הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

עיכוב אוסטאוקלסטוגנזה על ידי LY90009 באמצעות אפנון איתות חריץ במודלים של מחלות אוסטאוליטיות

501 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69178

⸱

7 באוקטובר 2025

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת ההשפעות המעכבות של LY900009 מעכב γ-secretase על אוסטאוקלסטוגנזה המושרה על ידי RANKL במקרופאגים שמקורם במח העצם. הפרוטוקול כולל הערכת ציטוטוקסיות, בדיקות תפקודיות, ניתוחים מולקולריים ואימות in vivo במודל אוסטאוליטי של עכברים, עם יישומים בפיתוח טיפולי של מחלות אוסטאוליטיות.

תקציר

פעילות אוסטאוקלסטים לא מווסתת תורמת עמוקות להתקדמות מחלה אוסטאוליטית, אך היקף שיטות ההתערבות הטיפוליות מוגבל על ידי תופעות לוואי. מחקר זה חקר את LY900009, מעכב γ-secretase, ואת יכולתו לדכא אוסטאוקלסטוגנזה הנגרמת על ידי RANKL באמצעות אפנון של איתות Notch. באמצעות מקרופאגים שמקורם במח העצם, ביצענו הערכות מקיפות במבחנה של ציטוטוקסיות, התמיינות ומבחנים תפקודיים. ניתוחי ביטוי גנים וחלבונים באמצעות qPCR וכתמים מערביים שימשו להבהרת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים. היעילות in vivo אומתה באמצעות מודל ספיגת עצם המושרה על ידי ליפופוליסכריד עכברים. LY900009 עיכב היווצרות אוסטאוקלסט ותפקוד ספיגה המושרה על ידי RANKL באופן תלוי מינון ללא ציטוטוקסיות בריכוזים טיפוליים. טיפול זה הפחית משמעותית את מספר האוסטיאוקלסטים החיוביים ל-TRAP, פגיעה בהיווצרות חגורת האקטין ודיכא את פירוק מטריצת העצם. הביטוי של סמני אוסטאוקלסטים, כולל NFATc1, c-Fos, קטפסין K ו-TRAP, היה מווסת באופן ניכר. מבחינה מכנית, LY900009 שיבש את איתות ה-Notch ואת מסלולי ה-MAPK/Akt במורד הזרם. מתן in vivo הפחית באופן משמעותי את הרס העצם הנגרם על ידי LPS, שיפר את פרמטרי העצם והפחית את נוכחות האוסטיאוקלסט. ממצאים אלה מדגימים כי LY900009 מעכב ביעילות אוסטאוקלסטוגנזה וספיגת עצם על ידי אפנון ציר האיתות Notch/MAPK/Akt, מה שהופך אותו למועמד טיפולי מבטיח להפרעות אוסטאוליטיות.

מבוא

הומאוסטזיס עצם מהווה פרדיגמה פיזיולוגית מתוזמרת להפליא בבעלי חוליות, בהרמוניה על ידי שיווי המשקל העדין בין היווצרות עצם בתיווך אוסטאובלסטים לבין ספיגת עצם מונעת אוסטאוקלסט1. איזון מורכב זה שומר על שלמות השלד, חוסן ביומכני ונאמנות מטבולית לאורך כל חייו של האדם, ומגיב באופן דינמי לדרישות מכניות, הפרעות אנדוקריניות ואתגרים פתולוגיים2. מחזור שיפוץ העצם כולל שלבים עוקבים של הפעלה, ספיגה, מעבר, היווצרות וסיום, כל אחד מהם נשלט על ידי מפלים מולקולריים מורכבים המבטיחים סנכרון מרחבי-זמני של פעילויות תאיות3.

שיבוש במנגנון הומאוסטטי זה, במיוחד באמצעות פעילות מוגזמת של אוסטאוקלסטים או תפקוד אוסטאובלסטים לקוי, מזרז אובדן עצם פתולוגי, האופייני להפרעות אוסטאוליטיות רבות 4,5. מצבים אלה מקיפים קשת רחבה של מחלות, כולל אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר והזדקנות, דלקת מפרקים שגרונית, דלקת מפרקים דלקתית, מעורבות עצם ניאופלסטית, מחלת פאג'ט והפרעות חניכיים6. הביטויים הקליניים של ספיגת עצם מוגזמת כוללים סיכון מוגבר לשברים, עיוות שלד, כאב כרוני, נכות תפקודית ונטל בריאותי משמעותי 6,7. מדדים אפידמיולוגיים עכשוויים מצביעים על כך שאוסטאופורוזיס לבדה משפיעה על למעלה מ-200 מיליון אנשים ברחבי העולם, כאשר שברים נלווים גורמים לתחלואה משמעותית, תמותה ועלויות כלכליות העולות על מיליארדי דולרים בשנה.

אוסטאוקלסטים מתבטאים כתאי ענק רב-גרעיניים מיוחדים ביותר שמקורם במבשרי המטופויאט של שושלת הפגוציטים החד-גרעיניים, במיוחד מקרופאגים שמקורם במח עצם9. היווצרותם מייצגת תהליך מורכב רב-שלבי הדורש תיאום מדויק של אותות חוץ-תאיים, מפלי איתות תוך-תאיים ותוכניות שעתוק10. הציטוקינים החיוניים השולטים באוסטיאוקלסטוגנזה כוללים מפעיל קולטן של גורם גרעיני κB ליגנד (RANKL) וגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF), הנקשרים לקולטנים שלהם RANK ו-c-Fms כדי ליזום תוכניות התמיינות11. אינטראקציית RANKL-RANK מפעילה הפעלה של מסלולי איתות מרובים במורד הזרם, כולל קינאזות חלבון המופעלות על ידי מיטוגן (MAPKs), גורם גרעיני κB (NF-κB), פוספואינוזיטיד 3-קינאז/חלבון קינאז B (PI3K/Akt), ומסלולי סידן/קלצינורין, המתכנסים לגורם הגרעיני של תאי T מופעלים ציטופלזמיים 1 (NFATc1), מווסת השעתוק הראשי של אוסטאוקלסטוגנזיס 10,11,12.

