כלים עיקריים
צנטריפוגה (מהירות גבוהה, מקוררת)אפנדורף5430RPurpose_Application:  עיבוד דגימה והפרדת תאים
Specifications_Comments: מקורר, מקסימום 30,000 x גרם
מערכת הדמיה כימלומינסצנטיתמעבדות ביו-ראד12003154Purpose_Application:  הדמיית וכימות של כתמים מערביים
Specifications_Comments: תיעוד ג'ל והדמיית ווסטרן בלוט
חממת CO2 (לחות)תרמו פישר סיינטיפיק51030287Purpose_Application:  תחזוקת תרביות תאים (37Â ° C, 5% CO2)
Specifications_Comments: גז משולש (CO2/O2/N2), שליטה בלחות
מד דופק (רצועת חזה)פולאר אלקטרוH10Purpose_Application:  ניטור דופק רציף
Specifications_Comments: חיבור Bluetooth ו-Acirc; &ועוד; דיוק של 1 פעימות לדקה
Hologic Discovery סורק DXAHologic Inc.גילוי א'Purpose_Application:  מדידת צפיפות מינרלים לעצם
Specifications_Comments: עם תוכנת APEX v4.5, נדרש בקרת איכות יומית
קורא מיקרופלט (מצב מרובה)ביו-טק אינסטרומנטססינרגיה H1Purpose_Application:  קריאת לוחות ELISA ומדידת ספיגה
Specifications_Comments: UV-Vis, פלואורסצנציה, זיהוי זוהר
הליכון ממונעלייפ פיטנס95TiPurpose_Application:  התערבות אימון סטנדרטית
Specifications_Comments: מהירות משתנה 0-16 קמ"ש, 0-15% דרגה
מערכת PCR בזמן אמת (CFX96 או שווה ערך)מעבדות ביו-ראד1855195Purpose_Application:  הגברה וזיהוי PCR בזמן אמת
Specifications_Comments: חסימת 96 בארות, בעלת שיפוע
<חזק>תוכנה ותוכנה כלי ניתוח
תוכנת APEX v4.5 (ניתוח DXA)Hologic Inc.גרסה 4.5Purpose_Application:  ניתוח סריקת DXA וחישוב BMD
Specifications_Comments: ניתוח BMD עם מסד נתונים רפרנס
מאסטרו Bio-Rad CFXמעבדות ביו-ראדמאסטרו CFXPurpose_Application:  ניתוח נתוני qPCR וקביעת CT
Specifications_Comments: ניתוח PCR בזמן אמת וייצוא נתונים
GraphPad Prism גרסה 9.0תוכנת GraphPadגרסה 9.0Purpose_Application:  ניתוח סטטיסטי ויצירת גרפים
Specifications_Comments: תוכנה סטטיסטית עם יצירת גרפים
ImageJ/Fiji v1.53המכונים הלאומיים לבריאותv1.53Purpose_Application:  צפיפות ווסטרן בלוט וניתוח תמונה
Specifications_Comments: ניתוח תמונה עם כלי מדידה
Microsoft Excel 365מיקרוסופט קורפוריישן365Purpose_Application:  ארגון נתונים וחישובים בסיסיים
Specifications_Comments: ארגון נתונים ופונקציות סטטיסטיות בסיסיות
<חזק>מוצרי צריכה וחומרים מתכלים פלסטיק< חזק>
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לאפנדורף22363204Purpose_Application:  אחסון ועיבוד דגימות בנפח קטן
Specifications_Comments: ללא DNase/RNase, עם קישור נמוך
צינורות קוניים בנפח 15 מ"לקורנינג430766Purpose_Application:  עיבוד דגימות בנפח בינוני
Specifications_Comments: פוליפרופילן, מדורג, עם קבלים
לוחות תרבית תאים עם 24 באריםקורנינג3524Purpose_Application:  קו-קולטורה ומערכת בדיקה פונקציונלית
Specifications_Comments: טיפול בתרבות רקמה, תחתית שטוחה
צינורות קוניים בנפח 50 מ"לקורנינג430829Purpose_Application:  איסוף ועיבוד דגימות בנפח גדול
Specifications_Comments: פוליפרופילן, מדורג עם קבלים
קריוביאלים (1 מ"ל)תרמו פישר סיינטיפיק375418Purpose_Application:  אחסון תאים ודגימות לטווח ארוך ב-80Â ° C
Specifications_Comments: חוט חיצוני, חותם O-טבעת, -196Â ° דירוג C
פסטר פיפט (סטרילי)פישר סיינטיפיק13-678-20APurpose_Application:  איסוף והעברת דגימה סטרילית
Specifications_Comments: עטופה בנפרד, סטרילית

מקורות

  1. Rachner, T. D., Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis: now and the future. Lancet. 377 (9773), 1276-1287 (2011).
