מאמר שיטה

מודל עכבר יילודים של דלקת מעיים נמקית ובידוד למינה פרופריה לפרופיל תאי חיסון

DOI:

10.3791/69233

⸱

19 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר יילודים של דלקת מעיים נמקית (NEC) ובידוד לאחר מכן של תאי חיסון למינה פרופריה מהמעי הדק של עכברי היילוד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דלקת מעיים נמקית (NEC) היא מחלה דלקתית קשה של המעי היילודים, הפוגעת בעיקר בפגים. NEC מאופיין בפגיעה באפיתל, דיסביוזיס מיקרוביאלי ותגובה חיסונית לא מווסתת, מה שגורם לעתים קרובות לנמק מעיים ודלקת מערכתית. מודלים ניסיוניים של עכברים המסכמים את ההיבטים העיקריים של מחלות אנושיות היו חיוניים לקידום הבנתנו את המנגנונים המניעים מחלות ומיידעים את ההתפתחות הטיפולית. פרוטוקול זה מתאר מודל עכברי יילודים מבוסס היטב של דלקת מעיים נמקית (NEC) תוך שימוש בהאכלת פורמולה, היפוקסיה לסירוגין, מתן דרך הפה של ליפופוליסכריד (LPS) וחיידקי מעיים שגודלו מתינוק עם NEC. שילוב זה גורם באופן אמין לתכונות היסטולוגיות, שעתוק ואימונולוגיות העולות בקנה אחד עם NEC בתינוקות אנושיים והיה יסוד במספר תגליות מפתח בתחום. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי חיסון מהלמינה פרופריה של המעי הדק של עכברים יילודים. בידוד תאי Lamina propria מאפשר פרופיל מפורט של תאי חיסון באמצעות ציטומטריית זרימה, מה שמקל על ניתוח אוכלוסיות תאים מולדות ונרכשות בתוך המעי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דלקת מעי נמקית (NEC) היא מחלה דלקתית קשה של המעי הפוגעת כמעט אך ורק בילודים פגים. כ-7%-8% מהתינוקות במשקל לידה נמוך מאוד (<1500 גרם) יושפעו מ-NEC, ושיעורי התמותה הקשורים למחלה יכולים להתקרב ל-50% ביילודים הזקוקים להתערבות כירורגית1. הפתוגנזה של NEC נותרה לא מובנת לחלוטין; עם זאת, עדויות עדכניות מצביעות על כך ש-NEC נובע ממפגש של מספר גורמים, כולל מחסום מעיים לא בשל, איתות חיסוני לא מווסת ומיקרוביום דיסביוטי 2,3,4. התכנסות הגורמים הללו עלולה ליזום ולהחמיר תגובות דלקתיות במעי, בעיקר באמצעות הפעלת קולטן דמוי טול 4 (TLR4), וכתוצאה מכך לנזק לאפיתל ולסוגים שונים של מוות תאי, כולל אפופטוזיס ונמק 5,6. מטרת פרוטוקול זה היא להציג מודל עכברי הניתן לשחזור ורלוונטי מבחינה פיזיולוגית של NEC המסכם את דלקת המעי ופנאומטוזיס אינסטינליס (גז בתוך דופן המעי) שנצפו בילודים אנושיים, ומאפשר חקירה מכניסטית של פתוגנזה של המחלה. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי חיסון מהלמינה פרופריה של המעי הדק של עכברים יילודים, ומאפשר לחוקרים לבצע פרופיל תאי חיסון באמצעות ציטומטריית זרימה.