בין מנגנוני הרגולציה השונים השולטים בביולוגיה של אוסטאוקלסטים, איתות Notch התגלה כמודולטור קריטי עם פונקציות מורכבות ותלויות הקשר13. מסלול ה-Notch הוא מערכת תקשורת תא-תא שמורה אבולוציונית השולטת בקביעת גורל התא, התמיינות, התפשטות ואפופטוזיס על פני רקמות מגוונות ושלבי התפתחות14. ביונקים, ארבעה קולטני Notch (Notch1-4) מקיימים אינטראקציה עם חמישה ליגנדים קנוניים (דמויי דלתא 1, 3 ו-4, ומשוננים 1 ו-2) כדי לתווך איתות בין-תאי. הפעלת המסלול כוללת קשירת ליגנד, שינויים קונפורמטיביים ומחשוף פרוטאוליטי עוקב על ידי מטאלופרוטיזים של ADAM וקומפלקס γ-secretase, אשר בסופו של דבר משחרר את התחום התוך-תאי Notch (NICD) לטרנסלוקציה גרעינית וויסות שעתוק של גני מטרה, כולל משפחות הס והיי14,15. תפקידו של איתות Notch באוסטאוקלסטוגנזה נותר שנוי במחלוקת ונראה כי הוא תלוי מאוד בהקשר, כאשר מחקרים מדווחים על השפעות מעוררות ומעכבות בהתאם לתת-סוגי הקולטנים הספציפיים, זמינות ליגנד, מיקרו-סביבה תאית ותנאי ניסוי 16,17,18.

הגישות הטיפוליות הרווחות למחלות אוסטאוליטיות מתמקדות בעיקר באסטרטגיות אנטי-ספיגה, כולל ביספוספונטים, דנוסומאב (מעכב RANKL), מודולטורים סלקטיביים של קולטני אסטרוגן וקלציטונין 7,8,19. למרות שטיפולים אלה מפחיתים ביעילות את ספיגת העצם ואת הסיכון לשברים, הם קשורים למגבלות משמעותיות, כולל רעילות במערכת העיכול, אוסטאונקרוזיס של הלסת, שברים לא טיפוסיים, סיכון מוגבר לזיהום וחששות לגבי בטיחות לטווח ארוך. בנוסף, חומרים אלה עלולים לדכא יתר על המידה את תחלופת העצם, מה שעלול לפגוע באיכות העצם ובמנגנוני התיקון. כתוצאה מכך, קיים צורך קליני דחוף בחומרים טיפוליים חדשים שיכולים לעכב באופן סלקטיבי את פעילות האוסטיאוקלסט הפתולוגית תוך מזעור תופעות לוואי ושימור יכולת שיפוץ עצםפיזיולוגית 8,14.

מעכבי γ-Secretase מייצגים סוג מבטיח של תרכובות עם יישומים פוטנציאליים במחלות אוסטאוליטיות באמצעות אפנון של איתות Notch14,20. חומרים אלה נחקרו בהרחבה במחקר אונקולוגיה ומחלות נוירודגנרטיביות, כאשר מספר תרכובות התקדמו לניסויים קליניים במחלת אלצהיימר וסוגי סרטן שונים. LY900009, מעכב γ-סקרטאז חזק וסלקטיבי, הוכיח תכונות פרמקולוגיות חיוביות, כולל ספציפיות גבוהה, זמינות ביולוגית ופרופיל בטיחות הניתן לניהול במחקרים ראשוניים21,22. עם זאת, ההשפעות הספציפיות שלו על אוסטאוקלסטוגנזיס המושרה על ידי RANKL והתועלת הטיפולית הפוטנציאלית במחלות אוסטאוליטיות נותרו מאופיינות באופן חלקי. מחקר זה נועד להעריך אם LY900009 יכול לעכב אוסטאוקלסטוגנזה באמצעות שיבוש איתות Notch, מה שעשוי להציע גישה טיפולית חדשה למחלות אוסטאוליטיות. פיתחנו פרוטוקולים מקיפים להערכת השפעותיהם על היווצרות אוסטאוקלסטים, פעילות ספיגת עצם, מסלולי איתות ויעילות in vivo במודלים של אובדן עצם דלקתי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המוסדיות ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים המרכזי המסונף לאוניברסיטה הרפואית הראשונה של שאנדונג (מספר אישור IACUC-2024-015). המחקר דבק בעקרונות אתיים מבוססים למחקר בבעלי חיים והנחיות ARRIVE, כולל שיכון בעלי חיים בכלובים סטנדרטיים (5 עכברים/כלוב, מחזור אור/חושך של 12 שעות, מזון/מים אד ליביטום ) ואקראיות לקבוצות