  2. Chen, X., et al. Association of cardiotrophin-like cytokine factor 1 levels in peripheral blood mononuclear cells with bone mineral density and osteoporosis in postmenopausal women. BMC Musculoskelet Disord. 22 (1), 62(2021).
  3. Ilesanmi-Oyelere, B. L., et al. Inflammatory markers and bone health in postmenopausal women: a cross-sectional overview. Immun Ageing. 16, 15(2019).
  4. Ahn, N., Kim, K. Effects of 12-week exercise training on osteocalcin, high-sensitivity C-reactive protein concentrations, and insulin resistance in elderly females with osteoporosis. J Phys Ther Sci. 28 (8), 2227-2231 (2016).
  5. Graves, D. T., Li, J., Cochran, D. L. Inflammation and uncoupling as mechanisms of periodontal bone loss. J Dent Res. 90 (2), 143-153 (2011).
  6. Kang, J. S., et al. Exercise-induced CLCF1 attenuates age-related muscle and bone decline in mice. Nat Commun. 16 (1), 4743(2025).
  7. Sims, N. A. Cardiotrophin-like cytokine factor 1 (CLCF1) and neuropoietin (NP) signalling and their roles in development, adulthood, cancer and degenerative disorders. Cytokine Growth Factor Rev. 26 (5), 517-522 (2015).
  8. Oliveira, M. C., Vullings, J., van de Loo, F. A. J. Osteoporosis and osteoarthritis are two sides of the same coin paid for obesity. Nutrition. 70, 110486(2020).
  9. Yokota, S., et al. Cardiotrophin-like cytokine factor 1 alleviates bone loss in osteoporosis mouse models by suppressing osteoclast differentiation through activating interferon signaling and repressing the nuclear factor-κB signaling pathway. Bone. 153, 116140(2021).
  10. Ponzetti, M., Rucci, N. Updates on osteoimmunology: what's new on the cross-talk between bone and immune system. Front Endocrinol (Lausanne). 10, 236(2019).
  11. Larsen, J. V., et al. Cytokine-like factor 1, an essential facilitator of cardiotrophin-like cytokine:ciliary neurotrophic factor receptor α signaling and sorLA-mediated turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
  12. de Vries, T. J., et al. What are the peripheral blood determinants for increased osteoclast formation in the various inflammatory diseases associated with bone loss. Front Immunol. 10, 505(2019).
  13. Weitzmann, M. N. The role of inflammatory cytokines, the RANKL/OPG axis, and the immunoskeletal interface in physiological bone turnover and osteoporosis. Scientifica (Cairo). 2013, 125705(2013).
  14. Srivastava, R. K., Dar, H. Y., Mishra, P. K. Immunoporosis: immunology of osteoporosis-role of T cells. Front Immunol. 9, 657(2018).
  15. Ming, J., Cronin, S. J. F., Penninger, J. M. Targeting the RANKL/RANK/OPG axis for cancer therapy. Front Oncol. 10, 1283(2020).
  16. Sobacchi, C., Menale, C., Villa, A. The RANKL-RANK axis: a bone to thymus round trip. Front Immunol. 10, 629(2019).
  17. Wang, T., He, C. TNF-α and IL-6: the link between immune and bone system. Curr Drug Targets. 21 (3), 213-227 (2020).
  18. Jones, S. A., Jenkins, B. J. Recent insights into targeting the IL-6 cytokine family in inflammatory diseases and cancer. Nat Rev Immunol. 18 (12), 773-789 (2018).