בהשוואה למודלים גדולים יותר של בעלי חיים, כגון חולדות יילודים או חזרזירים 7,8, מודלים של עכברים יילודים מציעים מספר יתרונות מובהקים, כולל עלות נמוכה יותר, גישה רבה יותר לבעלי חיים טרנסגניים ויכולת לבצע ניסויים על קבוצות גדולות יותר. מודלים של NEC עכברים משתמשים בעיקר בשילוב של הזנת פורמולה, מתח קר והיפוקסיה כדי לדמות את הפתופיזיולוגיה המורכבת של NEC שנצפתה בחולים אנושיים 7,8,9. עם זאת, מודלים רבים של עכברים של NEC מוגבלים על ידי התלות שלהם בגורמי לחץ מיקרוביאליים רחבים או שינויים מלאכותיים של המיקרוביוטה, מה שעלול לפגוע ברלוונטיות הקלינית שלהם. לעומת זאת, המודל המתואר בפרוטוקול זה מתגבר על מגבלות אלה על ידי שילוב מספר גורמים מרכזיים המעורבים בפתוגנזה של NEC בתינוקות אנושיים10,11. באופן ספציפי, מודל זה משלב מתח היפוקסי, המעורב בשיבוש שלמות מחסום המעי 3,12, עם מתן פומי של פורמולה לתינוקות בתוספת ליפופוליסכריד (LPS), ליגנד TLR4 מאופיין היטב הגורם לדלקת מעיים, כמו גם מיקרוביום דיסביוטי רלוונטי מבחינה קלינית עם חיידקי מעיים שגודלו מחולה עם NEC totalis, הצורה החמורה ביותר של המחלה, המאופיינת בנמק של המעי 10,13. על ידי שילוב גורמי לחץ רלוונטיים קלינית וספציפיים למחלה, המודל שלנו משקף במדויק את המאפיינים הקליניים והמולקולריים של NEC. יתר על כן, כדי לספק לחוקרים מסגרת לחקירת המנגנונים המתווכים על ידי מערכת החיסון העומדים בבסיס פתוגנזה של NEC, פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי למינה פרופריה מהמעי הדק של עכברי היילוד לצורך ניתוח זרימה ציטומטרית. כאתר העיקרי של פעילות חיסונית ברירית המעי, הלמינה פרופריה מכילה רפרטואר דינמי של תאי חיסון תושבים ומסתננים הממלאים תפקיד מרכזי בדלקת הקשורה ל-NEC14. זרימה ציטומטרית מספקת פלטפורמה חזקה וניתנת להרחבה לאפיון אוכלוסיות תאי חיסון אלה ברזולוציה גבוהה, המאפשרת ניתוח מפורט של פנוטיפים תאיים, כימות תגובות חיסוניות וזיהוי חתימות אימונולוגיות המעורבות בפתוגנזה של NEC15.

מודל NEC של עכברים המתואר בפרוטוקול זה משלים מודלים במבחנה בכך שהוא מאפשר לחקור אינטראקציות מארח-מיקרוביום, תגובות חיסוניות ואיתות דלקתי בסביבה המורכבת של מעי היילוד. הוא משחזר היבטים מרכזיים של פתוגנזה של NEC שלא ניתן לעצב במבחנה, מה שהופך אותו לכלי רב ערך להבהרת מנגנוני מחלה ולהערכת אסטרטגיות טיפוליות. למרות שהבדלים ספציפיים למינים נותרו מגבלה, מודל זה מציע פלטפורמה חזקה ונגישה לקידום הבנתנו את NEC ולהאיץ את הפיתוח של התערבויות ממוקדות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות האתיות שסופקו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל. עכברים גודלו, תוחזקו ושוכנו על פי נהלים המתוארים במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה על פי הצעת מחקר שאושרה על ידי IACUC (פרוטוקול מס' 24-114) של אוניברסיטת צפון קרוליינה בבית הספר לרפואה של צ'אפל היל. עכברי C57BL/6J שימשו לכל הניסויים שתוארו במחקר זה. גורים התחילו במודל ביום 4 לאחר הלידה, במשקל של בין 1.8-2.3 גרם; בעלי חיים מחוץ לטווח משקל זה לא נכללו. לקבוצות הניסוי הייתה התפלגות מין מאוזנת, כאשר זכרים ונקבות היוו כל אחד כ-50% מבעלי החיים שטופלו. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. מודל NEC עכברי

הערה: מלאי חיידקים אנטרי מיוצר על ידי השגת התוכן האנטרי מתינוק שהיה לו הצורה החמורה ביותר של NEC, NEC totalis13,16. התוכן האנטרי מתורבת למשך הלילה ב-1 x גרם למשך 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, צנטריפוגה ב-3000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ומרחבה מחדש ב-50% גליצרול. 20 מיקרוליטר מועברים לקריוביאלים ומאוחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. זמני התרבית שנבחרו בפרוטוקול זה נבחרו ליעילות זרימת העבודה. ניתן להתאים נקודות זמן אלה לפי הצורך כדי להתאים ללוחות זמנים בודדים של מעבדה מבלי להשפיע על המודל הכולל. בנוסף, פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לקיבולת מקסימלית של 40 עכברים, אך ניתן להגדיל אותו לפי הצורך.

  1. הכנת תרבית חיידקים
    1. ביום הניסוי 0 בשעה 15:00, הוסף 20 מיקרוליטר של חיידקי מעיים שתרבית מתינוק עם NEC totalis לצינור תרבית של 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של מרק לוריא-ברטאני (LB). דגרו את תרבית החיידקים עם מכסה הצינור במצב מאוורר בשייקר אורביטלי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 1 x גרם, למשך הלילה למשך 16 שעות, ודגרו על צינור תרבית המכיל רק 2 מ"ל של מרק LB בו זמנית כבקרה להערכת זיהום LB כלשהו.