1. בידוד ותרבות מקרופאגים שמקורם במח עצם

  1. המתת חסד של עכברי C57BL/6 זכרים בני 5 שבועות (n=5 לכל בידוד) על ידי הנחתם בתא CO2 עם קצב זרימה של 30% מנפח החדר לדקה למשך 5 דקות. אשר מוות על ידי פריקת צוואר הרחם.
  2. רססו את העכבר ב-70% אתנול. בצע חתך בקו האמצע מהערווה לעצם החזה בעזרת מספריים סטריליים. הסר את עצם הירך והשוקה באופן אספטי. מניחים עצמות ב-PBS סטרילי על קרח.
  3. נקה עצמות של רקמות רכות באמצעות גזה סטרילית. חותכים את שני קצוות העצמות במספריים סטריליים. שטוף מח באמצעות מחט 25G עם 10 מ"ל α-MEM קר לכל עכבר. העבירו את מתלה התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר.
  4. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. יש להשעות את הגלולה ב-α-MEM המכילה 10% FBS ו-33.3 ננוגרם/מ"ל M-CSF. ספור תאים באמצעות המוציטומטר עם אי הכללה כחולה של טריפאן. צלחת בגודל 2 x 106 תאים/מ"ל בצלוחיות T75.
  5. שמור על תרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 עם שינויים בינוניים כל 48 שעות.
  6. קציר 1x 106 תאים. יש לשטוף עם PBS המכיל 2% FBS. דגירה עם אנטי-CD11b-FITC (1:100) ואנטי-F4/80-PE (1:100) למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך. נתח לפי ציטומטריית זרימה באמצעות אסטרטגיית השער הבאה: ראשית, תאי שער המבוססים על פיזור קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC) כדי לא לכלול פסולת ולבחור תאים ברי קיימא. שנית, שער תאים חיוביים ל-CD11b מאוכלוסיית התאים הקיימת. שלישית, מתאים חיוביים ל-CD11b, שער תאים חיוביים F4/80 כדי לזהות מקרופאגים חיוביים כפולים CD11b+/F4/80+ . הגדר שערים המבוססים על פקדים לא מוכתמים ופקדים בצבע יחיד. המשך רק אם >95% התאים הם CD11b+/F4/80+.

2. הערכת ציטוטוקסיות

  1. מקרופאגים שמקורם במח עצם זרעים (BMMs) ב-1 x 104 תאים לבאר בצלחות של 96 בארות תוך שימוש ב-100 מיקרוליטר של מדיום לבאר. אפשר לתאים להיצמד למשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכן LY900009 דילולים במדיום שלם: 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4, 12.8, 25.6 מיקרומטר. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום טיפול לכל באר. הכן משולש לכל ריכוז.
  3. דגירה במשך 24 שעות, 48 שעות או 96 שעות. הסר את מדיום התרבות לחלוטין. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום טרי המכיל 10% מגיב CCK-8 (10 מיקרוליטר של CCK-8 ב-90 מיקרוליטר של מדיום). יש לדגור במשך שעתיים בדיוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. השתמש בקורא מיקרו-פלטות כדי למדוד ספיגה ב-450 ננומטר עם התייחסות ב-650 ננומטר.
  4. חשב את IC50 באמצעות GraphPad Prism. תוכנה פתוחה, ריכוז קלט (ציר X) ואחוז כדאיות (ציר Y). בחר נתח > רגרסיה לא ליניארית > מינון-תגובה > עיכוב > לוג (מעכב) לעומת תגובה עם שיפוע משתנה. הגדרת אילוצים: תחתון=0, עליון=100. רשום IC50 עם רווח בר-סמך של 95%.

3. התמיינות אוסטאוקלסטים וצביעה של TRAP

  1. מקרופאגים שמקורם במח עצם זרעים (BMMs) ב-1 x 104 תאים לבאר בצלחות של 96 בארות. תרבית לילה ב-α-MEM עם 10% FBS ו-33.3 ננוגרם/מ"ל M-CSF.
  2. החלף את המדיום ב-100 מיקרוליטר של מדיום התמיינות: α-MEM המכיל 10% FBS, 33.3 ננוגרם/מ"ל M-CSF, 100 ננוגרם/מ"ל רנקל ו-LY900009 (0, 100, 200, 400 ננומטר). הכן ארבע פעמים לכל מצב.
  3. החלף את המדיום כל 48 שעות במדיום התמיינות טרי. המשך 6 ימים. עקוב מדי יום באמצעות מיקרוסקופ הפוך ב-100x להיווצרות אוסטאוקלסט.
  4. הסר את כל המדיום על ידי שאיפה. יש לשטוף פעם אחת עם 200 מיקרוליטר PBS. הוסף 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS. דוגרים בדיוק 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר מקבע. שטפו 3x עם 200 מיקרוליטר PBS.
  5. הכן את תמיסת הצביעה TRAP: מערבבים 50 מ"ל של 0.1 M נתרן אצטט מאגר (pH 5.0), 10 מ"ל של 50 מ"מ נתרן טרטרט, 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל נפתול AS-MX פוספט בדימתילפורממיד, ו-0.5 מ"ל של 11 מ"ג/מ"ל מלח LB אדום מהיר. סנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש למרוח 200 מיקרוליטר לבאר. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך. עצור את התגובה על ידי שטיפה פי 3 במים מזוקקים.
  6. זהה אוסטאוקלסטים כתאים חיוביים ל-TRAP (סגול/אדום) המכילים שלושה גרעינים או יותר. ספרו באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 100. צלם חמישה שדות אקראיים לכל באר.
  7. כימות באמצעות ImageJ. לחץ על התמונה > המר ל-8 סיביות (סוג > תמונה > 8 סיביות) > הגדר סף (תמונה > התאם סף >) > בחר אזורים חיוביים ל-TRAP > ניתוח חלקיקים (ניתוח > ניתוח חלקיקים: גודל 100-אינסוף מיקרומטר2, מעגליות 0-1.0) > ייצוא תוצאות ל-Excel 23.

4. בדיקת ספיגת עצם פונקציונלית

  1. תרבית BMMs בצלחות של שש בארות (2 x 105 תאים / באר) עם M-CSF למשך 24 שעות. הוסף RANKL (100 ננוגרם/מ"ל) כדי לגרום להיווצרות טרום-אוסטאוקלסט למשך 3 ימים.
  2. קצור תאים באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לנטרל עם מדיום שלם. ספרו תאים ברי קיימא באמצעות טריפן כחול.
  3. זרעים 1 x 104 פרה-אוסטאוקלסטים לבאר על צלחות 96 בארות מצופות הידרוקסיאפטיט. אפשר חיבור למשך 4 שעות.
  4. טפלו ב-M-CSF (33.3 ננוגרם/מ"ל), RANKL (100 ננוגרם/מ"ל) ו-LY900009 (0, 100, 200, 400 ננומטר) למשך 4 ימים. החלף מדיום כל יומיים.
  5. הסר תאים באמצעות אקונומיקה 10% למשך 10 דקות. יש לשטוף פי 5 במים מזוקקים. יבש באוויר לחלוטין.
  6. הצג באופן חזותי בורות ספיגה באמצעות קורא הדמיה אוטומטי בהגדלה פי 4. צלם את כל שטח הבאר. כמת את האזור הנספג כאחוז מהשטח הכולל באמצעות ImageJ.

5. מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית

  1. אוסטאוקלסטים מתרבות על כיסויי זכוכית בצלחות 24 בארות למשך 5-7 ימים כמתואר בשלב 3.
  2. יש לתקן עם 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות. חדירה עם 0.1% Triton X-100 ב-PBS למשך 10 דקות. יש לחסום עם 1% BSA ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  3. דגירה עם רודמין-פלואידין (1:200) במאגר חוסם למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. כתם נגד גרעינים עם DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 10 דקות.
  4. התקן כיסויים על שקופיות באמצעות מדיום הרכבה נגד דהייה. בדוק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 200. מדוד את שטח טבעת האקטין באמצעות ImageJ.

6. ניתוח PCR כמותי בזמן אמת

  1. חלץ RNA כולל מ-2 x 106 תאים באמצעות מגיב מיצוי RNA. הומוגניזציה על ידי פיפטינג. דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. הוסף 200 מיקרוליטר כלורופורם. יש לנער במרץ במשך 15 שניות. דגירה 3 דקות. צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. מעבירים את השלב המימי לצינור חדש. הוסף 500 מיקרוליטר איזופרופנול. מערבבים בעדינות. דוגרים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. שטפו את הגלולה עם 1 מ"ל של 75% אתנול. יבש באוויר במשך 10 דקות. ממיסים ב-30 מיקרוליטר מים נטולי RNase. מדוד את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר (דרוש יחס A260/A280 >1.8).
  5. סנתז cDNA באמצעות 1 מיקרוגרם RNA עם ערכת שעתוק הפוך לפי פרוטוקול היצרן.
  6. הכן תגובות qPCR: 10 מיקרוליטר של מאסטר מיקס, 1 מיקרוליטר של cDNA, 0.5 מיקרוליטר מכל פריימר (10 מיקרומטר), 8 מיקרוליטר מים. פועל במערכת PCR בזמן אמת: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לאחר מכן 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות. חשב ביטוי יחסי בשיטת 2-ΔΔCt עם GAPDH כגן הייחוס.

7. ניתוח כתמים מערביים

  1. תאי ליז במאגר RIPA המכילים מעכבי פרוטאז ופוספטאז על קרח למשך 30 דקות. צנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  2. קבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA בהתאם להוראות היצרן. הכן דגימות חלבון של 30 מיקרוגרם במאגר טעינה. מרתיחים 5 דקות.
  3. טען דגימות על 10% ג'ל SDS-PAGE. הפעל ב 80 וולט למשך 30 דקות, ואז 120 וולט למשך 90 דקות. מעבירים לממברנות PVDF ב-100 וולט למשך 90 דקות במאגר העברה קרה.
  4. חסמו ממברנות עם 5% חלב דל שומן בתמיסת מלח Tris-Buffered עם 0.1% Tween-20 (TBST) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין.
  5. דגירה עם נוגדנים ראשוניים המפורטים בטבלת החומרים (1:1000) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין. יש לשטוף 3 פעמים עם TBST למשך 10 דקות כל אחד.
  6. דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים ל-HRP (1:5000) למשך שעה בטמפרטורת החדר. שטפו 3x עם TBST.
  7. זיהוי באמצעות מגיב ECL לפי הוראות היצרן. צלם תמונות באמצעות מערכת הדמיה אינפרא אדום. כימות עוצמת הלהקה באמצעות ImageJ.

8. מודל ספיגת עצם המושרה על ידי LPS In Vivo

  1. חשב את גודל המדגם באמצעות G*הספק 3.1 (גודל אפקט=0.8, α=0.05, הספק=0.80, מניב n=5/קבוצה). הקצה באופן אקראי עכברי C57BL/6 זכרים בני 7-8 שבועות לקבוצות באמצעות מחולל מספרים אקראיים. בית 5 עכברים לכלוב עם מחזור אור / חושך של 12 שעות, טמפרטורה 22 ± 2 מעלות צלזיוס, לחות 55% ± 10%, גישה אד ליביטום לצ'או ומים סטנדרטיים.
  2. להרדים עכברים באמצעות הזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג). אשר הרדמה על ידי רפלקס צביטה בבוהן.
  3. הכן בקרת רכב: PBS המכיל 1% DMSO. הכינו LY900009: מינון נמוך (2.5 מ"ג/ק"ג) ומינון גבוה (5 מ"ג/ק"ג) ברכב. יש להזריק 100 מיקרוליטר תת עורית על הקלווריה באמצעות מחט 27 גרם מדי יום למשך 14 יום. יש להזריק LPS (10 מ"ג/ק"ג) בימים 1 ו-8.
  4. עקוב אחר עכברים פעמיים ביום לאיתור סימני מצוקה. הגדירו נקודות קצה אנושיות: ירידה במשקל >20%, חוסר יכולת להסתובב, יציבה כפופה, טיפוח מופחת. המתת חסד מיד אם מגיעים לנקודות קצה.
  5. המתת חסד ביום ה-15 באמצעות מנת יתר של פנטוברביטל (100 מ"ג/ק"ג תוך צפקית). קציר קלבריה. יש לקבע ב-4% פרפורמלדהיד למשך 48 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