  19. Villafaina, S., Biehl-Printes, C., Parraca, J. A., de Oliveira Brauner, F., Tomas-Carus, P. What mathematical models are accurate for prescribing aerobic exercise in women with fibromyalgia. Biology (Basel). 11 (5), 704(2022).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  21. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−ΔΔC(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  22. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).
  23. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Sci Rep. 8 (1), 888(2018).
  24. Mousavi Kahaki, S. A., Ebrahimzadeh, N., Fahimi, H., Moshiri, A. Development of an optimized protocol for generating knockout cancer cell lines using the CRISPR/Cas9 system, with emphasis on transient transfection. PLoS One. 19 (11), e0310368(2024).
  25. Eren, K., Taktakoğlu, N., Pirim, I. DNA sequencing methods: from past to present. Eurasian J Med. 54 (Suppl1), 47-56 (2022).
  26. Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq. Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).
  27. Crisponi, L., Buers, I., Rutsch, F. CRLF1 and CLCF1 in development, health and disease. Int J Mol Sci. 23 (2), 992(2022).
  28. Ansari, S., Ito, K., Hofmann, S. Alkaline phosphatase activity of serum affects osteogenic differentiation cultures. ACS Omega. 7 (15), 12724-12733 (2022).
  29. Ghasemi, A., Zahediasl, S. Normality tests for statistical analysis: a guide for non-statisticians. Int J Endocrinol Metab. 10 (2), 486-489 (2012).
  30. Rousseaux, C. G., Gad, S. C. Haschek and Rousseaux's handbook of toxicologic pathology. , 3rd ed, Academic Press. (2013).
  31. Spiegelman, D. Commentary: some remarks on the seminal 1904 paper of Charles Spearman: the proof and measurement of association between two things. Int J Epidemiol. 39 (5), 1156-1159 (2010).
  32. Cleophas, T. J., Zwinderman, A. H., van Ouwerkerk, B. M. Methods for analyzing cardiovascular studies with repeated measures. Neth Heart J. 17 (11), 429-433 (2009).
  33. Haynes, W. Encyclopedia of systems biology. , Springer. New York. (2013).
  34. Kang, J. S., et al. Exercise-induced CLCF1 attenuates age-related muscle and bone decline in mice. Nat Commun. 16 (1), 4743(2025).
  35. Zhao, C., Gong, Y., Zheng, L., Zhao, M. Untargeted metabolomic reveals changes in muscle metabolites of mice during exercise recovery and mechanisms of whey protein and whey protein hydrolysate in promoting muscle repair. Food Res Int. 184, 114261(2024).
  36. Koltun, K. J., et al. Effect of acute resistance exercise on bone turnover in young adults before and after concurrent resistance and interval training. Physiol Rep. 12 (3), e15906(2024).
  37. Li, J. JAK-STAT and bone metabolism. JAK-STAT. 2 (3), e23930(2013).
  38. Sims, N. A. The JAK1/STAT3/SOCS3 axis in bone development, physiology, and pathology. Exp Mol Med. 52 (8), 1185-1197 (2020).
  39. Zhao, X., et al. Puerarin alleviates osteoporosis in rats by targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway. Biomol Biomed. 24 (6), 1651-1661 (2024).
  40. Terpos, E., Ntanasis-Stathopoulos, I., Gavriatopoulou, M., Dimopoulos, M. A. Pathogenesis of bone disease in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood Cancer J. 8 (1), (2018).
  41. Okamoto, K., et al. Osteoimmunology: the conceptual framework unifying the immune and skeletal systems. Physiol Rev. 97 (4), 1295-1349 (2017).
  42. Sims, N. A. Influences of the IL-6 cytokine family on bone structure and function. Cytokine. 146, 155655(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CLCF1RANKL OPGqPCRWestern BlottingCRISPR
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.