      1. לאשר חזותית את תרבית הלילה על ידי השוואת העכירות בין תרבית החיידקים לבקרה הברורה של LB בלבד; המשך רק אם תרבית החיידקים נראית עכורה והבקרה נשארת ברורה.
    2. ביום הניסוי הראשון, בשעה 07:00, יש להכניס 125 מיקרוליטר של תרבית הלילה המחוסנת לבקבוק תרבית תאים T75 עם מכסה מאוורר המכיל 25 מ"ל של מרק LB. הכן ארבע צלוחיות T75 בסך הכל ודגר אותן במצב זקוף בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס, 1 x גרם, למשך שעתיים כדי להרחיב את תרבית החיידקים.
      הערה: תרביות לילה מוכנות בימי ניסוי 0, 1 ו-2 של מודל NEC.
  2. הקצאת גורים לקבוצות ניסוי
    1. ביום הניסוי 1 בשעה 07:00, שקלו את הגורים ביום הרביעי לאחר הלידה.
      הערה: טווח המשקל האופטימלי הוא בין 1.8-2.3 גרם, ויש להסיר חריגים מהניסוי.
    2. קבצו את עכברי הניסוי לקבוצות שניזונו מפורמולה ומסכרים וחישבו את המשקל הממוצע של העכברים שניזונו מפורמולה. הפרד את העכברים המיועדים שניזונו מפורמולה מהסכר והנח אותם בכלוב חדש השוכן באינקובטור לתינוקות שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס. שמור את הגורים הניזונים מהסכר בכלוב המקורי עם הסכר.
      הערה: עכברים יילודים רגישים במיוחד לשינויים בטמפרטורת הסביבה. כדי לשמור על ויסות טמפרטורה עקבי לאחר ההפרדה מהסכר, גורים הניזונים מפורמולה מוחזקים באינקובטור תינוקות מבוקר טמפרטורה המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס. גישה זו עולה בקנה אחד עם פרוטוקולי NEC מבוססים השומרים על טמפרטורה פיזיולוגית ללא שימוש בהתערבויות תרמיות נוספות 11,17,18,19.
    3. חזרו על הפעולה בימי הניסוי 2 ו-3, שקלו את העכברים שהוזנו בפורמולה וחשבו את המשקל הממוצע לפני נקודת זמן ההאכלה של 07:00 מדי יום.
  3. מדידת צפיפות אופטית (OD) של תרבית חיידקים
    1. לאחר שעתיים של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-1 x גרם, הסר את ארבעת צלוחיות ה-T75 עם תרבית מורחבת משייקר המסלול בימי הניסוי 1, 2 ו-3. שלב את תכולת ארבע צלוחיות T75, ערבב היטב ופיפטה 1 מ"ל מתרבית החיידקים לקובטה.
      1. הכינו תמיסה ריקה על ידי הוספת 1 מ"ל מרק LB סטרילי לקובטה. מדוד את הצפיפות האופטית של תרבית החיידקים ב-600 ננומטר (OD600 ננומטר) בעזרת ספקטרופוטומטר.
        הערה: היעד OD600nm הוא 0.6 ±-0.02. אם ה-OD600nm של תרבית החיידקים נמוך מערך היעד, המשך בדגירה כמתואר בשלב 1.3.1. עד שיושג היעד OD600nm של 0.6 ± 0.02. אם ה-OD600 ננומטר הוא מעל 0.6, יש לדלל את תרבית החיידקים במרק LB סטרילי.
    2. העבירו 80 מ"ל מתרבית החיידקים לשני צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-3000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. אשר תרבית מוצלחת על ידי בדיקת גלולה גלויה בתחתית כל צינור.
  4. הכנת פורמולה
    1. יש להתחיל בהכנת הפורמולה בשעה 09:00 בימי הניסוי 1, 2 ו-3. שלבו 16 מ"ל פורמולה לתינוקות ו-8 מ"ל חלב גורים ביחס של 2:1 בצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל.
    2. הסר את הסופרנטנט משני צינורות הצנטריפוגה של 50 מ"ל המכילים תרבית חיידקים גלולה (שלב 1.3.2).
    3. השעו היטב כל אחד משני הכדורים ב-2 מ"ל של תערובת הפורמולה והעבירו את ההשעיה לתערובת הפורמולה כדי ליצור 24 מ"ל של נוסחת NEC.