9. מיקרו-CT ואנליזה היסטולוגית

  1. סרוק קלווריות קבועות באמצעות סורק מיקרו-CT עם הפרמטרים הבאים: 70 קילו וולט, 114 μA, מסנן אלומיניום 0.5 מ"מ, רזולוציה של 9 מיקרומטר, סיבוב של 180 מעלות עם צעדים של 0.4 מעלות.
  2. שחזור תמונות באמצעות תוכנת NRecon. נתח באמצעות תוכנת CTAn. הגדר את אזור העניין כאזור של 3 x 3 מ"מ שבמרכזו התפר הסגיטלי. חשב BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th.
  3. יש להסיר אבדן בדגימות ב-10% EDTA (pH 7.4) למשך 14 יום עם שינויים יומיים. בדוק את השלמת הסרת האבדן באמצעות בדיקת סידן אוקסלט24.
  4. תהליך להטמעת פרפין: להתייבש באמצעות אלכוהול מדורג, שקוף בקסילן, להסתנן עם פרפין. חתך בעובי 4 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום.
  5. ודא עיוורון: קודד את כל הדוגמאות באמצעות מספרים אקראיים בני שלוש ספרות. בקש מעמית לתחזק את מפתח הקוד. לבצע את כל הניתוחים ללא ידע על קבוצות הטיפול. פענוח רק לאחר השלמת איסוף הנתונים.
  6. בצע צביעת H&E: דה-פראפין, החזרת לחות, צביעה עם המטוקסילין למשך 5 דקות, הבדלה באלכוהול חומצי, צביעה עם אאוזין למשך 2 דקות, ייבוש והרכבה.
  7. בצע צביעת TRAP כמו בשלב 3.5. ספור תאים מרובי גרעינים חיוביים ל-TRAP לאורך פני העצם. מבטא כמספר לכל מ"מ היקף עצם.

10. ניתוח סטטיסטי

  1. חשב את גודל המדגם הנדרש באמצעות G*Power 3.1: גודל אפקט קלט f=0.8, α=0.05, הספק=0.80, מספר קבוצות. רשום את המינימום n לכל קבוצה.
  2. בדיקת תקינות באמצעות מבחן שפירו-וילק ב-SPSS 28.0. קחו בחשבון את p > 0.05 בחלוקה הרגילה. בדיקת שונות הומוגניות באמצעות מבחן לוין. קחו בחשבון את p > 0.05 כשונות שווה.
  3. החל בדיקות מתאימות על סמך התפלגות: עבור נתונים נורמליים עם שונות שווה, השתמש במבחנים פרמטריים. עבור שתי הקבוצות, החל את מבחן ה-t של הסטודנט הלא משויך. עבור קבוצות מרובות, השתמש ב- ANOVA חד-כיווני.
  4. בצע ניתוח פוסט הוק: עבור ANOVA משמעותי (p<0.05), החל את מבחן ההבדל המשמעותי בכנות של Tukey עבור כל ההשוואות הזוגיות.
  5. השתמש בחלופות לא פרמטריות עבור נתונים לא נורמליים: החל את מבחן Mann-Whitney U עבור שתי קבוצות ואת Kruskal-Wallis עם הפוסט הוק של דאן עבור מספר קבוצות.
  6. חישוב גדלי אפקט: d של כהן עבור מבחני t, eta חלקי בריבוע עבור ANOVA.
  7. דווח על ערכי p מדויקים לשלושה מקומות עשרוניים ורווחי סמך של 95%. הצג נתונים נורמליים כממוצע ± סטיית תקן, לא נורמלי כחציון (טווח בין-רבעוני).
  8. קחו בחשבון את p < 0.05 מובהקות סטטיסטית. החל את תיקון Bonferroni בעת ביצוע השוואות מרובות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

היישום המוצלח של פרוטוקול זה גילה כי LY900009 הפעילו השפעות מעכבות חזקות על היווצרות ותפקוד אוסטאוקלסטים באמצעות מנגנונים מרובים המחוברים זה לזה. הערכת ציטוטוקסיות ראשונית במקרופאגים שמקורם במח העצם הדגימה עלייה תלוית זמן ברעילות, עם ערכי IC50 מחושבים של 4.44 מיקרומטר, 3.66 מיקרומטר ו-2.93 מיקרומטר ב-24 שעות, 48 שעות ו-96 שעות, בהתאמה (איור 1A,B). חשוב לציין, ריכוזים ציטוטוקסיים אלה היו גבוהים משמעותית מהמינונים היעילים מבחינה טיפולית, ויצרו חלון טיפולי חיובי. המב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המחקר הנוכחי מספק ראיות משכנעות לכך LY900009 מייצג חומר טיפולי מבטיח למחלות אוסטאוליטיות באמצעות עיכוב חזק וסלקטיבי של אוסטאוקלסטוגנזה, העולה בקנה אחד עם העניין הגובר במעכבי γ-secretase להפרעות הקשורות לעצמות 14,20,21. הממצאים מראים כי מעכב γ-secretase זה מדכא ביעילות היווצרות אוסטאוקלסט המושרה על ידי RANKL ותפקוד ספיגת העצם באמצעות שיבוש מתואם של מסלולי איתות קריטיים מרובים, כולל מפלי Notch, MA...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי אינטרסים. לאף מחבר אין כל קשר פיננסי עם הגופים המסחריים המוזכרים בעבודה זו. כל המחברים מילאו את טפסי הגילוי של ICMJE.

תודות

המחברים רוצים להודות לצוות בית החולים המרכזי המסונף לאוניברסיטה הרפואית הראשונה של שאנדונג ולבית החולים העממי פיי-צ'נג על התמיכה הטכנית והסיוע במהלך המחקר הזה. אנו גם מעריכים את תרומתם של עמיתינו במעבדה על הדיונים החשובים שלהם ועל הסיוע בניסויים בבעלי חיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות תרבית תאים 24 בארותקורנינג3524מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית
צלחות תרבית תאים 6 בארותקורנינג3516תרבית תאים וכתם מערבי
70% אתנולסיגמא-אולדריץ'E7023עיקור וחיטוי
75% אתנולסיגמא-אולדריץ'E7148מאגר שטיפת RNA
צלחות תרבית תאים 96 בארותקורנינג3596תרבית תאים ובדיקות
פילטר אלומיניום (0.5 מ"מ)ברוקרלא ישיםמסנן סריקת מיקרו-CT
נוגדן נגד CD11b-FITCביולג'נד101206ציטומטריית זרימה - סמן מקרופאגים
נוגדן Notch1 נגד שסע (חד שבטי ארנב)טכנולוגיית איתות תאים4147Sכתם מערבי - איתות חריץ
נוגדן נגד F4/80-PEביולג'נד123108ציטומטריית זרימה - סמן מקרופאגים
אמצעי הרכבה נגד דהייהמעבדות וקטורH-1000הרכבה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית
נוגדן נגד Hes1 (חד שבטי ארנב)טכנולוגיית איתות תאיםשנות ה-11988כתם מערבי - יעד חריץ במורד הזרם
נוגדן נגד NFATc1 (חד שבטי של עכבר)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-7294כתם מערבי - ווסת ראשי אוסטאוקלסט
נוגדן אנטי-פוספו-Akt (Ser473)טכנולוגיית איתות תאיםשנות ה-4060כתם מערבי - איתות PI3K/Akt
נוגדן אנטי-פוספו-ERK1/2 (Thr202/Tyr204).טכנולוגיית איתות תאיםשניות 4370כתם מערבי - איתות MAPK
אנטי פוספו-NF-κ B p65 (Ser536) נוגדןטכנולוגיית איתות תאיםשנת 3033כתם מערבי - NF-κ איתות B
נוגדן נגד פוספו-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)טכנולוגיית איתות תאים4511כתם מערבי - איתות p38 MAPK
נוגדן אנטי-בטא;-אקטין (חד-שבטי של עכבר)טכנולוגיית איתות תאיםשנות ה-4970בקרת טעינת כתמים מערביים
קורא הדמיה אוטומטיהתקנים מולקולרייםImageXpress Microכימות בור ספיגה
ערכת בדיקת חלבון BCAפירס/תרמו פישר23225קביעת ריכוז חלבון
אקונומיקה (10% נתרן היפוכלוריט)סיגמא-אולדריץ'425044הסרת תאים מלוחות ספיגה
BSA (אלבומין סרום בקר)סיגמא-אולדריץ'א7906מאגר חוסם לאימונופלואורסצנציה
C57BL/6 עכברים (זכרים, בני 5-8 שבועות)מעבדות צ'ארלס ריבר27בידוד BMM במבחנה ומחקרי in vivo
מגיב לבדיקת סידן אוקסלטסיגמא-אולדריץ'C0350בדיקת השלמת הסרת אבנית
מגיב CCK-8 (ערכת ספירת תאים-8)דוג'ינדו טכנולוגיות מולקולריותCK04הערכת כדאיות תאים
מסננת תאים (70 μ m)בי.די פלקון352350סינון תאי מח עצם
צנטריפוגה (מקוררת)אפנדורףר5424רהכנת תאים ודגימה
כלורופורםסיגמא-אולדריץ'C2432הפרדת שלב מיצוי RNA
תא CO2Euthanex CorpEX-075המתת חסד של בעלי חיים
תוכנת CTAnברוקרגירסה 1.20ניתוח תמונות מיקרו-CT
DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול)סיגמא-אולדריץ'D9542כתמים גרעיניים
דימתילפורממיד (DMF)סיגמא-אולדריץ'D4551ממס מכתים TRAP
DMSO (דימתיל סולפוקסיד)סיגמא-אולדריץ'D2650הכנת בקרת רכב
מצע הכתמה מערבי ECLפירס/תרמו פישר32106זיהוי חלבונים בכתם מערבי
EDTA (10%, pH 7.4)סיגמא-אולדריץ'E6758פתרון הסרת אבדן
איוזין יסיגמא-אולדריץ'E4009H& E צביעה היסטולוגית
מלח LB סגול אדום מהירסיגמא-אולדריץ'F3381כרומין מכתים TRAP
סרום בקר עוברי (FBS)גיבקו/תרמו פישר16140-071תוסף תרבית תאים
ציטומטר זרימהBD BiosciencesFACSקליבוראפיון BMM
מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוסIX73הדמיה אימונופלואורסצנטית
תוכנת G*Powerאוניברסיטת היינריך היינהגירסה 3.1ניתוח כוח סטטיסטי
כיסויי זכוכית (22 ומעלה; 22 מ"מ)פישר סיינטיפיק12-541-במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית
פריזמה של GraphPadתוכנת GraphPadגירסה 9.0חישוב IC50 וגרפים
המטוקסיליןסיגמא-אולדריץ'H3136H& E צביעה היסטולוגית
המוציטומטרהאוסר סיינטיפיק3200ספירת תאים
ערכת שעתוק הפוך cDNA בעלת קיבולת גבוההאפלייד ביוסיסטמס4368814סינתזת cDNA מ-RNA
IgG מצומד נגד עכבר HRPטכנולוגיית איתות תאים7076Sנוגדן משני של כתם מערבי
IgG מצומד נגד ארנב HRPטכנולוגיית איתות תאים7074Sנוגדן משני של כתם מערבי
צלחות 96 בארות מצופות הידרוקסיאפטיטקורנינג ביו-קואט354651בדיקה תפקודית של ספיגת עצם
תמונהJה-NIHגירסה 1.53eניתוח וכימות תמונה
אינקובטור (CO2)תרמו פישר51033058תחזוקת תרבית תאים
מערכת הדמיה אינפרא אדוםביו-ראדChemiDoc חבר פרלמנטזיהוי כתמים מערביים
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסCKX41ניטור תרביות תאים, ספירת TRAP
איזופרופנולסיגמא-אולדריץ'I9516משקעי RNA
LPS (ליפופוליסכריד מ- E. coli)סיגמא-אולדריץ'L4391ספיגת עצם דלקתית in vivo
LY900009 (&מעכב גמא;-סקרטאז)סלק כימיקליםS7999תרכובת בדיקה - מעכב אוסטאוקלסטים
M-CSF (גורם מגרה מושבת מקרופאגים)מו"פ D מערכות416-מ"ל-010הישרדות מקרופאגים והתמיינות אוסטאוקלסטים
סורק מיקרו-CTברוקרסקייסקן 1272ניתוח מיקרו-ארכיטקטורת עצם
קורא מיקרו-פלטותביוטקסינרגיה H1מדידות ספיגה (CCK-8)
מיקרוטוםלייקה₪2255חתך היסטולוגי
נפתול AS-MX פוספטסיגמא-אולדריץ'N5000מצע צביעה TRAP
מחטים (25 גרם, 27 גרם)ב.ד.305122, 305109שטיפת מח עצם, זריקות
תוכנת NReconברוקרגירסה 1.7שחזור תמונה במיקרו-CT
שעוות פרפיןסיגמא-אולדריץ'עמ' 3683הטמעת רקמות
פרפורמלדהיד (4%)סיגמא-אולדריץ'עמ' 6148קיבוע תאים ורקמות
PBS (מי מלח עם חוצץ פוספט)גיבקו/תרמו פישר14190-144שטיפת תאים והכנת מאגר
פנטוברביטל נתרןסיגמא-אולדריץ'עמ' 3761הרדמה והמתת חסד של בעלי חיים
קוקטייל מעכב פוספטאזרוש4906837001שימור זרחון
PowerUp SYBR גרין מאסטר מיקסאפלייד ביוסיסטמסא25742PCR כמותי בזמן אמת
קוקטייל מעכב פרוטאזרוש11697498001מניעת פירוק חלבונים
קרום PVDF (0.45 μ m)ביו-ראד1620177העברת חלבון כתם מערבי
RANKL (מפעיל קולטן של NF-κ B ליגנד)מו"פ D מערכות462-TEC-010אינדוקציה של התמיינות אוסטאוקלסטים
מערכת PCR בזמן אמתאפלייד ביוסיסטמס7500 מהירניתוח כמותי של ביטוי גנים
רודמין-פלואידיןInvitrogen / תרמו פישר₪100ויזואליזציה של F-actin
מאגר RIPAטכנולוגיית איתות תאים9806Sמיצוי חלבון
מים ללא RNaseאמביון / תרמו פישרAM9937פירוק RNA ו-PCR
ג'ל SDS-PAGE (10%)ביו-ראד4561036הפרדת חלבון כתם מערבי
אבקת חלב רזהביו-ראד1706404חסימת כתמים מערביים
חוצץ נתרן אצטט (0.1 M, pH 5.0)סיגמא-אולדריץ'S2889מאגר צביעה TRAP
נתרן טרטרט (50 מ"מ)סיגמא-אולדריץ'S4297ספציפיות צביעת TRAP
ספקטרופוטומטרתרמו פישרננו-דרופ 2000מדידת ריכוז RNA/חלבון
אס.פי.אס.אסתאגיד IBMגירסה 28.0ניתוח סטטיסטי
מזרקים (1 מ"ל, 10 מ"ל)ב.ד.309659, 309604שטיפת מח עצם, זריקות
צלוחיות תרבית תאים T75קורנינג430641תרבית BMM ראשונית
TBST (תמיסת מלח Tris-Buffered עם 0.1% Tween-20)ביו-ראד1706531מאגר שטיפת כתמים מערביים
מאגר העברהביו-ראד1704270העברת חלבון כתם מערבי
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'T8787חדירות תאים
מגיב טריזולInvitrogen / תרמו פישר15596026מיצוי RNA כולל
טריפן כחול (0.4%)סיגמא-אולדריץ'T8154הערכת כדאיות תאים
טריפסין-EDTA (0.25%)גיבקו/תרמו פישר25200-056קצירת תאים וניתוק
מערכת העברת כתמים מערבייםביו-ראדטרנס-בלוט טורבוהעברת חלבון לממברנה
קסילןסיגמא-אולדריץ'X3750עיבוד וניקוי רקמות
α-MEM (מדיום חיוני מינימלי אלפא)גיבקו/תרמו פישר12561-056מדיום תרבית תאים