      הערה: ריכוז החיידקים הסופי בנוסחת NEC צריך להיות בין 4 ל-5 x 109 CFU/mL.
    4. סמן שש צינורות צנטריפוגות של 50 מ"ל עבור כל אחת משש נקודות זמן ההאכלה (10:00, 13:00, 16:00, 19:00, 22:00, 07:00).
    5. פיפטה 4 מ"ל של נוסחת NEC לכל צינור מסומן.
    6. הכן שש מנות חד פעמיות של מלאי LPS (5 מ"ג/מ"ל) ואחסן במיקרו-צינורות בעלי קשירה נמוכה ב-20 מעלות צלזיוס. הוסף LPS (ראה הערה לריכוז) לנוסחת NEC מיד לפני ההאכלה בכל נקודת זמן.
      הערה: כמות ה-LPS שנוספה לפורמולת NEC מבוססת על משקל הגוף הממוצע של הגורים הניזונים מפורמולה המחושב בשעה 07:00 בכל יום, תוך שימוש במינון של 5 מיקרוגרם LPS לגרם ממשקל גופם של הגורים. ריכוז ה-LPS הסופי משתנה בהתאם למשקל הגוף. לדוגמה, עם נפח האכלה של 80 מיקרוליטר ומשקל ממוצע של עוקבת גורים של 2 גרם, ריכוז ה-LPS בפורמולה יהיה 0.125 מ"ג/מ"ל.
  5. האכלה
    הערה: ביום הניסוי הראשון, עכברים שיוצבו במודל NEC צמים במשך 3 שעות לאחר ההפרדה מהסכר שלהם. ההזנה הראשונה של פורמולת NEC היא בשעה 10:00 ונמשכת כל 3 שעות עד השעה 22:00. בימי הניסוי 2 ו-3, עכברים מוזנים בשעות 07:00, 10:00, 13:00, 16:00, 19:00 ו-22:00. עכברים אינם מוזנים ביום הניסוי הרביעי.
    1. מיד לפני האכלת עכברים, הפשרה ומערבולת מנה אחת של LPS למשך 15 שניות. הוסף את הכמות המתאימה של LPS על סמך המשקל הממוצע של העכברים לצינור המוכן של 4 מ"ל של נוסחת NEC (ראה שלב 1.4.6 לחישוב) וערבב היטב על ידי פיפטינג.
    2. מלאו מזרק של 1 מ"ל בפורמולת NEC והצמידו קו קטטר מרכזי מוכנס היקפי ליילודים (PICC). ודא שאין בועות או אוויר במזרק או בקו ה-PICC.
    3. יש לתת את פורמולת ה-NEC לגורים באמצעות גבאז' דרך הפה עם קו PICC.
      1. רסנו בעדינות כל גור על ידי העור הרפוי בבסיס צווארו והחזיקו את העכבר במצב זקוף. בעזרת מלקחיים, הנח את הקצה הדיסטלי של קו ה-PICC לתוך הפה והוושט ומקם את קצה קו ה-PICC בתוך הקיבה.
        הערה: מרחק ההחדרה של קו ה-PICC שווה למרחק מזווית הפה לחלק העליון של נקודת החלב בקיבה. לאחר מכן יש לסמן בבירור את נקודת ההכנסה האופטימלית על קו ה-PICC באמצעות סמן קבוע.
      2. אם מורגשת התנגדות משמעותית במהלך הכנסת קו ה-PICC, הסר את קו ה-PICC, מקם מחדש ונסה שוב בזהירות את ההחדרה.
      3. יש להוציא 8 מיקרוליטר של פורמולת NEC באיטיות לתוך הקיבה, ולעקוב מקרוב אחר הגור לאורך כל ההאכלה לאיתור סימני שאיפה. שימו לב להופעת כתם חלב לבן כדי לאשר לידת קיבה מוצלחת.
      4. הסר את קו PICC. התבוננו בגור עבור כל נשימה מאומצת או הקאה. אם הגור מחזיר פורמולה, יש למרוח את הפה והאף במגבון מעבדה עם מוך נמוך.
    4. חזור על תהליך זה בכל נקודת זמן האכלה.
    5. פעמיים ביום, חשפו את הגורים להיפוקסיה למשך 10 דקות מיד לאחר זמני ההאכלה 13:00 ו-19:00.
      1. לאחר שתי האכלות ביום, הניחו את הגורים בתא היפוקסיה המחובר למיכל גז המכיל 95% חנקן ו-5% חמצן. פתח את שסתום המיכל ועקוב אחר רמות החמצן בתוך תא ההיפוקסיה האטום באמצעות צג כף יד. ברגע שתא ההיפוקסיה מגיע ל-5%± 0.5% חמצן, שמור על הגורים ברמת חמצן זו למשך 10 דקות.