מקורות

  1. Langdahl, B., Ferrari, S., Dempster, D. W. Bone modeling and remodeling: potential as therapeutic targets for the treatment of osteoporosis. Ther Adv Musculoskeletal Dis. 8 (6), 225-235 (2016).
  2. Shah, M. A. A., et al. Functional morphology of trabecular system in human proximal femur: a perspective from P45 sectional plastination and 3D reconstruction finite element analysis. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  3. Shah, M. A. A., et al. Microvasculature and trabecular bone in beagle proximal femur: Microstructural insights. Ann Anatomy. 258, 152368(2025).
  4. Mukherjee, K., Chattopadhyay, N. Pharmacological inhibition of cathepsin K: A promising novel approach for postmenopausal osteoporosis therapy. Biochem Pharmacol. 117, 10-19 (2016).
  5. Bertuglia, A., et al. Osteoclasts are recruited to the subchondral bone in naturally occurring post-traumatic equine carpal osteoarthritis and may contribute to cartilage degradation. Osteoarth Cartilage. 24 (3), 555-566 (2016).
  6. Alami, S., Hervouet, L., Poiraudeau, S., Briot, K., Roux, C. Barriers to Effective Postmenopausal Osteoporosis Treatment: A Qualitative Study of Patients' and Practitioners' Views. PLoS One. 11 (6), e0158365(2016).
  7. Hiligsmann, M., et al. A Systematic Review of Cost-Effectiveness Analyses of Drugs for Postmenopausal Osteoporosis. PharmacoEconomics. 33 (3), 205-224 (2014).
  8. Hadji, P., et al. Persistence, adherence, and medication-taking behavior in women with postmenopausal osteoporosis receiving denosumab in routine practice in Germany, Austria, Greece, and Belgium: 12-month results from a European non-interventional study. Osteoporosis Int. 26 (10), 2479-2489 (2015).
  9. Udagawa, N., et al. Osteoblasts/stromal cells stimulate osteoclast activation through expression of osteoclast differentiation factor/RANKL but not macrophage colony-stimulating factor. Bone. 25 (5), 517-523 (1999).
  10. Lee, K., et al. Selective Regulation of MAPK Signaling Mediates RANKL-dependent Osteoclast Differentiation. Int J Biol Sci. 12 (2), 235-245 (2016).
  11. Huang, H., et al. Osteoclast differentiation requires TAK1 and MKK6 for NFATc1 induction and NF-κB transactivation by RANKL. Cell Death Diff. 13 (11), 1879-1891 (2006).
  12. Matsumoto, Y., et al. RANKL coordinates multiple osteoclastogenic pathways by regulating expression of ubiquitin ligase RNF146. J Clin Investigat. 127 (4), 1303-1315 (2017).
  13. Lai, E. C. Notch signaling: control of cell communication and cell fate. Development. 131 (5), 965-973 (2004).
  14. Chen, X., et al. LY411575, a potent γ-secretase inhibitor, suppresses osteoclastogenesis in vitro and LPS-induced calvarial osteolysis in vivo. J Cellular Physiol. 234 (11), 20944-20956 (2019).
  15. Chen, S., Lee, B. H., Bae, Y. Notch Signaling in Skeletal Stem Cells. Calcified Tiss Int. 94 (1), 68-77 (2013).
  16. Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), (2012).
  17. Duan, L. Notch is activated in RANKL-induced osteoclast differentiation and resorption. Front Biosci. (13), 7064(2008).
  18. Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
  19. Hough, F. S., et al. The safety of osteoporosis medication. South African Med J. 104 (4), 279(2013).
  20. Espinosa, L. S., Inglés-Esteve, J., Robert-Moreno, A., Bigas, A. IκBα and p65 Regulate the Cytoplasmic Shuttling of Nuclear Corepressors: Cross-talk between Notch and NFκB Pathways. Mol Biol Cell. 14 (2), 491-502 (2003).
  21. Wang, Z., Li, Y., Sarkar, F. Notch Signaling Proteins: Legitimate Targets for Cancer Therapy. Curr Prot Peptide Sci. 11 (6), 398-408 (2010).
  22. Zhou, Z., et al. PP121 suppresses RANKL-Induced osteoclast formation in vitro and LPS-Induced bone resorption in vivo. Exp Cell Res. 388 (2), 111857(2020).
  23. Shah, M. A. A., et al. Regional distribution of microvasculature within the canine femoral head: a study of plastinated tissue histology and 3D reconstruction. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  24. Clayden, E. C. Practical Section Cutting and Staining. , Churchill. (1955).
  25. McHorney, C. A., Schousboe, J. T., Cline, R. R., Weiss, T. W. The impact of osteoporosis medication beliefs and side-effect experiences on non-adherence to oral bisphosphonates ates. Curr Med Res Opin. 24 (3), 707-708 (2008).
  26. Canalis, E. Notch in skeletal physiology and disease. Osteoporosis Int. 29 (12), 2611-2621 (2018).
  27. Zanotti, S., Canalis, E. Notch Signaling and the Skeleton. Endocrine Rev. 37 (3), 223-253 (2016).
  28. Grevers, L. C., et al. Immune complex-induced inhibition of osteoclastogenesis is mediated via activating but not inhibitory Fcγ receptors on myeloid precursor cells. Ann Rheumatic Dis. 72 (2), 278-285 (2013).
  29. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  30. Weber, J. M., Calvi, L. M. Notch signaling and the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Bone. 46 (2), 281-285 (2010).
  31. Kovtonyuk, L. V., Fritsch, K., Feng, X., Manz, M. G., Takizawa, H. Inflamm-Aging of Hematopoiesis, Hematopoietic Stem Cells, and the Bone Marrow Microenvironment. Front Immunol. 7, (2016).
  32. Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis treatment: recent developments and ongoing challenges. Lancet Diabet Endocrinol. 5 (11), 898-907 (2017).
  33. Reid, I. R. Efficacy, effectiveness and side effects of medications used to prevent fractures. J Inter Med. 277 (6), 690-706 (2015).
  34. Cosman, F., et al. Clinician's Guide to Prevention and Treatment of Osteoporosis. Osteoporosis Int. 25 (10), 2359-2381 (2014).
  35. Chen, Y. H., et al. Melatonin protects against lipopolysaccharide-induced intra-uterine fetal death and growth retardation in mice. J Pineal Res. 40 (1), 40-47 (2005).
  36. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. J Clin Investigat. 100 (6), 1557-1565 (1997).
  37. Black, D. M., Rosen, C. J. Postmenopausal Osteoporosis. New Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
  38. Eastell, R., et al. Pharmacological Management of Osteoporosis in Postmenopausal Women: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metabol. 104 (5), 1595-1622 (2019).
  39. Leder, B. Z. Optimizing Sequential and Combined Anabolic and Antiresorptive Osteoporosis Therapy. JBMR Plus. 2 (2), 62-66 (2018).
  40. Grey, A., Bolland, M., Cundy, T. Maintaining Order in Osteoporosis Treatments. Journal of Bone Miner Res. 32 (5), 1147-1147 (2017).
  41. McClung, M. R. Role of bone-forming agents in the management of osteoporosis. Aging Clin Exp Re. 33 (4), 775-791 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

עיכוב אוסטאוקלסטוגנזהLY900009אוסטאוקלסטים המונחים על ידי RANKLספיגת עצםמקרופאגים של מחולל גרמייםWestern Blotצביעת TRAPנתיב MAPK Akt
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.