        הערה: יש לייעל את קצב הזרימה כך שירד מ-20% ל-5% חמצן בקצב קבוע ומבוקר לאורך תקופה של 2 דקות.
    6. צפו בגורי העכברים בין ההאכלות לאיתור סימנים של מצוקה נשימתית, שינוי צבע חיוור או דום נשימה. אם קיימים סימנים אלה, הסר את הגור הנגוע מתא ההיפוקסיה, צפה בזהירות להתאוששות, ובמידת הצורך המת את הגורים בהתאם למדיניות IACUC.
    7. המשך האכלה דרך הפה וחשיפה להיפוקסיה בנקודות זמן מתוכננות למשך 72 השעות המלאות של מודל NEC.
      הערה: אם יום הניסוי הראשון מתחיל ביום שני בשעה 10:00, נקודת הסיום של 72 שעות תתרחש בשעה 10:00 ביום חמישי. זה מוגדר כיום הרביעי של הדגם. עכברים אינם מוזנים בשעה 07:00 ביום הרביעי של המודל, והם מורדמים בנקודת הזמן האחרונה של 10:00 לאיסוף רקמות.
  6. המתת חסד של בעלי חיים ואיסוף רקמות
    1. בבוקר היום הרביעי של המודל, שקלו ורשמו את המין של כל גור, ולאחר מכן המתת חסד בהתאם להנחיות IACUC.
    2. לאחר המתת חסד, אספו דם מכל גור לתוך צינור מפריד סרום המכיל מפעיל קרישים וג'ל.
    3. צנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להפרדת הסרום. יש להזרים את הסרום לשפופרות מסומנות של 1.7 מ"ל ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    4. בצע חתך בקו האמצע של 1-2 ס"מ דרך דופן הבטן והצפק כדי לחשוף את מערכת העיכול. בדוק את המעי החשוף לאיתור מאפיינים סימני היכר של NEC, כולל נפיחות, אריתמה, הצטברות גזים בתוך דופן המעי (פנאומטוזיס אינסטינליס) ובועות אוויר גלויות.
    5. זהה וכרת את התריסריון דרך פי הטבעת הדיסטלי. מניחים את הטישו בצלחת פטרי על קרח. השתמשו בתמיסת מלח בופר פוספט קר כקרח (PBS) כדי לשטוף את המעי.
    6. זהו את הצקום וחתכו אותו קרוב כדי להפריד את הצקום והמעי הגס מהמעי הדק. חתכו חלקים המתחילים באילאום הדיסטלי ומתקדמים לכיוון הג'ג'ונום. הניחו חתיכה בגודל 1 ס"מ בצינור המכיל מאגר ליזה RNA וחרוזי תחמוצת זירקוניום 1.5 מ"מ על קרח לניתוח שעתוק.
      1. שטפו חתיכה בגודל 1.5 ס"מ עם מזרק המכיל PBS המחובר למחט קהה של 24 גרם, ולאחר מכן הניחו אותה בצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA). יש להקפיא חתיכת מעי בגודל 1 ס"מ ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לניתוח חלבון. יש להקפיא חתיכת מעי בגודל 1 ס"מ ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עבור כל בדיקה נוספת.
    7. עבד רקמה שנאספה למאגר ליזה RNA במקצף חרוזים (5.50 מ'/ש', 1.0 דקות, מחזור = 1.0, שהיית הפסקה: 10 שניות, 4 מעלות צלזיוס) כדי להומוגניזציה של הרקמה, ולאחר מכן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
  7. קיבוע רקמות
    1. הניחו חתיכות רקמה שנאספו ב-4% PFA על נדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לקיבוע למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, הסר 4% PFA מכל צינור והחלף ב-1 מ"ל PBS כדי לשטוף את הטישו. מחזירים את הצינורות לנדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. חזור על שטיפת ה-PBS פעם אחת.
      1. הסר את ה-PBS והוסף 1 מ"ל של 50% אתנול לכל צינור והחזיר את הצינורות לנדנדה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הסר את 50% האתנול והוסף 1 מ"ל של 70% אתנול, ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לעבד רקמה לגושי היסטולוגיה של פרפין.
        הערה: ניתן לאסוף מקטעי מעיים נוספים או דגימות צואה לפי הצורך להמשך ניתוח.

2. בידוד תאי חיסון של Lamina propria

הערה: פרוטוקול זה מותאם לבידוד תאי למינה פרופריה מעכברים יילודים בגיל שבוע בערך. אם יש צורך בדגימות ייחוס לציטומטריית זרימה ספקטרלית, ניתן להשתמש בגמילה (שבועות 3-4 לאחר הלידה). עבור דגימות גמילה, הכפל את כל נפחי הריאגנטים המפורטים בפרוטוקול.

  1. הכנת ריאגנטים
    1. הכן 1x תמיסת המלח המאוזנת של האנק ללא Ca2+ ו-Mg2+ (HBSS W/O) המכילה 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ואחסן בטמפרטורת החדר.
    2. הכן מאגר מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) על ידי המסת 5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS + 5 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) ואחסן ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. יום לפני ביצוע בידוד תאי למינה פרופריה, הכינו תמיסת טרום עיכול על ידי הוספת 5 מ"מ EDTA, 5% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1 מ"מ דיתיותרייטול (DTT) ל-HBSS W/O.
    4. הכן תמיסת עיכול מיד לפני ביצוע בידוד תאי למינה פרופריה על ידי השלמת מכון רוזוול פארק ממוריאל 1640 בינוני (RPMI) עם 10% FBS ומ"ג/מ"ל קולגנאז IV.
      הערה: ניתן להכין HBSS ללא ביצועים מראש ולאחסן בטמפרטורת החדר. יש להכין את מאגר FACS מראש ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש להכין תמיסות עיכול ועיכול טריות מיד לפני ביצוע בידוד למינה פרופריה ולשמור על קרח.
  2. איסוף והכנת רקמת מעי לעיכול
    1. אתר את הצקום וחצה אותו קרוב כדי להסיר את הצקום והמעי הגס. יש להוציא 2-3 ס"מ מהמעי הדק הדיסטלי (אילאום) ולהניח אותו על HBSS קר כקרח בצלחת פטרי (המשך משלב 1.6.5).
    2. בעזרת מחט קהה של 24 גרם המחוברת למזרק, שטפו את לומן המעי לחלוטין עם HBSS קר כקרח ללא שימוש תוך ייצוב הרקמה בעזרת מלקחיים. ודא חזותית כי לומן המעי נקי מצואה לאחר השטיפה.
    3. הסר בזהירות את כל רקמת החיבור שנותרה מקטע המעי באמצעות מלקחיים עדינים או מספריים.
    4. חותכים את המעי לאורך לפתיחה, ואז חותכים לרוחב לקטעים של 1-1 ס"מ.
  3. Lamina propria dissociation
    1. העבירו מקטעי מעיים לצינור צנטריפוגה של 1 מ"ל המכיל 1 מ"ל של תמיסת עיכול מוקדמת שהתקררה על קרח.
    2. דגרו את הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עם סיבוב רציף כדי להקל על דיסוציאציה של רקמות.
    3. סובבו בעדינות את הצינור, ואז שפכו את התוכן דרך מסננת תאים של 10 מיקרומטר המונחת על צינור צנטריפוגה של 5 מ"ל.
      הערה: המסנן שנאסף דרך מסננת 10 מיקרומטר מכיל לימפוציטים תוך-אפיתליים (IELs) וניתן להשתמש בו לניתוח במורד הזרם במידת הצורך.
    4. העבירו שברי רקמות לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של תמיסת עיכול שחוממה מראש ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דגרו את הדגימה למשך 40 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב רציף.
    5. העבירו את הדגימה כולה לתוך צינור דיסוציאציה אוטומטי של רקמות והפעילו את תוכנית הדיסוציאציה המורכבת מארבעה מחזורי סיבוב של 15 שניות כל אחד, לסירוגין בין כיוון השעון ונגד כיוון השעון.
      הערה: חלופה למפריד רקמות אוטומטי היא טחינה ידנית של רקמת המעי באמצעות הקצוות החלביים של שתי שקופיות מיקרוסקופ. אם משתמשים בשיטה זו, הפעל לחץ עדין ואחיד כדי למנוע לחץ מכני מוגזם, מכיוון שהדבר יכול להפחית משמעותית את כדאיות התאים.
    6. מערבל בעדינות את תרחיף התאים, ולאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות בצינור דיסוציאציה של רקמות ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    7. שאפו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה, ואז השעו מחדש את התאים במ"ל של מאגר FACS קר כקרח.
    8. הנח מסננת תאים של 10 מיקרומטר על צינור צנטריפוגה של 5 מ"ל. העבירו את מתלה התא התלוי דרך המסנן, ולאחר מכן שטפו את המסנן עם מ"ל נוסף של מאגר FACS קר כקרח.
    9. ספרו תאים והעריכו את הכדאיות באמצעות טריפאן כחול או צבע כדאיות. צנטריפוגה הנפח הנדרש לזרימה ציטומטרית ב-30 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השתמש בתאים באופן מיידי עבור יישומים במורד הזרם כדי לשמר את הכדאיות ואת ביטוי הסמן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודל העכברים היילודים של NEC המתואר בפרוטוקול זה משכפל את המאפיינים העיקריים של המחלה. ניתוח ההישרדות של קפלן-מאייר (איור 1A) הראה ירידה משמעותית בהישרדות בקבוצת הטיפול ב-NEC בהשוואה לקבוצת הביקורת שניזונה מסכר (9/21 לעומת 8/8; p = 0.0063). בדיקה גסה של המעיים מהעכברים שנחשפו למודל (איור 1B) הדגימה מאפיינים מובהקים של NEC, כולל התנפחות מעיים, בועות אוויר ופנאומטוזיס אינסטינליס (הצטברות גזים בתוך דופן המעי). הער...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משלב מודל עכברי יילודים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של NEC עם בידוד תאי חיסון למינה פרופריה, ומספק פלטפורמה מקיפה לחקירת תגובות חיסוניות ריריות במהלך דלקת מעיים. על ידי שילוב חשיפות רלוונטיות מבחינה קלינית, כגון מיקרוביום אנטרי ממקרי NEC אנושיים, מתח היפוקסי והזנת פורמולה, מודל זה מסכם את הפתוגנזה המורכבת והרב-גורמית שנצפתה במחלות אנושיות10,13. הגישה מאפשרת אימונופנוטיפ מפורט לצד ניתוחים שעתוק ופרוטאומיים מאותה רקמת מעי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים הקשור לכתב היד הזה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב היד הזה נתמך על ידי R01DK124614, R01HD105301 DP1DK140012, מענק יוזמת צ'אן צוקרברג מספר 2022-316749, פרס יאנג לחוקר ביו-רפואי והמחלקה לרפואת ילדים של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 mL Syringe-Tuberculin Slip TipBecton Dickinson309659מזרק להזנה על פי נוסחה
1.5 mL semi-micro Disposable CuvettesBRAND GMBH + CO KG759085D
1.7 ml Microtubes ClearAxygen - Corning Inc.MCT-175-Cלא פירוגני & נקי מ-Rnase-/Dnase
5% Oxygen, Balance Nitrogen Certified Reference Material, Size 200 High Pressure Steel Cylinger, CGA 580AirgasX02NI95C2003186
Anti-Mo CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-85
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-86
APC anti-mouse Ly-6C Clone: HK1.4 Isotype: Rat IgGcBioLegend128015
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222
BB515 Rat Anti-CD11b Clone: M1/70BD Biosciences564455
BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Clone: RM4-5BD Biosciences566408
BD Microtainer SSTBecton Dickinson365867צינורית סרום
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p1200Fisher Scientific12-111-365
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p20Fisher Scientific12-111-366
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p200Fisher Scientific12-111-362
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563795
BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Clone: 1A8BD Biosciences751263
BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Clone: M5/114.15.2BD Biosciences563415
C57BL/6J Neonatal MiceThe Jackson Laboratory000664
CD45-VioGreen mouseMiltenyi Biotec 130-102-412
CD64 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 770, REAfinity Clone REA286Miltenyi Biotec 130-119-659
CFX Opus Real-Time PC Systems Bio-Rad12011319
Collagenase Type 4Worthington Biochemical Corporation LS004188
DL-dithiothreitol SigmaD9779-5g
eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer SetLife Technologies Corp. 00-5523-00
EDTA (0.5M), pH 8.0Quality Biological Inc351-027-721
Esbilac Puppy Milk ReplacerPet-Ag, Inc.99502-1חלב לגורים
Fisherbrand Disposable CuvettesFisher Scientific14-955-127
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 10mLFisher Scientific13-678-11E
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 25mLFisher Scientific13-678-11
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 50mLFisher Scientific13-678-11F
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 5mLFisher Scientific13-678-11D
Genie Temp-Shaker 300USA Scientific, Inc.SI-G1600
gentleMACS Dissociator (protocol; m_intestine-01)Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS  C TubesMiltenyi Biotec 130096334
Ghost Dye Red 780 Viability DyeTonbo Biosciences13-0865-T100
Glycerol ReagentPlusSigma-AldrichG7757-500ML
GraphPad Prims Software, Version 10.0GraphPadN/A
Greiner Bio-One Round Bottom Polypropylene Culture Tube with Two-Position Vent StopperFisher Scientific07-000-212
Handi+ Oxygen analyzerMaxtecN/A
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco141650-095
HEPES BufferMediatech, Inc. 25-060-CI
Hypoxia ChamberBillups-Rothenburg, Inc.N/A
ImageJSchneider et al., 2012N/A
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 10.2cmFisher Scientific12-460-655
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 9cmFisher Scientific12-460-598
Integra Miltex™ Swiss Jeweler-Style ForcepsFisher Scientific12-460-110
Isolette Infant IncubatorAir-Shields VickersC100-200-2 Series 02חממה לעכברים
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipesKimberly-Clark34120
LPSSigma-AldrichL3129-10mg
Luria Broth Broth, Miller Molecular Genetics PowderFisher ScientificBP1426-500
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec 130-091-376
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec 130-090-753
Microcentrifuge TubesThermo Scientific34511.5 ml, צלול, מדורג, סטרילי
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisher ScientificND-ONEC-W

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of necrotizing enterocolitis: A systematic review and meta-analysis. BMC Pediatr. 20 (1), 344(2020).
  2. Warner, B. B., Tarr, P. I. Necrotizing enterocolitis and preterm infant gut bacteria. Semin Fetal Neonatal Med. 21 (6), 394-399 (2016).
  3. Rose, A. T., Patel, R. M. A critical analysis of risk factors for necrotizing enterocolitis. Semin Fetal Neonatal Med. 23 (6), 374-379 (2018).
  4. Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: Modeling the innate immune response. Am J Pathol. 185 (1), 4-16 (2015).
  5. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair1. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  6. Hackam, D. J., Sodhi, C. P. Toll-like receptor-mediated intestinal inflammatory imbalance in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 6 (2), 229-238.e1 (2018).
  7. Sulistyo, A., Rahman, A., Biouss, G., Antounians, L., Zani, A. Animal models of necrotizing enterocolitis: Review of the literature and state of the art. Innov Surg Sci. 3 (2), 87-92 (2018).
  8. Lopez, C. M., et al. Models of necrotizing enterocolitis. Semin Perinatol. 47 (1), 151695(2023).
  9. Jilling, T., et al. The roles of bacteria and TLR4 in rat and murine models of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 177 (5), 3273-3282 (2006).
  10. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A mouse model of necrotizing enterocolitis. Methods Mol Biol. 2321, 101-110 (2021).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protoc. 2 (4), 100951(2021).
  12. Kaplina, A., et al. Necrotizing enterocolitis: The role of hypoxia, gut microbiome, and microbial metabolites. Int J Mol Sci. 24 (3), 2471(2023).
  13. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus hn001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: Evidence in mice for a role of TLR9. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  14. Denning, T. L., Bhatia, A. M., Kane, A. F., Patel, R. M., Denning, P. W. Pathogenesis of nec: Role of the innate and adaptive immune response. Semin Perinatol. 41 (1), 15-28 (2017).
  15. Yu, Y. -R. A., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLOS ONE. 11 (3), e0150606(2016).
  16. Mihi, B., et al. Interleukin-22 signaling attenuates necrotizing enterocolitis by promoting epithelial cell regeneration. Cell Rep Med. 2 (6), 100320(2021).
  17. Bautista, G. M., Cera, A. J., Chaaban, H., Mcelroy, S. J. State-of-the-art review and update of in vivo models of necrotizing enterocolitis. Front Pediatr. 11, 1161342(2023).
  18. Sodhi, C. P., et al. The human milk oligosaccharides 2'-fucosyllactose and 6'-sialyllactose protect against the development of necrotizing enterocolitis by inhibiting toll-like receptor 4 signaling. Pediatr Res. 89 (1), 91-101 (2021).
  19. Blum, L., Vincent, D., Boettcher, M., Knopf, J. Immunological aspects of necrotizing enterocolitis models: A review. Front Immunol. 15, 1434281(2024).
  20. Nolan, L. S., et al. Indole-3-carbinol-dependent aryl hydrocarbon receptor signaling attenuates the inflammatory response in experimental necrotizing enterocolitis. Immunohorizons. 5 (4), 193-209 (2021).
  21. Valle-Noguera, A., Gómez-Sánchez, M. J., Girard-Madoux, M. J. H., Cruz-Adalia, A. Optimized protocol for characterization of mouse gut innate lymphoid cells. Front Immunol. 11, 563414(2020).
  22. Booth, J. S., et al. Characterization and functional properties of gastric tissue-resident memory T cells from children, adults, and the elderly. Front Immunol. 5, 294(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים